مقالة منهجية

نموذج فأر حديثي الولادة لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر وعزل الصفيحة الاحترافية لتنميط الخلايا المناعية

DOI:

10.3791/69233

⸱

سبتمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول نموذج الفئران حديثي الولادة لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) والعزل اللاحق للخلايا المناعية الصفيحة المخصوصة من الأمعاء الدقيقة للفئران حديثي الولادة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الأمعاء والقولون الناخر هو مرض التهابي وخيم يصيب الأمعاء الوليدية يصيب الخدج في المقام الأول. يتميز NEC بإصابة ظهارية ، ودسبواج ميكروبي ، واستجابة مناعية غير منظمة ، مما يؤدي غالبا إلى نخر الأمعاء والتهاب جهازي. كانت نماذج الفئران التجريبية التي تلخص الجوانب الرئيسية للأمراض البشرية ضرورية في تعزيز فهمنا للآليات التي تدفع المرض وتعلم التطور العلاجي. يصف هذا البروتوكول نموذجا راسخا للفئران حديثي الولادة لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) باستخدام التغذية بالحليب الصناعي ، ونقص الأكسجة المتقطع ، وإعطاء عديدات السكاريد الدهنية عن طريق الفم (LPS) ، والبكتيريا المعوية المستزرعة من رضيع مصاب ب NEC. يحفز هذا المزيج بشكل موثوق السمات النسيجية والنسخية والمناعية المتوافقة مع NEC عند الرضع من البشر وكان أساسيا في العديد من الاكتشافات الرئيسية في هذا المجال. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا المناعية عن الصفيحة المعوية الدقيقة للفئران حديثي الولادة. يتيح عزل خلايا Lamina propria التنميط التفصيلي للخلايا المناعية عبر قياس التدفق الخلوي ، مما يسهل تحليل كل من مجموعات الخلايا الفطرية والتكيفية داخل الأمعاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو مرض التهابي حاد يصيب الأمعاء يصيب الأطفال حديثي الولادة بشكل حصري تقريبا. سيتأثر ما يقرب من 7٪ -8٪ من الأطفال منخفضي الوزن عند الولادة (<1500 غ) ب NEC ، ويمكن أن تقترب معدلات الوفيات المرتبطة بالمرض من 50٪ في حديثي الولادة الذين يحتاجون إلى تدخل جراحي1. لا يزال التسبب في NEC غير مفهوم بشكل كامل. ومع ذلك ، تشير الأدلة الحالية إلى أن NEC ينشأ من التقاء عوامل متعددة ، بما في ذلك الحاجز المعوي غير الناضج ، والإشارات المناعية غير المنظمة ، والميكروبيوم 2،3،4. يمكن أن يؤدي تقارب هذه العوامل إلى بدء وتفاقم الاستجابات الالتهابية في الأمعاء ، وعلى الأخص من خلال تنشيط المستقبل الشبيه بالحصيلة 4 (TLR4) ، مما يؤدي إلى تلف الظهارة وأنواع مختلفة من موت الخلايا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج والنخر5،6. الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم نموذج فأر قابل للتكرار وذو صلة من الناحية الفسيولوجية ل NEC يلخص التهاب الأمعاء والالتهاب الرئوي المعوي (غاز داخل جدار الأمعاء) لوحظ في حديثي الولادة من البشر ، مما يتيح التحقيق الميكانيكي في التسبب في المرض. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا المناعية عن صفيحة الأمعاء الدقيقة المخصوصة للفئران حديثي الولادة ، مما يسمح للباحثين بإجراء تنميط الخلايا المناعية عبر قياس التدفق الخلوي.

بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الأكبر حجما ، مثل الفئران حديثي الولادة أو الخنازيرالصغيرة 7،8 ، تقدم نماذج الفئران حديثي الولادة العديد من المزايا المميزة ، بما في ذلك التكلفة المنخفضة ، والوصول الأكبر إلى المعدلة وراثيا ، والقدرة على إجراء تجارب على مجموعات أكبر. تستخدم نماذج NEC الفئران في المقام الأول مزيجا من التغذية الاصطناعية والإجهاد البارد ونقص الأكسجة لمحاكاة الفيزيولوجيا المرضية المعقدة ل NEC التي لوحظت في المرضى البشريين7،8،9. ومع ذلك ، فإن العديد من نماذج الفئران الخاصة ب NEC محدودة باعتمادها على الضغوطات الميكروبية الواسعة أو التعديلات الاصطناعية للميكروبات ، مما قد يضر بأهميتها السريرية. في المقابل ، يتغلب النموذج الموصوف في هذا البروتوكول على هذه القيود من خلال دمج العديد من العوامل الرئيسية المتورطة في التسبب في مرض NEC عند الرضع من البشر10،11. على وجه التحديد ، يجمع هذا النموذج بين الإجهاد الناقص التأكسج ، والذي تورط في تعطيل سلامة الحاجز المعوي3،12 ، مع الإعطاء الفموي لحليب الأطفال المكمل بعديدات السكاريد الدهنية (LPS) ، وهو تجند TLR4 جيد الخصائص يسبب التهاب الأمعاء ، بالإضافة إلى الميكروبيوم الخلل الحيوي ذي الصلة سريريا مع البكتيريا المعوية المزروعة من مريض مصاب ب NEC totalis ، أشد أشكال المرض ، يتميز بنخر الأمعاء10،13. من خلال دمج هذه الضغوطات ذات الصلة سريريا والخاصة بالأمراض ، يعكس نموذجنا بدقة السمات السريرية والجزيئية ل NEC. علاوة على ذلك ، لتزويد الباحثين بإطار لاستجواب الآليات المناعية الكامنة وراء التسبب في NEC ، يحدد هذا البروتوكول عزل خلايا الصفيحة المخصوصة من الأمعاء الدقيقة لحديثي الولادة لتحليل قياس التدفق الخلوي. باعتبارها الموقع الرئيسي للنشاط المناعي للغشاء المخاطي المعوي ، تحتوي الصفيحة المخصوصة على ذخيرة ديناميكية من الخلايا المناعية المقيمة والمتسللة التي تلعب دورا مركزيا في الالتهاب المرتبط ب NEC14. يوفر قياس التدفق الخلوي منصة قوية وقابلة للتطوير لتوصيف مجموعات الخلايا المناعية هذه بدقة عالية ، مما يتيح التحليل التفصيلي للأنماط الظاهرية الخلوية ، والقياس الكمي للاستجابات المناعية ، وتحديد التوقيعات المناعية المتورطة في التسبب في NEC15.

يكمل نموذج NEC للفئران الموضح في هذا البروتوكول النماذج في المختبر من خلال تمكين دراسة تفاعلات الميكروبيوم المضيف والاستجابات المناعية والإشارات الالتهابية داخل البيئة المعقدة لأمعاء حديثي الولادة. إنه يعيد إنتاج الجوانب الرئيسية للتسبب في مرض NEC التي لا يمكن نمذجتها في المختبر ، مما يجعله أداة قيمة لتوضيح آليات المرض وتقييم الاستراتيجيات العلاجية. على الرغم من أن الاختلافات الخاصة بالأنواع لا تزال قيدا ، إلا أن هذا النموذج يوفر منصة قوية ويمكن الوصول إليها لتعزيز فهمنا ل NEC وتسريع تطوير التدخلات المستهدفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للإرشادات الأخلاقية التي قدمتها لجنة رعاية واستخدامها المؤسسية (IACUC) في جامعة نورث كارولينا في كلية الطب في تشابل هيل. تم تربية الفئران وصيانتها وإيوائها وفقا للإجراءات الموضحة في دليل رعاية واستخدام المختبر بموجب اقتراح دراسة معتمد من قبل IACUC (البروتوكول رقم 24-114) بجامعة نورث كارولينا في كلية الطب في تشابل هيل. تم استخدام الفئران C57BL / 6J لجميع التجارب الموصوفة في هذه الدراسة. بدأت الجراء في النموذج في يوم ما بعد الولادة 4 ، بوزن يتراوح بين 1.8-2.3 جم ؛ تم استبعاد خارج نطاق الوزن هذا. كان للمجموعات التجريبية توزيع جنسي متوازن ، حيث يشكل كل من الذكور والإناث حوالي 50٪ من المعالجة. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. نموذج NEC الفأر

ملاحظة: يتم إنتاج المخزون البكتيري المعوي عن طريق الحصول على المحتويات المعوية من الرضيع الذي كان يعاني من أشد أشكال NEC ، NEC totalis13،16. يتم استزراع المحتويات المعوية طوال الليل عند 1 × جم لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ويتم طردها بالطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإعادة تعليقها في 50٪ جلسرين. يتم سحب 20 ميكرولتر من الحصص في عبوات مبردة وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. تم اختيار أوقات الثقافة المختارة في هذا البروتوكول لكفاءة سير العمل. يمكن تعديل هذه النقاط الزمنية حسب الحاجة لاستيعاب الجداول المختبرية الفردية دون التأثير على النموذج العام. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين هذا البروتوكول لسعة قصوى تبلغ 40 فأرا ، ولكن يمكن توسيع نطاقه حسب الحاجة.

  1. تحضير الثقافة البكتيرية
    1. في اليوم التجريبي 0 الساعة 15:00 ، أضف 20 ميكرولتر من البكتيريا المعوية المزروعة من رضيع مصاب ب NEC totalis إلى أنبوب مزرعة 15 مل يحتوي على 2 مل من مرق Luria-Bertani (LB). احتضان المزرعة البكتيرية بغطاء الأنبوب في وضع التهوية في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية ، 1 × جم ، طوال الليل لمدة 16 ساعة ، واحتضان أنبوب مزرعة يحتوي على 2 مل فقط من مرق LB بشكل متزامن كعنصر تحكم لتقييم أي تلوث LB.
      1. تأكيد بصريا للثقافة بين عشية وضحاها من خلال مقارنة العكارة بين الثقافة البكتيرية والتحكم الواضح LB فقط ؛ تابع فقط إذا بدت المزرعة البكتيرية عكرة وظل التحكم واضحا.
    2. في اليوم التجريبي 1 ، الساعة 07:00 ، قم بإضافة 125 ميكرولتر من المزرعة الليلية الملقحة في قارورة زراعة الخلايا T75 بغطاء جيد التهوية يحتوي على 25 مل من مرق LB. قم بإعداد أربع قوارير T75 إجمالا واحتضانها في وضع رأسي في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية ، 1 × جم ، لمدة ساعتين لتوسيع المزرعة البكتيرية.
      ملاحظة: يتم تحضير الثقافات الليلية في الأيام التجريبية 0 و 1 و 2 من نموذج NEC.
  2. توزيع الجراء في مجموعات تجريبية
    1. في اليوم التجريبي 1 الساعة 07:00 ، قم بوزن 4 صغار بعد الولادة.
      ملاحظة: يتراوح نطاق الوزن الأمثل بين 1.8-2.3 جم ، ويجب إزالة القيم المتطرفة من التجربة.
    2. قم بتجميع الفئران التجريبية في مجموعات تتغذى على الحليب الصناعي وتتغذى على السد واحسب متوسط وزن الفئران التي تتغذى على الحليب الاصطناعي. افصل الفئران المخصصة التي تتغذى على الحليب الصناعي عن السد وضعها في قفص جديد موجود في حاضنة رضع مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. احتفظ بالجراء الذين يتغذون على السد في القفص الأصلي مع السد.
      ملاحظة: الفئران حديثي الولادة حساسة بشكل خاص للتغيرات في درجة الحرارة المحيطة. للحفاظ على تنظيم ثابت لدرجة الحرارة بعد الانفصال عن السد ، يتم الاحتفاظ بالجراء الذين يتغذون على الحليب الصناعي في حاضنة رضع يتم التحكم في درجة حرارتها عند 37 درجة مئوية. يتوافق هذا النهج مع بروتوكولات NEC المعمول بها التي تحافظ على درجة الحرارة الفسيولوجية دون استخدام تدخلات حرارية إضافية11،17،18،19.
    3. كرر ذلك في اليومين التجريبي 2 و 3 ، ووزن الفئران التي تتغذى على الحليب الصناعي وحساب متوسط الوزن قبل نقطة التغذية 07:00 يوميا.
  3. قياس الكثافة البصرية (OD) للثقافة البكتيرية
    1. بعد ساعتين من الحضانة عند 37 درجة مئوية و 1 × جم ، قم بإزالة قوارير T75 الأربعة مع المزرعة الموسعة من شاكر المداري في الأيام التجريبية 1 و 2 و 3. امزج محتويات قوارير T75 الأربعة، واخلطها جيدا، وقم بسحب 1 مل من المزرعة البكتيرية في كوفيت.
      1. قم بإعداد محلول فارغ عن طريق إضافة 1 مل من مرق LB المعقم إلى كوفيت. قم بقياس الكثافة البصرية للثقافة البكتيرية عند 600 نانومتر (OD600nm) باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
        ملاحظة: الهدف OD600nm هو 0.6 ± 0.02. إذا كان OD600nm للثقافة البكتيرية أقل من القيمة المستهدفة ، فاستمر في الحضانة كما هو موضح في الخطوة 1.3.1. حتى يتم الوصول إلى الهدف OD600 نانومتر من 0.6 ± 0.02. إذا كان OD600nm يزيد عن 0.6 ، فقم بتخفيف الثقافة البكتيرية بمرق LB المعقم.
    2. انقل 80 مل من المزرعة البكتيرية إلى أنبوبين للطرد المركزي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تأكد من الثقافة الناجحة عن طريق التحقق من وجود حبيبات مرئية في الجزء السفلي من كل أنبوب.
  4. تحضير الصيغة
    1. ابدأ تحضير الصيغة في الساعة 09:00 في الأيام التجريبية 1 و 2 و 3. امزج 16 مل من حليب الأطفال و 8 مل من حليب الجراء بنسبة 2: 1 في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
    2. قم بإزالة المادة الطافية من أنبوبي الطرد المركزي سعة 50 مل اللذين يحتويان على مزرعة بكتيرية محببة (الخطوة 1.3.2).
    3. أعد تعليق كل من الحبيبتين تماما في 2 مل من مزيج التركيبة وانقل إعادة التعليق إلى مزيج التركيبة لعمل 24 مل من تركيبة NEC.
      ملاحظة: يجب أن يكون التركيز البكتيري النهائي في صيغة NEC بين 4 و 5 × 109 CFU / مل.
    4. ضع ستة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل لكل نقطة من نقاط وقت التغذية الست (10:00 ، 13:00 ، 16:00 ، 19:00 ، 22:00 ، 07:00).
    5. ماصة 4 مل من تركيبة NEC في كل أنبوب مصنف.
    6. قم بإعداد ستة حصص تستخدم مرة واحدة من مخزون LPS (5 مجم / مل) وقم بتخزينها في أنابيب دقيقة منخفضة الارتباط عند -20 درجة مئوية. أضف LPS (انظر الملاحظة للتركيز) إلى تركيبة NEC مباشرة قبل الرضاعة في كل نقطة زمنية.
      ملاحظة: تعتمد كمية LPS المضافة إلى صيغة NEC على متوسط وزن جسم الجراء الذين يتغذون على الصيغة المحسوبة في الساعة 07:00 كل يوم ، باستخدام جرعة 5 ميكروغرام من LPS لكل جرام من وزن جسم الجراء. يختلف تركيز LPS النهائي باختلاف وزن الجسم. على سبيل المثال ، مع حجم تغذية يبلغ 80 ميكرولتر ومتوسط وزن مجموعة الجرو 2 جرام ، سيكون تركيز LPS في الصيغة 0.125 مجم / مل.
  5. إطعام
    ملاحظة: في اليوم التجريبي 1 ، يتم صيام الفئران المراد وضعها في نموذج NEC لمدة 3 ساعات بعد الانفصال عن سدها. أول تغذية لتركيبة NEC في الساعة 10:00 وتستمر كل 3 ساعات حتى الساعة 22:00. في اليومين التجريبي 2 و 3 ، يتم تغذية الفئران في الساعة 07:00 و 10:00 و 13:00 و 16:00 و 19:00 و 22:00. لا يتم إطعام الفئران في اليوم التجريبي 4.
    1. مباشرة قبل إطعام الفئران ، قم بإذابة الجليد والدوامة حصة واحدة من LPS لمدة 15 ثانية. أضف الكمية المناسبة من LPS بناء على متوسط وزن الفئران إلى الأنبوب المعد 4 مل من تركيبة NEC (انظر الخطوة 1.4.6 للحساب) واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات.
    2. املأ حقنة سعة 1 مل بتركيبة NEC وإرفاق خط قسطرة مركزية لحديثي الولادة يتم إدخالها محيطيا (PICC). تأكد من عدم وجود فقاعات أو هواء في المحقنة أو خط المركز الدولي للصدمة المدخلة طرفيا.
    3. قم بتطبيق تركيبة NEC للصغار عن طريق التزقيم الفموي باستخدام خط القسطرة المدخلة طرفيا (PICC).
      1. كبح جماح كل جرو برفق من الجلد المترهل عند قاعدة رقبته وأمسك الماوس في وضع رأسي. باستخدام الملقط ، قم بتوجيه الطرف البعيد لخط المركز المدخلي الصيني إلى البلعوم الفموي والمريء ، مع وضع طرف خط القسطرة المدخلة طرفيا داخل المعدة.
        ملاحظة: مسافة إدخال خط المركز المدخلي طرفيا تساوي المسافة من زاوية الفم إلى أعلى بقعة الحليب في المعدة. يجب بعد ذلك وضع علامة واضحة على نقطة الإدخال المثلى على خط الدخل المدخلي الدولي باستخدام علامة دائمة.
      2. إذا شعرت بمقاومة كبيرة أثناء إدخال خط النقطة المركزية المدخلة طرفيا ، فقم بإزالة خط النقطة المركزية المدخلة طرفيا ، وأعد موضعها ، وأعد محاولة الإدخال بعناية.
      3. قم بتوزيع 8 ميكرولتر من تركيبة NEC ببطء في المعدة ، وراقب الجرو عن كثب طوال فترة الرضاعة بحثا عن علامات الشفط. راقب ظهور بقعة حليب بيضاء لتأكيد الولادة المعدية الناجحة.
      4. قم بإزالة خط التوصية المؤدخلة طرفيا (PICC). راقب الجرو بحثا عن أي صعوبة في التنفس أو القيء. إذا كان الجرو يتقيأ التركيبة ، فقم بمسح الفم والأنف بمسحة معملية منخفضة النسالة.
    4. كرر هذه العملية في كل نقطة زمنية للتغذية.
    5. مرتين يوميا ، أخضع الجراء لنقص الأكسجة لمدة 10 دقائق مباشرة بعد أوقات الرضاعة 13:00 و 19:00.
      1. بعد وجبتين يوميا ، ضع الجراء في غرفة نقص الأكسجة متصلة بخزان غاز يحتوي على 95٪ نيتروجين و 5٪ أكسجين. افتح صمام الخزان وراقب مستويات الأكسجين داخل غرفة نقص الأكسجة محكمة الغلق باستخدام جهاز مراقبة محمول. بمجرد أن تصل غرفة نقص الأكسجة إلى 5٪ ± 0.5٪ أكسجين ، حافظ على الجراء عند مستوى الأكسجين هذا لمدة 10 دقائق.
        ملاحظة: يجب تحسين معدل التدفق لتقليل الأكسجين من 20٪ إلى 5٪ بمعدل ثابت ويتم التحكم فيه على مدى 2 دقيقة.
    6. راقب صغار الفئران بين الوجبات بحثا عن أي علامات لضائقة التنفس أو تغير اللون الباهت أو توقف التنفس أثناء التنفس. في حالة وجود هذه العلامات ، قم بإزالة الجرو المصاب من غرفة نقص الأكسجة ، وراقب بعناية الشفاء ، وإذا لزم الأمر ، قم بالقتل الرحيم للصغار وفقا لسياسة IACUC.
    7. استمر في تغذية التزقيم الفموي والتعرض لنقص الأكسجة في نقاط زمنية مجدولة لمدة 72 ساعة كاملة لنموذج NEC.
      ملاحظة: إذا بدأ اليوم التجريبي 1 يوم الاثنين الساعة 10:00، فستحدث نقطة نهاية 72 ساعة في الساعة 10:00 يوم الخميس. تم تعيين هذا كيوم 4 من النموذج. لا يتم إطعام الفئران في الساعة 07:00 في اليوم 4 من النموذج ، ويتم القتل الرحيم في هذه النقطة الزمنية الأخيرة 10:00 لجمع الأنسجة.
  6. القتل الرحيم للحيوانات وجمع الأنسجة
    1. في صباح اليوم 4 من النموذج ، قم بوزن وتسجيل جنس كل جرو ، ثم قم بالقتل الرحيم وفقا لإرشادات IACUC.
    2. بعد القتل الرحيم ، اجمع الدم من كل جرو في أنبوب فاصل مصل يحتوي على منشط جلطة وجل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لفصل المصل. قم بوضع المصل في أنابيب 1.7 مل وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    4. قم بعمل شق خط الوسط بطول 1-2 سم من خلال جدار البطن والصفاق لفضح الجهاز الهضمي. افحص الأمعاء المكشوفة بحثا عن السمات المميزة ل NEC ، بما في ذلك الانتفاخ والحمامي وتراكم الغازات داخل جدار الأمعاء (الالتهاب الرئوي المعوي) وفقاعات الهواء المرئية.
    5. تحديد واستئصال الاثني عشر من خلال المستقيم البعيد. ضع المنديل في طبق بتري على الثلج. استخدم محلول ملحي مبرد بالفوسفات المثلج (PBS) لشطف الأمعاء.
    6. حدد الأعور وقطعه عن كثب لفصل الأعور والقولون عن الأمعاء الدقيقة. قم بتقسيم القطع بدءا من الدقاق البعيد والعمل باتجاه الصائم. ضع قطعة 1 سم في أنبوب يحتوي على مخزن تحلل الحمض النووي الريبي وخرز أكسيد الزركونيوم 1.5 مم على الجليد لتحليل النسخ.
      1. اغسل قطعة مقاس 1.5 سم بحقنة تحتوي على PBS متصلة بإبرة حادة 24 جم ، ثم ضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). قم بتجميد قطعة من الأمعاء بطول 1 سم وخزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لتحليل البروتين. قم بتجميد قطعة من الأمعاء بحجم 1 سم وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لأي فحوصات إضافية.
    7. معالجة الأنسجة التي تم جمعها في مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي في مضرب حبة (5.50 م / ث ، 1.0 دقيقة ، دورة = 1.0 ، توقف مؤقت: 10 ثوان ، 4 درجات مئوية) لتجانس الأنسجة ، ثم تخزينها عند -80 درجة مئوية.
  7. تثبيت الأنسجة
    1. ضع قطع المناديل المجمعة في 4٪ PFA على هزاز عند 4 درجات مئوية لتثبيتها لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة 4٪ PFA من كل أنبوب واستبدله ب 1 مل PBS لغسل الأنسجة. أعد الأنابيب إلى الروك عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. كرر غسل PBS مرة واحدة.
      1. قم بإزالة PBS وأضف 1 مل من 50٪ إيثانول إلى كل أنبوب وأعد الأنابيب إلى الروك عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 50٪ وأضف 1 مل من 70٪ إيثانول ، واحفظه عند 4 درجات مئوية حتى يمكن معالجة الأنسجة في كتل أنسجة البارافين.
        ملاحظة: يمكن جمع أجزاء معوية إضافية أو عينات براز حسب الحاجة لمزيد من التحليل.

2. عزل الخلايا المناعية الصفيحة المخصوصة

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لعزل خلايا الصفيحة المخصوصة من الفئران حديثي الولادة في عمر أسبوع واحد تقريبا. إذا كانت هناك حاجة إلى عينات مرجعية لقياس التدفق الخلوي الطيفي ، فيمكن استخدام الفطام (أسابيع ما بعد الولادة 3-4). بالنسبة لعينات الفطام ، ضاعف جميع أحجام الكاشف المحددة في البروتوكول.

  1. تحضير الكواشف
    1. قم بإعداد محلول الملح المتوازن من هانك 1x بدون Ca2+ و Mg2+ (HBSS W / O) يحتوي على 10mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإعداد مخزن مؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورسنت (FACS) عن طريق إذابة 5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS + 5 ملي مولار حمض إيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
    3. في اليوم السابق لإجراء عزل خلايا الصفيحة المخصوصة ، قم بإعداد محلول ما قبل الهضم عن طريق إضافة 5 ملي مولار EDTA ، و 5٪ مصل أبقار الجنين (FBS) ، و 1 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) إلى HBSS W / O.
    4. قم بإعداد محلول الهضم مباشرة قبل إجراء عزل خلايا الصفيحة المخصوصة عن طريق استكمال وسط معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI) مع 10٪ FBS و mg / ml الكولاجيناز الوريدي.
      ملاحظة: يمكن تحضير HBSS W / O مسبقا وتخزينه في درجة حرارة الغرفة. يجب تحضير المخزن المؤقت FACS مسبقا وتخزينه عند 4 درجات مئوية. يجب تحضير محاليل ما قبل الهضم والهضم طازجة مباشرة قبل إجراء عزل الصفيحة المخصوصة وحفظها على الثلج.
  2. جمع وتحضير الأنسجة المعوية للهضم
    1. حدد موقع الأعور وقم بتمريره بالقرب من إزالة الأعور والقولون. قم بإزالة 2-3 سم من الأمعاء الدقيقة البعيدة (الدقاق) وضعها على HBSS W / O المثلج في طبق بتري (استئناف من الخطوة 1.6.5).
    2. باستخدام إبرة حادة 24 جرام متصلة بحقنة ، اغسل تجويف الأمعاء تماما باستخدام HBSS W / O البارد مع تثبيت الأنسجة بالملقط. تأكد بصريا من خلو تجويف الأمعاء من البراز بعد التنظيف.
    3. قم بإزالة أي نسيج ضام متبقي من الجزء المعوي بعناية باستخدام ملقط أو مقص ناعم.
    4. قطع الأمعاء طوليا لفتحها ، ثم قسمها بشكل عرضي إلى 1-1. سم.
  3. تفكك الصفيحة المخصوصة
    1. انقل أجزاء الأمعاء إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1 مل يحتوي على 1 مل من محلول ما قبل الهضم الذي تم تبريده على الثلج.
    2. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع دوران مستمر لتسهيل تفكك الأنسجة.
    3. قم بتدوير الأنبوب برفق ، ثم اسكب المحتويات من خلال مصفاة خلوية 10 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل.
      ملاحظة: يحتوي المرشح الذي تم جمعه من خلال مصفاة 10 ميكرومتر على الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة (IELs) ويمكن استخدامه للتحليل النهائي إذا رغبت في ذلك.
    4. انقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من محلول الهضم المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، احتضان العينة لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الدوران المستمر.
    5. انقل العينة بأكملها إلى أنبوب تفكك الأنسجة الآلي وقم بتشغيل برنامج التفكك الذي يتكون من أربع دورات دوران مدة كل منها 15 ثانية ، بالتناوب بين اتجاهين عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة.
      ملاحظة: بديل لفصل الأنسجة الآلي هو طحن أنسجة الأمعاء يدويا باستخدام الأطراف المتجمدة لشريحتين مجهريتين. إذا كنت تستخدم هذه الطريقة ، فاستخدم ضغطا لطيفا ومتساويا لتجنب الإجهاد الميكانيكي المفرط ، حيث يمكن أن يقلل ذلك بشكل كبير من بقاء الخلية.
    6. قم بتدوير تعليق الخلية برفق ، ثم قم بالطرد المركزي للعينات في أنبوب تفكك الأنسجة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. استنشق المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات ، ثم أعد تعليق الخلايا في مل من المخزن المؤقت FACS البارد.
    8. ضع مصفاة خلية 10 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل. انقل تعليق الخلية المعلق عبر الفلتر ، ثم اغسل الفلتر بمل إضافي من المخزن المؤقت FACS المثلج.
    9. عد الخلايا وقم بتقييم الجدوى باستخدام صبغة التربان الزرقاء أو صبغة الصلاحية. جهاز طرد مركزي الحجم المطلوب لقياس التدفق الخلوي عند 30 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استخدم الخلايا على الفور للتطبيقات النهائية للحفاظ على الجدوى وتعبير العلامة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يكرر نموذج الفئران حديثي الولادة ل NEC الموصوف في هذا البروتوكول السمات الرئيسية للمرض. كشف تحليل البقاء على قيد الحياة في كابلان ماير (الشكل 1 أ) عن انخفاض كبير في البقاء على قيد الحياة في مجموعة علاج NEC مقارنة بالضوابط التي تتغذى على السد (9/21 مقابل 8/8 ؛ 9/21 مقابل 8/8 ؛ 9/21 مقابل 8/8 ؛ 9/21 مقابل 8/8 ؛ ص = 0.0063). أظهر الفحص الإجمالي للأمعاء من الفئران التي تعرضت للنموذج (الشكل 1 ب) السمات المميزة ل NEC ، بما في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يدمج هذا البروتوكول نموذج الفئران لحديثي الولادة ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية ل NEC مع عزل الخلايا المناعية للصفيحة المخصوصة ، مما يوفر منصة شاملة للتحقيق في الاستجابات المناعية المخاطية أثناء التهاب الأمعاء. من خلال الجمع بين التعرضات ذات الصلة سريريا ، مثل الميكروبيوم المعوي من حالات NEC البشرية ، والإجهاد الناقص لتأكسج الأكسجين ، والتغذية بالحليب الصناعي ، يلخص هذا النموذج التسبب المعقد ومتعدد العوامل الذي لوحظ في الأمراض البشرية10،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه المخطوطة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه المخطوطة من قبل R01DK124614 و R01HD105301 و DP1DK140012 ، ومنحة مبادرة تشان زوكربيرج رقم 2022-316749 ، وجائزة يانغ للباحث في الطب الحيوي ، وجامعة نورث كارولينا في قسم طب الأطفال في تشابل هيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

```html

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Syringe for formula feeding
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-free
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serum Tube
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Puppy Milk
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
  2. Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neonatal Med. 21 (6), 394-399 (2016).
  3. Rose, A. T., Patel, R. M. A critical analysis of risk factors for necrotizing enterocolitis. Semin Fetal Neonatal Med. 23 (6), 374-379 (2018).
  4. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Modeling the innate immune response. Am J Pathol. 185 (1), 4-16 (2015).
  5. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair1. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  6. Hackam, D. J., Sodhi, C. P. Toll-like receptor-mediated intestinal inflammatory imbalance in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 6 (2), 229-238.e1 (2018).
  7. Sulistyo, A., Rahman, A., Biouss, G., Antounians, L., Zani, A. Animal models of necrotizing enterocolitis: Review of the literature and state of the art. Innov Surg Sci. 3 (2), 87-92 (2018).
  8. Lopez, C. M., et al. Models of necrotizing enterocolitis. Semin Perinatol. 47 (1), 151695(2023).
  9. Jilling, T., et al. The roles of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 177 (5), 3273-3282 (2006).
  10. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A mouse model of necrotizing enterocolitis. Methods Mol Biol. 2321, 101-110 (2021).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protoc. 2 (4), 100951(2021).
  12. Kaplina, A., et al. Necrotizing enterocolitis: The role of hypoxia, gut microbiome, and microbial metabolites. Int J Mol Sci. 24 (3), 2471(2023).
  13. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus hn001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: Evidence in mice for a role of TLR9. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  14. Denning, T. L., Bhatia, A. M., Kane, A. F., Patel, R. M., Denning, P. W. Pathogenesis of nec: Role of the innate and adaptive immune response. Semin Perinatol. 41 (1), 15-28 (2017).
  15. Yu, Y. -R. A., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLOS ONE. 11 (3), e0150606(2016).
  16. Mihi, B., et al. Interleukin-22 signaling attenuates necrotizing enterocolitis by promoting epithelial cell regeneration. Cell Rep Med. 2 (6), 100320(2021).
  17. Bautista, G. M., Cera, A. J., Chaaban, H., Mcelroy, S. J. State-of-the-art review and update of in vivo models of necrotizing enterocolitis. Front Pediatr. 11, 1161342(2023).
  18. Sodhi, C. P., et al. The human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 6'-sialyllactose protect against the development of necrotizing enterocolitis by inhibiting toll-like receptor 4 signaling. Pediatr Res. 89 (1), 91-101 (2021).
  19. Blum, L., Vincent, D., Boettcher, M., Knopf, J. Immunological aspects of necrotizing enterocolitis models: A review. Front Immunol. 15, 1434281(2024).
  20. Nolan, L. S., et al. Indole-3-carbinol-dependent aryl hydrocarbon receptor signaling attenuates the inflammatory response in experimental necrotizing enterocolitis. Immunohorizons. 5 (4), 193-209 (2021).
  21. Valle-Noguera, A., Gómez-Sánchez, M. J., Girard-Madoux, M. J. H., Cruz-Adalia, A. Optimized protocol for characterization of mouse gut innate lymphoid cells. Front Immunol. 11, 563414(2020).
  22. Booth, J. S., et al. Characterization and functional properties of gastric tissue-resident memory T cells from children, adults, and the elderly. Front Immunol. 5, 294(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة