تصوير الخلايا الحية للنقل الداخلي باستخدام الأجسام النانوية الوظيفية في الخلايا المستزرعة

يعد الالتقام الخلوي للمستقبلات وبروتينات الغشاء الأخرى (TM) من غشاء البلازما إلى مقصورات مختلفة داخل الخلايا أمرا مهما للحفاظ على توازن الغشاء^1،2. بعد الاستيعاب عن طريق الالتقام الخلوي المعتمد على الكلاثرين أو المستقل ، تملأ شحنات البروتين أولا الجسيمات الداخلية المبكرة حيث يتم فرزها إما على طول نظام الليزوزومات الداخلية ، أو إعادة تدويرها إلى غشاء البلازما ، أو شحنها باتجاه رجعي إلى شبكة عبر جولجي (TGN) ^3،4،5. تعد إعادة التدوير من الجسيمات الداخلية و / أو سطح الخلية إلى TGN جزءا من الدورة الوظيفية لعدد من مستقبلات الشحن عبر الغشاء ، مثل مستقبلات مانوز 6 فوسفات المعتمدة على الكاتيون والمستقلة عن الكاتيون (CDMPR و CIMPR) ، مما يوفر هيدرولازات ليزوزومية مركبة حديثا من TGN إلى الجسيمات الداخلية المتأخرة والجسيمات الحالة^6،7،8 ، Wntless (WLS) ينقل روابط Wnt إلى سطح الخلية^{9 ، 10،11،12} أو TGN46 الذي يرافق بروتينات الشحن الإفرازية القابلة للذوبان ، بما في ذلك عامل البنكرياس المنظم (PAUF) وشحنات CARTS الأخرى ، من TGN^{13،14،15،16}. في حين أن جميع مستقبلات الشحن هذه تتنقل عبر TGN لجمع بروتينات عميل جديدة ، فإن مستقبل الترانسفيرين (TfR) الذي يستوعب الترانسفيرين المرتبط بالحديد مستبعد من عودة جولجي^{17،18،19،20،21}.

للتحقيق في حركة المرور الداخلية والرجعية ، أنشأنا سابقا مجموعة أدوات قائمة على الأجسام النانوية مصممة لتسمية وتتبع بروتينات الشحن من سطح الخلية إلى المقصورات داخل الخلايا¹⁷. تشكل الأجسام النانوية فئة جديدة من مواد رابطة البروتين المشتقة من الأجسام المضادة ذات السلسلة الثقيلة فقط المتجانسة (hcAbs) الموجودة بشكل طبيعي في الإبل والأسماك الغضروفية^22،23. إنها تمثل مجال السلسلة الثقيلة المتغير (VHH) لقوات hcAbs وتوفر العديد من المزايا مقارنة بالأجسام المضادة التقليدية (على سبيل المثال ، IgGs): فهي أحادية ، صغيرة (~ 15 كيلو دالتون) ، قابلة للذوبان بدرجة عالية ، تفتقر إلى روابط ثاني كبريتيد ، ويمكن التعبير عنها بكتيريا ، وقابلة للاختيار للربط عالي التقارب²⁴. لتعزيز التنوع والتطبيق الواسع لمجموعة أدوات الأجسام النانوية هذه ، استخدمنا الأجسام النانوية الوظيفية المضادة ل GFP لتسمية البروتينات السطحية وتتبع العلامات بعلامات GFP على مجالاتها خارج الخلية أو التوجه. من خلال الاقتران المؤتلف للأجسام النانوية مع mCherry أو الأسكوربات بيروكسيداز 2 (APEX2) أو تسلسل كبريتات التيروزين ، يمكن تحليل الاتجار الرجعي لبروتينات الشحن عبر الغشاء حسنة النية عن طريق الفحص المجهري الفلوري الثابت والخلوي الحي ، أو الفحص المجهري الإلكتروني ، أو المقايسات الكيميائية الحيوية باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي. بالنظر إلى أن كبريتات التيروزين ، التي يتم تحفيزها بواسطة بروتين التيروزيل سلفوترانسفيراز TPST1 و TPST2 ، هي تعديل ما بعد الترجمة يقتصر على trans-Golgi / TGN ، تتيح هذه الإستراتيجية التقييم المباشر لديناميكيات النقل والحركية من سطح الخلية إلى حجرة جولجي^25،26،27. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتوسيع هذه الذخيرة من مواد ارتباط البروتين الوظيفية لتشمل الأجسام النانوية المشتقة المضادة للشري. أثبتت هذه الكواشف فعاليتها في تشريح مسارات النقل المعتمدة على الآلات ل MPRs ، ولا سيما CDMPR^17،28 ، إلى TGN من خلال التحليلات الكيميائية الحيوية.

بينما ركزت الدراسة السابقة بشكل أساسي على تطبيق الأجسام النانوية المعدلة بتسلسل كبريتات التيروزين لتقييم وصول TGN كيميائيا حيويا عن طريق التصوير الشعاعي^{الذاتي 19} ، تصف مقالة الطرق هذه توليد الأجسام النانوية الوظيفية ذات العلامات الفلورية (VHH-mCherry) وخطوط الخلايا المراسلة لتصوير الخلايا الحية للاتجار بالخلايا الداخلية. بالاقتران مع بروتين مراسل الفلورسنت الإضافي المقيم في جولجي ، يمكن تكييف هذا البروتوكول بشكل أكبر ليكون بمثابة سير عمل قوي للتحليل الكمي للتصوير الكمي للخلايا الحية لنقل الجسيم الداخلي إلى TGN لبروتينات الشحن المختارة.

قبل تطبيق هذا البروتوكول ، يجب على الباحثين التأكد من التعبير عن البروتين المستهدف كبنية اندماج تحمل علامة GFP ، والتي يتم إنشاؤها عادة بواسطة مناهج الاستنساخ الجزيئي القياسية. يمكن إنتاج الأجسام النانوية الوظيفية بسهولة في البكتيريا بعوائد كافية لتجارب وضع العلامات على السطح ، مع تركيزات العمل في النطاق النانومولي المنخفض المناسبة لمعظم فحوصات تصوير الخلايا الحية. يجب على المستخدمين أيضا مراعاة أن حركية النقل قد تختلف بين بروتينات الشحن ، مما يتطلب تعديل مدة وضع العلامات أو تردد التصوير من أجل التصور الأمثل للاتجار الداخلي أو الجسيم الداخلي إلى TGN.

1. التحول البكتيري مع VHH-mCherry

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للتعبير عن الأجسام النانوية الوظيفية المضادة ل GFP وتنقيتها وتحليلها كما هو موضح سابقا¹⁷. يتم تكييف الخطوات التالية مع VHH-mCherry وتتسق مع التقرير المنهجي^{السابق 19}.

1. قم بإذابة البكتيريا المختصة كيميائيا (50-100 ميكرولتر) المناسبة للتعبير عن البروتين (على سبيل المثال ، خلايا الإشريكية القولونية Rosetta BL21 (DE3)) عن طريق وضعها على الجليد.
   ملاحظة: قم بإعداد الخلايا البكتيرية المؤهلة للعلاج الكيميائي باتباع البروتوكولات المعملية القياسية. يمكن استخدام خلايا BL21 (DE3) المتوفرة تجاريا من NEB لهذا الغرض.
2. أضف 50 نانوغرام من البلازميد الذي يشفر بنية VHH-mCherry الوظيفية (Addgene # 109421). لضمان التكوين البيوتينيل الفعال الخاص بالموقع لمراسل الجسم النانوي أثناء التعبير البكتيري ، قم بالتحويل المشترك مع زيادة ثلاثة أضعاف (150 نانوغرام) من البلازميد الذي يشفر البيوتين البكتيرية ليجاز BirA (Addgene # 109424). حرك الأنبوب برفق 4x-5x لخلط الخلايا والحمض النووي البلازميد.
   ملاحظة: التحول المشترك مع البلازميد المشفر BirA ليس ضروريا إذا لم يكن البيوتينيل بواسطة الببتيد المتقبل للبيوتين (BAP) مطلوبا.
3. احتضن الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة. تجنب الإثارة خلال هذه الخطوة.
4. صدمة حرارية الخلايا البكتيرية عن طريق وضعها لمدة 20 ثانية بالضبط عند 42 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة تسخين.
5. أضف 1 مل من وسط مرق لوريا بدرجة حرارة الغرفة (RT) (LB) واحتضن البكتيريا المحولة في شاكر حراري (250-500 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعبير المظهري لجينات مقاومة المضادات الحيوية.
   ملاحظة: لتحضير 1 لتر من الوسط ، أضف 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 10 جم من التربتون ، و 10 جم من كلوريد الصوديوم وقم بتعويض الحجم بالماء ، وقم بتعقيمها عن طريق التعقيم.
6. قم بإزالة البكتيريا بالطرد المركزي عند 11,000 × جم لمدة 1 دقيقة وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسط LB الطازج. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات.
7. ضع البكتيريا العالقة على ألواح LB دافئة مسبقا تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال ، مع 50 ميكروغرام / مل كانامايسين ؛ إذا تم تحويلها بشكل مشترك مع BirA ، فقم أيضا بتضمين 50 ميكروغرام / مل كاربينيسلين ، انظر الخطوة 1.2).
8. احتضان ألواح LB المكملة بالمضادات الحيوية رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية لمدة 13-15 ساعة.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين الألواح ذات المستعمرات المزروعة عند 4 درجات مئوية وإغلاقها بغشاء قابل للاختراق لمنع الجفاف.

2. ثقافة السائل البكتيري وتحريض تعبير VHH-mCherry

1. اختر مستعمرة بكتيرية واحدة من لوحة التحويل وقم بتلقيحها في قارورة Erlenmeyer تحتوي على 20 مل من وسط LB المكمل بالمضادات الحيوية. احتضان المزرعة في حاضنة اهتزاز لمدة 13-15 ساعة عند 37 درجة مئوية (انظر أيضا الخطوة 1.7 فيما يتعلق بالمضادات الحيوية المختارة).
2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف المزرعة البكتيرية التي يبلغ وزنها 20 مل طوال الليل في قارورة جديدة تحتوي على 1 لتر من وسط LB مع المضادات الحيوية المختارة المقابلة.
3. استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية حتى تصل المزرعة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) من 0.6-0.7.
   ملاحظة: اترك المزرعة لتبرد إلى RT أو إلى 16 درجة مئوية قبل تحريض تعبير البروتين.
4. تحفيز التعبير عن VHH-mCherry (و BirA ، إذا تم التعبير عنه بشكل مشترك) عن طريق إضافة 1 مل من 1 M من الأيزوبروبيل-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) لتحقيق تركيز نهائي قدره 1 ملي مولار من المحفز (1: 1000 تخفيف). إذا تم إجراء التحويل المشترك مع بلازميد تعبير BirA ، فقم أيضا باستكمال المزرعة ب 10 مل من محلول مخزون D-biotin 20 ملي مولار ، مما ينتج عنه تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومتر D-biotin في وسط النمو. هذا يسهل الطباعة الحيوية في الجسم الحي لحاتمة متقبل البيوتين (BAP) الموجودة في بنية VHH-mCherry
   ملاحظة: قم بإعداد مخزون D-biotin في ddH₂O وإذابته عن طريق الإضافة التدريجية ل 500 ملي هيدروكنوميك_{الصوديوم 2}PO₄.
5. احتضان مزرعة 1 لتر التي يسببها IPTG لمدة 13-15 ساعة عند 16 درجة مئوية لتعزيز طي البروتين وإنتاجيته الأمثل.
   ملاحظة: قد تتطلب شروط التعبير لتركيبات الأجسام النانوية المصممة حديثا مع علامات الفلورسنت الأخرى تحسينا تجريبيا من قبل المحقق.
6. انقل المزرعة إلى زجاجة طرد مركزي سعة 1 لتر وخلايا الحصاد عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. تخلص من المادة الطافية في النفايات الحيوية السائلة المناسبة واستمر في خطوات التنقية.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة عن طريق تخزين الحبيبات البكتيرية عند -80 درجة مئوية. عادة ما تظهر حبيبات VHH-mCherry باللون الوردي ، مما يشير إلى الطي المناسب لبروتين الاندماج الفلوري.

3. تنقية VHH-mCherry المستندة إلى IMAC

1. إذا لزم الأمر, قم بإذابة الحبيبات البكتيرية المجمدة على الثلج (انظر أيضا الخطوة 2.6).
2. أضف 30 مل من المخزن المؤقت المرتبط المثلج (20 ملي مولار إيميدازول في 1x PBS) إلى حبيبات الخلية البكتيرية وأعد تعليقه جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. انقل المعلق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مسمى
3. استكمل الخلايا المعلقة ب 200 ميكروغرام / مل ليزوزيم ، و 20 ميكروغرام / مل DNase I ، و 1 ملي مولار MgCl_{2 ،} و 1 ملي مولار فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF). احتضن الخليط لمدة 10 دقائق عند RT ، متبوعا بساعة واحدة عند 4 درجات مئوية على محور دوار من طرف إلى طرف.
   ملاحظة: PMSF سامة. إعداد والتعامل مع محاليل المخزون في غطاء الدخان الكيميائي يرتدي قفازات ومعطف مختبر وحماية للعين. تخلص من النفايات المحتوية على PMSF في حاويات النفايات العضوية المهلجنة بالنسبة للتجارب ، تم استخدام محلول مخزون 0.1 M وتخفيفه بشكل أكبر.
4. تعطيل الخلايا البكتيرية ميكانيكيا باستخدام آلة صوتية طرف يتم إدخالها مباشرة في المعلق. تطبيق ثلاثة نبضات صوتنة ثابتة لمدة 1 دقيقة, السماح بفاصل زمني للتبريد 1 دقيقة بين كل نبضة مع إعدادات الصوتيات المحددة (حجم طرف المسبار: 6 مم, طرف صلب; السعة 40٪ ؛ دورة العمل (وضع النبض): 1 ثانية تشغيل/1 ثانية إيقاف)
5. قم بتوضيح المحلل عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة لحبيبات بقايا الخلايا البكتيرية والبكتيريا السليمة.
   ملاحظة: يمكن نقل المحلل إلى زجاجة جهاز طرد مركزي أو تحويله إلى أنابيب سعة 5 مل للطرد المركزي على الطاولة
6. انقل المادة الطافية الناتجة بعناية إلى أنبوب جديد سعة 50 مل وتخلص من الحبيبات في النفايات الحيوية المناسبة.
7. احتفظ بالمحللة التي تم تطهيرها على الجليد أثناء التحضير لكروماتوغرافيا التقارب المعدني الثابت (IMAC). لعزل الأجسام النانوية الموسومة بالهيستيدين ، استخدم أعمدة تنقية His-tag المعبأة مسبقا وذات الاستخدام الواحد المحسنة لتشغيل تدفق الجاذبية.
8. قم بتأمين أعمدة Ni-NTA (حمض النيكل - نتريل تريوسيتيك) على حامل معدني أو حامل عمود مناسب.
   1. قم بتصريف المخزن المؤقت للتخزين من الأعمدة ووازنها مع 10 مل من المخزن المؤقت للربط (20 ملي مولار إيميدازول في 1x PBS).
   2. السماح للمخزن المؤقت بالمرور عن طريق الجاذبية ؛ تخلص من التدفق كنفايات حيوية.
9. ضع تدريجيا المحلل البكتيري الذي تم تطهيره (~ 30 مل) على العمود. دعها تتدفق عن طريق الجاذبية وتخلص من التدفق.
10. اغسل العمود بحجمين متتاليين 10 مل من المخزن المؤقت للربط (20 ملي مولار إيميدازول في 1x PBS).
11. قم بإزالة الأجسام النانوية المرتبطة ب 2 مل من المخزن المؤقت للشطف (500 ملي مولار إيميدازول في 1x PBS) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
12. قم بإجراء تبادل مخزن مؤقت.
    1. قم بموازنة عمود تحلية يوضع في محول أنبوب 50 مل عن طريق شطف 5x ب 5 مل من 1x PBS.
    2. السماح للمخزن المؤقت بالدخول بالكامل إلى الراتنج المعبأ ؛ تجاهل التدفق. بعد غسل PBS النهائي ، قم بطرد مركزي العمود عند 1,000 × جم لمدة دقيقتين.
    3. تجاهل التدفق. ضع العمود مع المحول على أنبوب جديد سعة 50 مل. قم بتحميل 2 مل من الجسم النانوي الوظيفي الممسول (من الخطوة 3.11) على عمود تحلية PBS الموازن وقم بالتدوير عند 1,000 × جم لمدة دقيقتين واجمع التشويه.
       ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك استخدام غسيل الكلى لتبادل المخزن المؤقت.
13. حدد تركيز بروتين VHH-mCherry المنقى باستخدام حمض البيسينشونيك (BCA) أو مقايسة برادفورد وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: من أجل امتصاص الأجسام النانوية بكفاءة في تطبيقات تصوير الخلايا الحية ، يوصى بتركيز نهائي للمخزون من 5-10 مجم / مل.

4. التحقق من صحة تعبير VHH-mCherry ونقائها (تلطيخ Coomassie)

1. قم بإعداد جل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم بنسبة 10٪ (SDS-PAGE) وفقا لبروتوكولات المختبر المعمول بها.
   ملاحظة: كبديل ، يمكن استخدام المواد الهلامية التدرج مسبقة الصب المتوفرة تجاريا من Bio-Rad للراحة والاستنساخ.
2. Aliquot 20 ميكروغرام من VHH-mCherry المنقى في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وقم بتفكيك طبيعته عن طريق الغليان في مخزن مؤقت للعينة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. قم بتحميل عينة الجسم النانوي المشوه على هلام SDS-بولي أكريلاميد وقم بإجراء الرحلان الكهربائي باتباع إجراءات PAGE القياسية حتى تصل صبغة التتبع (على سبيل المثال ، البروموفينول الأزرق) إلى قاع الجل الحل.
4. استمر في تلطيخ Coomassie وإزالة الجل.
   1. قم بإزالة الجل بعناية من الكاسيت واغمره في محلول تلطيخ Coomassie (5٪ من مخزون Coomassie Brilliant Blue سعة 10 جم / لتر في 10٪ حمض الأسيتيك و 45٪ ميثانول في ddH₂O) لمدة 20-30 دقيقة في RT على منصة رج بلطف. تأكد من غمر الجل بالكامل في محلول التلوين.
   2. قم بإزالة الجل باستخدام محلول إزالة التلطيخ (7.5٪ حمض الأسيتيك و 15٪ ميثانول في ddH₂O) ، وقم بإجراء 2-3 غسلات متسلسلة لمدة ساعة واحدة لكل منهما في RT. لتقليل الخلفية الأمثل ، اترك الجل لمدة 13-15 ساعة في محلول إزالة صبغة طازج.
      ملاحظة: يمكن امتصاص الصبغة الزائدة بشكل فعال عن طريق وضع مناشف ورقية منزلية حول الجل أثناء عملية إزالة الصبغة. تحتوي محاليل التلوين / التلطيخ على ميثانول قابل للاشتعال وحمض الخليك المهيج. استخدم في غطاء الدخان ، وارتد القفازات والنظارات الواقية ، واجمع المحاليل المستهلكة في حاويات نفايات سائلة قابلة للاشتعال مخصصة.
5. تخيل الجل باستخدام نظام توثيق الجل أو الكاميرا التي تختارها.
   ملاحظة: للحصول على تأكيد إضافي لتعبير الأجسام النانوية ، يمكن إجراء التنشيف المناعي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالحاتمة (انظر أيضا الشكل 1 ج).

5. إنشاء خطوط خلايا HeLa المراسلة الموسومة ب GFP باستخدام نقل الفيروسات القهقرية

ملاحظة: تم إنشاء العديد من خطوط خلايا HeLa α Kyoto (تسمى هنا ببساطة HeLa أو HeLa α) مسبقا¹⁷. لغرض إظهار مقايسة تصوير الخلايا الحية ، يتم استخدام CDMPR أو TfR الموسومة بعلامة GFP ، كبروتينات شحن تمثيلية. في حين أن بروتينات TM ذات الطوبولوجيا من النوع الأول تحمل علامة GFP في نهاية N القصوى ، فإن بروتينات TM ذات الطوبولوجيا من النوع الثاني تتطلب اندماج GFP الطرفي C.

1. تم استنساخ الجينات المشفرة ل EGFP-CDMPR (Addgene # 182642) أو TfR-EGFP (# 243763) سابقا في ناقل الفيروسات القهقرية pQCXIP باستخدام تقنيات استنساخ إنزيم التقييد القياسية¹⁷. بعد التحول إلى بكتريا قولونية ذات كفاءة كيميائية ، قم بإعداد الحمض النووي البلازميد عالي النقاء باستخدام مجموعات إعداد ميدي (على سبيل المثال ، من Macherey-Nagel).
   ملاحظة: يجب تحضير الخلايا البكتيرية المؤهلة للعلاج الكيميائي وفقا لبروتوكولات المختبر القياسية. يمكن استخدام NEB 5-alpha Efficient E. coli من NEB للاستنساخ وتنقية البلازميد.
2. لإنشاء خطوط خلايا HeLa مستقرة لمراسل GFP ، يتم إنتاج جزيئات الفيروسات القهقرية عن طريق تعداء خط خلية التعبئة والتغليف Phoenix ampho. يتم إجراء جميع أعمال زراعة الخلايا في ظل ظروف التدفق الصفحي BSL2.
   1. في اليوم السابق للتعداء ، قم بزرع 2.0-3.0 × 10⁶ خلايا أمفو من طائر الفينيق في طبق بطول 10 سم في 10 مل من الوسط لتحقيق التقاء 60٪ -80٪ بحلول اليوم التالي. يتم الحفاظ على أمفو فينيكس في غلوتا ماكس I عالي الجلوكوز DMEM مع 10٪ مصل بقري الجنين (FBS) ، و 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 1 ملي بيروفات الصوديوم.
   2. في يوم التعداء ، استبدل الوسط ب 10 مل من الوسط الطازج الكامل.
   3. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، اجمع بين 1 مل من الجلوتاماكس I عالي الجلوكوز الخالي من المصل والمكملات الغذائية مع 10 ميكروغرام من pQCXIP-EGFP-CDMPR أو pQCXIP-TfR-EGFP و 30 ميكرولتر من كاشف تعداء FuGENE HD. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات.
   4. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح بتكوين مجمعات كاشف الحمض النووي.
   5. أضف خليط التعداء بالكامل بالتنقيط إلى مزرعة أمفو فينيكس. قم بتدوير اللوحة برفق لتوزيع المجمعات بالتساوي.
   6. احتضان خلايا أمفو العنقاء المنقولة لمدة 13-15 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظة: يمكن استخدام خطوط خلايا تغليف بديلة، شريطة أن تكون متوافقة مع نظام ناقلات Retro-X Q.
3. في اليوم التالي ، تخلص من وسط التعداء واستبدله ب 7 مل من الوسط الكامل الطازج لتعزيز إنتاج الفيروس.
4. عند 48 ساعة واختياريا 72 ساعة بعد التعداء ، اجمع المادة الطافية المزرعة (~7 مل) التي تحتوي على جزيئات فيروسية باستخدام مساعدة الماصة. مراقبة تعبير GFP في خلايا أمفو Phoenix المنقولة باستخدام مجهر مضان أو نظام تصوير (على سبيل المثال ، Bio-Rad ZOE).
   ملاحظة: مرة أخرى ، تتطلب عمليات التلاعب بالفيروسات القهقرية احتواء BSL-2. قم بأداء جميع الأعمال في خزانة سلامة حيوية معتمدة ، وارتداء قفازات ، ومعطف مختبر ، وحماية للعين ، وتطهير الأسطح ب 1٪ سداسي ربع متبوعا ب 70٪ إيثانول قبل التخلص من النفايات عبر الأوتوكلاف.
5. قم بتصفية المادة الطافية الفيروسية التي تم جمعها من خلال مرشح بحجم 0.45 ميكرومتر. يمكن استخدام المادة الطافية المفلترة على الفور (انظر الخطوة 5.7) أو تخزينها عند 4 درجات مئوية للاستخدام على المدى القصير أو عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. لاحظ أن العيار الفيروسي قد ينخفض عند التجميد.
6. لإنشاء خلايا HeLa المستقرة لمراسل GFP ، تابع نقل الفيروسات القهقرية باستخدام المادة الطافية الفيروسية المفلترة. يجب تنفيذ جميع الإجراءات في ظل شروط BSL2.
   1. قبل يوم واحد من التحويل ، قم بالبذور حوالي 2.0-3.0 × 10⁶ خلايا α هيلا في طبق 10 سم مع 10 مل من الوسط للوصول إلى 60٪ -80٪ من التقاء بحلول اليوم التالي. يتم استزراع خلايا HeLa α في DMEM عالي الجلوكوز GlutaMAX-I مع 10٪ FBS و 100 U / مل من البنسلين / الستربتومايسين.
   2. امزج المادة الطافية الفيروسية المفلترة مع 15 ميكروغرام/مل بوليبرين (هيكساديميثرين بروميد) لتعزيز كفاءة العدوى.
      ملاحظة: البوليبرين هو مادة مهيجة - أثناء تحضير المخزون ، والتعامل معها بالقفازات وحماية العين ، وتجنب تكوين الهباء الجوي ، والتخلص من المحاليل المحتوية على البوليبرين كنفايات كيميائية خطرة.
   3. في اليوم التالي ، استبدل وسط النمو القياسي بمادة طافية فيروسية غير مخففة تحتوي على بوليبرين ، مما يضمن تغطية سطح الطبق بالكامل.
   4. احتضان خلايا HeLa α تحت التنبيغ لمدة 13-15 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظة: لتحديد العيار الفيروسي ، يمكن إجراء فحوصات التخفيف التسلسلي والعدوى على خلايا HeLa α. المعايرة في هذه الحالة اختيارية ، حيث تصيب الفيروسات القهقرية الخلايا المنقسمة فقط.
7. في اليوم التالي للنقل ، تخلص من الوسط الفيروسي في نفايات BSL2 واستبدله ب 10 مل من وسط HeLa α الطازج الكامل. احتضان لمدة 13-15 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
8. في اليوم التالي ، ابدأ الاختيار عن طريق استبدال الوسيط بوسط كامل يحتوي على 1.5 ميكروغرام / مل بورومايسين.
9. حافظ على ضغط الاختيار لمدة 2-3 أسابيع ، وتمر الخلايا حسب الحاجة. قبل نقل الخلايا المعدلة وراثيا إلى بيئة BSL1 ، تأكد من خلوها من الجزيئات الفيروسية المختصة بالتكاثر.
10. للحصول على مجموعة متجانسة ، استخدم إما العزل النسيلي باستخدام حلقات الاستنساخ أو الأسطوانات ، أو فرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS). يمكن إجراء FACS على خلايا HeLa α المحولة باستخدام FACSAria III أو Fusion (BD Biosciences) لإثراء السكان الذين لديهم تعبير موحد ل GFP بناء على شدة التألق.
    ملاحظة: يمكن التحقق من صحة التعبير عن مراسل GFP في خلايا HeLa α عن طريق الفحص المجهري الفلوري للخلايا الثابتة أو التنشيف المناعي باستخدام الأجسام المضادة ل GFP (انظر أيضا الشكل 2 ج).

6. امتصاص VHH-mCherry بواسطة الخلايا المستنبتة لتصوير الخلايا الحية

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع إجراءات زراعة الخلايا في ظل ظروف معقمة داخل غطاء التدفق الرقائقي قبل الفحص المجهري للخلايا الحية.

1. 6.1تحت التدفق الرقائقي المعقم ، يتم إنشاء ما يقرب من 50,000 إلى 110,000 خلية HeLa التي تعبر بثبات عن CDMPR أو TfR المسجل بعلامة GFP في كل بئر من شريحة غرفة ibiTreat ذات 4 آبار ذات μ شرائح. استخدم 700 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الذي يحتوي على مضادات حيوية (DMEM عالي الجلوكوز ، خالي من الفينول الأحمر) ، مع 10٪ FBS ، 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 2 ملي لتر الجلوتامين ، و 1.5 ميكروغرام / مل بورومايسين.
2. احتضان الخلايا لمدة 13-15 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح بالالتصاق والانتشار المناسبين. يجب أن تصل الخلايا إلى ما يقرب من 80٪ من التقاء بحلول اليوم التالي.
3. في يوم التصوير ، قبل التجربة مباشرة ، استبدل الوسط في كل بئر برفق ب 350 ميكرولتر من الوسط الكامل الطازج الخالي من الفينول الأحمر.
4. في موازاة ذلك ، قم بإعداد محلول عمل VHH-mCherry بتركيز نهائي يبلغ 2.5 ميكروغرام / مل (حوالي 50 نانومتر) في وسط دافئ مسبقا وخالي من الفينول الأحمر. حافظ على المحلول عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5. بعد تهيئة نظام التصوير الآلي للخلايا الحية (على سبيل المثال ، FEI MORE أو Nikon Ti2 X-Light V3) ، قم بتسخين غرفة حضانة المجهر مسبقا إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ قبل نقل غرفة الفحص المجهري ibidi إلى المجهر وتكوين إعدادات الاستحواذ على النحو التالي.
   1. اختر U PlanS Apo 100x NA 1.4 وأضف غرفة الفحص المجهري ibidi على مرحلة المجهر.
   2. قم بإعداد قناتين بطول موجة الإثارة المناسب ومرشحات انبعاث تمرير النطاق الفردي ل EGFP (على سبيل المثال: 470/20 نانومتر ، em: 517/20 نانومتر) و mCherry (على سبيل المثال: 550/15 نانومتر ، em: 590/20 نانومتر).
   3. اختر وقت تعريض ضوئي قصير وشدة إضاءة منخفضة لتجنب التبييض الضوئي (على سبيل المثال ، 50 مللي ثانية وطاقة 5٪ ل EGFP و 160 مللي ثانية و 25٪ ل mCherry). من المهم أن تظل القيم المختارة ثابتة لجميع التجارب.
   4. لكل شرط (= حسنا) ، قم بتخزين إحداثيات 10 مجالات عرض مختلفة مع تركيز 3-4 خلايا في قائمة نقاط.
   5. صور كل موضع في قائمة النقاط هذه مرة واحدة بلقطة واحدة. هذه هي الصور المرجعية قبل إضافة VHH-mChery.
   6. لبدء امتصاص الخلايا الداخلية، أضف برفق 350 ميكرولتر من محلول VHH-mCherry المسخن مسبقا إلى كل بئر، مما يضمن الحد الأدنى من الإزعاج للطبقة الأحادية للخلية. استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   7. صور كل نقطة في قائمة النقاط بشكل متكرر في تجربة اللقطات المتتابعة ل 100 إطار مع تأخير 36 ثانية بين الإطارات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   8. لتقليل التبييض الضوئي ، اطلب الحصول على القنوات لتصوير mCherry أولا ، ثم EGFP.
   9. لزيادة الإنتاجية ، اطلب الاستحواذ أولا على جميع المراكز بالتتابع وكرر ذلك لكل نقطة زمنية.

7. تحليل الصور لامتصاص الخلايا الداخلية VHH-mCherry

1. المعالجة المسبقة للصور بعد الحصول عليها واستخراج البيانات في فيجي.
   1. قم بتحميل صورة اللقطات المتتابعة باستخدام المكون الإضافي لمستورد التنسيقات الحيوية مع تنشيط خيار تقسيم القنوات.
   2. تصحيح الانجراف الجانبي باستخدام المكون الإضافي MultiStackReg. استخدم قناة EGFP كمرجع وقم بتطبيق التحويل على قناة mCherry أيضا.
   3. لكل خلية ، ارسم منطقة الاهتمام (ROI) باستخدام أداة المضلع (على سبيل المثال ، حول المنطقة المحيطة بالنواة) وأضفها إلى مدير عائد الاستثمار.
   4. بالنسبة لكلتا القناتين ، قم بقياس متوسط الكثافة في جميع عائد الاستثمار والنقاط الزمنية باستخدام وظيفة القياس المتعدد لمدير عائد الاستثمار واحفظ الجدول الناتج كملف نصي.
   5. افتح الصورة المرجعية المقابلة وكرر القياس لكل عائد استثمار.
2. تحليل البيانات لتحديد منحنيات امتصاص الخلايا الداخلية
   1. افتح الملف النصي واطرح كل رقم إطار على 1 بحيث يبدأ عند 0 ، ثم اضرب كل رقم إطار في التأخير بين الإطارات ب s (أي 36).
   2. لكل عائد استثمار ، اطرح متوسط الكثافة في قناة VHH-mCherry للصورة المرجعية من كل إطار من صورة الفاصل الزمني المقابلة في قناة VHH-mCherry لإزالة التألق الذاتي والخلفية.
   3. لكل إطار وعائد استثمار ، اقسم شدة VHH-mCherry المطروحة في الخلفية على متوسط كثافة قنوات EGFP لحساب تقلبات الشدة داخل عائد الاستثمار بخلاف VHH-mCherry ، على سبيل المثال ، عن طريق حركة جولجي أو تقلص الخلية أو الانجراف z أو عدم استقرار الإضاءة.
   4. تطبيع المنحنى الناتج إلى الحد الأقصى.
   5. حدد نطاقا من الإطارات لاستبعاد أي عناصر في بداية (أي إضافة الوسائط) أو نهاية (أي الانحراف، التبييض) من الفاصل الزمني.
   6. قم باحتواء بيانات المنحنى مع دالة اضمحلال أسية واحدة تقوم بنمذجة عملية حركية من الدرجة الأولى:
      
      حيث I (t) هي الشدة الطبيعية في الوقت t ، و t₀ تمثل التأخير الزمني بين إضافة VHH-mCherry وبدء التسجيل. من ثابت المعدل k ، احسب عمر النصف τ_1/2 للعملية على النحو التالي:
      
      ملاحظة: عند إجراء تجربة مع مجال رؤية متعدد (FOV) مصور لاحقا لكل نقطة زمنية ، يمكن أن يكون كل t0 المقابل مختلفا قليلا ، ولكن يجب أن يزداد إلى قيم أعلى من مجال رؤية إلى آخر.
   7. كرر الإجراء لجميع مجموعات البيانات وأبلغ عن قيم نصف العمر في مخططات الصندوق.

للتحقيق في تهريب البروتين الرجعي إلى مقصورات مختلفة داخل الخلايا ، أنشأنا مؤخرا أداة قائمة على الأجسام النانوية المضادة ل GFP لوضع العلامات على بروتينات الاندماج المؤتلف وتتبعها من سطح الخلية17. هنا ، نصف الإنتاج البكتيري لهذه الأجسام النانوية المشتقة ونوضح فائدتها في مراقبة امتصاص الخلايا الداخلية عن طريق تصوير الخلايا الحية. بالاشتراك مع مراسل الفلورسنت المقيم في جولجي ، يوفر هذا البروتوكول منصة قوية لدراسة النقل الرجعي لبروتينات الشحن المختارة إلى شبكة عبر جولجي (TGN) في الوقت الفعلي.

لقد أنشأنا مجموعة من الأجسام النانوية الوظيفية المتميزة المضادة ل GFP التي تشترك في بنية معيارية مشتركة ، باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية17. على الرغم من أن الدراسة الحالية تركز على متغير الفلورسنت VHH-mCherry ، إلا أننا نقوم أيضا بتضمين أجسام نانوية مشتقة إضافية لتوضيح تعدد استخدامات مجموعة الأدوات هذه وتسليط الضوء على إمكاناتها للتطبيقات المستقبلية. يشتمل البناء الأساسي لدينا ، VHH-std (std للمعيار) ، على مجال VHH ، وحواتم T7 و HA للكشف القائم على الأجسام المضادة ، وعلامة هيكساهيستيدين (6) للتنقية ، وتسلسل الببتيد المتقبل البيوتين (BAP) لتمكين البيوتينيل الأنزيمي ومقايسات المنسدلة القائمة على الستربتافيدين عالية التقارب (الشكل 1 أ). من هذا التصميم الأساسي ، تم تطوير العديد من مشتقات الأجسام النانوية لتسهيل دراسة الاتجار الداخلي والرجعي من خلال التحليل الكيميائي الحيوي ، وتصوير الخلايا الثابتة والحية ، والفحص المجهري الإلكتروني.

لتصوير الخلايا الحية للنقل الداخلي ، قمنا بتصميم جسم نانوي فلوري مضاد ل GFP يشتمل على فلوروفور مع أطياف الإثارة والانبعاث المتميزة عن تلك الموجودة في GFP ، وبالتالي ضمان الفصل الطيفي الأمثل أثناء الفحص المجهري الفلوري. بناء على خصائصه القابلة للطي الفائقة في الإشريكية القولونية التي يسببها IPTG وخصائصه الفيزيائية الضوئية المميزة جيدا ، اخترنا mCherry كعلامة الفلورسنت المفضلة. ستكون الفلوروفورات الأخرى المنزوعة للأحمر ، مثل بروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي (mRFP) ، بدائل مناسبة من حيث المبدأ ، لكن mCherry أثبت قوته وفعاليته بشكل خاص في هذا النظام.

ما إمكانات الأجسام النانوية الوظيفية الأخرى غير VHH-mCherry؟ للتحقيق في تهريب البروتين من غشاء البلازما إلى شبكة عبر جولجي (TGN) ، استفدنا من التوطين الخاص بالمقصورة ل TPSTs ، والتي توجد حصريا في صهاريج TGN و trans-Golgi. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتعديل VHH-std باستخدام شكل كبريتات التيروزين الترادفي (2xTS) المشتق من بروكوليسستوكينين الفئران29 ، مما يتيح قراءة كيميائية حيوية لوصول البضائع إلى هذه المقصورات. في حين أن اندماج VHH-std إلى mCherry يسمح بالتصور المباشر للانتقال الرجعي عن طريق تصوير الخلايا الثابتة أو الحية ، فإن الوظيفة باستخدام البيروكسيديز مثل APEX230 تسمح بالتوطين الفائق عن طريق المجهر الإلكتروني أو الاستئصال الكيميائي الخلوي المستهدف أو فحوصات البيوتينيل القائمة على القرب. علاوة على ذلك ، فإن دمج موقع انقسام البروتياز لفيروس حفر التبغ (TEV) في سقالة الأجسام النانوية يوفر وسيلة كيميائية حيوية للتمييز بين الأجسام النانوية الداخلية والمرتبطة بالسطح (الشكل 1 أ). لقد استخدمنا سابقا بنية VHH-tev لمراقبة حركية إعادة التدوير ل EGFP-CDMPR و TfR-EGFP17 المرتبطة بالجسم النانوي. يمكن اكتشاف عودة ظهور المستقبلات الموسومة بالأجسام النانوية على سطح الخلية بسهولة عن طريق تطبيق بروتياز TEV المؤتلف خارج الخلية ، مما يؤدي إلى فقدان محدد لكاسيت الحاتمة الطرفية C للجسم النانوي. وبالمثل ، فإن إدراج موقع انقسام TEV داخل الجسم النانوي الوظيفي mCherry المقدم هنا يسمح بالتقييم الديناميكي لإعادة تدوير مراسل EGFP عن طريق تصوير الخلايا الحية. يمكن تحقيق الوظيفة مع مجالات البروتين البديلة - مثل الفلوروفورات الإضافية أو العلامات الأنزيمية أو أشكال التسلسل لتعديل ما بعد الترجمة - بسهولة عن طريق الاستنساخ الفرعي للإدخالات المطلوبة في العمود الفقري ل VHH-std بواسطة مواقع تقييد SpeI و EcoRI. تم إيداع جميع تركيبات الأجسام النانوية المضادة ل GFP الوظيفية المستخدمة في الدراسة الأصلية17 مع Addgene للتوزيع العام.

باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، تم تنقية جميع متغيرات الأجسام النانوية الموضحة هنا إلى إنتاجية ونقاء عالية (الشكل 1 ب). فقط اندماج mCherry أظهر قصاصة تحلل البروتين الطفيفة لمجالات البروتين بعد التنقية (الشكل 1 ب ، الممر 5). من المرجح أن يتوافق منتجا التحلل المرصود مع مجالات VHH و mCherry الفردية ، كما هو مستدل من أوزانهما الجزيئية الظاهرة وتم التحقق منها عن طريق الكشف عن اللطخة المناعية الخاصة بالحاتمة (الشكل 1 ج). في حالة عدم وجود BirA المعبر عنه بشكل مشترك ، تعافى VHH-mCherry عادة بإنتاجية تبلغ حوالي 20 مجم لكل مستحضر. بناء على تجربتنا ، فإن التعبير المشترك عن BirA يقلل باستمرار من إنتاجية الأجسام النانوية بحوالي 1/3إلى 1/2. اكتمل التحليل الحيوي إلى حد ما لأن الأجسام النانوية من خليط 1: 1 مع BSA تم استردادها بالكامل بواسطة الستربتافيدين أغروز (الشكل 1 د).

لتقييم مدى ملاءمة مجموعة أدوات الأجسام النانوية هذه لدراسة النقل الداخلي ، أنشأنا خطوط خلايا HeLa مستقرة تعبر عن بروتينات مستقبلات السطح الموسومة ب EGFP مع طرق تهريب مميزة داخل الخلايا. وشملت هذه TfR ، التي تدور بين غشاء البلازما والجسيمات الداخلية المبكرة (الفرز وإعادة التدوير). TGN46 ، الذي يتحرك بين غشاء البلازما و TGN بواسطة الجسيمات الداخلية المبكرة ؛ وكل من MPRs ، التي تنقل بين TGN ، وغشاء البلازما ، وكل من الجسيمات الداخلية المبكرة والمتأخرة17. تم دمج EGFP في المجال خارج الخلية لكل مستقبل - على وجه التحديد ، تم إدخاله بين ببتيد الإشارة وتسلسل المستقبلات ل CDMPR و CIMPR و TGN46 - وإلى الطرف C ل TfR. حافظ هذا التصميم على المجالات السيتوبلازمية الأصلية ، مما يضمن بقاء جميع إشارات الفرز المعروفة سليمة وعلامة EGFP التي يمكن الوصول إليها للربط بواسطة الأجسام النانوية المضادة ل GFP خارج الخلية (الشكل 1E). بالنسبة إلى CIMPR ، الذي يكون مجاله خارج الخلية كبيرا بشكل غير عادي ، تم استخدام نسخة مقطوعة ، بما يتفق مع الدراسات السابقة التي تثبت أن هذا الاقتطاع يحافظ على سلوك الاتجار الطبيعي31،32.

تم إنشاء خطوط الخلايا المستقرة عن طريق نقل الفيروسات القهقرية ، متبوعا بفرز الخلايا المنشطة بالتألن (FACS) لعزل مجموعات الخلايا المتجانسة بمستويات تعبير معتدلة وقابلة للمقارنة. وتجدر الإشارة إلى أن EGFP-CDMPR ظهر باستمرار كنطاق مزدوج في اللطخات المناعية ، على غرار نظيره الداخلي33 ، مما يدل على الارتباط بالجليكوزيل غير المتجانس. لتقييم ما إذا كانت بروتينات اندماج EGFP تلخص أنماط توطين الحالة المستقرة والتعبير للبروتينات الداخلية ، تم استزراع الخلايا التي تعبر بثبات مع خلايا HeLa الأبوية وتحليلها بواسطة الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر (الشكل 2 ب). عكست إشارة EGFP بأمانة توزيع البروتينات الداخلية المقابلة. كما هو متوقع ، تم توطين CDMPR و CIMPR وإصداراتها الموسومة ب EGFP في الغالب إلى المنطقة المحيطة بالنواة - مما يعكس TGN والمقصورات الداخلية المتأخرة - مع وضع العلامات الإضافية في الجسيمات الداخلية المحيطية. تم العثور على كل من TGN46 الداخلي المنشأ وعلامة EGFP بشكل حصري تقريبا في TGN حول النواة ، بينما أظهر TfR و TfR-EGFP التوزيع الداخلي المبكر المميز ، مع فرز محيطي بارز وإندوسومات إعادة التدوير حول النواة. على الرغم من أن الأجسام المضادة المستخدمة اكتشفت كلا من الأشكال الداخلية المنشأ وذات العلامات EGFP (باستثناء CIMPR) ، إلا أن شدة التلوين الإجمالية لم تزد بشكل ملحوظ في الخلايا التي تعبر عن بروتينات الاندماج ، مما يشير إلى أن تركيبات EGFP لم يتم التعبير عنها بشكل كبير. قمنا بتضمين EGFP-TGN46 و EGFP-CIMPR في الشكل 2 ب للمقارنة المباشرة مع EGFP-CDMPR و TfR-EGFP. تم تحديد البروتوكولات المستخدمة لتثبيت الخلايا والتصوير المجهري الفلوري في الدراساتالسابقة 17،19.

باستخدام VHH-mCherry ، يمكن مراقبة النقل الداخلي لبروتينات المراسل الموسومة ب EGFP عن طريق تصوير الخلايا الحية. لهذا ، استخدمنا كأمثلة على الخلايا التي تعبر عن EGFP-CDMPR و TfR-EGFP. تم تصوير الخلايا بمرور الوقت باستخدام مجهر فلورسنت واسع المجال مقلوب عند إضافة VHH-mCherry إلى الوسط (الفيديو 1 والفيديو 2). تظهر الصور الثابتة في نقاط زمنية مختلفة في الشكل 3. تم قياس الامتصاص عن طريق قياس الإشارة في قناة mCherry ، وطرح خلفية التألق الذاتي ، والتطبيع إلى إشارة EGFP للتخلص من التقلبات بسبب حركة المقصورات المصنفة أو التحولات الصغيرة المحتملة في المستوى البؤري. كان مضان VHH-mCherry في الوسط عند 25 نانومتر ضئيلا ولا يتداخل مع القياسات. أسفر تحليل نقل المراسلين من سطح الخلية إلى مقصوراتهم داخل الخلايا ، إلى توزيع الحالة المستقرة ، عن نفس النتائج الحركية مثل التجارب الكيميائية الحيوية الموضحة في الشكل 2 من المنشورالسابق 17 ، مع عمر نصف واضح لامتصاص ~ 9 دقائق ل EGFP-CDMPR و ~ 4 دقائق ل TfR-EGFP ، والتشبع بعد ~ 43 دقيقة و ~ 20 دقيقة ، على التوالي. كانت هذه القيم قابلة للمقارنة مع القيم التي تم الحصول عليها من تجارب الامتصاص الكيميائي الحيوي باستخدام فحوصات التنشيف المناعي17. من حيث المبدأ ، يمكن أيضا تحليل حركية النقل الرجعي إلى المناطق تحت الخلوية ذات الأهمية ، مثل المنطقة المحيطة بالنووية ذات أعلى تركيز من MPRs. ومع ذلك ، فإن المنطقة المحيطة بالنووية لا تحتوي فقط على Golgi / TGN ولكن يتم إثرائها أيضا في الجسيمات الداخلية المتأخرة والجسيمات الداخلية إعادة التدوير حركية امتصاص الأجسام النانوية في المنطقة المحيطة بالنووية ليست محددة بما يكفي لتحليل النقل الرجعي إلى عضية محددة. لتقييم نقل غشاء البلازما إلى TGN بشكل أكثر موثوقية ، يجب التعبير عن بروتين فلوري آخر ، وهو بروتين عبر غشاء مقيم في TGN ، بشكل ثابت جنبا إلى جنب مع بروتين مراسل GFP ، بطريقة لا يوجد فيها تداخل طيفي لخصائص الفلوروفور. يسمح استخدام هذه العلامة الإضافية بالكشف عن VHH-mCherry المستورد من المراسل ، على غرار كبريتات التيروزين بوساطة TPSTs ، كما هو موثق سابقا19.

الشكل 1: تصميم وإنتاج الأجسام النانوية المشتقة لتتبع بروتينات سطح الخلية الموسومة ب EGFP. (أ) نظرة عامة تخطيطية للأجسام النانوية المشتقة. يشتمل هيكل الجسم النانوي القياسي على مجال VHH خاص ب GFP ، وعلامات حتمة T7 و HA ، وببتيد متقبل البيوتين (BAP) ، وعلامة هيكساهيستيدين طرفي C (His 6) للتنقية. تشمل متغيرات الأجسام النانوية الإضافية تعديلات مع مواقع كبريتات التيروزين الترادفية (2xTS) ، أو بيروكسيداز APEX2 المصمم هندسيا ، أو بروتين الفلورسنت mCherry. يشير شريط المقياس إلى طول الأحماض الأمينية (aa). (ب) تم تحليل الأجسام النانوية المعبر عنها بكتيريا وتنقيتها بالتقارب (20-50 ميكروغرام) بواسطة SDS-PAGE المتدرج وتصورها بواسطة تلطيخ Coomassie. يشار إلى معايير الوزن الجزيئي (بالكيلو دالتون) على اليسار. لوحظ قطع محلل البروتين الطفيف فقط ل VHH-mCherry ، والذي من المحتمل أن يحدث بين مجالات VHH و mChery. (ج) تحليل اللطخة المناعية لمستحضرات الأجسام النانوية (10 نانوغرام) باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد T7 أو HA أو حواتم6 ، أو تم اكتشافها بواسطة Streptavidin-HRP (SA-HRP) لتقييم البيوتينيل. (د) تم تقييم مدى الحقن الحيوي للأجسام النانوية عن طريق احتضان الأجسام النانوية بنسبة 1: 1 مع BSA ، متبوعا بسحب الستربتافيدين - الاغاروز ، والتكوير ، وغسل الخرز. تم تحليل أحجام متساوية من المادة الطافية (S) والمادة المرتبطة بالخرزة (B) لاحقا بواسطة تلطيخ SDS-PAGE و Coomassie. يشير الاسترداد الكمي للجسم النانوي في الجزء المرتبط بالخرزة إلى البيوتينيل الكامل. يشير وجود كل من شظايا VHH و mCherry في الجزء المرتبط إلى تدهور جزئي ، من المحتمل أن يحدث أثناء تحضير العينة لتحليل SDS-PAGE. يشير الخط الأبيض بين المسارين 2 و 3 إلى حذف مسارين غير مرتبطين. تم تعديل هذا الرقم من17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التعبير والتوطين داخل الخلايا لمستقبلات الشحن ذات العلامات الفلورية EGFP. (أ) التمثيل التخطيطي لتركيبات اندماج EGFP. يتم تصوير التسلسلات المشتقة من بروتينات الغشاء الإفرازية باللون الأسود ، مع تمييز ببتيدات الإشارة الطرفية N ومجالات الغشاء الداخلية باللون الأصفر. تم توضيح جزء EGFP باللون الأخضر. تم إنشاء تركيبات كاملة الطول ل CDMPR و TfR و TGN46 ، بينما تم استخدام متغير مقطوع جيد الخصائص ل CIMPR للحفاظ على سلوك الاتجار الطبيعي. يشير شريط المقياس إلى طول الأحماض الأمينية (aa). تم وصف EGFP-CDMPR و TfR-EGFP سابقا17. (ب) لتقييم التوطين تحت الخلوي ، تم استزراع خلايا HeLa التي تعبر بثبات عن بروتينات اندماج EGFP مع خلايا HeLa الأبوية وتحليلها بواسطة الفحص المجهري الفلوري. يمثل شريط المقياس 10 ميكرومتر. (ج) تم تحليل خلايا HeLa التي تعبر بثبات عن بروتينات المراسل الموسومة ب EGFP ، وخضعت مستخلصات البروتين ل SDS-PAGE متبوعا بالنشاف المناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP والأكتين. يشار إلى علامات الوزن الجزيئي (بالكيلو دالتون) على اليمين. تم تعديل هذا الرقم من17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تصوير الخلايا الحية لحركية امتصاص الخلايا النانوية بوساطة EGFP-CDMPR و TfR-EGFP. تم إجراء تصوير الخلايا الحية بعد إضافة 25 نانومتر VHH-mCherry إلى خلايا HeLa التي تعبر بثبات عن (أ) EGFP-CDMPR أو (ب) TfR-EGFP في وسط كامل خال من الفينول الأحمر عند 37 درجة مئوية. تم تصوير الخلايا في قنوات GFP و mCherry باستخدام مجهر مضان واسع المجال شبه آلي على فترات 36 ثانية. يتم عرض صور ثابتة مدمجة تمثيلية ، مصحوبة بمناظر مكبرة للمنطقة المحيطة بالنووية (التكبير: 2.2x) في القنوات الفردية أدناه. (قضبان المقياس ، 10 ميكرومتر.) انظر أيضا الفيديو 1 والفيديو 2. تم إجراء التحليل الكمي لحركية امتصاص الأجسام النانوية في (C) EGFP-CDMPR و (D) TfR-EGFP باستخدام بيانات من ثلاث تجارب مستقلة ، كل منها يلتقط ما يقرب من 40 خلية فردية. لحساب حركة العضية وتقلب المستوى البؤري ، تم تطبيع شدة التألق mCherry (القاعدة) إلى إشارة GFP ورسمها كمتوسط ± SD عبر جميع الخلايا من التجارب الثلاث. تم تطبيع متوسط إشارة الامتصاص القصوى إلى 1. تم تركيب حركية الامتصاص لكل خلية بشكل فردي باستخدام نموذج حركي من الدرجة الأولى. تمثل الخطوط المرسومة متوسط المنحنيات المشتقة من متوسط ثوابت المعدل المقابلة. تم تعديل هذا الرقم من17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: تصوير الخلايا الحية لامتصاص الأجسام النانوية mCherry بواسطة EGFP-CDMPR. تم تحضين خلايا HeLa التي تعبر بثبات عن EGFP-CDMPR عند 37 درجة مئوية في وسط كامل يحتوي على 25 نانومتر VHH-mCherry وتم تصويرها في كل من قناتي التألق EGFP و mCherry على فترات 36 ثانية. تم عرض الفيلم بمعدل تشغيل 5 إطارات / ثانية ، وهو ما يتوافق مع ضغط في الوقت الفعلي لمدة 3 دقائق / ثانية. تم تعديل هذا الفيلم من17. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 2: تصوير الخلايا الحية لامتصاص mCherry nanobody بواسطة TfR-EGFP. تم تحضين خلايا HeLa التي تعبر بثبات عن TfR-EGFP عند 37 درجة مئوية في وسط كامل مكمل ب 25 نانومتر VHH-mCherry وتم تصويرها ل EGFP و mCherry الفلورية على فترات 36 ثانية. تم عرض الفيلم بمعدل 5 إطارات / ثانية ، وهو ما يمثل معدل فاصل زمني يبلغ 3 دقائق / ثانية. تم تعديل هذا الفيلم من17. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.