يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استراتيجيات مقارنة لاكتشاف اليوبيكوتينيشن في محللات الخلايا الثديية باستخدام SMAD2/SMURF2 كنموذج

948 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69321

⸱

أبريل 17, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Surgery, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Department of Medical Genetics, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

يعد اليوبيكوتينيشن منظما حيويا لوظائف البروتين داخل الخلية. هنا، نصف طريقتين لتحليل الخلايا لاكتشاف مستويات اليوبيكوتينات في بروتين الركيزة في الخلايا الثديية ونقارن فعاليتهما في تحليل مستويات اليوبيكوتين. تم تحفيز فرط التعبير عن البروتين في خلايا HEK293T بواسطة النقل العابر، وتم اكتشاف البروتينات الشاملة في كل مكان بواسطة تحليل النقطة الغربية.

الملخص

اليوبيكوتين، وهو تعديل بعد الترجمة، هو منظم حيوي لوظيفة البروتين داخل الخلية. يقوم اليوبيكويتين بتعديل وظائف البروتين من خلال تعزيز تحلل البروتيازوم أو تغيير التمركز تحت الخلوي من خلال الإشارات المعتمدة على سلسلة اليوبيكويتين. هنا، نصف طريقتين لتحليل الخلايا للكشف عن مستويات اليوبيكوتينيشن SMAD2 في خلايا HEK293T ونقارن فعاليتهما في تحليل مستويات التوفيرية البروتينية. تم تحفيز فرط التعبير عن البروتين في الخلايا بواسطة النقل العابر. تمت إضافة البلازميدات (HA-Ub، FLAG-SMAD2، وMYC-SMURF2) والكواشف التحويلية بشكل منفصل إلى وسط قاعدي، وخلطها، وأضيف الخليط إلى الخلايا. قبل الحصاد، أضيف MG132 لتثبيط تحلل البروتيازوم وتعزيز تراكم البروتين الموجود في كل مكان. الاختلاف الأساسي بين النهجين التجريبيين هو طرق تحلل الخلايا بينهما - طريقة حمام الثلج (التي تجرى عند 4 درجات مئوية) وطريقة المعالجة بالحرارة (التي تتضمن الحضانة عند 95 درجة مئوية)، والتي تؤثر بشكل كبير على كفاءة تحلل البروتين. بعد الانتهاء من تحلل الخلية، تم خلط تحلل الخلية وخرز الأغاروز والجسم المضاد FLAG وحضانته عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ثم تم اكتشاف البروتينات التي تحتوي على يوبيكوتين بواسطة تحليل البقعة الغربية. قبل اكتشاف البروتينات الشاملة في كل مكان، كان يستخدم جسم مضاد خفيف السلسلة لحضانة الأجسام المضادة الثانوية. ثم تم اكتشاف أشرطة اليوبيكوتين. تظهر النتائج أن كلا من طريقة الحمام الثلجي وطريقة المعالجة بالحرارة يمكن استخدامهما للكشف عن مستويات اليوبيكوتينية، بينما قد تسهل طريقة المعالجة الحرارية اكتشاف وجود يوبيكوتينات ل SMAD2. تحدد هذه الدراسة وتقارن طريقتين لتحليل الخلايا لقياس مستويات التوبيكوتينات في الخلايا الثديية، باستخدام SMURF2/SMAD2 كنموذج، لمساعدة الباحثين في اختيار طرق أكثر ملاءمة للكشف عن مستويات الانتشار الشامل في بروتينات الركيزة.

المقدمة

اليوبيكوتين، وهو تعديل لا غنى عنه بعد الترجمة، هو منظم حيوي لوظائف البروتين داخل الخلية1. يتكون نظام اليوبيكويتين-بروتيازوم (UPS)، الذي يتوسط في تحلل أكثر من 80٪ من البروتينات في حقيقيات النوى، من اليوبيكويتين (Ub)، والإنزيمات المنشطة ل E1، وإنزيمات الاقتران E2، وليغازات E3، وإنزيمات ديوبيكويتيل (DUBs)، وبروتيسوم 26S 2. ينظم هذا النظام دوران البروتين بدقة عالية، وبالتالي يتحكم في العمليات الخلوية الأساسية مثل تقدم دورة الخلية3، نقل الإشارة 4,5، واستجابات الإجهاد 6,7. اليوبيكوتينيشن هو عملية إنزمية متعددة الخطوات. يقوم E1 بتحليل ATP ليؤدي إلى أدينيل الطرف C ل Ub، مكولا وسيطا من Ub-AMP. ثم ينقل اليوب المنشط من E1 إلى الموقع النشط للسيستين في إنزيم مترافق E2، مكونة رابطة ثيوستر. أخيرا، يقوم ليغاز E3 بتجنيد كل من مركب E2-Ub والبروتين المستهدف، مما يحفز نقل اليبون من E2 إلى بقايا الليسين على الركيزة8.

يمكن لليوبيكويتين تشكيل سلاسل متعددة من البولي يوبيكويتين من خلال الربط عند سبعة بقايا ليسين (Lys6، Lys11، Lys27، Lys29، Lys33، Lys48، Lys63) أو Met1(M1)4. كل نوع من الروابط يحدد نتائج بيولوجية مميزة: السلاسل المرتبطة ب K48 تستهدف بشكل أساسي البروتينات لتحلل البروتيازومي9، وسلاسل K63 المرتبطة ب K63 تنظم الإشارات وإصلاح الحمض النووي10،11، وسلاسل M1 المرتبطة ضرورية للاستجابات المناعية الفطرية12. اليوبيكوتينيشن وإزالة اليوبيكوتينيشن هما عمليتا تعديل محورية بعد الترجمة تحكمان أحداثا خلوية متنوعة، بدءا من تحلل البروتين إلى نقل الإشارة. على سبيل المثال، في سرطان القولون والمستقيم، يؤدي التنشيط الشاذ لنوبة p53 اليوبيكويتينية التي تتوسط MDM2 إلى تحلل مفرط ل p53، مما يضعف قدرته على تحفيز توقف دورة الخلايا والموت المبرمج، مما يدفع تقدم الورم ومقاومة الكيماويين13,14. في إصابة نقص التروية الكبدي-إعادة التروية، يقوم OTUD1 بتثبيت NRF2 عن طريق إزالة البولييوبيكويتينات المرتبطة ب K48، مما يخفف مستويات الإجهاد التأكسدي داخل الخلية15,16. دخلت مجموعة من مثبطات البروتيازوم مثل بورتيزوميب، كارفيلزوميب، وإكزازوميب، تدريجيا في الممارسة السريرية لأمراض مثل الورم النخاعيالمتعدد 17، 18، 19.

حاليا، هناك العديد من الطرق للكشف عن البروتينات الشاملة في كل مكان، بما في ذلك الغربي البلوتينج، والاختبارات القائمة على النشاط الإشعاعي، واختبارات التألق20. ومع ذلك، في البحث العلمي، تظل البقعة الغربية الطريقة المفضلة للكشف عن وجود البروتينات في كل مكان بسبب بروتوكولها السريع والمباشر نسبيا. الطرق التقليدية للكشف عن البروتينات المجمعة في اليوبيكوتينات تشبه تقنية التفاعل المناعي المشترك (co-IP): حيث تستخدم مخزن تحلل لحضانة وتحليل حبيبات الخلايا عند درجة حرارة منخفضة لإطلاق البروتينات، ثم تستخدم الأجسام المضادة للكشف عن تكوين بروتينات الركيزة21,22. ومع ذلك، غالبا ما يتطلب هذا البروتوكول التجريبي عددا كبيرا من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، وبما أن طريقة التحلل الخفيفة نسبيا عند درجات حرارة منخفضة لا يمكنها تعطيل تفاعلات البروتين تماما، فإن ذلك يزيد من احتمال حدوث نتائج إيجابية كاذبة في اليوبيكويتينيشن المكتشف. يمكن أن يؤدي التسخين واستخدام SDS إلى تعطيل كبير بنية البروتين، مما يؤدي إلى تفريغها الكامل، وبالتالي تقليل النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن تفاعلات البروتينوالبروتين 23,24,25. وبالمثل، تخضع الخلايا لكمية كافية من التحلل عند التسخين ومعالجة SDS، مما يطلق المزيد من البروتينات، وبالتالي يقلل من كمية الخلايا المطلوبة للتجربة. باختصار، تقوم طريقة الحمام الجليدي وطريقة المعالجة بالحرارة بتحليل الخلايا واكتشاف مستويات الانتشار في بروتينات الركيزة عبر حضانة الأجسام المضادة. ومع ذلك، تؤدي طريقة التسخين إلى تحلل خلوي أكبر وزيادة في تآكل البروتين.

يلعب TGF-β دورا مزدوجا في العمليات الفيزيولوجية المرضية لمختلف الأمراض 26,27. SMAD2 هو عامل نسخ حاسم في TGF-β. يستهدف التحول الشامل بواسطة SMURF2 ل SMAD2 لتحلل البروتيازومات، مما يضبط شدة إشارة TGF-βبدقة 28. تحدد هذه الدراسة وتقارن بين طريقتين لتحليل الخلايا لقياس مستويات التوفيرية في الخلايا الثديية، باستخدام نموذج SMURF2/SMAD2. هنا، تم تحفيز فرط التعبير البروتيني في خلايا HEK293T بواسطة النقل العابر باستخدام بلازميدات HA-Ub وFLAG-SMAD2 وMYC-SMURF2. تم تحلل الخلايا باستخدام طريقة الحمام الجليدي وطريقة المعالجة بالحرارة على التوالي. تم اكتشاف البروتينات التي تحتوي على يوبيكوتين بواسطة تحليل البلوت الغربي. وجدنا أن طريقة الحمام الجليدي وطريقة المعالجة بالحرارة يمكن استخدامها للكشف عن مستويات اليوبيكوتينية، وقد تجعل طريقة المعالجة الحرارية من السهل اكتشاف وجود يوبيكوتينات ل SMAD2. يوفر هذا البروتوكول بديلا جديدا للكشف عن البروتينات اليوبيكوتينية. علاوة على ذلك، بالنسبة لبعض البروتينات الركيزية المرتبطة بقوة باليوبيكوتين، تحقق طريقة المعالجة بالحرارة كفاءة تحلل البروتينات أفضل، مما يتيح الكشف بسهولة أكبر عن اليوبيكوتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير مخزن التحلل والكواشف

ملاحظة: جهز جميع المخازن عند التركيزات الموجهة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة بشأن مسطحات الكواشف لتجنب اختلافات التركيز.

  1. جهز مخزن التحلل يحتوي على 20 ملليمولايتر تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4)، 50 ملليمولار NaCl، 1 ملليمولار EDTA (رقم الهيدروجينات 8.0)، و1٪ ترايتون X-100. اضبط تركيز NaCl بين 50-150 ملليمولار إذا لزم الأمر. جهز جميع المخازن باستخدام H₂O المقطر المزدوج.
  2. جهز المحلول العامل عن طريق إضافة محلول التحلل مع كوكتيل مثبط بروتياز بنسبة 1٪ (بدون EDTA). اخلط جيدا وابق عليه على الثلج حتى الاستخدام.
  3. تحضير 10٪ SDS عن طريق إذابة 1 جرام من مسحوق SDS في 10 مل من PBS. اخلط حتى يذوب تماما. خزن في درجة حرارة الغرفة.
  4. جهز 5× محلول تحميل بروتين يحتوي على 250 ملليمولار تريس-HCl (درجة حموضة 6.8)، 10٪ SDS، 50٪ جليسرول، 0.5٪ بروموفينول أزرق، و5٪ β-ميركابتوإيثانول. قم بإذابة المكونات في ماء ماء مزدوج المقطر. اخلط جيدا قبل الاستخدام.
    ملاحظة: تعامل مع SDS و β-ميركابتوإيثانول في غطاء بخار مع ارتداء معدات الحماية المناسبة. التخلص من المواد الملوثة وفقا لإرشادات النفايات الكيميائية المؤسسية.

2. تحضير الخلايا

  1. الحفاظ على HEK293T الخلايا في DMEM عالي الجلوكوز مع مكمل 10٪ FBS و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين. الحضانة عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون تحت ظروف معقمة. خلايا المرور عند التقاء حوالي 90٪.
  2. خلايا البذور في صفائح ذات 6 آبار عند 5 × 10⁵ خلايا لكل بئر. تجمع الخلايا من بئرين لتوليد عينة واحدة.
  3. تحضير خلطات النقل لتمثيل 10٪ من إجمالي حجم الزراعة واستخدام اليوبيكوتينيشن SMAD2 كنموذج تجريبي. اجمع بين 1 ميكروغرام من بلازميد HA-Ub، و1 ميكروغرام من بلازميد FLAG-SMAD2، و0.5 ميكروغرام من بلازميد الناقل الفارغ أو MYC-SMURF2 في 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. في أنبوب منفصل، قم بتخفيف 3.75 ميكرولتر من كاشف التحويل في 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. أضف خليط الكاشف باتجاه الأسفل إلى محلول البلازميد، ثم حضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وزعه بالتساوي على الخلايا.
  4. استبدل وسط النقل بعد 6-8 ساعات ب 2 مل من DMEM الطازج الكامل لكل بئر. حضانة الخلايا لمدة 48 ساعة.
  5. عالج الخلايا ب 5 ميكرومولار MG132 لمدة 12 ساعة قبل الحصاد.
    ملاحظة: تعامل مع MG132 في خزانة السلامة الحيوية أثناء ارتداء القفازات. التخلص من المواد الملوثة وفقا لإجراءات السلامة المؤسسية.

3. جمع الخلايا

  1. احصد الخلايا عند 90-100٪ من التقاء الخلايا (~3 × 10⁶ خلايا). استنشق الوسط واغسل كل بئر ب 1 مل من PBS المبرد. أزل PBS تماما.
  2. أضف 1 مل من PBS إلى كل بئر وأعد تعليق الخلايا بلطف. انقل التعليق إلى أنبوب بسعة 1.5 مل وضعه على الثلج.
  3. الطرد المركزي عند 380 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أزل السوبرناتينت واحتفظ بالحبيبة.

4. تحضير خرزة الأغاروز

  1. نقل 50 ميكرولتر من خرزات الأروز A/G لكل عينة إلى أنبوب جديد. اغسل الخرز 3 مرات باستخدام 1 مل من محلول التحلل. الطرد المركزي عند 100 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية بين الغسلات.
  2. أزل المخزن المتبقي دون إزعاج الحبيبة. أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل و5 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة FLAG. احتضن لمدة 6 ساعات عند 4 درجات مئوية مع دوران لطيف.

5. تحلل الخلايا

  1. طريقة حمام الثلج
    1. أضف 500 ميكرولتر من محلول العمل المبرد مسبقا إلى الحبيبة. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.
    2. سونيكيت بقوة 2 واط باستخدام 4 دورات تشغيل وأربع ثوان توقف لخمس تكرارات. احتفظ بالعينات على الثلاجة أثناء السونيكشن. أعد العينات إلى الثلج لبقية فترة الحضانة.
      ملاحظة: في حالة التفاعلات البروتينية الضعيفة، قلل تركيز NaCl إلى 50-75 ملليموتر وتجنب السونيكشن.
  2. طريقة المعالجة الحرارية
    1. أضف 45 ميكرولتر من محلول العمل إلى الحبيبة. أضف 5 ميكرولتر من 10٪ SDS مع المزج المستمر.
    2. دوامة لفترة وجيزة وتسخن عند 95 درجة مئوية حتى يصبح التعليق شفافا وسائلا بالكامل. قم بعكس الطلاء بشكل متقطع لضمان إزالة الطبيعة بشكل موحد.
    3. أضف 450 ميكرولتر من محلول العمل. سونيك بقوة 2 W باستخدام 4 دورات تشغيل وأربع ثوان توقف لمدة خمس تكرارات مع إبقاء العينات على الجليد.
      ملاحظة: تأكد من بقاء تركيز SDS النهائي <0.1٪. تأكيد التحلل الكامل من خلال التحقق من اختفاء الحبيبات المرئية ووضوح المحلول الموحد.

6. التقرب المناعي واكتشاف التوبيكوتينات

  1. يقوم جهاز الطرد المركزي بتحلل 13,680 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد.
  2. احتفظ ب 60 ميكرولتر من اللايزات وأضف 15 ميكرولتر من مخزن تحميل 5×. سخن على 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وضع علامة على المدخل.
  3. أضف 100 ميكرولتر من خرزات الأجسام المضادة إلى ما تبقى من اللايزات (الحجم النهائي 540 ميكرولتر). حضن عند 4 درجات مئوية لمدة 8-12 ساعة مع التناوب.
  4. خرزات الطرد المركزي عند 100 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام محلول التحلل. أضف 75 ميكرولتر من 1× SDS تحميل وسخن على 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ليتم إلقاء البروتينات. التصنيف كملكية فكرية.
  5. اكتشاف البروتينات الشاملة بواسطة ويسترن بلوت وفقا لبروتوكول JoVE القياسي.
    ملاحظة: راجع بروتوكول النقطةالغربية رقم 29 لإجراءات النقل والكشف التفصيلية. تم توفير البقع الكاملة غير المقطوعة مع مؤشرات الوزن الجزيئي في الملف التكميلي 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بصفته "رسول جزيئيا" في مسار إشارة TGF-β، يشكل SMAD2، بعد فسفرته بواسطة مستقبلات TGF-β، مركبا مع SMAD3 وSMAD4، وينتقل إلى النواة، ويبدأ نسخ الجينات المستهدفة30 في المراحل اللاحقة. لذا فهي جزيء رئيسي يربط الإشارات خارج الخلية بالتعبير الجيني داخل الخلية. يتم تحلله بواسطة SMURF2، وهو ليغاز يوبيكويتين E3 يحفز تعدد اليوبيكويتين للبروتين المستهدف، مما يستهدفه لتحلل البروتيازومات. هذا التحلل الذي يتوسط SMURF2 ل SMAD2 ضروري لإنهاء إشارات TGF-β، ومنع التنشيط المفرط للجينات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعرض هذه الدراسة وتقارن بين بروتوكوليكي تحليل البروتين التفصيليين المحسنين خصيصا للكشف عن التوفيرية الشاملة للركيزة التي توسطها ليغاز E3. لضمان قابلية الكشف، استخدمنا فرط التعبير القائم على البلازميدات (مثل SMAD2 أو SMURF2 أو Ub) في الخلايا، والذي وفر مستويات كافية من البروتين لرؤية إشارات اليوبيكوتينيشن المحددة، وهو أمر حاسم للتحقق من تفاعلات ليغاز E3 مع الركيزة في هذه الدراسة. قبل حصاد الخلايا، أضيف MG132، وهو مثبط قوي للبروتيازوم، لمنع التحلل الناتج عن البروتيازوم للبروتينات اليوبيكوت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه الدراسة البحثية المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين، الأرقام 82370647 (W.H.)، ورقم 82170642 (J-X). Z)، رقم 81801923 (X-F. Z)، رقم 81670575 (J-X. Z)، أرقام 81570570 (W.H.) ورقم 81070355 (J-X. Z)، وبرنامج فريق شباب HUST الأكاديمي الحدودي، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا (2018QYTD02). المؤسسة المفتوحة لمختبر هوبي الرئيسي للطب التجديدي والبحث الترجمي متعدد التخصصات (2022zsyx003). البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2024YFA1107601).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب دقيق بسعة 1.5 ملسيرفيسبيوEP-150-M
طبق مزروع معالج ب TC بقطر 100 ممسيرفيسبيوCCD-100
قرص 6-بئرسيرفيسبيوCCP-6H
الأجسام المضادة المضادة FLAGبروتين تك20543-1-APاستخدم التخفيف 1:200 لبروتوكول الإنترنت 1:10000 لواير بيك
الأجسام المضادة المضادة ل GAPDHبروتين تكMA5-15738التخفيف المستخدم 1:10000
الأجسام المضادة المضادة ل HAبروتين تك51064-2-APالتخفيف المستخدم 1:10000
الأجسام المضادة المضادة ل-IgGCST#3900تم استخدام التخفيف بنسبة 1:200 لبروتوكول الإنترنت
الأجسام المضادة المضادة ل MYCبروتين تك60003-2-Igالتخفيف المستخدم 1:10000
الأجسام المضادة المضادة ل SMAD2CST#5339استخدم التخفيف 1:200 لبروتوكول الإنترنت 1:2000 ل WB
بروموفينول الأزرقسيرفيسبيوGC307006-5 جرام
EDTA (pH=8.0)سيرفيسبيوG1207-1L
FBSABW
الجلسرولسينوفارم10010618
حمام جاف للتدفئة/التبريدقوتشنغ
HEK293T الخلاياATCCCRL-3216
DMEM عالي الجلوكوزسيرفيسبيوG4515-500ML
سلسلة خفيفة IgG مضادة للفأر من نوع HRP الموصلة إلى الماعز  أبكلونالAS062التخفيف المستخدم 1:5000
سلسلة خفيفة IgG مضادة للأرانب مع HRP متصلة ب HRP&nb;أبكلونالAS061التخفيف المستخدم 1:10000
Lipo8000بيوتايمC0533
MG132علاء الدينM421264
الطرد المركزي الدقيقلابجيكCF1524R
مسحوق NaClسيرفيسبيوGC102004
PBS سيرفيسبيوG4202-500ML
pCMV-FLAG-SMAD2للتعبير الثديي
pCMV-HA-Ubللتعبير الثديي
pCMV-MYCللتعبير الثديي
pCMV-MYC-SMURF2للتعبير الثديي
البنسلين-ستربتوميسينسيرفيسبيوG4003-100ML
كوكتيل مثبط البروتيز بدون EDTAتارجت مولC0001
خرزات الأغاروز البروتينية A/GبيوتايمP2017
غشاء PVDFفايزميE801
مسحوق SDSسولاربيولوجياS8010-500g
نظام SDS-PAGEإيرفيسيبيوBVE4-BVT4
سونيكسخلية أوبرا
مسحوق تريس-HClبيوتوبيدHST-0372
ترايتون X-100سيرفيسبيوGC204003-100 مل
تريبسنسيرفيسبيوG4021-100ML
خلاط الدوامةتبرع بلطف من فايزمي
β-ميركابتوإيثانولعلاء الدينM301573

المراجع

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  2. Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
  3. Fulcher, L. J., Batley, C., Sobajima, T., Barr, F. A. Time as a danger signal promoting G1 arrest after mitosis. Trends Cell Biol. 36 (2), 142-153 (2025).
  4. Gao, L., et al. The mechanism of linear ubiquitination in regulating cell death and correlative diseases. Cell Death Dis. 14 (10), 659(2023).
  5. Serratore, V., Lucibello, M., Malanga, D., Viglietto, G., De Marco, C. Akt and DUBs: A bidirectional relationship. Cell Mol Biol Lett. 30 (1), 77(2025).
  6. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends Biochem Sci. 42 (11), 873-886 (2017).
  7. Liu, J. Z., et al. BDH2 triggers ROS-induced cell death and autophagy by promoting NRF2 ubiquitination in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 123(2020).
  8. Cappadocia, L., Lima, C. D. Ubiquitin-like protein conjugation: Structures, chemistry, and mechanism. Chem Rev. 118 (3), 889-918 (2018).
  9. Li, J., et al. ATRA upregulates OTUD6B to recruit CD8+ T cells to suppress colorectal liver metastasis by stabilizing DDX5/STAT3/CXCL11 axis. Cell Death Dis. 16 (1), 521(2025).
  10. Niu, K., et al. USP33 deubiquitinates PRKN/Parkin and antagonizes its role in mitophagy. Autophagy. 16 (4), 724-734 (2020).
  11. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. J Cell Mol Med. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  12. Guo, Y., Zhao, Y., Cong, Y. S. Met1-linked ubiquitination in cell signaling regulation. Biophys Rep. 10 (4), 230-240 (2024).
  13. Di, Y., et al. The c-Myc-WDR43 signalling axis promotes chemoresistance and tumour growth in colorectal cancer by inhibiting p53 activity. Drug Resist Updat. 66, 100909(2023).
  14. Liebl, M. C., Hofmann, T. G. The role of p53 signaling in colorectal cancer. Cancers (Basel). 13 (9), 2125(2021).
  15. Oikawa, D., et al. OTUD1 deubiquitinase regulates NF-κB- and KEAP1-mediated inflammatory responses and reactive oxygen species-associated cell death pathways. Cell Death Dis. 13 (8), 694(2022).
  16. Zhang, Q., et al. The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury. Redox Biol. 75, 103287(2024).
  17. Moreau, P., et al. Oral ixazomib, lenalidomide, and dexamethasone for multiple myeloma. N Engl J Med. 374 (17), 1621-1634 (2016).
  18. Stewart, A. K., et al. Carfilzomib, lenalidomide, and dexamethasone for relapsed multiple myeloma. N Engl J Med. 372 (2), 142-152 (2015).
  19. Zhu, Y., et al. Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metab. 36 (1), 159-175.e8 (2024).
  20. De Silva, A. R. I., Page, R. C. Ubiquitination detection techniques. Exp Biol Med (Maywood). 248 (15), 1333-1346 (2023).
  21. Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of protein ubiquitination. J Vis Exp. (30), e1293(2009).
  22. Worboys, J. D., Palazón-Riquelme, P., López-Castejón, G. Method to measure ubiquitination of NLRs. Methods Mol Biol. 2696, 105-114 (2023).
  23. DeCaprio, J., Kohl, T. O. Denaturing lysis of cells for immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 098616(2020).
  24. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Crane, J. L., Cao, X. Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling. J Clin Invest. 124 (2), 466-472 (2014).
  27. Gough, N. R., Xiang, X., Mishra, L. TGF-β signaling in liver, pancreas, and gastrointestinal diseases and cancer. Gastroenterology. 161 (2), 434-452.e15 (2021).
  28. Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β signaling. Biomolecules. 10 (3), 487(2020).
  29. The western blot. J vis exp. , e5065(2025).
  30. Wu, M., Chen, G., Li, Y. P. TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease. Bone Res. 4, 16009(2016).
  31. Jeon, S., et al. The miR-15b-SMURF2-HSP27 axis promotes pulmonary fibrosis. J Biomed Sci. 30 (1), 2(2023).
  32. Zhang, W., et al. SMURF2 predisposes cancer cell toward ferroptosis in GPX4-independent manners by promoting GSTP1 degradation. Mol Cell. 83 (23), 4352-4369.e8 (2023).
  33. Pi, Y., et al. Loss of SMURF2 expression enhances RACK1 stability and promotes ovarian cancer progression. Cell Death Differ. 30 (11), 2382-2392 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SMAD2 SMURF2 HEK293T
استراتيجيات مقارنة لاكتشاف اليوبيكوتينيشن في محللات الخلايا الثديية باستخدام SMAD2/SMURF2 كنموذج
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.