Method Article

التقييم الكمي الأمثل لاستقرار الحمض النووي الريبي المعزز في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران

DOI:

10.3791/69325

⸱

November 21st, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقيس هذا البروتوكول بشكل كمي استقرار ونصف عمر الحمض النووي الريبي المعزز بين الجينات وداخل الوراثة في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران باستخدام علاج الأكتينومايسين D، وRT-qPCR، وتحليل الانحدار غير الخطي. يتم دمج استراتيجيات تطبيع خاصة بالموقع لنمذجة ديناميكيات تحلل eRNA بدقة بطريقة تعتمد على السياق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحمض النووي الريبي المعزز (eRNAs) هو نسخ غير مشفرة تنتج من مناطق معززة نشطة في النسخ، وتعرف بشكل متزايد كمنظمات رئيسية لتعبير الجينات. على الرغم من أهميتها الوظيفية، لا تزال ديناميكيات الاستقرار والتدهور في eRNA غير موصوفة بشكل جيد، خاصة في الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)، حيث تكون برامج النسخ ديناميكية للغاية وتعتمد على السياق. يقدم هذا البروتوكول طريقة كمية لتقييم حركية التحلل ونصف عمر الحمض النووي الريبي الريبي الداخلي بين الجينات وداخل الجينات في الخلايا الدماغية الوراثية للفئران. يتم تثبيط النسخ باستخدام أكتينوميسين D، ويتم جمع إجمالي الحمض النووي الريبي في عدة نقاط زمنية محددة. يتم تصنيع cDNA باستخدام بادئات سداسية عشوائية وأوليغو(dT) لتمكين الكشف عن النسخ متعددة الأدينيل وغير متعددة الأدينيل. بالنسبة للحمض النووي الريبي الحيوي بين الجينات، يتم إجراء التطبيع باستخدام جين تنظيف المنزل أو قيمة Ct عند الزمن 0 دقيقة. بالنسبة للرنا الريبي داخل الجين، يستخدم نهج تطبيع مزدوج لتقليل التداخل الناتج عن تداخل ال mRNA الأولي. يتم تحليل منحنيات الانحلال باستخدام نموذج تحلل أسي أحادي الطور، مما يتيح تقديرا دقيقا لعمر النصف العمر. يكشف البروتوكول أن eRNA في mESCs تظهر دورانا سريعا، مع عمر نصف يقارب 2-3 دقائق. توفر هذه المنهجية إطارا قويا وقابلا للتكرار لدراسة استقرار الحمض النووي الريبي الإلكتروني، مما يوفر رؤى حول نشاط المعززات وديناميكيات الحمض النووي الريبي في سياقات الخلايا الجذعية متعددة القدرات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعززات هي عناصر تنظيمية للسيس (CREs) تنظم التعبير الجيني الخاص بالأنسجة والمحفزات من خلال العمل كمنصات ارتباط لعوامل النسخ والمنظمين المشاركين 1,2,3,4,5,6. على الرغم من أن المعززات يمكن أن تكون بعيدة عن جيناتها المستهدفة على مستوى الجينوم الخطي، إلا أن آليات حلقة الكروماتين تتيح القرب المكاني من المروجات، مما يسهل تنظيم النسخ. يتم نسخ المعززات النشطة ثنائية الاتجاه بواسطة بوليميراز RNA II (Pol II)، مما ينتج RNA طويلة غير مشفرة تعرف باسم RNA المعززة (eRNAs)، والتي عادة ما يكون طولها الوسيط حوالي 1 كيلوبايت 1,2,7,8,9. يرتبط تعبير eRNA بشكل وثيق بتنشيط الجينات المستهدفة القريبة 10,11,12، وقد أظهرت الدراسات الوظيفية باستمرار أن استنزاف eRNA يقلل من نسخ جيناتها المستهدفة، مما يشير إلى أن eRNA يعمل كمنظمات وظيفية وليس كنواتج ثانوية نسخية 13,14,15,16,17 . على الرغم من أهميتها الوظيفية، لا تزال البروتوكولات التجريبية للكشف والقياس الثقيل للحمض النووي الريبي الإلكتروني محدودة.

في الخلايا الجذعية، يلعب نشاط المعززات دورا حيويا في الحفاظ على تعدد القدرات ودفع التحولات التنموية18,19. يمكن أن تعيش المعززات في مناطق بين الوراثين (معززات بين الوراثين أو خارج الوراثة) أو تدمج داخل أجسام الجينات كمحسنات داخل الجينات8. بينما تم دراسة المعززات بين الوراثين بشكل مكثف عبر أنواع خلايا مختلفة، لا تزال المعززات داخل الجين غير مستكشفة نسبيا بسبب التحديات التقنية، مثل التداخل النسخي مع الحمض النووي الريبي المسبق للجين المضيف ووجود تعديلات الهيستون المرتبطة بالإطالة الناصقية20,21. ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن كل من المعززات بين الجينات وداخل الجينات تساهم في شبكات تنظيم الجينات المشاركة في تعدد القدرات22,23 والتمايز المبكر24 في الخلايا الوراثية الوراثية. ومن الجدير بالذكر أن ما يقرب من نصف جميع المعززات المشروحة هي داخل الجينات20,25، ويختلف نشاطها عبر مراحل النمو، وغالبا ما تزداد في الأنسجة المتمايزة 8,26,27,28. ومع ذلك، لا تزال الشائعات والأدوار الوظيفية للمحسنات داخل الوراثة في الخلايا العاطفية غير مفهومة بشكل كامل. على وجه الخصوص، بينما يتم نسخ eRNA بين الجينات، يتم نسخ eRNA داخل الجينات داخل أجسام الجينات وقد تتداخل مع نسخ ما قبل mRNA. هذا الاختلاف الموقعي يتطلب مناهج تحليلية مميزة عند تفسير وقياس الحمض النووي الريبي الداخلي بين الجينات وداخل الجينات.

على عكس mRNAs، عادة ما تفتقر eRNA إلى ذيل بولي(A) بطول 3′، مما يؤدي إلى استقرار منخفض وتدهور سريع 1,2,7,8,9. هذا عدم الاستقرار الجوهري يجعل من الصعب تحليل تعبير eRNA، خاصة في تجارب المسار الزمني. في الخلايا العصبية، تم الإبلاغ عن أن eRNA تظهر نصف عمر يصل إلى 7.5 دقيقةو17 دقيقة. ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح ما إذا كان هذا عدم الاستقرار متسقا عبر أنواع الخلايا المختلفة، خصوصا في الخلايا الكيميائية المزمنة، حيث يكون كل من نشاط المعززات ونسخ eRNA مرتبطا بنوع الخلايابشكل خاص جدا 7,17,29,30. تعتمد الخلايا التنظيمية الديناميكية على برامج تنظيم جيني ديناميكية للحفاظ على تعدد القدرات أو بدء التمايز، مما يجعلها نظاما فريدا لفحص معدل دوران الحمض النووي الريبيالإلكتروني 31,32. نظرا للتغيرات السريعة في النسخ في الخلايا الكهرومغناطيسية المستمرة، قد يكشف فهم تحلل الحمض النووي الريبي الإلكتروني في هذا السياق كيف يتم تنظيم نشاط المعززات زمنيا17. علاوة على ذلك، تتطلب الاختلافات بين الحمض النووي الريبي الوريثاني بين الجينات وداخل الجين، مثل التداخل مع نسخ جينات المضيف، أساليب تحليلية مميزة20. على الرغم من أهمية هذه الأسئلة، إلا أن هناك طرق معيارية قليلة لقياس نصف عمر eRNA في الخلايا الريفية الخلفية أو لمقارنة ديناميكيات التحلل لأنواع مختلفة من eRNA.

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا كميا لتقييم استقرار ونصف عمر الحمض النووي الريبي المسجل من المعززات بين الجينات وداخل الجينات في الخلايا الوراثية الوراثية. يتم تحقيق التثبيط النسخي باستخدام الأكتينوميسين D (ActD) على فترات زمنية محددة، يليه تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) وتحليل الانحدار غير الخطي لقياس تحلل eRNA. لمعالجة الفروق الموضعية بين المعززات بين الجينات وداخل الجينات، تدمج الطريقة استراتيجيات تطبيع مميزة، مما يتيح مقارنة منهجية ودقيقة لديناميكيات تحلل eRNA. يوفر هذا الإطار التحليلي المنظم رؤى قيمة حول دوران eRNA في الخلايا الجذعية متعددة القدرات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب في هذه الدراسة باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mESC؛ E14Tg2A) التي لم تولد مباشرة في مختبرنا بل تم الحصول عليها من خط خلوي معتمد، وهو متوفر تجاريا أيضا من ATCC (CRL-1821). لذلك، لا يتطلب العمل الموضح في هذا المقال مراجعة لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) في جامعة تشونغنام الوطنية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. زراعة الخلايا لمركبات mESC

  1. غطى ألواح زراعة الخلايا ذات 6 آبار مسبقا ب 0.1٪ جيلاتين (2 مل لكل بئر). حضن الألواح على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. استنشق الجيلاتين واغسل كل جيلاتين مرة واحدة بمحلول 1 مل من PBS. قم بتعقيم الصفائح بأشعة فوق بنفسجية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
  3. تم تركيب قطع البذور على الألواح المغطاة بالجيلاتين باستخدام 2 مل كامل من وسط زراعة الخلايا (الجدول 1).
    ملاحظة: أضف LIF طازجا إلى وسط الزراعة بتركيز مطلوب مباشرة قبل الاستخدام، بناء على الحجم الإجمالي المطلوب للتجربة.
مكوناتالتركيز النهائيالحجم المستخدم
الحد الأدنى من الوسط الأساسي في غلاسكو (GMEM)-500 مل
بديل مصل الضربة القاضية™ (KOSR)10%50 مل
البنسلين-ستربتوميسين0.50%2.5 مل
مصل البقر الجنيني (FBS)1%5 مل
بيروفات الصوديوم0.1 مللي موتر / 1٪5 مل
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (MnEA)0.1 ملميول/1٪5 مل
2-ميركابتوإيثانول0.1 مللي مولار910 uL
عامل تثبيط اللوكيميا (LIF)1000 وحدة وحدة لكل مل-

الجدول 1: تركيب وسيط ثقافة mESC. المكونات وتركيزاتها النهائية المستخدمة في تحضير وسط زراعة mESC. يتم سرد الأحجام النموذجية لكل 500 مل من الوسط الكلي.

  1. حافظ على الخلايا تحت ظروف زراعة قياسية عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (الشكل 1A).

figure-protocol-1
الشكل 1: تصميم تجريبي لتحليل استقرار eRNA. (أ) مخطط تجربة توقف النسخ (التوقف النسخي). تم طلاء الخلايا على ألواح مغطاة بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ وذات 6 آبار، وعالجت ب actD (التركيز النهائي: 5 ميكروغرام/مل) في النقاط الزمنية المحددة (0 دقيقة، 5 دقائق، 10 دقائق، 15 دقيقة، 20 دقيقة، و30 دقيقة) بعد الحصاد. (ب) تخطيط اختبار RT-qPCR. تم نسخ الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام بادئات سداسية عشوائية أو أوليغو(dT). تم تحليل عينات cDNA من كل نقطة زمنية باستخدام RT-qPCR للأهداف المشار إليها: Tbp_mRNA، eRNA بين الجينات، والحمض النووي الريبي داخل الجين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. علاج أكتينومايسين D (ActD)

  1. قم بإذابة actD في DMSO لتحضير محلول مخزوني بتركيز 1 ملغ/مل33.
    ملاحظة: بينما يستخدم أكتينومايسين D هنا للتثبيط النسخي قصير الأمد، قد تستخدم مثبطات بديلة مثل التريبتولايد لمنع بدء النسخ في الدراسات المستقبلية. نظرا لأن كل من أكتينوميسين D وDMSO حساسان للضوء، حضر المحلول المخلب في أنابيب دقيقة كهرمانية، وحمه من الضوء، وخزنه عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. بعد يومين من بذر الخلية (أو في يوم الحصاد)، أضف محلول المخزون actD إلى وسط الزراعة إلى تركيز نهائي 5 ميكروغرام/مل33. اجمع العينات بعد 0 دقيقة، 5 دقائق، 10 دقائق، 15 دقيقة، 20، و30 دقيقة بعد العلاج (الشكل 1A).
    ملاحظة: بينما تظهر معظم eRNA تحللا سريعا ضمن نطاق 0-30 دقيقة، قد تظهر بعض eRNA أعمار نصف أطول. اعتمادا على خصائص موقع الهدف، قد يتم تضمين عينات إضافية في نقاط زمنية ممتدة (مثل 1 ساعة أو 3 ساعات أو 6 ساعات) لالتقاط حركيات التآكل بدقة أكبر. في هذه الدراسة، استخدم أكتينومايسين D بتركيز 5 ميكروغرام/مل للحجب النسخي قصير الأمد (≤30 دقيقة)؛ ومع ذلك، في الحضانات الأطول (>1 ساعة)، ينصح بتقليل التركيز إلى 1-2 ميكروغرام/مل لتقليل استجابات الإجهاد الخلوي. نظرا لأن DMSO نفسه يمكن أن يؤثر على النشاط النسخي، يجب تضمين تحكم DMSO فقط.

3. استخراج الحمض النووي الريبي وتخليق cDNA

  1. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا عن طريق الشفط، وأضف 1 مل من مادة ترايزول إلى كل بئر. حضن الألواح على هزاز لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة (RT)34,35، ثم نقل الليزات إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل.
    ملاحظة: بعد علاج الثلاثيول، يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل استخراج الحمض النووي الريبي. نظرا لأن كاشف ترايزول يحتوي على الفينول وإيزوثيوسيانات الجوانيدينيوم، وهي شديدة السمية والمسببة للتآكل، تعامل معه بحذر شديد. يجب جمع جميع نفايات ترايزول في حاوية مخصصة لنفايات المذيبات العضوية للتخلص السليم.
  2. أضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل عينة. اهز الأنابيب بقوة واحتضن الأنابيب عند RT لمدة 3 دقائق.
  3. قم بعمل الطرد المركزي للعينات عند 13,500 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. انقل الطور المائي بعناية إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل يحتوي على حجم متساو من الأيزوبروبانول. حضن الخليط في RT لمدة 10 دقائق لتعزيز ترسيب RNA.
    ملاحظة: انقل بحذر فقط الطور المائي العلوي الشفاف لتجنب التلوث بالطور الداخلي. لزيادة إنتاج الحمض النووي الريبي، قم بحضن العينات عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة حتى الليل (O/N) بعد إضافة إيزوبروبانول. بالنسبة للعينات منخفضة المدخل، أضف الجليكوجين (النهائي 10-20 ميكروغرام/مل) أو GlycoBlue قبل إضافة الأيزوبروبانول لتحسين رؤية حبيبات RNA وكفاءة الاسترجاع. الأيزوبروبانول قابل للاشتعال بشدة وقد يكون ضارا بصحة الإنسان؛ قد يسبب استنشاق الأبخرة أو ملامسة الجلد أو العينين تهيج أو صداعا أو دوارا أو اكتئاب في الجهاز العصبي المركزي. تعامل بحذر، واجمع جميع الحلول المتبقية في حاوية نفايات مذيبات عضوية معتمدة للتخلص السليم.
  5. قم بعمل الطرد المركزي للعينات مرة أخرى عند 13,500 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من الفائق.
  6. اغسل حبيبات RNA الناتجة ب 1 مل من الإيثانول 75٪. الطرد المركزي عند 6,800 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: قم بقلب الأنبوب بلطف بعد إضافة الإيثانول لرفع الحبيبة.
  7. أزل الفائق بحذر وجفف الحبيبة في الهواء لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 42 درجة مئوية. أعد تعليق الحبيبات المجففة في ماء خال من RNase وحضن الحبيبات عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: عندما تكون نقاء الحمض النووي الريبي مرتفعة، قد تصبح الحبيبة البيضاء شفافة أثناء عملية التجفيف بالهواء. تجنب تجفيف الحبيبة بشكل مفرط لأكثر من 10 دقائق، لأن التجفيف المفرط قد يقلل من كفاءة إعادة التعليق.
  8. قس تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف نانودروب.
  9. تخليق cDNA من ميكروغرام من RNA باستخدام مجموعة تصنيع m-MLV cDNA، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الجدول 2).
مكوناتالحجم المستخدم 
مخزن مؤقت 10X M-MLV RT2 ميكرولتر
dNTP2 ميكرولتر
برايمر (عشوائي / أوليدو dT)1uL
إم-إل إل في آر تي1uL
مثبط RNASE0.5 ميكرولتر
عينة RNA2ug (تم تعديل الحجم بناء على تركيز عينة RNA)
جافيتم تعديل الحجم حسب تركيز عينة RNA (لتكوين الحجم النهائي)
الحجم الكلي20 ميكرو

الجدول 2: تركيب تفاعل تخليق cDNA (منسكريبتاز عكسي M-MLV). أحجام مفصلة وكواشف تستخدم للنسخ العكسي ل 2 ميكروغرام من إجمالي RNA باستخدام مجموعة تخليق m-MLV cDNA. تم تعديل حجم عينة الحمض النووي الريبي بناء على تركيزها، وأضيف DW خال من النوكلياز ليصل حجم التفاعل النهائي إلى 20 ميكرولتر.

  1. حضن تفاعل cDNA عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، ثم قم بإيقاف تنشيط الإنزيم عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: تخزين cDNA المصطنعة عند -20 درجة مئوية. التركيز النموذجي ل cDNA هو حوالي 100 نانوغرام/ميكرولتر. للكشف عن الحمض النووي الريبي الداخلي الوراثي، قم بتصنيع cDNA من نفس عينة RNA باستخدام كل من بادئات الشياطئ العشوائية وأوليغو(dT).

4. تفاعل بوليميراز متسلسل كمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)

  1. حضر خليط تفاعل بسعة 10 ميكرولتر يحتوي على 15 نانوغرام من cDNA، و5 ميكرولتر من خليط Power SYBR Green PCR الرئيسي، و5 ميكرولتر من كل برايمر، وماء مقطر (DW).
    ملاحظة: غالبا ما تحتوي مواقع eRNA على تسلسلات متكررة أو تكون مجاورة، مما يتطلب تصميما دقيقا للبرايمر. استخدم تسلسلات مأخفية بتكرار لتقييد المناطق المرشحة والتحقق من خصوصية زوج البرايمر عبر الجينوم باستخدام BLAST. عند الإمكان، أضف مناطق تحكم قريبة لاستبعاد التضخيم غير المحدد36.
  2. إجراء التضخيم باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي مع الشرط التالي للدورة الحرارية: خطوة تفعيل وإزالة الطبيعة الأولية عند 50 °م لمدة دقيقتين و95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها 40 دورة إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، وقياس التلدين، التمديد، والفلورة عند 60 درجة مئوية لمدة دقيقةو34 ثانية. 37 (الجدول 3).
مرحلةدرجدرجة الحرارة (°م)الوقتدور
مسرح الانتظارالنسخ العكسي50دقيقتان1
الإزالة البدائية9510 دقائق1
مرحلة PCRإزالة الطبيعة9515 ثانية40
التلدين/التمديد60دقيقة واحدة40
مرحلة منحنى الصهرإزالة الطبيعة9515 ثانية1
الصلب60دقيقة واحدة1
الانفصال (منحنى الانصهار)9515 ثانية1

الجدول 3: ظروف الدورة الحرارية ل RT-qPCR. ملخص ظروف درجة الحرارة والوقت والدورة للنسخ العكسي، وتفاعل qPCR لمدة 40 دورة (تفاعل 10 ميكرولتر)، وتحليل منحنى الصهر القياسي.

  1. لقياس كمية eRNA داخل الجين، قم بتحليل كل من Tbp (أو جين التحكم/التحكم الآخر) ومنطقة المعزز داخل الجين باستخدام cDNA مركب مع بادئات oligo(dT). بالنسبة للحمض النووي الريبي الكهربائي بين الجينات، استخدم فقط cDNA المركب مع بادئات سداسية عشوائية (الجدول 4 والشكل 1B).
    ملاحظة: شغل كل عينة في نسخ تقنية مكررة (بئران) للسماح بالمتوسط أثناء تحليل البيانات.
اسم الجينمسبار التمهيدالتسلسل (5'-3')أحجام المضخمات 
الملاحظةأماميTGACTCCTGGAATTCCCATC122 نقطة أساس
عكسTTGCTGCTGTGTGTGTGT
Nsun2_mRNAأماميGGATGAAGCAGTGATCGCAG93 نقطة أساس
عكسATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNAأماميTCCCTACAGCAGATCACTCAC80 نقطة أساس
عكسCGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNAأماميACAGATGCAACCGATGCACC105 نقطة أساس
عكسTGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNAأماميCCTGAGAGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT110 نقطة أساس
عكسAGGTTAACACATCAGCCCCCA
Pou5f1_eRNAأماميCACTTCTGTGTCTGTGTGTGG107 نقطة أساس
عكسCCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNAأماميAGTCAGCTACATGGGCAGAG119 نقطة قبل الأساس
عكسCCCCTCTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative التحكمأماميCCCCGTGTTTAAGAGGAATGA88 نقطة أساس
عكسACTGAGAACCAACCACACTAGCA

الجدول 4: تسلسلات تمهيدية لتحليل RT-qPCR. تستخدم تسلسلات التمهيد الأمامي والعكسي لتضخيم محدد لكل جين مستهدف في تجارب RT-qPCR. تم تحسين هذه البادئات لضمان القياس الدقيق للتعبير عن mRNA وeRNA.

5. تحليل بيانات استقرار الحمض النووي الريبي 22

  1. حلل جميع البيانات باستخدام طريقة ΔCt، وتطبيع مستويات eRNA النسبية إلى Tbp_mRNA (الملف التكميلي 1 والشكل 2A).
    ملاحظة: إذا تجاوز فرق قيمة Ct بين نسختين تقنيتين 0.5، استبعد البيانات من التحليل الإضافي. احسب مستويات التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة ΔCt عن طريق طرح قيمة Ct للجين الضابط (مثل Tbp_mRNA) من قيمة الجين المستهدف (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). يمكن بعد ذلك حساب التعبير النسبي ك 2^-ΔCt (الملف التكميلي 2B).
  2. لقياس الحمض النووي الريبي الحيوي داخل الجين، قم بتطبيع قيم التعبير عن طريق قسمة القيم من cDNA المصطنعة باستخدام سداسي العينات العشوائية على تلك الخاصة ب cDNA المركب باستخدام أوليغو (dT) بادئات.
    ملاحظة: نفذ جميع تفاعلات qPCR باستخدام ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة (n = 3).
  3. قم بتطبيع مستوى تعبير كل نقطة زمنية (تم الحصول عليه باستخدامطريقة ΔCt) إلى القيمة الصغرى 0 ورسم منحنى الانحدار.
    ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم علاج قصير بأكتينومايسين د، إلا أن التعرض المطول لمثبطات النسخ (مثل ActD) قد يقلل أيضا من تعبير جينات التنظيف. للقياس الدقيق الأعلى، نوصي بإضافة RNA خارجي مدخن (مثل ERCC) عند خطوة تحليل الخلية لتصحيح التغيرات في كفاءة استخراج RNA، وكفاءة النسخ العكسي، ودقة التوصيل، مما يمكن تطبيعا أكثر اتساقا عبر العينات38,39.
  4. رسم مستويات eRNA مطبعة مع مرور الوقت وضبطها باستخدام نموذج انحدار غير خطي (تلاشي أسي أحادي الطور) في منشور GraphPad (الملف التكميلي 3).
  5. تقدير نصف عمر الحمض النووي الريبي الأوروبي من النسخ البيولوجية الفردية.
    1. افتح منشور GraphPad واختر إنشاء > XY (الخيارات: X = أرقام؛ Y = أدخل وارسم قيمة Y واحدة لكل نقطة).
    2. أدخل نقاط التوقيت (0، 5، 10، 15، 20، و30 دقيقة) كقيم محور X.
    3. قم بإدراج أسماء العينات على محور Y (المجموعة) وأدخل قيمة البيانات الفردية المقابلة لكل نقطة زمنية.
    4. اختر تحليل > الانحدار والمنحنيات > الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى).
    5. في تبويب الأسي ، اختر نموذج تلاشي الطور الواحد .
    6. في ورقة الجدول إلى النتائج ، احسب متوسط وانحراف معياري لقيم نصف العمر لكل عينة باستخدام Excel أو برامج مشابهة. ارسم القيم الناتجة.
  6. منحنيات تراجع التوافق مع فترات ثقة 95٪
    1. افتح منشور GraphPad واختر إنشاء > XY (الخيارات: X = أرقام؛ Y = إدخال 3 قيم مكررة في أعمدة فرعية متجاورة.
    2. أدخل نقاط التوقيت (0، 5، 10، 15، 20، و30 دقيقة) كقيم محور X.
    3. قم بإدراج أسماء العينات على محور Y (المجموعة) وأدخل القيم الثلاث المكررة لكل عينة eRNA في ورقة البيانات المقابلة.
    4. اختر تحليل > الانحدار والمنحنيات > الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى).
    5. في تبويب الأسي ، اختر نموذج تحلل الطور الواحد للتحليل.
    6. في ورقة الجدول إلى النتائج، استخرج قيم فترة الثقة 95٪ (CI) التي تم الحصول عليها من تحليل العينات الثلاثية.
      ملاحظة: استخدم معادلة التحلل التالية: Y = (Y0 - هضبة) • e-kt + هضبة، حيث Y هو مستوى eRNA النسبي في الزمن t، وY0 هو مستوى eRNA الابتدائي، وk هو ثابت التحلل. لا تثبت الهضبة على الصفر أثناء تركيب منحنى eRNA، حيث تظهر الدراسات السابقة أن eRNA قد يستمر ولا يتدهور تمامامع مرور الوقت. ومع ذلك، يجب تثبيت الهضبة عند الصفر عند تحليل تحلل mRNA، وفقا لبروتوكولات mRNA السابقة41,42. السماح لمنشور GraphPad بحساب نصف عمر eRNA تلقائيا (t₁/₂) باستخدام الصيغة: t1/2 = In(2)/ k. أدخل الوقت بالدقيقة؛ أبلغ عن قيم نصف العمر الناتجة بالحد الأدنى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم استقرار الحمض النووي الريبي بعد توقف النسخ، تم علاج الخلايا الريبية المجهولة ب actD، وتم جمع إجمالي الحمض النووي الريبي في نقاط زمنية محددة (0 دقيقة، 5 دقائق، 10 دقائق، 15 دقيقة، 20 دقيقة، و30 دقيقة). بعد تخليق cDNA، تم إجراء RT-qPCR لقياس eRNA داخل الجين ل Nsun2 و Sox2، والحمض النووي الريبي بين الجينات ل Pou5f1، وmRNA المقابل لهما. تم استخدام هذه البيانات لإنشاء منحنيات تدهور تعتمد على الزمن (الشكل 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لقياس استقرار eRNA في الخلايا الميثوية. تم توضيح الخطوات التجريبية الحاسمة، بما في ذلك زراعة الخلايا، وعلاج الأكتينوميسين D، واستخراج الحمض النووي الريبي، وقياس RT-qPCR، بوضوح في الأشكال والملفات الإضافية لإرشاد المستخدمين خلال سير العمل. بالإضافة إلى ذلك، تم توفير إجراءات تحليلية مفصلة مثل نمذجة الانحدار غير الخطي وتفسير فترات الثقة في الملف التكميلي 4 لدعم تقدير نصف العمر بدقة. من بين هذه الخطوات، التوقيت الدقيق والتعامل ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب مصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة صندوق الأبحاث في جامعة تشونغنام الوطنية [2024-0991-01 (S.-K.K.)]; برنامج أبحاث العلوم الأساسية [RS-2023-00209842 (S.-K.K.)] وبرنامج تطوير التكنولوجيا الحيوية والطبية [RS-2025-02305916 (S.-K.K.)] التابع للمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) الممول من الحكومة الكورية (MSIT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-ميركابتوإيثانولجيبكو21985023
أكتينومايسين ديسيغما-ألدرتشA9415
الكلوروفورمكيماويات دايجونغ2548-4105
DMSOجين ديبوتD2680
مصل البقر الجنيني (FBS)سيغما-ألدرتشF0392
الجيلاتينسيغما-ألدرتشG1890-100G
غلاسكو' الوسيط الأساسي الأدنى (GMEM)جيبكو11710035
جراف باد بريزم (الإصدار 9)برنامج جراف باد
إيزوبوبانولكيماويات دايجونغ5035-4105
بديل مصل الضربة القاضية (KOSR)Gibco, 10828028
عامل تثبيط اللوكيميا (LIF)ميركESG1106
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (MnEA)ويلجينLS005
مجموعة تصنيع الحمض النووي m-MLV  الإنزينوميكسEZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus KLAB01-QI685-M-16-C
البنسلين-ستربتوميسينويلجينLS202-02
Power SYBR-Green PCR المزيج الرئيسي  أنظمة حيوية تطبيقية4368708
QuanStudio1 نظام PCR في الوقت الحقيقي أنظمة حيوية تطبيقيةA40425
بيروفات الصوديومويلجينLS013
تريزول إنفيتروجين15596018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  3. Joo, J. -Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. -K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  4. Levine, M. Transcriptional enhancers in animal development anfd evolution. Curr Biol. 20 (17), R754-R763 (2010).
  5. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  6. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
  7. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biol. 8 (5), e1000384(2010).
  8. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  9. Songyue, G., et al. The roles of enhancer, especially super-enhancer-driven genes in tumor metabolism and immunity. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142414(2025).
  10. Kim, S. H., et al. Epigenetic regulation of IFITM1 expression in lipopolysaccharide-stimulated human mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 11, 1-12 (2020).
  11. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: Recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  12. Sartorelli, V., Lauberth, S. M. Enhancer RNAs are an important regulatory layer of the epigenome. Nat Struct Mol Biol. 27 (6), 521-528 (2020).
  13. Lam, M. T., et al. Rev-Erbs repress macrophage gene expression by inhibiting enhancer-directed transcription. Nature. 498 (7455), 511-515 (2013).
  14. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  15. Melo, C. A., et al. eRNAs are required for p53-dependent enhancer activity and gene transcription. Mol Cell. 49 (3), 524-535 (2013).
  16. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  17. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  18. Göttgens, B., et al. Establishing the transcriptional programme for blood: The SCL stem cell enhancer is regulated by a multiprotein complex containing Ets and GATA factors. The EMBO J. 21 (12), 3039-3050 (2002).
  19. Wang, H. F., et al. Defining essential enhancers for pluripotent stem cells using a features-oriented CRISPR-Cas9 screen. Cell Rep. 33 (4), 108309(2020).
  20. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117.e106 (2017).
  21. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  22. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 319, 145470(2025).
  23. Tata, P. R., Tata, N. R., Kühl, M., Sirbu, I. O. Identification of a novel epigenetic regulatory region within the pluripotency associated microRNA cluster, EEmiRC. Nucleic Acids Res. 39 (9), 3574-3581 (2011).
  24. Sohni, A., et al. Dynamic switching of active promoter and enhancer domains regulates Tet1 and Tet2 expression during cell state transitions between pluripotency and differentiation. Mol Cell Biol. 35 (6), 1026-1042 (2015).
  25. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  26. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  27. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  28. Pérez-Molina, R., et al. An intronic Alu element attenuates the transcription of a long non-coding RNA in human cell lines. Front Genet. 11, 928(2020).
  29. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  30. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  31. Atlasi, Y., Stunnenberg, H. G. The interplay of epigenetic marks during stem cell differentiation and development. Nat Rev Genet. 18 (11), 643-658 (2017).
  32. Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144 (6), 940-954 (2011).
  33. Ratnadiwakara, M., Änkö, M. -L. mRNA stability assay using transcription inhibition by actinomycin D in mouse pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (21), e3072-e3072 (2018).
  34. Kim, S. -K., et al. Functional coordination of BET family proteins underlies altered transcription associated with memory impairment in fragile X syndrome. Sci Adv. 7 (21), eabf7346(2021).
  35. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (30), e1470(2009).
  36. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).
  37. Kim, S. -K., et al. SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs. Cell Stem Cell. 15 (6), 735-749 (2014).
  38. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. DRUID: A pipeline for transcriptome-wide measurements of mRNA stability. RNA. 24 (5), 623-632 (2018).
  39. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. Determining mRNA half-lives on a transcriptome-wide scale. Methods. 137, 90-98 (2018).
  40. Tsai, P. F., et al. A muscle-specific enhancer rna mediates cohesin recruitment and regulates transcription in trans. Mol Cell. 71 (1), 129-141.e128 (2018).
  41. Woolley, C. R., et al. Full-length mRNA sequencing resolves novel variation in 5' UTR length for genes expressed during human CD4 T-cell activation. Immunogenetics. 77 (1), 14(2025).
  42. Zhang, H., et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 621 (7978), 396-403 (2023).
  43. Kim, T. -K., Shiekhattar, R. Architectural and functional commonalities between enhancers and promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhancer RNAsRNA StabilityMouse Embryonic Stem CellseRNA DecayActinomycin DRT qPCRIntergenic Enhancer RNAIntragenic Enhancer RNARNA Half LifeTranscriptional Arrest

Related Articles