يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تثبيط تكوين هشاشة العظام عن طريق LY90009 من خلال تعديل إشارات الشق في نماذج أمراض حال العظم

500 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69178

⸱

أكتوبر 7, 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقييم التأثيرات المثبطة لمثبطات γ-secretase LY900009 على تكوين هشاشة العظام الناجم عن RANKL في البلاعم المشتقة من نخاع العظام. يتضمن البروتوكول تقييم السمية الخلوية ، والمقايسات الوظيفية ، والتحليلات الجزيئية ، والتحقق من الصحة في الجسم الحي في نموذج تحلل العظام للفئران ، مع تطبيقات في التطوير العلاجي لأمراض حال العظم.

الملخص

يساهم نشاط ناقضات العظم غير المنظم بشكل عميق في تطور مرض انحلال العظام ، ومع ذلك فإن مدى طرائق التدخل العلاجي مقيد بالآثار الضارة. بحثت هذه الدراسة في LY900009 ، وهو مثبط γ إفراز ، وقدرته على قمع تكوين هشاشة العظام الناجم عن RANKL من خلال تعديل إشارات Notch. باستخدام البلاعم المشتقة من نخاع العظام ، أجرينا تقييمات شاملة في المختبر للسمية الخلوية والتمايز والمقايسات الوظيفية. تم استخدام تحليلات التعبير الجيني والبروتين باستخدام qPCR والنشاف الغربي لتوضيح الآليات الجزيئية الأساسية. تم تأكيد فعالية في الجسم الحي باستخدام نموذج ارتشاف العظام الناجم عن عديد السكاريد الدهني في الفئران. LY900009 يثبط تكوين ناقضات العظم التي يسببها RANKL ووظيفة الامتصاص بطريقة تعتمد على الجرعة دون سمية خلوية بتركيزات علاجية. قلل هذا العلاج بشكل كبير من عدد ناقضات العظم الإيجابية ل TRAP ، وضعف تكوين حزام الأكتين ، وقمع تدهور مصفوفة العظام. تم تقليل التعبير عن علامات ناقضات العظم ، بما في ذلك NFATc1 و c-Fos و cathepsin K و TRAP بشكل ملحوظ. ميكانيكيا ، LY900009 عطل إشارات Notch ومسارات MAPK / Akt النهائية. قللت الإدارة في الجسم الحي بشكل كبير من تدمير العظام الناجم عن LPS ، وتحسين معلمات العظام وتقليل وجود ناقضات العظم. توضح هذه النتائج أن LY900009 يمنع بشكل فعال تكوين هشاشة العظام وارتشاف العظام عن طريق تعديل محور إشارات Notch / MAPK / Akt ، مما يجعله مرشحا علاجيا واعدا لاضطرابات انحلال العظام.

المقدمة

يشكل التوازن العظمي نموذجا فسيولوجيا منسقا بشكل رائع في الفقاريات ، متناسقا من خلال التوازن الدقيق بين تكوين العظام بوساطة بانيات العظم وارتشاف العظام الذي يحركها ناقضات العظم1. يحافظ هذا التوازن المعقد على سلامة الهيكل العظمي ، والمرونة الميكانيكية الحيوية ، ودقة التمثيل الغذائي طوال عمر الفرد ، ويستجيب ديناميكيا للمتطلبات الميكانيكية ، واضطرابات الغدد الصماء ، والتحديات المرضية2. تتضمن دورة إعادة تشكيل العظام مراحل متسلسلة من التنشيط والارتشاف والانتقال والتكوين والإنهاء ، وكل منها تحكمه شلالات جزيئية معقدة تضمن التزامن الزماني المكاني للأنشطة الخلوية3.

يؤدي تعطيل هذه الآلية المتماثلة ، لا سيما من خلال نشاط ناقضات العظم المفرط أو عدم كفاية وظيفة بانيات العظم ، إلى فقدان العظام المرضي ، وهو سمة من سمات العديد من اضطرابات انحلال العظام4،5. تشمل هذه الحالات مجموعة واسعة من الأمراض ، بما في ذلك هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث والشيخوخة ، والتهاب المفاصل الروماتويدي ، والتهاب المفاصل ، وإصابة العظام الورمية ، ومرض باجيت ، واضطرابات اللثة6. تشمل المظاهر السريرية لارتشاف العظام المفرط زيادة خطر الكسور ، وتشوه الهيكل العظمي ، والألم المزمن ، والإعاقة الوظيفية ، وعبء الرعاية الصحية الكبير6،7. تشير المقاييس الوبائية المعاصرة إلى أن هشاشة العظام وحدها تؤثر على أكثر من 200 مليون فرد في جميع أنحاء العالم ، مع الكسور المرتبطة بها مما يؤدي إلى مراضة كبيرة ووفيات وتكاليف اقتصادية تتجاوز مليارات الدولارات سنويا7،8.

تظهر ناقضات العظم على شكل خلايا عملاقة متعددة النوى عالية التخصص مشتقة من السلائف المكونة للدم لسلالة البلعمة أحادية النواة ، وتحديدا البلاعم المشتقة من نخاع العظام9. يمثل تكوينها عملية معقدة متعددة الخطوات تتطلب تنسيقا دقيقا للإشارات خارج الخلية ، وشلالات الإشارات داخل الخلايا ، وبرامج النسخ10. تشمل السيتوكينات الأساسية التي تحكم تكوين هشاشة العظام منشط مستقبلات العامل النووي κB (RANKL) وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ، والتي ترتبط بمستقبلاتها RANK و c-Fms لبدء برامج التمايز11. يؤدي تفاعل RANKL-RANK إلى تنشيط مسارات إشارات متعددة في اتجاه مجرى النهر ، بما في ذلك كينازات البروتين المنشطة بالميتوجين (MAPKs) ، والعامل النووي κB (NF-κB) ، والفوسفينوسيتيد 3-كيناز / بروتين كيناز ب (PI3K / Akt) ، ومسارات الكالسيوم / الكالسينيورين ، والتي تتقارب على العامل النووي للخلايا التائية المنشطة السيتوبلازم 1 (NFATc1) ، منظم النسخ الرئيسي لتكوين هشاشة العظام10،11،12.

من بين الآليات التنظيمية المختلفة التي تتحكم في بيولوجيا ناقضات العظم ، برزت إشارات Notch كمغير حاسم مع وظائف معقدة وتعتمد على السياق13. مسار Notch هو نظام اتصال خلوي خلوي محفوظ تطوريا يحكم تحديد مصير الخلية والتمايز والتكاثر وموت الخلايا المبرمج عبر الأنسجة المتنوعة ومراحل النمو14. في الثدييات ، تتفاعل أربعة مستقبلات Notch (Notch1-4) مع خمسة روابط أساسية (تشبه دلتا 1 و 3 و 4 و Jagged 1 و 2) للتوسط في الإشارات بين الخلايا. يتضمن تنشيط المسار ربط الترابط ، والتغيرات التوافقية ، والانقسام المحلل للبروتين المتسلسل بواسطة ADAM metalloproteases ومركب γ-secretase ، والذي يطلق في النهاية مجال Notch داخل الخلايا (NICD) للنقل النووي وتنظيم النسخ للجينات المستهدفة ، بما في ذلك عائلات Hes و Hey14،15. لا يزال دور إشارات Notch في تكوين هشاشة العظام مثيرا للجدل ويبدو أنه يعتمد بشكل كبير على السياق ، حيث أبلغت الدراسات عن كل من التأثيرات التحفيزية والمثبطة اعتمادا على الأنواع الفرعية المحددة للمستقبلات ، وتوافر الترابط ، والبيئة المكروية الخلوية ، والظروف التجريبية16،17،18.

تركز الأساليب العلاجية السائدة لأمراض انحلال العظم بشكل أساسي على الاستراتيجيات المضادة للارتشاف ، بما في ذلك البايفوسفونات ، ودينوسوماب (مثبط RANKL) ، ومعدلات مستقبلات هرمون الاستروجين الانتقائية ، والكالسيتونين7،8،19. على الرغم من أن هذه العلاجات تقلل بشكل فعال من ارتشاف العظام وخطر الكسور ، إلا أنها ترتبط بقيود كبيرة ، بما في ذلك سمية الجهاز الهضمي ، ونخر العظم في الفك ، والكسور غير النمطية ، وزيادة خطر الإصابة بالعدوى ، والمخاوف بشأن السلامة على المدى الطويل. بالإضافة إلى ذلك ، قد تثبط هذه العوامل بشكل مفرط دوران العظام ، مما قد يضر بجودة العظام وآليات الإصلاح. وبالتالي ، هناك حاجة سريرية ملحة لعوامل علاجية جديدة يمكنها تثبيط نشاط ناقضات العظم المرضية بشكل انتقائي مع تقليل الآثار الضارة والحفاظ على قدرة إعادة تشكيل العظام الفسيولوجية8،14.

تمثل مثبطات γ-Secretase فئة واعدة من المركبات ذات التطبيقات المحتملة في أمراض انحلال العظام من خلال تعديل إشارات Notch14،20. وقد درست هذه العوامل على نطاق واسع في علم الأورام وأبحاث الأمراض التنكسية العصبية, مع تقدم العديد من المركبات إلى التجارب السريرية لمرض الزهايمر وأنواع مختلفة من السرطان. أظهر LY900009 ، وهو مثبط γ سيكرتيز قوي وانتقائي ، خصائص دوائية مواتية ، بما في ذلك الخصوصية العالية والتوافر البيولوجي وملف تعريف السلامة الذي يمكن التحكم فيه في الدراسات الأولية21،22. ومع ذلك ، فإن آثاره المحددة على تكوين هشاشة العظام الناجم عن RANKL والفائدة العلاجية المحتملة في أمراض حال العظم لا تزال غير مميزة بشكل كامل. تم تصميم هذه الدراسة لتقييم ما إذا كان LY900009 يمكن أن يمنع تكوين هشاشة العظام من خلال تعطيل إشارات Notch ، مما قد يقدم نهجا علاجيا جديدا لأمراض حال العظام. قمنا بتطوير بروتوكولات شاملة لتقييم آثارها على تكوين ناقضات العظم ، ونشاط ارتشاف العظام ، ومسارات الإشارات ، والفعالية في الجسم الحي في نماذج فقدان العظام الالتهابية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للإرشادات المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدامه في المستشفى المركزي التابع لجامعة شاندونغ الطبية الأولى (رقم الموافقة IACUC-2024-015). التزمت الدراسة بالمبادئ الأخلاقية الراسخة للأبحاث الحيوانية وإرشادات ARRIVE ، بما في ذلك إسكان في أقفاص قياسية (5 فئران / قفص ، دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة ، طعام / ماء إعلاني ) والتوزيع العشوائي إلى مجموعات

1. عزل البلاعم المشتقة من نخاع العظام وزراعتها

  1. قم بالقتل الرحيم للفئران الذكور C57BL / 6 البالغة من العمر 5 أسابيع (ن = 5 لكل عزلة) عن طريق وضعها في غرفة ثاني أكسيد الكربون2 بمعدل تدفق 30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. رش الماوس بنسبة 70٪ إيثانول. قم بعمل شق خط الوسط من العانة إلى القص باستخدام مقص معقم. إزالة عظم الفخذ والساق aseptically. ضع العظام في PBS معقم على الثلج.
  3. نظف عظام الأنسجة الرخوة باستخدام شاش معقم. قطع طرفي العظام بمقص معقم. اغسل النخاع باستخدام إبرة 25 جرام مع 10 مل من α-MEM البارد لكل فأر. مرر تعليق الخلية عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
  4. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في α-MEM تحتوي على 10٪ FBS و 33.3 نانوغرام / مل M-CSF. عد الخلايا باستخدام مقياس الصفيحات الدموية مع استبعاد التريبان الأزرق. صفيحة بحجم 2 × 106 خلايا / مل في قوارير T75.
  5. حافظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مع تغييرات متوسطة كل 48 ساعة.
  6. حصاد 1 × 106 خلايا. يغسل باستخدام PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS. احتضان مع مضاد CD11b-FITC (1: 100) ومضاد F4 / 80-PE (1: 100) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. قم بالتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية البوابات التالية: أولا ، خلايا البوابة القائمة على التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) لاستبعاد الحطام وتحديد الخلايا القابلة للحياة. ثانيا ، بوابة الخلايا الإيجابية CD11b من مجموعة الخلايا القابلة للحياة. ثالثا ، من الخلايا الإيجابية CD11b ، بوابة الخلايا الموجبة F4 / 80 لتحديد البلاعم الإيجابية المزدوجة CD11b +/F4/80+ . قم بتعيين البوابات بناء على عناصر التحكم غير الملوثة وعناصر التحكم أحادية اللون. تابع فقط إذا كانت >95٪ من الخلايا هي CD11b +/F4 / 80+.

2. تقييم السمية الخلوية

  1. البلاعم المشتقة من نخاع عظم البذور (BMMs) عند 1 × 104 خلايا لكل بئر في صفيحة 96 بئرا باستخدام 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر. اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد LY900009 التخفيفات في وسط كامل: 0 ، 0.1 ، 0.2 ، 0.4 ، 0.8 ، 1.6 ، 3.2 ، 6.4 ، 12.8 ، 25.6 ميكرومتر. قم بإزالة الوسط القديم. أضف 100 ميكرولتر من وسط العلاج لكل بئر. قم بإعداد ثلاث نسخ لكل تركيز.
  3. احتضان لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة أو 96 ساعة. قم بإزالة وسط الاستزراع تماما. أضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج الذي يحتوي على 10٪ من كاشف CCK-8 (10 ميكرولتر من CCK-8 في 90 ميكرولتر من الوسط). احتضان لمدة 2 ساعة بالضبط عند 37 درجة مئوية. استخدم قارئ microplate لقياس الامتصاص عند 450 نانومتر مع مرجع عند 650 نانومتر.
  4. احسب IC50 باستخدام منشور GraphPad. البرمجيات المفتوحة وتركيز المدخلات (المحور X) ونسبة الجدوى (المحور Y). حدد تحليل > الانحدار غير الخطي > استجابة الجرعة > تثبيط > السجل (المثبط) مقابل الاستجابة مع المنحدر المتغير. تعيين القيود: أسفل = 0 ، أعلى = 100. سجل IC50 بفاصل ثقة 95٪.

3. تمايز ناقضات العظم وتلوين TRAP

  1. البلاعم المشتقة من نخاع عظم البذور (BMMs) عند 1 × 104 خلايا لكل بئر في صفيحة 96 بئرا. الاستزراع بين عشية وضحاها في α-MEM مع 10٪ FBS و 33.3 نانوغرام / مل m-csf.
  2. استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر من وسط التمايز: α-MEM يحتوي على 10٪ FBS ، 33.3 نانوغرام / مل m-CSF ، 100 نانوغرام / مل RANKL ، و LY900009 (0 ، 100 ، 200 ، 400 نانومتر). قم بإعداد رباعي الأشكال لكل حالة.
  3. استبدل الوسط كل 48 ساعة بوسط تمايز جديد. استمر لمدة 6 أيام. المراقبة اليومية باستخدام مجهر مقلوب بمعدل 100x لتكوين ناقضات العظم.
  4. قم بإزالة كل الوسائط عن طريق الشفط. يغسل مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من PBS. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 15 دقيقة بالضبط في درجة حرارة الغرفة. إزالة المثبت. اغسل 3 مرات ب 200 ميكرولتر من PBS.
  5. تحضير محلول تلطيخ TRAP: امزج 50 مل من 0.1 مل من أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.0) ، 10 مل من طرطرات الصوديوم 50 ملي ، 1 مل من 5 مجم / مل من فوسفات النفثول AS-MX في ثنائي ميثيل فورماميد ، و 0.5 مل من 11 مجم / مل ملح LB أحمر بنفسجي سريع. قم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. ضع 200 ميكرولتر لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام. أوقف التفاعل عن طريق غسل 3x بالماء المقطر.
  6. حدد ناقضات العظم على أنها خلايا إيجابية TRAP (أرجواني / أحمر) تحتوي على ثلاث نوى أو أكثر. العد باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 100x. صور خمسة حقول عشوائية لكل بئر.
  7. تحديد الكمية باستخدام ImageJ. انقر فوق الصورة > تحويل إلى 8 بت (الصورة > النوع > 8 بت) > تعيين الحد (الصورة > ضبط عتبة >) > تحديد المناطق الموجبة TRAP > تحليل الجسيمات (تحليل > تحليل الجسيمات: الحجم 100-إنفينيتيميكرومتر 2 ، الدائرية 0-1.0) > تصدير النتائج إلى Excel 23.

4. مقايسة ارتشاف العظام الوظيفية

  1. ثقافة BMMs في لوحات بستة آبار (2 × 105 خلايا / بئر) مع M-CSF لمدة 24 ساعة. إضافة رانكل (100 نانوغرام / مل) للحث على تكوين ما قبل العظم لمدة 3 أيام.
  2. حصاد الخلايا باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحييد مع وسط كامل. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام Trypan Blue.
  3. البذور 1 × 104 ناقضات العظم لكل بئر على ألواح 96 بئرا مطلية بالهيدروكسيباتيت. السماح المرفق لمدة 4 ساعات.
  4. عالج مع M-CSF (33.3 نانوغرام / مل), RANKL (100 نانوغرام/مل), و LY900009 (0, 100, 200, 400 نانومتر) لمدة 4 أيام. قم بتغيير الوسط كل يومين.
  5. قم بإزالة الخلايا باستخدام مبيض 10٪ لمدة 10 دقائق. يغسل 5 مرات بالماء المقطر. يجف في الهواء تماما.
  6. تصور حفر الارتشاف باستخدام قارئ تصوير آلي بتكبير 4x. التقط منطقة البئر بأكملها. حدد المنطقة المعاد امتصاصها كنسبة مئوية من المساحة الإجمالية باستخدام ImageJ.

5. الفحص المجهري المناعي التألق

  1. تنزلق ناقضات عظم العظم على الأغطية الزجاجية في ألواح 24 بئرا لمدة 5-7 أيام كما هو موضح في الخطوة 3.
  2. يصلح مع 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة. نفل مع 0.1٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق. كتلة مع 1٪ BSA في PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. احتضان الرودامين-فالويدين (1:200) في المخزن المؤقت للحجب لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. مضاد النوى باستخدام DAPI (1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقائق.
  4. قم بتركيب الأغطية على الشرائح باستخدام وسيط تثبيت مضاد للبهتان. افحص باستخدام مجهر مضان بتكبير 200x. قم بقياس مساحة حلقة الأكتين باستخدام ImageJ.

6. تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي

  1. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من 2 × 106 خلايا باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي. التجانس عن طريق العينة. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم. رج العبوة بقوة لمدة 15 ثانية. احتضان 3 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول. تخلط بلطف. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل الحبيبات ب 1 مل من 75٪ إيثانول. جفف في الهواء لمدة 10 دقائق. تذوب في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. قياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي (يتطلب نسبة A260 / A280 >1.8).
  5. قم بتجميع (كدنا) باستخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مع مجموعة النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. تحضير تفاعلات qPCR: 10 ميكرولتر من Master Mix ، 1 ميكرولتر من cDNA ، 0.5 ميكرولتر من كل برايمر (10 ميكرومتر) ، 8 ميكرولتر من الماء. يعمل على نظام PCR في الوقت الفعلي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. احسب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCt مع GAPDH كجين مرجعي.

7. تحليل اللطخة الغربية

  1. الخلايا الحاجزة في RIPA المؤقت التي تحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز على الجليد لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  2. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد عينات بروتين 30 ميكروغرام في المخزن المؤقت للتحميل. يغلي لمدة 5 دقائق.
  3. قم بتحميل العينات على 10٪ جل SDS-PAGE. قم بالتشغيل عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة ، ثم 120 فولت لمدة 90 دقيقة. نقل إلى أغشية PVDF عند 100 فولت لمدة 90 دقيقة في المخزن المؤقت للنقل البارد.
  4. قم بحظر الأغشية مع 5٪ حليب خالي الدسم في محلول ملحي من Tris-Buffered مع 0.1٪ Tween-20 (TBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.
  5. احتضان بالأجسام المضادة الأولية المفصلة في جدول المواد (1: 1000) طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف. اغسل 3 مرات مع TBST لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  6. احتضان الأجسام المضادة الثانوية المقترنة ب HRP (1: 5000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يغسل 3 مرات باستخدام TBST.
  7. اكتشف استخدام كاشف ECL وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. التقط الصور باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء. تحديد كثافة النطاق باستخدام ImageJ.

8. في نموذج ارتشاف العظام الناجم عن الجسم الحي LPS

  1. احسب حجم العينة باستخدام G * Power 3.1 (حجم التأثير = 0.8 ، α = 0.05 ، الطاقة = 0.80 ، مما ينتج عنه ن = 5 / مجموعة). قم بتخصيص الفئران الذكور C57BL / 6 البالغة من العمر 7-8 أسابيع بشكل عشوائي إلى مجموعات باستخدام مولد أرقام عشوائي. منزل 5 الفئران لكل قفص مع دورة ضوئية / داكنة 12 ساعة ، درجة حرارة 22 ± 2 درجة مئوية ، الرطوبة 55٪ ± 10٪ ، الوصول المجاني إلى الطعام القياسي والماء.
  2. تخدير الفئران باستخدام حقن بنتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق (50 ملغ/كغ). تأكد من التخدير عن طريق رد فعل قرصة إصبع القدم.
  3. إعداد التحكم في السيارة: PBS يحتوي على 1٪ DMSO. تحضير LY900009: جرعة منخفضة (2.5 ملغ/كغ) وجرعة عالية (5 ملغ/كغ) في السيارة. حقن 100 ميكرولتر تحت الجلد فوق الجلجلة باستخدام إبرة 27 جرام يوميا لمدة 14 يوما. حقن LPS (10 مجم / كجم) في اليومين 1 و 8.
  4. راقب الفئران مرتين يوميا بحثا عن علامات الضيق. تحديد نقاط النهاية الإنسانية: فقدان الوزن >20٪ ، عدم القدرة على التنقل ، الموقف المنحني ، تقليل الاستمالة. القتل الرحيم على الفور إذا تم الوصول إلى نقاط النهاية.
  5. يتم القتل الرحيم في اليوم 15 باستخدام جرعة زائدة من البنتوباربيتال (100 ملغ/كغ داخل الصفاق). حصاد الكهفاريا. يثبت 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.

9. التصوير المقطعي المحوسب والتحليل النسيجي

  1. امسح الجلجلات الثابتة باستخدام ماسح ضوئي دقيق بالأشعة المقطعية مع المعلمات التالية: 70 كيلو فولت ، 114 ميكرو أمبير ، فلتر ألومنيوم 0.5 مم ، دقة 9 ميكرومتر ، دوران 180 درجة بخطوات 0.4 درجة.
  2. أعد بناء الصور باستخدام برنامج NRecon. التحليل باستخدام برنامج CTAn. حدد منطقة الاهتمام على أنها منطقة 3 × 3 مم تتمحور حول الخيط السهمي. احسب BMD ، BV / TV ، TB.N ، Tb.Th.
  3. قم بإزالة الكلسات من العينات في 10٪ EDTA (درجة الحموضة 7.4) لمدة 14 يوما مع التغييرات اليومية. إتمام اختبار إزالة الكلس باستخدام اختبار أكسالات الكالسيوم24.
  4. عملية تضمين البارافين: الجفاف من خلال الكحول المتدرج ، واضح في الزيلين ، تسلل مع البارافين. قسم بسمك 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
  5. ضمان الكشف عن العمى: قم بترميز جميع العينات باستخدام أرقام عشوائية مكونة من ثلاثة أرقام. اطلب من زميل الاحتفاظ بمفتاح الرمز. إجراء جميع التحليلات دون معرفة مجموعات العلاج. فك التشفير فقط بعد اكتمال جمع البيانات.
  6. قم بإجراء تلطيخ H & E: إزالة البارافينات ، وإعادة الترطيب ، وصمة عار بالهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ، والتفريق في الكحول الحمضي ، وصمة عار بالإيوزين لمدة دقيقتين ، والتجفيف ، والتركيب.
  7. قم بإجراء تلطيخ TRAP كما في الخطوة 3.5. عد الخلايا متعددة النوى إيجابية TRAP على طول سطح العظام. التعبير كرقم لكل مم محيط العظام.

10. التحليل الإحصائي

  1. احسب حجم العينة المطلوب باستخدام G * Power 3.1: حجم تأثير الإدخال f = 0.8 ، α = 0.05 ، الطاقة = 0.80 ، عدد المجموعات. سجل الحد الأدنى n لكل مجموعة.
  2. اختبار الحالة الطبيعية باستخدام اختبار Shapiro-Wilk في SPSS 28.0. ضع في اعتبارك p > 0.05 كما هو موزع عادة. اختبار التجانس باستخدام اختبار ليفين. ضع في اعتبارك p > 0.05 فروق متساوية.
  3. تطبيق الاختبارات المناسبة بناء على التوزيع: بالنسبة للبيانات العادية ذات التباينات المتساوية ، استخدم الاختبارات البارامترية. بالنسبة للمجموعتين، قم بتطبيق اختبار t للطالب غير المزترن. بالنسبة لمجموعات متعددة، استخدم ANOVA أحادي الاتجاه.
  4. قم بإجراء تحليل لاحق: للحصول على ANOVA الهامة (p<0.05) ، قم بتطبيق اختبار الفرق المهم بصدق من Tukey لجميع المقارنات الزوجية.
  5. استخدم بدائل غير بارامترية للبيانات غير العادية: قم بتطبيق اختبار Mann-Whitney U لمجموعتين و Kruskal-Wallis مع اختبار Dunn اللاحق لمجموعات متعددة.
  6. احسب أحجام التأثير: كوهين د لاختبارات t ، إيتا جزئية تربيع ل ANOVA.
  7. أبلغ عن قيم p الدقيقة إلى ثلاث منازل عشرية وفترات ثقة 95٪. تقديم البيانات العادية كمتوسط ± الانحراف المعياري ، غير طبيعي كمتوسط (النطاق الربيعي).
  8. ضع في اعتبارك p < 0.05 ذات دلالة إحصائية. قم بتطبيق تصحيح Bonferroni عند إجراء مقارنات متعددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كشف التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول أن LY900009 يمارس تأثيرات مثبطة قوية على تكوين ناقضات العظم ووظيفتها من خلال آليات متعددة مترابطة. أظهر التقييم الأولي للسمية الخلوية في البلاعم المشتقة من نخاع العظام زيادات تعتمد على الوقت في السمية ، مع قيم IC50 المحسوبة من 4.44 ميكرومتر و 3.66 ميكرومتر و 2.93 ميكرومتر في 24 ساعة و 48 ساعة و 96 ساعة على التوالي (الشكل 1 أ ، ب). الأهم من ذلك ، أن هذه التركيزات السامة للخلايا كانت أعلى بكثير من الجرعات الفعالة علاجيا ، مما أدى إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يقدم التحقيق الحالي دليلا مقنعا على أن LY900009 يمثل عاملا علاجيا واعدا لأمراض انحلال العظم من خلال تثبيطه القوي والانتقائي لتكوين هشاشة العظام ، بما يتفق مع الاهتمام المتزايد بمثبطات γ secretase للاضطرابات المرتبطة بالعظام14،20،21. توضح النتائج أن مثبط γ secretase هذا يثبط بشكل فعال تكوين ناقضات العظم التي يسببها RANKL ووظيفة امتصاص العظام من خلال التعطيل المنسق لمسارات الإشارات الحرجة المتعددة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن المؤلفان عن أي مصالح مالية متنافسة أو تضارب في المصالح. لا يوجد مؤلف لديه أي علاقة مالية مع الكيانات التجارية المذكورة في هذا العمل. أكمل جميع المؤلفين استمارات الإفصاح ICMJE.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا موظفي المستشفى المركزي التابع لجامعة شاندونغ الطبية الأولى ومستشفى Feicheng الشعبي على دعمهم الفني ومساعدتهم خلال هذه الدراسة. كما نقدر مساهمات زملائنا في المختبر لمناقشاتهم القيمة ومساعدتهم في التجارب على.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 بئر لوحات زراعة الخلاياكورنينج3524الفحص المجهري المناعي
6-لوحات زراعة الخلاياكورنينج3516زراعة الخلايا واللطخة الغربية
70٪ إيثانولسيجما ألدريتشإ7023التعقيم والتطهير
75٪ إيثانولسيجما ألدريتشE7148مخزن غسيل الحمض النووي الريبي
96 بئرا لوحات زراعة الخلاياكورنينج3596زراعة الخلايا والمقايسات
فلتر ألومنيوم (0.5 مم)بروكرغير متاحمرشح الفحص بالأشعة المقطعية الدقيقة
الأجسام المضادة المضادة CD11b-FITCبيو ليجند101206قياس التدفق الخلوي - علامة البلاعم
الأجسام المضادة Notch1 المضادة للشقوق (أحادية النسيلة للأرانب)تقنية إشارات الخلية4147 ثانيةوصمة عار غربية - إشارات الشق
الأجسام المضادة المضادة F4 / 80-PEبيو ليجند123108قياس التدفق الخلوي - علامة البلاعم
وسيط تركيب مضاد للبهتانمختبرات ناقلاتإتش -1000تركيب المجهر الفلوري
الأجسام المضادة المضادة ل Hes1 (أحادي النسيلة الأرانب)تقنية إشارات الخلية11988قاللطخة الغربية - هدف المصب
الجسم المضاد المضاد ل NFATc1 (أحادي النسيلة للفأر)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-7294لطخة غربية - منظم رئيسي لناقضات العظم
الأجسام المضادة للفوسفو Akt (Ser473)تقنية إشارات الخلية4060 ثانيةاللطخة الغربية - إشارات PI3K / Akt
الأجسام المضادة المضادة للفوسفو-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)تقنية إشارات الخلية4370 ثانيةاللطخة الغربية - إشارات MAPK
مضاد للفوسفو NF- وكابا. الجسم المضاد B p65 (Ser536)تقنية إشارات الخلية3033 ثانيةوصمة عار غربية - NF- وكابا. الإشارات B
الأجسام المضادة المضادة للفوسفو-p38 MAPK (Thr180 / Tyr182)تقنية إشارات الخلية4511 قاللطخة الغربية - p38 إشارات MAPK
الأجسام المضادة للأكتين (أحادية النسيلة للفأر)تقنية إشارات الخلية4970 ثانيةالتحكم في تحميل اللطخة الغربية
قارئ التصوير الآليالأجهزة الجزيئيةImageXpress Microالقياس الكمي لحفرة الارتشاف
مجموعة فحص بروتين BCAبيرس / ثيرمو فيشر23225تحديد تركيز البروتين
مبيض (10٪ هيبوكلوريت الصوديوم)سيجما ألدريتش425044إزالة الخلايا من ألواح الارتشاف
BSA (مصل الأبقار الألبومين)سيجما ألدريتشأ7906حجب المخزن المؤقت للتألق المناعي
C57BL / 6 الفئران (ذكر ، 5-8 أسابيع)مختبرات نهر تشارلز27عزل BMM في المختبر والدراسات في الجسم الحي
كاشف اختبار أكسالات الكالسيومسيجما ألدريتشرقم C0350اختبار إكمال إزالة الكلس
كاشف CCK-8 (طقم عد الخلايا -8)دوجيندو للتقنيات الجزيئيةCK04تقييم صلاحية الخلية
مصفاة الخلية (70 μ m)BD فالكون352350ترشيح خلايا نخاع العظم
جهاز طرد مركزي (مبرد)إيبندورف5424صتحضير الخلية والعينات
كلوروفورمسيجما ألدريتشسي 2432فصل مرحلة استخراج الحمض النووي الريبي
غرفة ثاني أكسيد الكربون 2< / sub>الرحم كوربالرقم EX-075القتل الرحيم للحيوان
برنامج CTAnبروكرالإصدار 1.20تحليل الصور بالأشعة المقطعية الدقيقة
دابي (4',6-دياميدينو-2-فينيليندول)سيجما ألدريتشد9542التلوين النووي المضاد
ثنائي ميثيل فورماميد (DMF)سيجما ألدريتشD4551مذيب تلطيخ TRAP
DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد)سيجما ألدريتشD2650إعداد التحكم في السيارة
ركيزة النفخ الغربي ECLبيرس / ثيرمو فيشر32106كشف البروتين في اللطخة الغربية
EDTA (10٪ ، الرقم الهيدروجيني 7.4)سيجما ألدريتشE6758محلول إزالة الكلس
إيوسين وايسيجما ألدريتش[إ4009]إتش & تلطيخ النسيجي E
ملح أحمر بنفسجي سريعسيجما ألدريتشإف 3381TRAP تلطيخ الكروموجين
مصل الأبقار الجنينية (FBS)جيبكو / ثيرمو فيشر16140-071مكمل زراعة الخلايا
مقياس التدفق الخلويBD Biosciencesفاكسكاليبورتوصيف BMM
مجهر مضانأوليمبوستاسعة 73التصوير المناعي التألق
برنامج G * Powerجامعة هاينريش هاينةالإصدار 3.1تحليل القوة الإحصائية
أغطية زجاجية (22 &مرة؛ 22 مم)فيشر العلمية12-541-بالفحص المجهري المناعي
GraphPad المنشوربرنامج GraphPadالإصدار 9.0حساب IC50 والرسوم البيانية
الهيماتوكسيلينسيجما ألدريتش[إتش3136]إتش & تلطيخ النسيجي E
مقياس الخوضهاسر العلمي3200عد الخلايا
طقم النسخ العكسي (كدنا) عالي السعةالأنظمة الحيوية التطبيقية4368814تخليق (كدنا) من الحمض النووي الريبي
HRP مقترن مضاد للفأر IgGتقنية إشارات الخلية7076 ثانيةالأجسام المضادة الثانوية للطخة الغربية
HRP مترافق مضاد للأرانب IgGتقنية إشارات الخلية7074 قالأجسام المضادة الثانوية للطخة الغربية
ألواح 96 بئرا مطلية بالهيدروكسيباتيتكورنينج بيو كوت354651الفحص الوظيفي لارتشاف العظام
إيمج جيالمؤسسهالإصدار 1.53eتحليل الصور وقياسها كميا
حاضنة (ثاني أكسيد الكربون 2)ثيرمو فيشر51033058صيانة زراعة الخلايا
نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراءبيو رادChemiDoc MPكشف اللطخة الغربية
المجهر المقلوبأوليمبوسCKX41مراقبة زراعة الخلايا ، عد TRAP
إيزوبوبانولسيجما ألدريتشط9516ترسيب الحمض النووي الريبي
LPS (عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية)سيجما ألدريتشL4391ارتشاف العظام الالتهابية في الجسم الحي
LY900009 (مثبط سيكريتيز غاما)سيليك للكيماوياتط7999مركب الاختبار - مثبط ناقضات العظم
M-CSF (عامل تحفيز مستعمرة البلاعم)آر آند د سيستمز416-مل-010بقاء البلاعم وتمايز ناقضات العظم
ماسح ضوئي دقيقبروكرسكاي سكان 1272تحليل البنية الدقيقة للعظام
قارئ Microplateبيوتيكالتآزر H1قياسات الامتصاص (CCK-8)
ميكروتوملايكا2255 رينجيت ماليزيالتقسيم النسيجي
فوسفات النفثول AS-MXسيجما ألدريتشN5000الركيزة تلطيخ TRAP
الإبر (25 جم ، 27 جم)دينار بحريني305122, 305109تنظيف نخاع العظم والحقن
برنامج NReconبروكرالإصدار 1.7إعادة بناء صورة التصوير المقطعي المحوسب الصغير
شمع البارافينسيجما ألدريتشص 3683تضمين الأنسجة
بارافورمالديهايد (4٪)سيجما ألدريتشص 6148تثبيت الخلايا والأنسجة
PBS (محلول ملحي مخزن الفوسفات)جيبكو / ثيرمو فيشر14190-144غسل الخلايا وإعداد المخزن المؤقت
بنتوباربيتال الصوديومسيجما ألدريتشص 3761التخدير الحيواني والقتل الرحيم
كوكتيل مثبط الفوسفاتيزروش4906837001الحفاظ على الفسفرة
باور أب SYBR جرين ماستر ميكسالأنظمة الحيوية التطبيقيةأ25742PCR الكمي في الوقت الحقيقي
كوكتيل مثبط البروتيازروش11697498001منع تدهور البروتين
غشاء PVDF (0.45 μ m)بيو راد1620177نقل البروتين الغربي
RANKL (مستقبلات المنشط من NF- & kappa; ب ليجند)آر آند د سيستمز462-TEC-010تحريض تمايز ناقضات العظم
نظام PCR في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيوية التطبيقية7500 سريعالتحليل الكمي للتعبير الجيني
رودامين فالويدينInvitrogen / Thermo FisherR415تصور F-actin
مخزن مؤقت RIPAتقنية إشارات الخلية9806 قاستخراج البروتين
Rمياه خالية من النيازأمبيون / ثيرمو فيشررقم 9937انحلال الحمض النووي الريبي و PCR
جل SDS-PAGE (10٪)بيو راد4561036فصل بروتين اللطخة الغربية
مسحوق الحليب الخالي من الدسمبيو راد1706404حجب اللطخة الغربية
عازلة أسيتات الصوديوم (0.1 م ، درجة الحموضة 5.0)سيجما ألدريتشس 2889TRAP عازلة تلطيخ
طرطرات الصوديوم (50 ملم)سيجما ألدريتشط4297خصوصية تلطيخ TRAP
مقياس الطيف الضوئيثيرمو فيشرنانو دروب 2000قياس تركيز الحمض النووي الريبي / البروتين
SPSSشركة IBMالإصدار 28.0التحليل الإحصائي
المحاقن (1 مل ، 10 مل)دينار بحريني309659, 309604تنظيف نخاع العظم والحقن
قوارير ثقافة الخلايا T75كورنينج430641ثقافة BMM الأولية
TBST (محلول ملحي تريس مخزن مع 0.1٪ توين-20)بيو راد1706531عازلة الغسيل الغربية
المخزن المؤقت للنقلبيو راد1704270نقل البروتين الغربي
تريتون X-100سيجما ألدريتشتي 8787نفاذية الخلية
كاشف TRIzolInvitrogen / Thermo Fisher15596026استخراج الحمض النووي الريبي الكلي
أزرق تريبان (0.4٪)سيجما ألدريتشتي 8154تقييم صلاحية الخلية
التربسين-EDTA (0.25٪)جيبكو / ثيرمو فيشر25200-056حصاد الخلايا وانفصالها
نظام نقل اللطخة الغربيةبيو رادترانس بلطخ توربونقل البروتين إلى الغشاء
الزيلينسيجما ألدريتشإكس 3750معالجة الأنسجة وتطهيرها
α-MEM (ألفا الحد الأدنى من الوسيط الأساسي)جيبكو / ثيرمو فيشر12561-056وسط زراعة الخلايا

المراجع

  1. Langdahl, B., Ferrari, S., Dempster, D. W. Bone modeling and remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis. Ther Adv Musculoskeletal Dis. 8 (6), 225-235 (2016).
  2. Shah, M. A. A., et al. Functional morphology of trabecular system in human proximal femur: a perspective from P45 sectional plastination and 3D reconstruction finite element analysis. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  3. Shah, M. A. A., et al. Microvasculature and trabecular bone in beagle proximal femur: Microstructural insights. Ann Anatomy. 258, 152368(2025).
  4. Mukherjee, K., Chattopadhyay, N. Pharmacological inhibition of cathepsin K: A promising novel approach for postmenopausal osteoporosis therapy. Biochem Pharmacol. 117, 10-19 (2016).
  5. Bertuglia, A., et al. Osteoclasts are recruited to the subchondral bone in naturally occurring post-traumatic equine carpal osteoarthritis and may contribute to cartilage degradation. Osteoarth Cartilage. 24 (3), 555-566 (2016).
  6. Alami, S., Hervouet, L., Poiraudeau, S., Briot, K., Roux, C. Barriers to Effective Postmenopausal Osteoporosis Treatment: A Qualitative Study of Patients' and Practitioners' Views. PLoS One. 11 (6), e0158365(2016).
  7. Hiligsmann, M., et al. A Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Postmenopausal Osteoporosis. PharmacoEconomics. 33 (3), 205-224 (2014).
  8. Hadji, P., et al. Persistence, adherence, and medication-taking behavior in women with postmenopausal osteoporosis receiving denosumab in routine practice in Germany, Austria, Greece, and Belgium: 12-month results from a European non-interventional study. Osteoporosis Int. 26 (10), 2479-2489 (2015).
  9. Udagawa, N., et al. Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor. Bone. 25 (5), 517-523 (1999).
  10. Lee, K., et al. Selective Regulation of MAPK Signaling Mediates RANKL-dependent Osteoclast Differentiation. Int J Biol Sci. 12 (2), 235-245 (2016).
  11. Huang, H., et al. Osteoclast differentiation requires TAK1 and MKK6 for NFATc1 induction and NF-κB transactivation by RANKL. Cell Death Diff. 13 (11), 1879-1891 (2006).
  12. Matsumoto, Y., et al. RANKL coordinates multiple osteoclastogenic pathways by regulating expression of ubiquitin ligase RNF146. J Clin Investigat. 127 (4), 1303-1315 (2017).
  13. Lai, E. C. Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development. 131 (5), 965-973 (2004).
  14. Chen, X., et al. LY411575, a potent γ-secretase inhibitor, suppresses osteoclastogenesis in vitro and LPS-induced calvarial osteolysis in vivo. J Cellular Physiol. 234 (11), 20944-20956 (2019).
  15. Chen, S., Lee, B. H., Bae, Y. Notch Signaling in Skeletal Stem Cells. Calcified Tiss Int. 94 (1), 68-77 (2013).
  16. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), (2012).
  17. Duan, L. Notch is activated in RANKL-induced osteoclast differentiation and resorption. Front Biosci. (13), 7064(2008).
  18. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  19. Hough, F. S., et al. The safety of osteoporosis medication. South African Med J. 104 (4), 279(2013).
  20. Espinosa, L. S., Inglés-Esteve, J., Robert-Moreno, A., Bigas, A. IκBα and p65 Regulate the Cytoplasmic Shuttling of Nuclear Corepressors: Cross-talk between Notch and NFκB Pathways. Mol Biol Cell. 14 (2), 491-502 (2003).
  21. Wang, Z., Li, Y., Sarkar, F. Notch Signaling Proteins: Legitimate Targets for Cancer Therapy. Curr Prot Peptide Sci. 11 (6), 398-408 (2010).
  22. Zhou, Z., et al. PP121 suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and LPS-Induced bone resorption in vivo. Exp Cell Res. 388 (2), 111857(2020).
  23. Shah, M. A. A., et al. Regional distribution of microvasculature within the canine femoral head: a study of plastinated tissue histology and 3D reconstruction. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  24. Clayden, E. C. Practical Section Cutting and Staining. , Churchill. (1955).
  25. McHorney, C. A., Schousboe, J. T., Cline, R. R., Weiss, T. W. The impact of osteoporosis medication beliefs and side-effect experiences on non-adherence to oral bisphosphonates ates. Curr Med Res Opin. 24 (3), 707-708 (2008).
  26. Canalis, E. Notch in skeletal physiology and disease. Osteoporosis Int. 29 (12), 2611-2621 (2018).
  27. Zanotti, S., Canalis, E. Notch Signaling and the Skeleton. Endocrine Rev. 37 (3), 223-253 (2016).
  28. Grevers, L. C., et al. Immune complex-induced inhibition of osteoclastogenesis is mediated via activating but not inhibitory Fcγ receptors on myeloid precursor cells. Ann Rheumatic Dis. 72 (2), 278-285 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Weber, J. M., Calvi, L. M. Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Bone. 46 (2), 281-285 (2010).
  31. Kovtonyuk, L. V., Fritsch, K., Feng, X., Manz, M. G., Takizawa, H. Inflamm-Aging of Hematopoiesis, Hematopoietic Stem Cells, and the Bone Marrow Microenvironment. Front Immunol. 7, (2016).
  32. Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabet Endocrinol. 5 (11), 898-907 (2017).
  33. Reid, I. R. Efficacy, effectiveness and side effects of medications used to prevent fractures. J Inter Med. 277 (6), 690-706 (2015).
  34. Cosman, F., et al. Clinician's Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporosis Int. 25 (10), 2359-2381 (2014).
  35. Chen, Y. H., et al. Melatonin protects against lipopolysaccharide-induced intra-uterine fetal death and growth retardation in mice. J Pineal Res. 40 (1), 40-47 (2005).
  36. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Investigat. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  37. Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal Osteoporosis. New Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  38. Eastell, R., et al. Pharmacological Management of Osteoporosis in Postmenopausal Women: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metabol. 104 (5), 1595-1622 (2019).
  39. Leder, B. Z. Optimizing Sequential and Combined Anabolic and Antiresorptive Osteoporosis Therapy. JBMR Plus. 2 (2), 62-66 (2018).
  40. Grey, A., Bolland, M., Cundy, T. Maintaining Order in Osteoporosis Treatments. Journal of Bone Miner Res. 32 (5), 1147-1147 (2017).
  41. McClung, M. R. Role of bone-forming agents in the management of osteoporosis. Aging Clin Exp Re. 33 (4), 775-791 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تثبيط تكوين ناقضات العظمLY900009ناقضات العظم المستحثة بـ RANKLارتشاح العظمبلاعم نخاع العظملطخة ويسترنصبغ TRAPمسار MAPK Akt
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.