تم إجراء جميع التجارب على وفقا للمعايير الأخلاقية لحيوانات التجارب التي وضعها قسم العلوم والتكنولوجيا في معهد سيتشوان العالي للطب الصيني التقليدي (رقم الموافقة: 2023DS01). يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.
1. التصميم والإجراءات التجريبية
تم إيواء ستة وثلاثين من الذكور ، وعمرها 12 أسبوعا من فئران CD-Sprague-Dawley وتزويدها بتغذية ad libitum طوال الفترة التجريبية. تم الحفاظ على البيئة عند درجة حرارة 20-25 درجة مئوية ومستوى رطوبة 50٪ -60٪ ، مع دورة ضوئية / داكنة لمدة 12 ساعة.
- تصميم المجموعة
بعد أسبوع من التغذية التكيفية ، تم تعيين الفئران بشكل عشوائي إما إلى مجموعة تحكم (Con ، n = 6) أو مجموعة تمرين شاملة (EE ، ن = 30). خضعت الفئران في مجموعة EE لتدريب التكيف من خلال الجري بسرعة 10 م / دقيقة لمدة 15 دقيقة على جهاز المشي الشاق مع ميل 10 درجات لمدة ثلاثة أيام. بعد التدريب التكيفي ، تم تقسيم مجموعة EE إلى خمس مجموعات زمنية فرعية: 0 ساعة ، 6 ساعات ، 12 ساعة ، 24 ساعة ، و 48 ساعة بعد التمرين الشامل.
- إجراء التدخل
لم تمارس الفئران في المجموعة الضابطة ، بينما خضعت الفئران في مجموعة EE للجري الشامل على جهاز المشي الشاق عند منحدر 10 درجات (الشكل 1 أ). باتباع بروتوكول بيدفورد9 ، تم تقسيم حمل التمرين إلى ثلاثة مستويات: المستوى 1 عند 10 م / دقيقة لمدة 15 دقيقة ، والمستوى 2 عند 15 م / دقيقة لمدة 15 دقيقة ، والمستوى 3 عند 20 م / دقيقة حتى الإرهاق (الشكل 1 ب). تم تحديد الإرهاق عندما لم يعد الجرذ قادرا على الجري وظل عالقا على المسار ثلاث مرات خلال فترة أقل من 1 دقيقةو 10 ، على الرغم من تكرار الكهرباء منخفضة الكثافة (150 فولت ، 0.5 مللي أمبير تيار متردد) وتحفيز الصوت (70 ديسيبل).
تم التضحية بالفئران عن طريق الحقن المفرط داخل الصفاق بنسبة 3٪ بنتوباربيتال الصوديوم (200 مجم / كجم) في الأوقات المحددة (0 ساعة ، 6 ساعات ، 12 ساعة ، 24 ساعة ، و 48 ساعة بعد التمرين). تم تشريح الجلد والأنسجة تحت الجلد للعقبي بعناية ، وتم قطع وتر العرقوب 2 سم فوق العقبي بمقص العيون. تم حفظ العقبي الأيمن (بما في ذلك وتر العرقوب المرفق) في 4٪ بارافورمالديهايد للفحص النسيجي المرضي والاختبار الكيميائي المناعي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تخزين ثلاث عينات عشوائية من الجانب الأيسر في محلول 2٪ بارافورمالديهايد -2.5٪ جلوتارالديهايد للفحص المجهري الإلكتروني لدراسة التغيرات الفوقية ( الشكل 1 ج).
2. أنسجة تقاطع الأوتار والعظام
تم تثبيت العينات في 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 48 ساعة وإزالة الكلس بنسبة 15٪ EDTA لمدة 4 أسابيع في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) ، مع تغيير المحلول يوميا. انتهت عملية إزالة الكلس عندما يمكن ثقب العظم بسهولة بواسطة إبرة دون استخدام أي قوة. بعد إزالة الكلس ، خضعت العينات للجفاف من خلال عملية آلية تتضمن سلسلة متدرجة من الإيثانول والزيلين ، تليها ثلاث غسلات مع PBS. تم تضمين العينات في البارافين بشكل ساهمي وتقسيمها عند 5 ميكرومتر. تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين وفقا للإجراءات القياسية ، وتم التقاط الصور باستخدام نظام الكاميرا الدقيقة ثلاثية العينين الرقمي Panthera بتكبير 20× و 40×.
3. المسح المجهري الإلكتروني
تم مسبوقة العينات اليسرى ب 2٪ بارافورمالديهايد -2.5٪ جلوتارالديهايد لمدة 48 ساعة ، ثم تم تجفيفها في سلسلة من محاليل الأسيتون ، وتسلل في محلل معالجة الايبوكسي ، وجزءا لا يتجزأ من القوس. تم تلطيخ المقاطع شبه الرقيقة باستخدام الميثيلين الأزرق لتحديد منطقة تقاطع الأوتار والعظام. تم قطع المقاطع فائقة النحافة ، التي يبلغ سمكها حوالي 60-90 نانومتر ، باستخدام سكين ماسي. تم تلطيخ هذه الأقسام بخلات اليورانيل لمدة 10-15 دقيقة ، تليها سترات الرصاص لمدة 1-2 دقيقة. تم فحص الأقسام تحت مجهر إلكتروني ناقل الحركة بتكبير 6000× و 12000× و 25000×.
4. الفحص الكيميائي المناعي
تم إزالة الكلس بشكل روتيني وتقسيمها بين الوتر والعظام كما هو موضح سابقا. بعد الحضانة بمحلول استرجاع مستضد السترات العازلة لمدة 10 دقائق ، تمت معالجة العينات ب 3٪ H2O2 لمدة 10 دقائق لمنع نشاط البيروكسيديز الداخلي ، متبوعا بالحجب باستخدام مصل الماعز الطبيعي لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية ، ثم تم تحضين الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ، بما في ذلك GRP78 (1: 100) ، CHOP (1:100) ، و Caspase-12 (1:100). بعد ذلك ، تم تحضين العينات بأجسام مضادة ثانوية لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية. تم تحقيق تطوير اللون باستخدام DAB لمدة 8 دقائق عند 25 درجة مئوية ، مما أدى إلى إشارة إيجابية بنية صفراء. تم تلطيخ النوى بالهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق ، وتم استخدام برنامج Image-Pro Plus 6.0 لتحليل متوسط الكثافة. تم اختيار ثلاث مناطق ذات أهمية في منطقة تقاطع الأوتار والعظام (الأوتار والغضروف الليفي والغضروف الليفي المعدني) للتحليل ، وتم حساب متوسط القيمة.
5. التحليل الإحصائي
تم استخدام GraphPad Prism 8 لتحليل البيانات وإنشاء الرسوم البيانية. يتم التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. تم إجراء مقارنات بين المجموعات المختلفة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه ، واستخدم اختبار الفرق الأقل دلالة (LSD) للمقارنات الزوجية. واعتبرت قيمة P البالغة < 0.05 ذات دلالة إحصائية.