Shrinky - دينك قطرة الشنق : وسيلة بسيطة إلى نموذج الثقافة والأجرام مضغي الشكل

ملخص

نعرض طريقة بسيطة وسريعة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار وصيانتها microfabricated للتنمية الجسم مضغي الشكل.

الملخص

الهيئات مضغي الشكل (EB) هي مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية. الطريقة الأكثر شيوعا لإنشاء هذه المجاميع هو الأسلوب قطرة شنقا ، نهجا شاقة من pipetting عدد التعسفي من الخلايا في لوحات جيدا. التفاعلات بين الخلايا الجذعية يجبرن على مقربة من بعضها البعض يروج لجيل من EBS. لأن وسائل الإعلام في كل من الآبار والتي يتم تبادلها يدويا كل يوم ، وهذا النهج هو مكثفة يدويا.

وعلاوة على ذلك ، لأن المعايير البيئية بما في ذلك خلية خلية ، والتفاعلات عامل الخلية القابلة للذوبان ، ودرجة الحموضة ، وتوافر الأكسجين ويمكن لحجم المهام EB ، يمكن الحصول عليها من السكان الخلية التقليدية قطرات شنقا حتى عندما تختلف بشكل كبير مثقف في ظل ظروف مماثلة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة حقا أن العدد الأولي من الخلايا التي تشكل مجموع يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على تمايز الخلايا الجذعية. طورنا طريقة بسيطة الثقافة وسريعة ، وقابلة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار وصيانتها microfabricated للتنمية الجسم مضغي الشكل. أخيرا ، فإن هذه الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة لمزيد من التحليل والتجريب. هذه الطريقة هي قابلة لأي مختبر ويتطلب أي معدات متخصصة. نظهر هذا الأسلوب من خلال إنشاء هيئات مضغي الشكل باستخدام الخلايا الحمراء الفلورسنت الماوس سطر (129S6B6 - F1).

البروتوكول

1. صنع قالب Shrinky - دينك

1. طباعة النمط المطلوب على shrinky - دينك ورقة باستخدام الطابعة تعريف جيد.
2. خبز shrinky - دينك ورقة في 163 درجة مئوية لمدة حوالي 10 دقيقة حتى ، أو تقلصت بشكل كامل وبعد أن حصلت على شكل منتظم.
3. بعد shrinky - دينك العفن هدأت ، يغرق في حمام الأيزوبروبانول حتى بالكاد يغطي سطح كاملة.
4. بعناية ، رش بعض الأسيتون على العفن ويهز الحاويات عدة مرات. لإضافة المزيد من الأيزوبروبانول تغسل الزائدة الأسيتون وكرر هذه الخطوة عدة مرات حتى shrinky العفن تبدو نظيفة.
5. تزج العفن في الماء المقطر لمدة 10 دقيقة ليغسل المتبقية أي مذيب عضوي.
6. الهواء النظيف shrinky العفن. إعادة الحرارة لمدة حوالي 5 دقائق على 163 درجة مئوية وهذا الحبر المدمجة وتتبخر أي مذيب المتبقية.

2. جعل PDMS microwells

1. إعداد 10:01 PDMS خليط كيل / علاج ، وتستنهض الهمم بقوة لبضع دقائق.
2. مكان shrinky - دينك العفن في طبق بتري الصغيرة. يصب الخليط PDMS حتى يصل حوالي 1 / 2 سم فوق سطح القالب.
3. طبق في ظل فراغ الجرس للقضاء على جميع الفقاعات من خليط PDMS.
4. طبق مكان في الفرن عند 70 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
5. قطع PDMS الصلبة من العفن وربط لشريحة الزجاج فقط من خلال ممارسة الضغط.
6. تجاهل first microwell رقاقة ، لأنه بقايا الحبر incrusted بين PDMS.
7. كرر هذا الإجراء لإنتاج شريحة الثانية التي هي خالية من الحبر ، وشكل أكثر تحديدا.
8. تنظيف رقاقة microwell باستخدام 70 ٪ حل الايثانول. وضعه تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق لتعقيم عليه.

3. محاصرة الخلايا في microwells

1. عدد الخلايا وتخفيف لهم في وسائل الاعلام الى التركيز الثقافة المطلوب (اعتمادا على كيفية العديد من الخلايا الأولية في الآبار التي ترغب). اعتدنا على سبيل المثال ، للحصول على ما يقرب من 10-15 في الخلايا بشكل جيد (متوسط ​​= 11 ، SD = 5.4 ، ومعدل التحميل = 93 ٪) ، وتركيز 8 × 10 ⁴ خلايا / مل. لتركيز 17 × 10 ⁴ خلايا / مل ، يمكن أن نحصل موثوق بين 25 و 35 خلايا لكل بئر (متوسط ​​= 27.17857 SD = 7.7 ، ومعدل التحميل = 100 ٪).
2. المكان بعناية microwell رقاقة الطرد المركزي في أنبوب 50 مل تحتوي على قاعدة PDMS طدت.
3. إضافة حوالي مل 2JDP من الحل الخلية.
4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في الدقيقة 760 ، و 4 درجات مئوية.
5. الماصة من حل الزائدة وغسل بعناية microwell مع الحل 1X PBS.
6. microwell مكان في صحن بيتري الصغيرة ، والحرص أثناء تناول شريحة من أنبوب الطرد المركزي.
7. غسل الزائد باستخدام خلية 1 حل PBS X.
8. مكان microwell رقاقة تحت مجهر مقلوب للتحقق من عدد من الخلايا المقصود لكل بئر.
9. احتضان microwell تحتوي على خلايا في الظروف القياسية.
   
   

4. خلية الحضانة

1. اتباع بروتوكول EB طبيعي في المختبر.
2. تغيير المتوسطة ببطء من جانب الغرفة ، وتجنب تعكير خلية في microwell.

المناقشة

طورنا طريقة بسيطة الثقافة وسريعة ، وقابلة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار microfabricated (مصبوب من Dinks - Shrinky) والمحافظة عليها من أجل التنمية الجسم مضغي الشكل. أخيرا ، فإن هذه الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة لمزيد من التحليل والتجريب. هذه الطريقة هي قابلة لأي مختبر ويتطلب أي معدات مخصصة لأننا تغني عن الحاجة إلى ضوئيه. يمكننا أن يختلف حجم microwells فضلا عن تركيز خلايا / بئرا لتغيير عدد وحجم الهيئات مضغي الشكل.

المواد

لوسائل الإعلام مسك (مكلوسكي مختبر بروتوكول) : (مجموع وسائل الإعلام على استعداد : 50ml ؛ 100ML) KO DMEM : 40.8ml ؛ 81.6ml KSR 15 ٪ : 7.5ml ؛ 15ml - 1X بن بكتيريا : 0.5 مل ؛ 1ml 2mm والجلوتامين L - : 0.5 مل ؛ NEAA 1ml : 0.5 مل ؛ 1ml LIF : 100ul ؛ 200ul BMP - 4 (10ng/ml) : 50ul ؛ 100ul المخففة BME : 50ul ؛ 100ul (إضافة 35ul من العقيمة BME المصفاة ل5ml من برنامج تلفزيوني وتصفية تعقيم المحاقن تجاهل بعد 2 أسابيع. تركيز النهائي في الحل هو 0.1 ملم)