مقالة منهجية

اختبار مصلي متعدد الإرسال للكشف عن استجابات الأجسام المضادة للفيروسات المفصلية

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69259

⸱

نوفمبر 4, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Infectious Diseases Epidemiology and Analytics G5 Unit, Department of Global Health, Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM U1347, 2Laboratory for Urgent Response to Biological Threats (CIBU), Environment and Infectious Risks (ERI) Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 3Immunology of Infectious Diseases Unit, Institut Pasteur de Madagascar, 4MRC Centre for Infectious Disease Analysis and Modelling, School of Public Health, Imperial College London, 5Immunophysiopathology and Infectious Diseases Department, Institut Pasteur de Dakar, 6Pasteur Network, Institut Pasteur, 7Department of Immunology, Institut Pasteur

في هذه المقالة

ملخص

أصبحت المقايسات المناعية الفلورية المتعددة مرجعا لاختبار الأمصال. ومع ذلك ، فإن تطبيقها محدود بسبب التعقيد وعمليات اقتران تحليل الخرزة التي تستغرق وقتا طويلا. يقدم هذا التقرير بروتوكول اقتران حبة الكرة المجهرية متعددة الإرسال شبه آلي وقابل للتكرار يمكن مقارنته بالطريقة القياسية مع تقليل الوقت اللازم لتحقيق النتائج بشكل كبير.

الملخص

الفيروسات التي تنقلها المفصليات (الفيروسات المفصلية) هي مجموعة من مسببات الأمراض التي ينقلها البعوض والتي يتم توزيعها عالميا. منذ تفشي فيروس زيكا في الأمريكتين في عام 2016 والذي أدى إلى توعية الجمهور بهذه الإصابات، لا تزال الفيروسات المفصلية تفرض عبئا كبيرا على الصحة العامة. ويعد ظهورها في المناطق التي لم تكن موبوءة سابقا سببا للقلق الصحي العام. تعد مراقبة ومكافحة العدوى الفيروسية المفصلية أولوية حاليا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، التي أطلقت خطة استراتيجية عالمية لمكافحة الأمراض الفيروسية المفصلية في عام 2024. أحدثت تقنية تعدد الإرسال® ثورة في مجال المراقبة المصلية ، مما سمح بالقياس المتزامن للأجسام المضادة المتعددة مع الحاجة إلى الحد الأدنى من حجم العينة. بناء على الخبرة في تطوير الاختبارات المصلية متعددة الإرسال ، تم تطوير اختبار متعدد الإرسال قائم على الخرزة للكشف عن الأجسام المضادة لمستضدات الفيروسات المفصلية. يشتمل الاختبار على مستضدات متعددة خاصة بالفيروسات المفصلية الشائعة ، بما في ذلك فيروسات حمى الضنك (DENV) والحمى الصفراء (YFV) وزيكا والشيكونغونيا (CHIKV). تم استخدام طريقة شبه آلية لربط المستضدات تساهميا بخرز الكرة المجهري. هذا البروتوكول الجديد فعال للغاية ، حيث يتيح اقتران ما يصل إلى 96 مستضدا في تجربة واحدة مع ضمان نتائج قابلة للتكرار. تم الحصول على بيانات متوسط شدة التألق (MFI) باستخدام نظام تصوير مضان سهل الاستخدام. عند تطبيقه على عينات المصل البشري من البلدان الموبوءة ، نتوقع أن يشكل هذا الاختبار أداة قوية لجهود المراقبة المصلية.

المقدمة

تتسبب فيروسات المفصلين بشكل جماعي في آلاف الوفيات كل عام. تنتقل هذه الفيروسات إلى البشر عن طريق المفصليات المصابة ، ومعظمها من البعوض والقراد. وتتنوع شدة العدوى الفيروسية المفصلية وتتراوح من العدوى التي لا تظهر عليها أعراض إلى المرض الشديد الذي يمكن أن يؤدي إلى الوفاة. في عام 2024 ، سجلت منظمة الصحة العالمية (WHO) أكثر من 10,000 حالة وفاة ناجمة عن الأنماط المصلية الأربعة لفيروس حمى الضنك (DENV) وحدها1. في نفس العام ، أصاب الفيروس أكثر من 14 مليون شخص ، بما في ذلك 50,000 حالة خطيرة1. في حين أن DENV هو الفيروس المفصلي الأبرز ، فإن المجموعة تشمل مسببات الأمراض الأخرى التي تهدد الحياة والتي كانت مسؤولة عن تفشي العديد من الفاشيات في جميع أنحاء العالم. وجدت مراجعة موجزة حديثة للعدوى الفيروسية المفصلية في إفريقيا أن هذه الفيروسات ، بما في ذلك فيروس حمى الضنك ، وفيروس الحمى الصفراء (YFV) ، وفيروس الشيكونغونيا (CHIKV) ، وفيروس حمى القرم والكونغو النزفية (CCHFV) ، وفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV) ، وفيروس غرب النيل (WNV) ، وفيروس زيكا (ZIKV) ، تسببت في 29 تفشيا على الأقل في جميع أنحاء القارة في عام 20232. وفي عام 2022، سلط تقرير نشره المكتب الإقليمي لمنظمة الصحة العالمية في أفريقيا الضوء على القيود الحالية في ترصد الفيروسات المفصلية في جميع أنحاء الإقليم، مشددا على الحاجة الملحة لتطوير طرائق لترصد الفيروسات المفصلية ومكافحتها3.

يمثل التشخيص السريري للعدوى الفيروسية المفصلية تحديا بسبب أوجه التشابه في الأعراض ، مثل الحمى والألم المفاصل والشعور بالضيق العام ، والتي تشترك في مسببات الأمراض الأخرى الموجودة في المناطق الموبوءة4. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للدوران المشترك والعدوى المشتركة للفيروسات ، فإن التمييز بين العامل الممرض المسبب للأمراض أمر صعب5. التأكيد المختبري أمر بالغ الأهمية للتشخيص التفريقي. توجد عدة طرق للكشف عن فيروسات الشجرة في العينات البشرية. تكشف الطرق المباشرة ، بما في ذلك اختبارات التشخيص الجزيئي ، والكشف عن المستضد الفيروسي ، والعزل الفيروسي ، عن وجود العامل الممرض ، بينما تقيس الطرق غير المباشرة ، مثل التشخيص المصلي ، الاستجابة المناعية للعدوى الفيروسية6.

تم تطوير عدد كبير من الطرق للكشف عن استجابات الأجسام المضادة للفيروسات المفصلية. وتشمل هذه المقايسات الممتزة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) ، والتثبيت التكميلي ، وتثبيط التراص الدموي ، والمقايسات المناعية للمحيط المجهري6،7. يقدم هذا التقرير مقايسة مناعة قائمة على الغلاف المجهري متعدد الإرسال (FMIA) للكشف عن استجابات الأجسام المضادة لمستضدات الفيروسات المفصلية. تستخدم المقايسات القائمة على الميكروسفير8 على نطاق واسع في علم الأمصال وتقدم العديد من المزايا ، أهمها القدرة على اكتشاف تحليلات متعددة في تفاعل واحد بأقل حجم للعينة. تستخدم المجهرية المشفرة بصريا (حبات البوليسترين المغناطيسي) المطلية بمستضدات مؤتلفة ذات أهمية في مقايسة مناعية مصلية غير مباشرة. ثم يتم تحضين الخرزات المقترنة بعينات ، ويتم الكشف عن الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للإنسان IgG مقترن بمراسل فلوروفور Phycoerythrin (PE). تتوفر العديد من أجهزة التحليل للكشف عن التألق المنبعث ، والذي يتم الإبلاغ عنه على أنه MFI.

تم تفصيل مبدأ الفحص في Angeloni et al.8. باختصار ، ترتبط المستضدات ذات الأهمية كيميائيا بالكريات المجهرية المرمزة بالألوان. لهذا الغرض ، تتم معالجة الخرزات في البداية باستخدام 1-إيثيل -3- [3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل] كاربوديميد (EDC) و N-هيدروكسي سولفوسوكسينيميد (سلفو-NHS) ، والتي تنشط مجموعة الكربوكسيل على سطح الخرز ، مما يخلق مركبا تفاعليا للأمين. ثم يتم خلط هذا المركب الوسيط شبه المستقر مع البروتين محل الاهتمام ، حيث ترتبط شقوق الأمين من البروتين تساهميا بالخرز ، مما يولد ميكروبيدات مستقرة مغلفة بالبروتين محل الاهتمام على السطح. يتم تحضين الخرزات المرتبطة بالمستضد بعينات ، مما يسمح للأجسام المضادة بالارتباط بمستضدات معينة. يتم الكشف عن الأجسام المضادة المرتبطة بالمستضد باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للغلوبولين المناعي مقترن بصبغة فلورية. نحن نستخدم الأجسام المضادة الثانوية المسمى PE. يتم قياس MFIs باستخدام جهاز تصوير ضوئي (يتم توفير تفاصيل الجهاز في جدول المواد). تستخدم الأداة مصباحين LED ، LED أحمر ومصباح LED أخضر ، مما يثير بشكل منفصل الأصباغ الداخلية للخرز ومضان مراسل على سطح الخرز9. ثم يتم استخدام المرشحات لتصنيف الخرز بناء على اللون وتحديد التألق المنبعث من المواد التحليلية.

لقد طبقنا سابقا التكنولوجيا للكشف عن استجابات الأجسام المضادة ل SARS-CoV-210 والأمراض التي يمكن الوقاية منها باللقاحات11 وأظهرنا أن المقايسات المتعددة تشكل أداة لا تقدر بثمن لدراسات الانتشار المصلي والمراقبة. الهدف من هذا المشروع هو توسيع استخدام FMIA ليشمل الكشف عن استجابات الأجسام المضادة لمستضدات متعددة تنتمي إلى الفيروسات المفصلية بهدف تطبيق الفحص على فحص عينات من المنطقة الأفريقية.

تم وصف فحوصات تعدد الإرسال لفيروس Arbovirus باستخدام تقنية تعدد الإرسال في مكان آخر باستخدام أهداف مستضد مختلفة مثل البروتين غير الهيكلي 1 (NS1) 12،13 أو مجال المغلف الثالث (EDIII) 14. يتم تقديم اختبار 50 ضفرة ، والذي يتضمن 26 مستضدا للفيروس المفصلي (بما في ذلك NS1 و EDIII والجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) والعديد من المستضدات الأخرى لاختبار مسببات الأمراض التي تنتشر بشكل مشترك في المنطقة. سيسمح الفحص بتقييم شدة انتقال هذه مسببات الأمراض. يتم توفير ملخص للمستضدات المؤتلفة المستخدمة لتطوير الفحص في الجدول 1. تم تطوير البروتوكول المقدم في هذا التقرير استكمالا لدراسة تطوير طريقة مكثفة تركز على تحسين الكشف عن الفيروسات المفصلية.

عادة ، يتم اقتران (أو تثبيت) المستضدات بخرز الكرة المجهرية في أنابيب مفردة8 (اقتران يدوي). هذه العملية تستغرق وقتا طويلا ومرهقة وعرضة لأخطاء التكرار. تشير هذه المقالة إلى بروتوكول يستخدم أداة آلية لتنفيذ الخطوات المتتالية التي ينطوي عليها الارتباط الكيميائي للمستضدات بالخرز. في هذه المخطوطة ، نبلغ عن الخطوات المتخذة للتحقق من صحة البروتوكول الجديد. تم إجراء التحقق من صحة البروتوكول الجديد من خلال مقارنة استجابات IgG المقاسة باستخدام FMIA 50-plex باستخدام حبات مقترنة بالمستضد محضرة إما بالطريقة اليدوية أو البروتوكول الآلي. تم إجراء مزيد من التحقق من صحة الطريقة من خلال تحليل عينات المصل البشري من الأفواج الأفريقية والفرنسية.

بروتوكول اقتران الخرزات الآلي سريع ، مما يسمح بالاقتران المتزامن لما يصل إلى 96 تحليلا في جولة واحدة. والأهم من ذلك ، أن النتائج قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول اليدوي المعمول به ، مع تقليل التباين من دفعة إلى دفعة.

البروتوكول

تم الحصول على الموافقة الأخلاقية المناسبة لاستخدام العينات البشرية. كانت العينات عبارة عن بقايا مجهولة المصدر من الدراسات السابقة. تمت الموافقة على بروتوكول استخدام عينات ORPAL "المجمع القياسي" من قبل المجلس الوطني للأخلاقيات في سورينام (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek) ، رقم الرأي VG 25-17). تمت الموافقة على استخدام عينات من مدغشقر كجزء من مشروع PvSTATEM من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لكلية لندن للصحة والطب الاستوائي (28541) ولجنة مدغشقر للبحوث الحيوية (135MSANP / SG / AMM / CERBM) ، بينما تمت الموافقة على استخدام العينات السنغالية كجزء من مشروع Dielmo و Ndiop الجاري من قبل اللجنة الوطنية لأخلاقيات البحوث الصحية السنغالية (CNERS Sénégal). ومنحت CNERS Sénégal الموافقة على قياس الأجسام المضادة لأمراض المناطق المدارية المهملة في هذه العينات (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). تم اشتقاق العينات الفرنسية غير المتوطنة من الاختبارات الطبية الروتينية داخل مختبرات المستشفيات الفرنسية وتمت معالجتها وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية الحالية للجنة الوطنية للمعلومات والحريات. تم الحصول على عينات مصل بشري من أشخاص من مناطق ذات انتشار مرتفع للفيروسات المفصلية ومن السكان الفرنسيين الساذجين. تم تعطيل عينات المصل بالحرارة قبل استخدامها عن طريق الحضانة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إذا لم يتم تعطيل العينات ، فقم بمعالجتها تحت خزانة الأمان. تم الحصول على معظم المستضدات المؤتلفة تجاريا باستثناء البروتينات المؤتلفة EDIII ، والتي تم تصنيعها داخليا. تم استخدام أداة محلل قائمة على التصوير9 للحصول على البيانات. يتم توفير الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تحديد تركيزات المستضد المثلى للاقتران

ملاحظة: لمنع التبييض الضوئي ، قلل من تعرض حبيبات الغلاف المجهري للضوء طوال العملية. قبل الاقتران بالجملة ، قم بتحسين تركيزات الاقتران لكل مستضد باستخدام بروتوكول اقتران يدوي. تم تكييف البروتوكول من Angeloni et al.8. يتم تفصيل المخازن المؤقتة والحلول في الجدول التكميلي 1.

  1. حدد مناطق الخرزة لاستخدامها في الاقتران. دوامة شاملة لمدة 20 ثانية. صوتنة الأنبوب لمدة لا تقل عن 60 ثانية.
  2. انقل 200 ميكرولتر (2.5 مليون حبة) من الخرز إلى أنبوب 1.5 مل.
  3. اغسل الخرز ب 200 ميكرولتر 100 ملي فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة / 0.125x Triton.
    1. ضع الأنبوب على فاصل أنبوب مغناطيسي لمدة 60 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون لمس الخرز.
    2. أضف محلول فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة. اتركيه على الرف المغناطيسي لمدة 60 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية.
  4. قم بتنشيط الخرزات باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على 80 ميكرولتر من 100 ملي مولار فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، و 0.125 × تريتون ، و 10 ميكرولتر من سلفو-NHS ، و 10 ميكرولتر من EDC.
    1. أضف فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة -sulfo-NHS -EDC إلى الأنابيب. احتضن في الظلام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على أسطوانة.
    2. اغسل الخرزات في 250 ميكرولتر PBS (1x) و 0.125x Triton. كرر الغسيل ثلاث مرات.
  5. ربط المستضدات.
    1. تحضير التركيزات المختلفة (التخفيفات التسلسلية) للمستضدات بحجم إجمالي 1 مل 1x PBS و 0.125x Triton. اختبر تركيزين على الأقل من المستضدات.
    2. أضف محاليل المستضد إلى الخرز المنشط. احتضان في الظلام 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية على الأسطوانة.
  6. اغسل الخرز المقترن بسعة 500 ميكرولتر PBS-TBN و 0.125x Triton. كرر الغسيل ثلاث مرات.
  7. أعد تعليق الخرزات المقترنة في 1 مل من PBS-TBN و 0.125x Triton.
    ملاحظة: قم بتخزين الخرزات المقترنة عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. أظهرت الخرزات المقترنة تباينا في MFIs عند اختبارها مباشرة بعد الاقتران مقارنة بالاختبار بعد 24 ساعة.
  8. حدد التركيز الأمثل لاستخدامه في أداة التوصيل اللاحقة واسعة النطاق. استخدم حبات مقترنة مختلفة للمقايسة المناعية في حمام سباحة قياسي. حدد أقل تركيز تم عنده الحصول على منحنى قياسي خطي.
    ملاحظة: يتم توفير مثال على خطية استجابة الأجسام المضادة لتجمع قياسي في قسم النتائج ، الشكل 1.

2. اقتران حبة آلي على نطاق واسع

  1. تحضير حبات COOH المغناطيسية الاحترافية.
    1. حساب الخرزات المطلوبة: باستخدام 500 خرزة / عينة ، يكفي 2.5 مليون خرزة ل 5000 عينة.
    2. قم بإعداد مناطق الخرزة لاستخدامها في الاقتران كما هو موضح سابقا.
    3. نقل الحجم المطلوب من الخرز إلى الآبار المخصصة. بالنسبة ل 2.5 مليون ، تم استخدام 200 ميكرولتر من الخرز (تركيز Luminex القياسي هو 1.25e7 حبات / مل).
  2. تحضير المستضدات. هذه خطوة حاسمة لضمان كميات دقيقة من المستضدات.
    1. احسب كميات المستضد المطلوب ، بعد التحسين. التركيزات المستخدمة لكل مستضد مفصلة في الجدول 1.
    2. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، امزج جيدا كمية كافية من المستضدات ذات الأهمية مع 1x PBS / 0.125x Triton إلى ما مجموعه 1 مل.
  3. تحضير لوحات مع الكواشف. تحضير 96 لوحة بئر عميقة على النحو التالي. الأحجام لكل بئر ومحسوبة ل 2.5 مليون اقتران خرزة.
    1. اللوحة 1 (أمشاط الطرف): أمشاط التحميل
    2. اللوحة 2 (الخرز): أضف 8 ميكرولتر من 0.125x Triton و 200 ميكرولتر من مناطق الخرزة ذات الأهمية.
    3. اللوحة 3 (Wash1): أضف 200 ميكرولتر من 100 ملي فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة / 0.125x Triton.
    4. اللوحة 4 (التنشيط): أضف 80 ميكرولتر من 100 ملي فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة / 0.125x Triton + 10 ميكرولتر سلفو-NHS + 10 ميكرولتر EDC.
    5. اللوحة 5 (Wash2): أضف 250 ميكرولتر من 1x PBS / 0.125x Triton.
    6. اللوحة 6 (اقتران): نقل 1 مل من محلول المستضد إلى البئر المخصص.
    7. اللوحة 7 (Wash3): أضف 500 ميكرولتر من PBS-TBN / 0.125x Triton.
    8. اللوحة 8 (اللوحة النهائية ، تحتوي على حبات مقترنة): أضف 1 مل من PBS-TBN + 0.125x Triton.
  4. قم بإعداد تشغيل دورة الاقتران في المعالج الآلي.
    1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتشغيل الجهاز وإعداد البروتوكول. البرامج الضرورية قابلة للتنزيل على جهاز الكمبيوتر15. يتم تفصيل المعلمات الخاصة بالتشغيل في الجدول التكميلي 2.
    2. قم بتحميل الألواح في الفتحة المخصصة على الماكينة. حدد البروتوكول. ابدأ الدورة. الوقت المقدر لإكمال البرنامج هو 2:50 ساعة.
  5. نهاية الدورة
    1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإيقاف تشغيل الجهاز. تفريغ اللوحات حسب التعليمات. تحقق بصريا من أن اللوحة 8 تحتوي على الخرز (الحبيبات البنية). بالإضافة إلى ذلك، يتم تصدير تقرير التشغيل من الأدوات.
    2. انقل الخرزات المقترنة من اللوحة 8 إلى الأنابيب الفردية سعة 1.5 مل للتخزين. قم بتخزين الخرزات المقترنة عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  6. عد الخرز.
    ملاحظة: تم استخدام عداد الخلايا. للعد اليدوي باستخدام مقياس الكريات الدموية ، راجع دليل كتاب الطبخ Luminex8.
    1. دوامة تماما مقترنة الخرز. نقل 10 ميكرولتر إلى غرفة عد الخلايا. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لقراءة عدد الخرزات لكل مل.
    2. تحقق من التجميع عن طريق تصور الصورة على عداد الخلية. انظر الشكل التكميلي 1 للحصول على صورة تمثيلية للخرز غير المجمع.
    3. في حالة وجود الركام ، دوامة تماما وصوتنة لمدة 5 دقائق على الأقل. كرر العد
      ملاحظة: بعد تعداد الخرزات ، تم تقييم كفاءة الاقتران عن طريق إجراء اختبار مناعي للحبات المقترنة على تجمع قياسي لتقييم خطية استجابة الجسم المضاد.

الجدول 1: لوحة المستضدات المدرجة في 50-plex. يتضمن الفحص مستضدات متعددة للكشف عن الالتهابات الفيروسية المفصلية ومسببات الأمراض المنتشرة. يتم توفير كميات من المستضدات المستخدمة في اقتران 1.25 مليون خرزة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

3. المقايسة المناعية متعددة الإرسال

ملاحظة: ترد الخطوات التفصيلية لبروتوكول قياس التمويل الأصغر في الدليل9 المعني. لتقليل تعرض الخرزات للضوء وخطر التبييض الضوئي ، يتم تحضير جميع المحاليل والعينات قبل إخراج الخرز من الثلاجة.

  1. قم بإعداد تخطيط اللوحة. تم استخدام ألواح 96 بئرا وشملت تخفيفات متسلسلة لحوض قياسي بالإضافة إلى فراغ (مخزن مؤقت فقط) في الصف الأول.
  2. تمييع العينات والمعيار في المخزن المؤقت PBT في لوحة منفصلة غير ملزمة. تم استخدام تخفيف 1: 200 (التركيز النهائي 1: 400) للعينات. بالنسبة للمنحنى القياسي ، تم استخدام تخفيف 1:50 لتجمع المصل القياسي (مما أدى إلى تركيز نهائي قدره 1: 100) وعشرة تخفيفات تسلسلية 2 ضعفين.
  3. تحديد كمية الخرزات المقترنة لاستخدامها في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر / بئر. تم استخدام 500 حبة من كل حبة لكل بئر وتعديلها حسب الحجم باستخدام مخزن مؤقت PBT.
  4. دوامة تماما مزيج الخرز المقترن لمدة 30 ثانية. سونيكيت لمدة 60 ثانية على الأقل.
  5. احسب حجم كل حبة مقترنة لإضافتها إلى الخلطة المتعددة لضمان حبات متساوية لكل تحليل متساو. تم حساب أحجام الخرزات على النحو التالي: حجم الخرزات لكل بئر = عدد الخرزات لكل بئر / عدد حبة.
    ملاحظة: مثال لحساب الخرز وأحجام المخزن المؤقت اللازمة للخلطة الجاهزة موضح في الجدول التكميلي 3.
  6. نقل أحجام كافية من مستضد الخرزة إلى أنبوب الطرد المركزي.
  7. اضبط مستوى الصوت باستخدام PBT.
  8. امزج جيدا الخلطة الجاهزة.
  9. وزع 50 ميكرولتر من الخلطة الجاهزة على صفيحة التصوير الدقيقة (على سبيل المثال ، ps ، ألواح f-bottom).
  10. أضف 50 ميكرولتر من العينات المخففة إلى الخرز.
  11. تخلط على شاكر الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، 700 دورة في الدقيقة.
  12. اغسل الأطباق ثلاث مرات على النحو التالي (الغسيل اليدوي).
    1. ضع اللوحة على رف مغناطيسي لمدة 60 ثانية في درجة حرارة الغرفة. أمسك اللوحة بإحكام على الرف وتخلص من المادة الطافية.
    2. أضف 100 ميكرولتر من PBT العازلة. اتركيه على الرف المغناطيسي لمدة 60 ثانية. كرر الغسيل
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام غسالة الألواح16 . تم ضبط الغسالة على النحو التالي: نقع دورة واحدة ، تليها 3 دورات (الشفط ، والتوزيع ، والنقع) ودورة الشفط النهائية.
  13. تخلص من المادة الطافية وأضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف.
    1. اتبع تعليمات المورد لتحضير محلول مخزون من الجسم المضاد الثانوي. تم استخدام محلول تخفيف 1/120 للأجسام المضادة الثانوية. تم حساب أحجام الجسم المضاد الثانوي على النحو التالي: حجم الجسم المضاد الثانوي = الحجم الكلي / عامل التخفيف.
    2. امزج الجسم المضاد الثانوي مع كمية كافية من المخزن المؤقت PBT. امزج جيدا. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى الخرزات المغسولة.
  14. احتضان على شاكر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، 700 دورة في الدقيقة.
  15. قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل كما هو موضح سابقا.
  16. أعد تعليق الخرزات في مخزن مؤقت PBT سعة 150 ميكرولتر.
  17. احتضان على شاكر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، 700 دورة في الدقيقة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد الأدوات9.
    ملاحظة: تم استخدام برنامج xPONENT17 المزود بأداة التصوير. تم تعيين إعدادات قراءة التألق على النحو التالي: تم ضبط حجم التجميع على 50 ميكرولتر ، مع حد أدنى يبلغ 50 خرزة ، بدون سخان XY ، ونوع التحليل على أنه لا شيء.

4. تحليل البيانات

  1. تشغيل التحقق من الصحة
    1. تحقق من الوصول إلى الحد الأدنى لعدد الخرز. يوصى باستخدام ما لا يقل عن 35 خرزة لكل بئر للحصول على MFI8 صالح إحصائيا.
    2. تحقق من قيم MFI لعينة التحكم الفارغة والسلبية ضئيلة.
    3. تحقق من قيم MFI للمعايير عن طريق رسم منحنى قياسي. هذه أعلى من عينة التحكم الفارغة و / أو السلبية.
  2. تحليل بيانات العينة
    1. قم بتصدير البيانات كملفات CSV وتحليلها خارجيا باستخدام برنامج R.

النتائج

لتوضيح العملية المتبعة للتحقق من صحة البروتوكول ، اخترنا ثلاثة مستضدات تمثل ثلاث عائلات من الفيروسات المفصلية: Flaviviruses (بروتين DENV1 NS1) ، وفيروسات ألفا (بروتين CHIKV VLP) ، وفيروسات بونيا (RVFV NP). تم اختبار المستضدات على مجموعة قياسية من السكان المعرضين مسبقا (ORPAL) ، والمصل السكاني الفرنسي (غير المعرض) ، ومجموعتين من إفريقيا (السنغال ومدغشقر).

التخفيف الخطي لاستجابة الأجسام المضادة
تم تحديد تركيز المستضدات لاستخدامها في اقتران الخرزة باستخدام التخفيفات التسلسلية لمجمع ORPAL. تم اختيار التركيز الأمثل باعتباره أقل تركيز تم عنده الحصول على منحنى معياري خطي (البيانات غير معروضة). يوضح الشكل 1 خطية مستضدات الفيروسات المفصلية المختارة بالتركيز الأمثل لكل مستضد. لمراقبة جودة أداة التوصيل ، تم اختبار كل دفعة من الخرزات المقترنة من أجل خطية التخفيف على تجمع ORPAL القياسي باستخدام التركيز المحدد مسبقا.

قابلية المقارنة مع مقايسة الاقتران اليدوي القياسية
لتقييم قابلية مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول الآلي الجديد مع الاقتران اليدوي الراسخ ، قمنا بمقارنة المنحنيات القياسية الناتجة عن النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الاقتران اليدوي مقابل الاقتران الآلي. يوضح الشكل 2 الخطية المتوازية لكلا المقايستين. تختلف قيم MFI حسب المستضد.

اختلاف دفعة اقتران الخرزة
تم تقييم تباين دفعة الاقتران ، حيث تم تقييم قابلية تكرار الاختبارات من نفس دفعة الاقتران ، باستخدام مخطط Levey-Jennings18. تم استخدام المستضدات التمثيلية والخرز المقترن ب BSA واختبارها على تجمع ORPAL القياسي. يوضح الشكل 3 مؤسسات التمويل الأصغر من 19 لوحة مختلفة ، تم اختبارها في أيام مختلفة لكل مستضد. تقع مؤسسات التمويل الأصغر الناتجة ضمن نطاق متوسط ± 3 SD للمستضدات الثلاثة وعنصر التحكم.

تأثير تعدد الإرسال على مؤسسة التمويل الأصغر
لمزيد من تقييم أداء الفحص ، اختبرنا ما إذا كان تعدد إرسال العديد من المستضدات قد أثر على استجابة الأجسام المضادة المقاسة. تمت مقارنة الاستجابة بمستضد واحد (أو حبة ضفرة واحدة) باستخدام تجمع ORPAL القياسي. يوضح الشكل 4 ارتباطا قويا (R = 0.99 ، ص < 2.2e-16) بين النتائج التي تم الحصول عليها عند قياس مؤسسات التمويل الأصغر على مستضدات مفردة أو من مزيج مسبق يحتوي على 50 مستضدا.

استجابات الأجسام المضادة من عينات المصل البشري في السكان الأفارقة
لتقييم قابلية تطبيق الاختبار على عينات من مجموعات متنوعة ، قارنا استجابات الأجسام المضادة في عينات المصل البشري من السكان الأفارقة ، والتي لديها احتمال كبير للتعرض للفيروسات المفصلية ، مع تلك من مجموعة فرنسية يفترض أنها أقل عرضا لهذه الفيروسات. في المجموع ، تم اختبار 1,596 عينة لمدغشقر ، و 1,428 للسنغال ، و 84 عينة من المجموعة الفرنسية. يعرض الشكل 5 مخططات الكثافة للمجموعات المختلفة. بالنسبة للمجموعة السنغالية ، لوحظ توزيع ثنائي النمط واضح للبيانات للاستجابات ل CHIKV VLP ، مما يشير إلى استجابتين متميزتين ل CHIKV في السكان. كما لوحظ وجود ذيل ثنائي النمط دقيق ل DENV1 NS1 و RVFV NP في مجموعة السنغال ، بينما لا يوجد فرق بين المجموعات الفرنسية ومدغشقر.

figure-results-1
الشكل 1: خطية استجابة الأجسام المضادة التي تم اختبارها على تجمع ORPAL القياسي. يتم عرض مستضدات الفيروسات المفصلية المختارة كمثال. يتم عرض شدة التألق المتوسطة (MFI) على المحور y (مقياس اللوغاريتم) والتخفيف التسلسلي للتجمع القياسي على المحور x. تم اختبار جميع المستضدات في اللوحة مسبقا على المجمع القياسي قبل الاختبار المجمع على العينات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الخطية المتوازية لاستجابة الأجسام المضادة بطرق الاقتران. سجل MFI (المحور y) للمستضدات التمثيلية (الوجه) تم اختباره على التخفيفات التسلسلية لتجمع ORPAL القياسي (المحور x). تمثل الألوان طرق اقتران مختلفة: الأتمتة (الأحمر والأخضر والأزرق) واليدوية (الأرجواني). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التباين من لوحة إلى لوحة. يتم عرض Levey_Jennings مخططات للحبة المقترنة BSA (التحكم) و DENV1 NS1 و CHIKV VLP و RVFV لتجمع ORPAL القياسي بتركيز 1: 400. تمثل النتائج 19 لوحة تعمل في أيام مختلفة. يتم تقديم مؤسسات التمويل الأصغر على المحور y ، وعدد الاختبارات على المحور x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: ارتباط استجابة الأجسام المضادة للمقايسة الأحادية والمتعددة الإرسال. تم تخفيف التجمع القياسي بتركيز نهائي قدره 1: 400 وتم اختباره على مزيج مسبق يحتوي على مستضدات 50 plex بالتوازي مع حبات مفردة مغلفة بالمستضد. تم استخدام ارتباط بيرسون للتحليل. يتم عرض ثلاثة مستضدات تمثيلية كمثال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تطبيق الفحص على مجموعة العينات المتوطنة وغير المتوطنة. تم اختبار الاختبار على عينات من مدغشقر (أخضر) والسنغال (أزرق) وفرنسا (أحمر). تم تخفيف العينات بتركيز نهائي قدره 1: 400. يمثل المحور X مؤسسات التمويل الأصغر الطبيعية (nMFI) ، محسوبة كنسبة من MFI للعينة إلى MFI القياسية بنفس التركيز (1: 400). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: مثال على الصورة التمثيلية لتجميع الخرز. تعرض اللوحة (أ) الخرز غير المجمع، وتعرض اللوحة (ب) مجاميع الخرز. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: جدول المخازن المؤقتة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: إعدادات بروتوكول اقتران حبات KingFisher Apex. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: مثال لحساب أحجام الخرزات للخلط التحضيري. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

أدى استخدام FMIA إلى تغيير مشهد الاختبارات المصلية. تكمن قوة المقايسات في القدرة على تقييم استجابات الأجسام المضادة لمستضدات متعددة في تفاعل واحد ، مما يقلل من الوقت اللازم لتحقيق النتائج ويقلل من تكلفة الاختبار. هذا مهم بشكل خاص في المراقبة المصلية. ومع ذلك ، فإن الاستخدام الروتيني لمقايسات FMIA يعوقه خطوة اقتران الخرزة اليدوية التي تتطلب عمالة مكثفة وتستغرق وقتا طويلا ، والتي تتطلب التعامل مع مستضدات مفردة لكل تفاعل. يقدم هذا التقرير طريقة آلية للاقتران الكيميائي للمستضدات بالخرز. تسمح الأتمتة بالاقتران المتزامن لما يصل إلى 96 مستضدا في جولة واحدة ، مما يقلل بشكل كبير من الوقت اللازم لاقتران المستضد عالي الإنتاجية.

يوضح الشكل 1 أن المستضدات كانت مرتبطة بنجاح بالخرز. تظهر النتائج أيضا توازبا قويا بين البروتوكول الآلي الجديد والبروتوكول اليدوي الراسخ (الشكل 2) ، مما يشير إلى دقة غير أقل شأنا في الكشف عن استجابات IgG للمستضدات التي تم تقييمها. تظهر نتائج اللوحة إلى اللوحة (الشكل 3) وتباين دفعة اقتران الخرزة (الشكل 2) قابلية مقارنة البيانات عند استخدام الطريقة الآلية للاقتران. يظهر الارتباط العالي بين مؤسسات التمويل الأصغر متعددة الإرسال والمفردة (الشكل 4) أن تعدد عدد كبير من المستضدات لا يؤثر على استجابة الأجسام المضادة لمجموعة المستضدات الفردية المستخدمة في هذا الفحص.

للتحقق من صحة الفحص ، تم اختبار عينات من كل من المجموعات المستوطنة وغير المتوطنة (الشكل 5). في حين أن دراسات الانتشار المصلي للفيروسات المفصلية لا تزال نادرة في أفريقيا ، تشير البيانات المتاحة19،20،21،22 إلى صورة دقيقة مع انتشار مصلي متغير IgG بين البلدان الفردية وداخلها. والجدير بالذكر أن البيانات الحالية تشير إلى ارتفاع معدل انتشار الفيروسات الثلاثة (الشيكونغونيا وحمى الضنك والوادي المتصدع) في السنغال مقارنة بمدغشقر ، على سبيل المثال19. وتتسق حالات الانتشار هذه مع الملاحظة الواردة في هذا التقرير، والتي أظهرت استجابة واضحة ومميزة للمستضدات المختلفة في السنغال عند مقارنتها بالمجموعات الأخرى. هذا يدعم قدرة الفحص على تمييز ملامح الأجسام المضادة في سياق الانتشار المصلي المرتفع نسبيا. ويمكن تفسير البيانات المرصودة لأترابية مدغشقر بانخفاض معدل انتشار الفيروسات في موقع جمع العينات22، في حين أن قابلية مقارنة البيانات بالأفترابية غير المتوطنة يمكن تفسيرها جزئيا بصغر حجم العينة للأترابية الفرنسية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يفسر التباين المبلغ عنه بين المناطق الاختلافات التي لوحظت في مجموعات البيانات. من الضروري إجراء دراسة مكثفة لتقييم الانتشار المصلي IgG. ومع ذلك ، تظهر البيانات المقدمة في هذا التقرير أن الاختبار المطور خاص بالكشف عن استجابات IgG لمستضدات الفيروسات المفصلية التي تم تقييمها ، وتمييز البيانات من المناطق المتوطنة بالإضافة إلى الاستجابات الدقيقة والمتميزة داخل نفس السكان.

تضمنت التحديات التقنية الرئيسية تحقيق محاليل مستضد متجانسة على الرغم من استخدامها بكميات صغيرة جدا ، وضمان تمثيل متساوي المولار لمناطق الخرزة في الخلطة الجاهزة ، وتقليل تراكم الخرز. للتغلب على صعوبة تحقيق محلول متجانس في اللوحة المكونة من 96 بئرا ، تم تنفيذ خطوة حيث تم خلط جميع المحاليل المستضدية جيدا في أنبوب 1.5 مل قبل توزيعها في اللوحة. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة خطوة لحساب الخرزات المقترنة وضبط الأحجام لضمان إضافة عدد متساو من مناطق الخرزة إلى الخلطة الجاهزة. كما تم تضمين خطوة صوتنة لتسهيل خلط الخرزة وتقليل التجميع في الخلطة الجاهزة.

في هذه الدراسة المحدودة ، لم يتم تقييم ثبات الخرزات المقترنة وتأثيرها على أداء الفحص ، حيث تم اختبار جميع العينات في غضون شهر واحد من اقتران الخرزة. كان هذا التقييم خارج نطاق هذا التقرير وسيتم تقييمه في الدراسات المقبلة. على الرغم من هذه القيود ، يقدم هذا التقرير طريقة سريعة وموثوقة للكشف عن استجابات الأجسام المضادة لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك الفيروسات المفصلية. يعد الترصد المصلي للعدوى الفيروسية المفصلية أمرا بالغ الأهمية لمكافحة الأمراض ، ويمثل توافر طريقة سريعة قابلة للتكرار للكشف عن استجابات الأجسام المضادة لهذه الفيروسات تقدما كبيرا في الجهود العالمية لتقييم عدم التجانس في انتقال العدوى والتدخلات المستهدفة للتخفيف من عبء هذه العدوى. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن تركيز هذا التقرير ينصب على الفيروسات المفصلية ، إلا أن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع على مجموعة واسعة من المستضدات ويمثل تقدما كبيرا في هذا المجال.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون بصدق المشاركين في الدراسة والعاملين في مجال الصحة المجتمعية في كل موقع من مواقع الدراسة. كما نعرب عن امتناننا لجميع موظفي المختبرات والميدانيين لجهودهم المتفانية في جمع العينات والحصول على البيانات والتحليلات المختبرية. تم دعم هذا العمل من خلال إعادة بناء شدة انتقال الفيروسات المفصلية في جميع أنحاء إفريقيا وتأثير التدخلات في تغير المناخ (xSTAR) من Wellcome Trust [228185/Z/23/Z]. لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلفون بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العامة CC BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ عن هذا التقديم. ونشكر أيضا ما يلي على الإذن باستخدام العينات: روب فان دير بلويم (علم الأوبئة والتحليلات للأمراض المعدية، معهد باستور، باريس) وماليس دوين وأليس سانا (مركز التحقيقات في عيادة الأنتيل - غيان، مركز مستشفى كايين، كاين).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 مل -المستهلكات العامة للمختبر
وحدات فلتر 1000 مل 0.2 ميكرومترثيرمو فيشر ساينتيفيك567-0020
خزانات سعة 25 مل؛العلم الحراري95128095
أنابيب فالكون بسعة 50 ملليمتر-المستهلكات العامة للمختبر
96 لوحة بئر عميقة - KingFisher DWالعلم الحراري10373480
غسيل ألواح آلي (اختياري)تيكانغسالة الميكرولوبلايت HydroFlex Plus
B السعال الديكي FHAالمستضد الأصلي  BP-FHA-50
التوازن-معدات المختبر العامة
جهاز الطرد المركزي على المقعد  - معدات المختبر العامة
خرز BioPlex Pro المغناطيسي COOH لومينيكسMC10xxx  (x=منطقة الخرز)
مصل البقر الألبومين، BSAسيغماA7906
برانسون ألتراسونيكس برانسونيك منظف الموجات فوق الصوتية موديل B200فيشر العلمي15-337-22
BSAسيغما ألدريتشA7906
جائزة CCHF الكبرىالمستضد الأصليREC31639-100
عداد الخلايا / مقياس الهيماسيتوميتالبيوراد / ميركTC20 /Z359629
CHIKV E2المستضد الأصليREC31617-100
CHIKV VLPالمستضد الأصليCHIKV-VLP-100
ألواح مناعية شفافة ذات قاع مسطح وغير معقمة من 96 بئرالعلم الحراري3455
جسيمات CMVالمستضد الأصليCMV-HP-100
شرائح العد، غرفة مزدوجة لعداد الخلية  بيورادL003662 أ
cp23المستضد الأصليبرودكشن بروت
CT694المستضد الأصليبرودكشن بروت
CtxB
DENV1 EDIII + SNAPالإنتاج الداخلي-
DENV1 NS1المستضد الأصليDENV1-NS1-100
DENV1 VLPالمستضد الأصليDENVX4-VLP-100
DENV2 EDIII + SNAPالإنتاج الداخلي-
DENV2 NS1المستضد الأصليDENV2-NS1-100
DENV2 VLPالمستضد الأصليDENVX4-VLP-100
DENV3 EDIII + SNAPالإنتاج الداخلي-
DENV3 NS1المستضد الأصليDENV3-NS1-100
<اسم="ميدان! A33">DENV3 VLPالمستضد الأصليDENVX4-VLP-100
DENV4 EDIII + SNAPالإنتاج الداخلي-
DENV4 NS1المستضد الأصليDENV4-NS1-100
DENV4 VLPالمستضد الأصليDENVX4-VLP-100
سم الدفتيرياتالمستضد الأصلي  DIP-TNL-100
EBV-GP125المستضد الأصليREC31601-100
EDC سيغما03449
الإيثانول 100٪ -مختبر عام  
ختم الألمنيوم الفيلم غير المعقم -عام
جهاز تصوير الفلورة - نظام MAGPIXلومينيكس MAGPIX-XPON4.1-CEIVD
مغناطيس محمول للألواح - فاصل مغناطيسي بسعة 96 بئرلومينيكسCN-0269-01
HEV-ORF2المستضد الأصلي  REC31653-100
إينابا OSPBoston_MGH -
مشط طرف كينغفيشر ديب ويل 96 بئرالعلم الحراري17170069
ليشمانيا K28علوم الكلينياتMBS3040095
مجموعة معايرة لومينيكس ماجبيكسلومينيكسMPX-CAL-K25
مجموعة التحقق من Luminex MAGPIXلومينيكسMPX-PVER-K25
فاصل الأنابيب المغناطيسيةإنفيتروجيندايناماج
ماجبيكس درايف فلويد بلسلومينيكس40-50030
NP للحصبةالمستضد الأصليREC31796
هزاز اللوحة الدقيقة  راندوكس
الصفيحة الدقيقة، بئر 96، PS، قاع F (بئر المدخنة)غرينر-بيو واحد655096
ميلي كيو H20 -مختبر عام  
الماصات متعددة القنوات 10، 300سارتوريوس
NIEالمستضد الأصليبرودكشن بروت
أوغاوا OSPBoston_MGH -
ONNV E2علوم الكلينياتIT-022-006 Ep
أداة معالجة الجسيماتالعلم الحراريثيرمو ساينتفيك كينغفيشر فليكس
PBS 10x PH~7.0يوروميديكسET330
الجسم المضاد الثانوي IgG Fc المضاد للبشر المتقارن ب PEأبحاث جاكسون المناعي709-116-098
PfAMA1الإنتاج الداخلي-
PfMSP1المستضد الأصليREC32013-100
PGP3المستضد الأصليبرودكشن بروت
نصائح Pipette (المورد) 10 وميكرو؛ L، 200 وميكرو؛ L، 1000 وميكرو؛ L -المستهلكات العامة للمختبر
Pm MSP1علوم الكلينياتCUST-PRT-31102024-1B
بو MSP1علوم الكلينياتCUST-PRT-31102024-1A
PvMSP1المستضد الأصليREC31724-100
برنامج R R4.4.1--
RVFV NPالمستضد الأصليREC31640-100
الماصات أحادية القناة 10p، 20p، 200p، 1000pإبندورف
سنابالإنتاج الداخلي-
S-NHS سيغما56485
أزيد الصوديومسيغماS2002
محلول هيبوكلوريت الصوديوم (مبيض) -المبيض المنزلي العام
سم الكزازالمستضد الأصليREC31801-100
إصدار 1.1 من برنامج Thermo Scientific BindIxثيرموفيشر ساينتيفيك-
ترايتونثيرمو ساينتفيكA16046
أسطورة أنبوب إيكارولر 6D -100219627
توين-20سيغماP7949
USUV EDIII + SNAPالإنتاج الداخلي-
USUV NS1المستضد الأصلييو إس يو في-NS1-100
Vortex  -معدات المختبر العامة
VSP3المستضد الأصليبرودكشن بروت
VSP5المستضد الأصليبرودكشن بروت
WNV EDIII + SNAPالإنتاج الداخلي-
WNV NS1المستضد الأصليWNV-NS1-100
برنامج xPONENTلومينيكس89-30000-00-759 المراجعة أ مايو-19
YFV EDIII + SNAPالإنتاج الداخلي-
YFV NS1المستضد الأصليYFV-NS1-100
ZIKV EDIII + SNAPالإنتاج الداخلي-
ZIKV NS1المستضد الأصليZIKV-NS1-100
ZIKV VLPالمستضد الأصليZIKV-VLP-100

المراجع

  1. Global dengue surveillance. , World Health Organization. https://worldhealthorg.shinyapps.io/dengue_global (2025).
  2. Bangoura, S. T., et al. Arbovirus epidemics as global health imperative, Africa, 2023. Emerg Infect Dis. 31 (2), e240754(2024).
  3. World Health Organization. Surveillance and control of arboviral diseases in the WHO African Region: assessment of country capacities. , WHO. (2022).
  4. Starolis, M. W., Perez, O., Powell, E. A. Clinical features and laboratory diagnosis of emerging arthropod-transmitted viruses. J Clin Virol. 132, 104651(2020).
  5. Alves, R. P. D. S., Amorim, J. H. Editorial: Arboviruses: Co-circulation, co-transmission, and co-infection. Front Microbiol. 14, 1321166(2023).
  6. Pan American Health Organization. Recommendations for laboratory detection and diagnosis of arbovirus infections in the region of the Americas. , PAHO. (2023).
  7. Fischer, C., et al. Challenges towards serologic diagnostics of emerging arboviruses. Clin Microbiol Infect. 27 (9), 1221-1229 (2021).
  8. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. xMAP cookbook: A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP technology. Luminex. , https://info.diasorin.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook (2025).
  9. Luminex MAGPIX user manual. , Luminex Corporation. (2023).
  10. Rosado, J., et al. Multiplex assays for the identification of serological signatures of SARS-CoV-2 infection: An antibody-based diagnostic and machine learning study. Lancet Microbe. 2 (2), e60-e69 (2021).
  11. Bloch, E., et al. Investigation of the sero-epidemiology of vaccine preventable diseases and common viral infections in French populations using a multiplex serological assay. medRXiv. , (2024).
  12. Venkateswaran, N., Sarwar, J., Nelson, W., Venkateswaran, K. Determination of IgG antibody profile to arboviruses using a multiplex serology panel. , (2024).
  13. Lawford, H. L. S., et al. Integrated serological surveillance for neglected tropical diseases, vaccine-preventable diseases, and arboviruses in Samoa, 2018. Sci Rep. 15 (1), 12667(2025).
  14. Bailly, S., et al. Spatial distribution and burden of emerging arboviruses in French Guiana. Viruses. 13 (7), 1299(2021).
  15. KingFisher Apex purification system: User guide. , Thermo Fisher Scientific Inc. https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0018970_kingfisher_apex_UG.pdf (2025).
  16. Instructions for use for HydroFlex Plus. , Tecan. (2025).
  17. XPONENT 4.3 installation instructions. , Luminex Corporation. https://us.diasorin.com/sites/default/files/products-documentation-tool/89-30000-00-759.pdf (2025).
  18. Van Den Hoogen, L. L., et al. Quality control of multiplex antibody detection in samples from large-scale surveys: the example of malaria in Haiti. Sci Rep. 10 (1), 1135(2020).
  19. Bangoura, S. T., et al. Seroprevalence of seven arboviruses of public health importance in sub-Saharan Africa: a systematic review and meta-analysis. BMJ Glob Health. 9 (10), e016589(2024).
  20. Awuah, A. A., et al. Seroprevalence of dengue in the Democratic Republic of Congo, Ghana and Senegal: results of the SERODEN study. Int J Infect Dis. 152, 107428(2025).
  21. Mhamadi, M., et al. Human and livestock surveillance revealed the circulation of Rift Valley Fever virus in Agnam, Northern Senegal, 2021. Trop Med Infect Dis. 8 (2), 87(2023).
  22. Broban, A., et al. Seroprevalence of IgG antibodies directed against dengue, chikungunya and West Nile viruses and associated risk factors in Madagascar, 2011 to 2013. Viruses. 15 (8), 1707(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة