نقدم بروتوكولا لتوليد عضويات معوية مشتقة من المرضى ذات بذور خلية واحدة، موفرين زراعة موحدة تقلل من التباين وتحسن قابلية التكرار في الفحوصات اللاحقة وتطبيقات الطب الدقيق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نقدم بروتوكولا لتوليد عضويات معوية مشتقة من المرضى ذات بذور خلية واحدة، موفرين زراعة موحدة تقلل من التباين وتحسن قابلية التكرار في الفحوصات اللاحقة وتطبيقات الطب الدقيق.
مكنت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الأورجينويدات من إنشاء عضويات معوية مشتقة من المرضى (PDIOs) تعيد تلخيص الخصائص البنيوية والوظيفية والوراثية والوراثية لأنسجتها الأصلية. ومع ذلك، فإن العضويات التقليدية المشتقة من الممر تنتج حتما تجمعات غير متجانسة في الحجم والعدد، مما يؤدي إلى نتائج غير متسقة حتى في ظروف متطابقة. لمعالجة ذلك، تم إنشاء نهج موحد يشار إليه هنا باسم "PDIOs ذات بذور خلية واحدة". في هذه الطريقة، تم تفكيك PDIOs الناضجة إنزيميا إلى خلايا مفردة وزرع بذرع بعدد محدد في آبار فردية من صفيحة تحتوي على 96 بئرا. هذا الزرع المتحكم به كان يطبع حجم وعدد PDIOs. مقارنة بالعضويات المشتقة من الممر، أظهرت PDIOs المبذرة من خلايا واحدة تباينا أقل في أعداد الأعضاء وتغيرات داخل البئر في أحجام العضويات، مما يمكن من تحديد كفاءة التوليد ويحسن من قابلية تكرار اختبارات القابلية للحياة. علاوة على ذلك، تتوافق هذه المنصة مع التحليل اللاحق، بما في ذلك تحليل النسخ النصي وتحليل تعبيرات البروتين. بشكل جماعي، قد يعزز هذا النهج اتساق التجارب ويوفر أساسا عمليا للدراسات القابلة لإعادة الإنتاج القائمة على PDIO.
الأمعاء البشرية نظام بيئي معقد للغاية يعرف بتفاعلات دقيقة بين ميكروبيوم الأمعاء، وظهارة الأمعاء،والجهاز المناعي. تحافظ هذه المكونات على توازن الأمعاء من خلال شبكات إشارات منظمة بدقة. على سبيل المثال، تتفاعل ميكروبيوم الأمعاء، التي تتكون من أكثر من عشرة تريليونات كائن ميكروبي، مع الخلايا المناعية لتنظيم نشاط الجهاز المناعي وتحافظعلى بيئة معوية متوازنة. الظهارة المعوية لها دور أساسي في التوسط في هذا التفاعل بين الميكروبيونات والجهاز المناعي 3,4. الخلايا الجذعية المعوية (ISCs)، المحرك الرئيسي لتجديد الظهارة، تتجدد باستمرار وتتمايز إ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
جميع المواد والكواشف المطلوبة للتجربة مدرجة في جدول المواد.
1. تحضير المواد والكواشف
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
لتوليد PDIO ذات بذور خلية واحدة، تم جمع خزعات الضغط المخاطي من اللفائفي النهائي والقولون الصاعد من أشخاص أصحاء موافقين أثناء تنظير القولون باستخدام ملقط خزعة قياسية بقطر 2.8 مم، وذلك ضمن مجلس مراجعة مؤسسة كلية غروسمان للطب بجامعة نيويورك (تحليل المناعة المخاطية لدى مرضى مرض الأمعاء الالتهابي؛ S12-01137). ثم تم توليد PDIOs ذات بذور خلية واحدة عن طريق تفكيك 6,000 خلية معزولة من PDIOs ناضجة إلى ECM، تلتها الزراعة في DIF. نشأت العضويات من خلايا مفردة وبدأت في تكوين هياكل شبيهة بالبراعم في ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تحمل PDIOs وعدا هائلا لنمذجة الأمراض الدقيقة، وفحص الأدوية، والطب التجديدي، حيث تحافظ بأمانة على المشهد الجيني والوراثي للمرضى الفرديين. ومع ذلك، غالبا ما تعيق تطبيقاتها العملية صعوبات توحيد إنتاج وتوصيف العضويات. لتجاوز هذه التحديات، تم تقديم نهج يستخدم PDIOs مشتقة من تعليق الخلية الواحدة أو الخلايا المفردة في دراسات حديثة 45,48,49,50,51,52,53,54.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
حصل جوردان إي. أكسلراد على منح بحثية من BioFire Diagnostics، وGenentech، وJanssen، وTakeda؛ رسوم الاستشارات، أو رسوم الأجر، أو رسوم المجلس الاستشاري من AbbVie، Abivax، Adiso، Biomerieux، Bristol-Myers Squibb، Celltrion، Ferring، Fresenius، Janssen، Merck، Pfizer، Sanofi، Takeda، وVedanta. ك.س. مخترع في براءة الاختراع الأمريكية رقم 10,722,600 وبراءات الاختراع المؤقتة 62/935,035 و63/157,225.
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) (RS-2025-0057588، RS-2024-00411768، RS-2025-18362970، وRS-2025-02214844، كيونغ كو جانغ); منحة من مشروع البحث والتطوير لتكنولوجيا الصحة في كوريا عبر معهد تطوير صناعة الصحة الكورية (KHIDI) الممول من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية في جمهورية كوريا (RS-2024-00406488، كيونغ كو جانغ); منح DK093668 المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (كين كادويل)؛ K23DK124570 (جوردان إي. أكسلراد)؛ مؤسسة كرون والتهاب القولون (جوردان إي. أكسلراد). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، أو جمع البيانات وتحليلها، أو قرار النشر، أو إعداد المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| [ليو<سوب>15]-غاسترين أنا إنسان | سيغما-ألدرتش | G91450-0.1 ملغ | |
| أنبوب مخروطي بحجم 15 مل | SPL | 50015 | |
| 20X PBS، درجة حموضة 7.4 | بيوسيسانغ | P2007-7.4 | |
| أنبوب مخروطي بحجم 50 مل | SPL | 50050 | |
| A 83-01 | توكريس | 2939-10 ملغ | |
| DMEM/F-12 المتقدمة | جيبكو | 12634010 | |
| أكسجين 1000 وميكرو؛ رؤوس الماصة L، واسعة التجويف، شفافة، غير معقمة | أكسجين | T-1005-WB-C | |
| أكسجين 200 وميكرو؛ رؤوس الماصة L، واسعة التجويف، شفافة، غير معقمة | أكسجين | T-205-WB-C | |
| مكمل B-27 (50X) خالي من المصل | جيبكو | 17504044 | |
| مصل البقر الألبومين | روش | 10735078001 | |
| ألواح بوليسترين شفافة بسعة 96 بئر من كورنينغ | كورنينغ | 3599 | |
| حل استرداد خلايا كورنينغ | كورنينغ | 354253 | |
| مصفوفة كورنينج ECM (كورنينغ ماتريجيل) | كورنينغ | 356231 | |
| ألواح بئر متعددة معالجة ب TC شفافة ببئر كوستار 24 بئرا | كورنينغ | 3526 | |
| ارتفاع الجلوكوز في DMEM مع جلوتامين مستقر مع بيروفات الصوديوم | بيوويست | L0103-500 | |
| جنتاميسين | جيبكو | 15750060 | |
| كاشف تفكك الخلايا اللطيف | الخلايا الجذعية | 100-0485 | |
| بروتين إعادة تركيب FGF البشري الأساسي (FGF-2/bFGF) (154 aa) | جيبكو | 100-18B-100UG | |
| IGF-I البشري، بروتين مؤتلف خال من الحيوانات | جيبكو | AF-100-11-500UG | |
| بروتين نوجين البشري | نظام الأكرو بيولوجي | غير H5219-1 ملغ | |
| بروتين R-Spondin 1 / RSPO1 البشري (21-146) | نظام الأكرو بيولوجي | RS6-H4220-1mg | |
| وسط نمو العضوية IntestiCult (الإنسان) | الخلايا الجذعية | 6010 | |
| إل-جلوتامين 100X | بيوويست | X0550-100 | |
| بروتين EGF المؤتلف في الفأر | جيبكو | 315-09-100UG | |
| ن-أسيتيل-إل-سيستين | سيغما-ألدرتش | A9165-5 g | |
| محلول البنسلين-ستربتوميسين 100X | بيوويست | L0022-100 | |
| بديل البشري المؤتلاف Wnt3a | نظام الأكرو بيولوجي | WNE-W5253-50ug | |
| TrypLE (كاشف التفكك الإنزيمي) يعبر عن إنزيم (1X)، بدون فينول أحمر | جيبكو | 12604013 | |
| Y-27632 ديهيدروكلوريد | توكريس | 1254-10MG |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.