مقالة منهجية

الهندسة اللاجينية لخلايا K562: استراتيجية عرضية مزدوجة المتجه لمثيلة الحمض النووي المستهدفة المستقرة باستخدام بروتينات الاندماج dCas9-DNMT3A و -HDAC1

DOI:

10.3791/69328

⸱

أكتوبر 31, 2025

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نظاما غير تكاملي قائم على كريسبر / دكاس9 لتحرير اللاجيني المستهدف في خلايا K562 ، ويجمع بين مؤثرات dCas9-DNMT3A و dCas9-HDAC1 مع sgRNAs محددة للحث على مثيلة الحمض النووي الخاصة بالموقع بدقة وتقليل التأثيرات غير المستهدفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل التحقيق في الدور الدقيق لمثيلة الحمض النووي في تنظيم نسخ الجينات وتطوير العلاجات التي تستهدف أنماط معينة من مثيلة الجينات تحديات كبيرة بسبب ندرة الأدوات متعددة الاستخدامات القادرة على إحداث تعديلات جينية خاصة بالموقع وطويلة الأجل لتعديل التعبير الجيني. تهدف الدراسة إلى تطوير والتحقق من صحة نظام مبتكر قائم على الحلقة لتسهيل مثيلة الحمض النووي المستقرة في موضع الجين المستهدف ، والذي يحتمل أن يكون مفيدا لكل من أبحاث الوراثة اللاجينية الأساسية والتطبيقات العلاجية. لتحقيق ذلك ، تم نقل خط الخلية K562 مع ناقلين عرضيين متميزين. تم تصميم كلا النوعين من النواقل للتعبير عن الحمض النووي الريبي التوجيهي (gRNAs) الذي يستهدف منطقة غير ميثيل 367 نقطة أساس داخل جزيرة CpG 326 ، الواقعة في اتجاه المنبع من جين ZBTB7A . قام كل ناقل بتشفير شكل معطل من نوكلياز داخلي Cas9 (ميت أو dCas9) مدمج إما في المجال التحفيزي لميثيل ترانسفيراز DNA DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) أو هيستون ديسيتيلاز كامل الطول HDAC1 (dCas-HDAC1). تضمن تسلسل dCas إشارتين للتوطين النووي (NLS) لضمان الاستيراد النووي للبروتين. يعزز كاسيت التعبير المزدوج هذا حالة الكروماتين التي يحتمل أن تؤدي إلى إسكات اللاجيني على المدى الطويل ، مما يعد بنتائج جينية قوية ودائمة. يوفر هذا النهج المتداخل لجينوم المضيف من خلال استخدام النواقل العرضية ذاتية التكاثر العديد من المزايا: الحفاظ على النواقل والتعبير عنها بأعداد نسخ منخفضة عبر انقسامات خلايا متعددة دون الاندماج في جينوم المضيف ، وبالتالي تقليل التأثيرات غير المستهدفة والحفاظ على سلامة الجينوم. نبلغ عن الزيادة الدقيقة والمهمة في مثيلة الحمض النووي في جزيرة ZBTB7A CpG المستهدفة 326. تؤكد النتائج أن أنظمة CRISPR / dCas العرضية المصممة هندسيا يمكن أن تثير مثيلة الحمض النووي المتينة الخاصة بالموقع. لذلك ، يعد هذا النظام أداة بحثية قيمة لتقييم الآثار الوظيفية لتغيرات المثيلة المستهدفة ومنصة واعدة لتطوير العلاجات اللاجينية المستقبلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب التنظيم اللاجيني ، بما في ذلك مثيلة الحمض النووي وتعديلات الهيستون ، دورا محوريا في التحكم في التعبير الجيني وتمايز الخلايا واستقرار الجينوم. غالبا ما يكون خلل تنظيم هذه الآليات متورطا - إما كسبب أو نتيجة - في حالات مرضية مختلفة ، لا سيما في السرطان والاضطرابات العصبية ومتلازمات البصمة1،2،3. والجدير بالذكر أنه من خلال التدخل بدقة في المشهد اللاجيني في مواقع جينومية محددة باستخدام تحرير epigenome تقنية التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) ، يمكن تحقيق مستويات قمع الجينات المماثلة لتلك التي لوحظت في نماذج الضربة القاضية للجينات ، دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي4. نتيجة لذلك ، ظهر التحرير اللاجيني المستهدف كاستراتيجية واعدة لتشريح آليات تنظيم الجينات وتطوير علاجات دقيقة.

مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMT) ومثبطات هيستون ديستيلاز (HDAC) هي علاجات جينية معتمدة حاليا للاستخدام السريري. ومع ذلك ، فإن هذه العوامل تستهدف بشكل غير انتقائي العلامات اللاجينية عبر الجينوم ، مما يؤدي إلى تغيير حالات الكروماتين العالمية ، مما يتسبب في تأثيرات غير مستهدفة وسمية لدى المرضى5. لمعالجة قيود عوامل التغيير اللاجينية التقليدية ، تم تطوير المحررين اللاجينيين القابلين للبرمجة على أساس Cas9 الميت تحفيزيا (dCas9) المدمجة في مجالات المستجيب ، مثل ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (على سبيل المثال ، DNMT3A) ، ديميثيلاز (على سبيل المثال ، TET1) ، أسيتيل ترانسفيراز هيستون (على سبيل المثال ، p300) ، أو ديأسيتيليز (على سبيل المثال ، HDAC3) ، تم تطويره6،7،8،9. يسمح نظام dCas9-proctor بتعديل epigenome الخاص بالموضع الموجه بجزيء RNA صغير ، يعرف باسم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNA) ، دون إدخال فواصل مزدوجة الشريطة في التسلسل المستهدف. أثبتت الدراسات الحديثة استخدامها في تعديل التعبير الجيني ، وإعادة تشكيل إمكانية الوصول إلى الكروماتين ، وحتى إعادة برمجة الأنماط الظاهرية الخلوية10،11،12.

على الرغم من التقدم السريع ، لا تزال أنظمة هندسة epigenome المستندة إلى dCas9 تواجه بعض القيود. التحدي الأكثر شيوعا هو التأثيرات غير المستهدفة بسبب عدم خصوصية مجالات المستجيب اللاجيني ، خاصة مع التعبير القوي أو المطول لأدوات الاندماج dCas913،14. بالإضافة إلى ذلك ، يمثل الحجم الكبير لاندماج dCas9 تحديات تسليم كبيرة. يبلغ حجم تسلسل Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) حوالي 4.2 كيلو بايت15 ، وهو ما يمكن مقارنته بالحد الأقصى لحجم السعة لناقلات الفيروس المرتبطة بالغدة (AAV). في حين أن نواقل الفيروسات العدسية لها سعة كبيرة نسبيا (~ 12-1 كيلو بايت) ، مما يتيح توصيل SpCas9 كامل الطول المنصهر مع المؤثرات اللاجينية ، إلا أنها لا تزال تحتفظ بإمكانية التكامل الجيني العشوائي ، مما يخاطر بحدوث طفرات إدحامية والحد من تطبيقاتها السريرية16. من ناحية أخرى ، تعاني الأساليب غير الفيروسية مثل تعداء البلازميد من ضعف الاحتفاظ في الخلايا المنقسمة. تستبعد مناهج التوصيل العابرة أو "الكر والفر" إمكانية التكامل الجيني ، ولكنها غالبا ما تفشل في الحفاظ على تغييرات المثيلة عبر انقسامات الخلايا ، ما لم يتم دمجها مع إعادة تشكيل الكروماتين أو المؤثرات التعاونية17،18،19.

لمواجهة هذه التحديات ، استخدمنا نظام ناقلات عرضي غير تكاملي ذاتي التكاثر (pEPI-S / MAR) لتقديم مؤثرات جينية لاجينية مدمجة مع dCas9. يستمر هذا المتجه خارج الكروموسومات في تقسيم الخلايا بأرقام نسخ منخفضة (~ 1-2 لكل خلية) ، مما يسمح بالتعبير المستمر والمعتدل ، من أجل تقليل الوظائف غير المرغوب فيها المرتبطة بالإفراط في التعبير20،21. يتفاعل عنصر منطقة ارتباط السقالة / المصفوفة (S / MAR) في الظهيرة مع المصفوفة النووية ، مما يساهم في الحفاظ على الحلقة المستقرة في نواة الخلايا أثناء انقسام الخلية22،23. علاوة على ذلك ، يتجنب نظام ناقلات pEPI المخاطر المرتبطة بالتكامل الفيروسي ويتيح تسليم التركيبات دون تجاوز حدود التغليف.

أظهرت الدراسات الحديثة أن مناطق المروج التي تتميز بتعديلات هيستون نشطة ، وخاصة أستلة H3K27 (H3K27ac) ، غالبا ما تكون مقاومة لمثيلة الحمض النووي المهندسة. ثبت أن الأساليب الاندماجية التي تزيل أو تضيف علامات الهيستون باستخدام كتاب أو محايات تعديلات الهيستون وتقدم في نفس الوقت مثيلة الحمض النووي عبر DNMT3A تزيد من استقرار وثبات قمع الجينات ، حتى في الأساليب العابرة19،24. بناء على هذه الأفكار ، افترضنا أن التوصيل المشترك ل dCas9-HDAC1 و dCas9-DNMT3A واستهداف المناطق الجينية المجاورة من شأنه أن يعزز إعادة تشكيل الكروماتين ويسهل مثيلة أكثر كفاءة ومتانة في العناصر التنظيمية المستهدفة.

في هذه الدراسة ، هدفنا إلى تصميم وبناء نظام قادر على تقديم مثيلة الحمض النووي المستهدفة والمستقرة إلى جزيرة CpG 326 من ZBTB7A ، وهي منطقة تتميز بالمثيلة الداخلية المنخفضة وعلامات H3K27ac الشاذة في خلايا K562. كان الهدف من هذه الدراسة هو تقديم بنكين عرضيين يشفران dCas9 مدمجان لكل من المؤثرات اللاجينية المميزة ، جنبا إلى جنب مع sgRNAs ، مما يستهدف المنطقة التنظيمية الغنية ب CpG في اتجاه المنبع لجين ZBTB7A باستخدام نظام pEPI منخفض التعبير ومستقر وغير تكاملي. كما هو موضح في الشكل 1 ، يتيح التعداء المشترك لخلايا K562 مع هذه الجزوفات التجنيد المزدوج لمجمعات التحرير في جزيرة CpG ذات الأهمية ، حيث يزيل HDAC1 أستلة الهيستون المحلية لتسهيل مثيلة الحمض النووي اللاحقة بواسطة DNMT3A ، مما يؤدي إلى تعديل جيني منسق وخاص بالموقع.

النظام الموصوف هنا مناسب للتطبيقات التي لا يكون فيها توصيل الفيروس ممكنا بسبب حجم البناء أو مخاوف تتعلق بالسلامة أو قيود التكلفة. وهو يدعم الاستنساخ المعياري لمختلف sgRNAs واندماج المستجيب ، مما يجعله قابلا للتكيف مع مجموعة من المواقع المستهدفة. وهي حاليا الأنسب للدراسات في المختبر أو قبل السريرية في خطوط الخلايا التي تتسامح مع تعداء البلازميد واختيار المضادات الحيوية. في تنفيذنا ، تم تحقيق التوصيل العرضي في خلايا K562 باستخدام الكواشف القائمة على ليبوفيكتامين والحفاظ عليها تحت اختيار G-418.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم sgRNAs

  1. حدد جزيرة CpG المطلوبة أو مواقع CpG التنظيمية داخل منطقة المروج للجين محل الاهتمام باستخدام متصفح الجينوم (على سبيل المثال ، متصفح جينوم UCSC). هنا ، تم تطبيق التصميم على جزيرة CpG 326 (GRCh38) من جين ZBTB7A .
  2. صمم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNAs) باستخدام منصة تصميم sgRNA عبر الإنترنت من كريسبر [على سبيل المثال ، أداة الويب CHOPCHOP (الإصدار 3)]. عند تصميم sgRNAs ، اتبع التوصيات أدناه لضمان نشاط مرتفع على الهدف والحد الأدنى من التأثيرات غير المستهدفة:
    1. حدد بروتين SpCas9 باعتباره نوكلياز داخلي ، باستخدام 5'-NGG-3' كشكل مجاور للمفاصل الأولي في النهاية 3 (PAM-3).
    2. اختر طول sgRNA ليكون 20 نقطة أساس (إلى جانب تسلسل PAM). اسمح بمطابقات خارج الهدف مع ثلاثة حالات عدم تطابق فقط في تسلسل الفاصل الأولي.
    3. عند اختيار استهداف منطقة معينة من الجين ، اختر خيار "المروج" وحدد نطاق المنبع (على سبيل المثال ، من 1500 نقطة أساس إلى 3000 نقطة أساس في المنبع لجزيرة CpG 326) لوضع sgRNAs داخل المنطقة التنظيمية.
    4. استخدم درجات الكفاءة المستهدفة مثل تلك التي طورها Doench et al.25 ، لتقييم نشاط sgRNA.
  3. عند اختيار sgRNAs للاستخدام التجريبي ، ضع في اعتبارك المعايير التالية:
    1. ترتيب جميع sgRNAs المرشحة حسب الكفاءة للمنطقة المستهدفة. اختر sgRNAs في أعلى 10-20٪ من الكفاءة المتوقعة. عند الاختيار ، تجنب sgRNAs ذات عدم التطابق (MM0 ، MM1 ، MM2 ، MM3) في المواقع المحتملة خارج الهدف.
    2. اختر sgRNAs التي تستهدف المناطق غير الميثيل أو الميثيلة الضعيفة في الأصل لقمع النسخ باستخدام dCas9-DNMTs. لقمع النسخ باستخدام dCas9- HDACs ، استهدف المناطق عالية الأسيتيل لزيادة الكفاءة. استخدم قواعد البيانات عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، ChIP-Atlas) لتأكيد مثيلة الحمض النووي وعلامات أستلة الهيستون في خلايا K562 في المواقع المستهدفة.
    3. استخدم sgRNAs متعددة لتغطية المناطق المستهدفة التي تزيد عن 100-200 نقطة أساس26.
      ملاحظة: تؤثر التعديلات اللاجينية (المثيلة وإزالة الأسيتلة) على المناطق في المنبع وأسفل مجرى موقع ربط sgRNA ، وقد تقتصر هذه التأثيرات على الفترات الجينومية القصيرة.
    4. اختر sgRNAs ذات محتوى GC بين 40٪ و 80٪.
      ملاحظة: محتوى GC في sgRNA مهم ، حيث يعمل محتوى GC العالي على تحسين استقرار الحمض النووي الريبي وربط dCas.
    5. تجنب sgRNAs التي تحتوي على امتدادات من أربعة أو أكثر من الثايميدينات (Ts) واختر sgRNAs مع نيوكليوتيدات الأدينين أو الثايمين الموجودة على أربع قواعد في أعلى موقع PAM.
      ملاحظة: يمكن أن تؤدي أربعة T أو أكثر إلى إنهاء النسخ المبكر. قد تظهر sgRNAs مع A أو T الموجودة على أربع قواعد في اتجاه المنبع من موقع PAM ارتباطا أقوى ب dCas.
    6. تحقق من sgRNAs ذات التكامل الذاتي العالي وتجنبها لتقليل مخاطر تكوين البنية الثانوية.
    7. الانتهاء من اختيار عدد قليل من تسلسلات sgRNA.
      ملاحظة: تم تصميم أربعة sgRNAs تمتد عبر جزيرة CpG 326. يتم عرض التسلسلات المستهدفة sgRNA1-4 والمواقع المستهدفة عبر جزيرة CpG 326 في الجدول التكميلي 1.
  4. قم بتحويل تسلسل sgRNA المفضل (باستثناء ثلاثي PAM) إلى مكمل عكسي. أضف GATCG إلى نهاية 5 'من التسلسل الأمامي و G إلى نهايته 3' ، و AAAAC إلى نهاية 5 'من التسلسل التكميلي العكسي و C إلى نهايته 3'. اطلب اثنين من oligos النهائيين لكل sgRNA من موفر oligo تجاري.

2. الاستنساخ

ملاحظة: يصف هذا القسم تصميم البلازميد pEPI-1 لتوليد نواقل عرضية تحمل كلا من اندماج المستجيب اللاجيني dCas وأشرطة تعبير sgRNA. راجع الشكل 2 للحصول على نظرة عامة شاملة على سير عمل الاستنساخ وبنية المتجهات. تم تنفيذ جميع تفاعلات الهضم والربط الموضحة أدناه وفقا للبروتوكولات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لكل إنزيم وكاشف مستخدم ، ويتم سرد مواصفات التفاعل بالتفصيل في الجدول التكميلي 2.

  1. هضم بلازميد pEPI-1 باستخدام AgeI و BspEI ، اللذين يحيطان بتسلسل ترميز eGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز). بعد تقييد الهضم ، قم بتخفيف البروز المتدلية الناتجة باستخدام جزء Klenow من بوليميراز الحمض النووي I. قم بربط العمود الفقري للبلازميد ذو الأطراف الحادة باستخدام T4 DNA ligase لتوليد المتجه المحذوف من eGFP.
    ملاحظة: يتم حذف جين eGFP لتقليل الحجم الإجمالي للناقل. قد يحد حجم المتجه الأكبر من خطوات الاستنساخ والتعداء النهائية.
  2. احصل على تسلسلات الترميز للمجال التحفيزي (CD) لجين DNMT3A والطول الكامل لجين HDAC1 . قم بإلحاق كودون توقف في نهاية 3 '(المصب) لكل تسلسل ترميز. أضف مواقع تقييد BglII (5 ') و AseI (3') تحيط بالتسلسلات.
  3. استوعب متجه pEPI-1 المحذوف من eGFP باستخدام BglII وAseI. بشكل منفصل ، قم بهضم تسلسلات ترميز DNMT3A (CD) و HDAC1 المحضرة بنفس الإنزيمات. قم بإجراء تفاعلين مستقلين للربط:
    1. قم بربط جزء DNMT3A (CD) في المتجه المهضوم لإنشاء بنية pEPI-1-DNMT3A.
    2. قم بربط جزء HDAC1 في المتجه المهضوم لإنشاء بنية pEPI-1-HDAC1.
      ملاحظة: تضع مواقع BglII و AseI الإدخالات في اتجاه مجرى محفز pCMV ومنبع عنصر S / MAR للحصول على التعبير الأمثل.
  4. قم بتحويل الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا (على سبيل المثال ، NEB 5-alpha Efficient E. coli ، عالية الكفاءة) باستخدام منتجات الربط من كل ناقل على حدة. قم بطلاء الخلايا المحولة على LB agar المحتوي على kanamycin (50 ميكروغرام / مل) واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. حدد مستعمرات إيجابية وعزل الحمض النووي البلازميد باستخدام طريقة التحضير المصغر للغليانالسريع 27،28.
  5. احصل على التسلسل الذي يقوم بتشفير SpCas9 الميت حفازيا (dCas9). أدخل العناصر التالية بالترتيب المحدد:
    1. في نهاية 5 ': موقع تقييد AscI ، وتسلسل إجماع Kozak ، وبدء الكودون (ATG).
    2. في نهاية 3 ': NLS ، اختياريا علامة HA ، متبوعا بموقع تقييد BamHI.
  6. هضم كل من ناقلات pEPI-1-DNMT3A و pEPI-1-HDAC1 باستخدام AscI و BamHI. قم بإجراء نفس عملية الهضم على ملحق dCas9. قم بربط جزء dCas9 في كل متجه معني.
    ملاحظة: تضمن مواقع AscI/BamHI إدخال dCas9 في المنبع من DNMT3A أو HDAC1، مباشرة في اتجاه مجرى النهر من محفز pCMV. تأكد من وجود رابط قصير أو عدد قليل من النيوكليوتيدات بين dCas9 والمستجيب اللاجيني للحفاظ على إطار القراءة الصحيح.
  7. قم بتحويل منتجات الربط النهائية إلى سلالات بكتريا قولونية عالية الكفاءة مع تحكم صارم في تعبير البلازميد (على سبيل المثال ، NEB 5-alpha F'Iq Efficient E. coli ، كفاءة عالية). حدد المحولات على ألواح الكانامايسين. قم بإعداد الحمض النووي البلازميد عالي الجودة من المستنسخة الإيجابية باستخدام طريقة التحضير المصغر للغليان السريع.
  8. قم بتسلسل تركيبات البلازميد النهائية (pEPI-1-dCas9-DNMT3A و pEPI-1-dCas9-HDAC1) باستخدام تسلسل المسام النانوية لتأكيد التجميع الصحيح لجميع المكونات ، والتحقق من إطار القراءة باستخدام أداة ترجمة عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، أداة ترجمة Expasy 3.0) ، وتحقق من وجود طفرات محتملة أو أحداث إعادة التركيب باستخدام أداة محاذاة عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، أداة محاذاة BLAST).
    ملاحظة: النواقل الكبيرة أكثر عرضة لإعادة التركيب وقد تتراكم الطفرات. لذلك ، يعد التحقق الشامل من صحة التسلسل أمرا ضروريا.
  9. قم بفسفور مجموعات هيدروكسيل 5 بوصات لكل من قليل النوكليوتيدات sgRNA الأمامية والخلفية باستخدام T4 عديد النوكليوتيدات كيناز قم بتهجين الخيطين التكميليين عن طريق تسخين الخليط إلى 90 درجة مئوية لعدة دقائق لتغيير طبيعة الهياكل الثانوية ، ثم السماح بالتبريد التدريجي إلى درجة حرارة الغرفة طوال الليل للتلدين الكامل في الحمض النووي مزدوج الشريطة.
  10. استوعب متجه تعبير pGuide sgRNA المحدد باستخدام BamHI و Esp3I. قم بربط جزء sgRNA مزدوج الشريطة الملدن في المتجه الخطي باستخدام T4 DNA ligase.
  11. باستخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل المحددة (الجدول التكميلي 3) ، قم بتضخيم كاسيت تعبير gRNA الكامل الذي يشتمل على (1) محفز U6 ، (2) تسلسل sgRNA المستنسخ ، و (3) سقالة sgRNA. استخدم بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة الذي لا يولد نتوءات متدلية مقاس 3 بوصات (أي بوليميراز التدقيق اللغوي) لضمان منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيفة وغير الحادة المناسبة للاستنساخ النهائي.
  12. كرر الخطوات 2.9-2.11 لكل gRNA فردي مصمم في القسم 1. تأكد من تحضير كل كاسيت gRNA وتضخيمه بشكل منفصل للحفاظ على خصوصية الهدف.
  13. هضم المتجهات pEPI-1-dCas9-DNMT3A و pEPI-1-dCas9-HDAC1 باستخدام SacII. قم بمسح الأطراف اللاصقة باستخدام جزء Klenow من بوليميراز الحمض النووي I. استنساخ أشرطة سقالة المروج U6 المضخمة مسبقا في هذه المتجهات باستخدام T4 ligase.
    ملاحظة: تم إنشاء العديد من مجموعات المستجيبات اللاجينية gRNA-اللاجينية (على سبيل المثال ، sgRNA1-dCas9-DNMT3A و sgRNA2-dCas9-HDAC1 وما إلى ذلك) خلال المرحلة التجريبية. ومع ذلك ، تم نقل مجموعتين مختارتين فقط للتجارب المعروضة في الأقسام اللاحقة.
  14. قم بتحويل منتجات الربط النهائية إلى سلالات بكتريا قولونية عالية الكفاءة مع تحكم محكم في تعبير البلازميد. حدد المحولات على ألواح الكانامايسين. قم بإعداد الحمض النووي البلازميد عالي الجودة من المستنسخة الإيجابية باستخدام طريقة التحضير المصغر للغليان السريع.
  15. تسلسل تركيبات البلازميد النهائية باستخدام تسلسل المسام النانوية ، وتحقق من إطار القراءة ، وتحقق من الطفرات المحتملة أو أحداث إعادة التركيب.

3. زراعة الخلايا والتعداء

  1. حافظ على خلايا K562 في قوارير مزرعة T-75 عند 37 درجة مئوية ، تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 وظروف الرطوبة. استخدم وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو المكمل بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (FBS) ، 1× محلول البنسلين / الستربتومايسين (القلم / البكتيريا).
  2. تحضير البلازميدات للتعدي:
    1. استخدم 8 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي البلازميد لكل تعداء ، وبالتالي 4 ميكروغرام من كل بلازميد للتعداء المشترك لاثنين من البلازميدات. حدد كمية الحمض النووي باستخدام الامتصاص عند 260 نانومتر ، ثم قم بتخفيف الكمية المطلوبة في 90 ميكرولتر من الماء فائق النقاء.
    2. أضف 10 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم 3 M و 2.5 حجم من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الحمض النووي المخفف.
    3. تخلط جيدا وتحتضن عند -20 درجة مئوية طوال الليل لترسيب الحمض النووي.
      ملاحظة: عند نقل بلازميدات متميزة مع مجموعات مستجيب gRNA-اللاجينية المميزة (على سبيل المثال ، gRNA1-dCas9-DNMT3A و gRNA2-dCas9-HDAC1) ، يوصى بدمج كلا البلازميدات في نفس أنبوب الترسيب لتبسيط التعامل مع الإجراءات النهائية.
    4. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي لأنابيب ترسيب الحمض النووي عند 11,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة الحيوية ، حيث ستتضمن هذه المرحلة أيضا التعامل مع الخلايا الحية.
    5. تخلص بعناية من الطايف. أضف 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول لغسل الحبيبات. جهاز طرد مركزي عند 11,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. قم بإزالة المادة الطافية للإيثانول تماما. اترك الحبيبات تجف في الهواء حتى لا يتبقى إيثانول مرئي.
    7. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي المجففة جيدا في 50 ميكرولتر من DMEM. يحفظ محلول البلازميد-DMEM عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    8. قم بتشغيل 400 نانوغرام من الحمض النووي العرضي المحضر (حوالي 2.5 ميكرولتر من المحلول المعلق) على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ للتحقق من نجاح تنقية الحمض النووي وسلامته قبل التعدي.
  3. تحضير الخلايا:
    1. احصد خلايا K562 من قارورة T-75 عندما تصل المزارع إلى 50-60٪ من التقاء التقاء.
    2. عد الخلايا باستخدام مقياس الخلايا. نقل حجم يحتوي على 2 × 105 خلايا إلى طبق مزرعة 35 مم يحتوي على 900 ميكرولتر من DMEM بدون FBS أو مضادات حيوية.
      ملاحظة: استخدم DMEM الخالي من المصل لجميع خطوات إجراء تعدي. استئناف ظروف الاستزراع المتوسطة الكاملة فقط بعد اكتمال فترة حضانة التعدي.
    3. ضع الطبق في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2) للحفاظ على الخلايا جاهزة للتعدي.
  4. استخدم مجموعة تعدي التعدي المستندة إلى ليبوفيكتامين لتوصيل البلازميد. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمجموعة المحددة المستخدمة ، واضبط أحجام التداول إذا لزم الأمر.
    1. أضف 3 ميكرولتر من كاشف P3000 (المزود في مجموعة تعدي) إلى محلول البلازميد-DMEM المحضر. اخلطي برفق واحتضني مزيج كاشف البلازميد-P3000 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. أضف 5 ميكرولتر من كاشف ليبوفيكتامين 3000 (يتم توفيره في مجموعة التعدي) جنبا إلى جنب مع كمية كافية من DMEM للوصول إلى حجم تفاعل إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    3. أضف خليط التعداء الكامل 100 ميكرولتر إلى الطبق الذي يحتوي على الخلايا مقاس 35 مم. رج الطبق برفق لتفريق الخليط ، ثم أعد الطبق إلى الحاضنة.
  5. بعد 24 ساعة من النداء ، أضف 3 مل من الوسط الكامل (DMEM مع 10٪ FBS و 1× قلم / Strep) إلى كل طبق 35 مم لبدء تكاثر الخلايا المنقولة. بعد 72 ساعة من تعداء التعدي ، ابدأ إجراء الاختيار بإضافة مضاد حيوي G-418 إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل.
  6. بمجرد تحديد الاختيار بشكل كاف وتجاوز إجمالي عدد الخلايا 1 × 106 ، تابع عزل المستنسخة المفردة (الشكل 3 أ) باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS):
    1. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 6 دقائق عند 25 درجة مئوية. اغسل مرة واحدة بمحلول ملحي معقم بالفوسفات 1× (PBS ، درجة الحموضة ~ 7.4) وجهاز طرد مركزي مرة أخرى في نفس الظروف.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1× PBS وحدد تركيز الخلية باستخدام مقياس الخلايا الدموية. قم بتخفيف التعليق إلى 1 × 106 خلايا / مل ، مما يضمن إعادة التعليق الشامل.
    3. قم بإعداد FCS أقصر إلى وضع الخلية الواحدة (يضمن خلية واحدة لكل قطرة) ، باستخدام لوحة معالجة بزراعة الأنسجة ب 96 بئرا كجهاز تجميع. اضبط إعدادات البرنامج إذا لزم الأمر، وفقا للأداة المستخدمة (الشكل 3 ب).
    4. قم ببوابة السكان الأوليين بناء على الحجم المتوقع (FSC) والحبيبات (SSC). استبعاد الحطام (منخفض FSC / SSC) والمواد عالية الحبيبات أو الميتة (SSC مرتفع). استخدم المخططات النقطية FSC-A مقابل FSC-H أو SSC-A مقابل SSC-H لبوابة المفردات.
    5. املأ اللوحة المكونة من 96 بئرا مسبقا ب 100 ميكرولتر من الوسط الكامل الذي يحتوي على 1 مجم / مل G-418 لكل بئر. قم بتسخين الطبق في الحاضنة قبل الفرز.
    6. قم بإجراء الفرز في وضع الخلية الواحدة ، مع الحفاظ على معدل فرز أقل من 300 حدث / ثانية لتحسين دقة الفرز.
    7. بعد الفرز ، افحص الآبار تحت المجهر لتأكيد خلية واحدة لكل بئر. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  7. اسمح للنسخ أحادية الخلية بالتوسع بشكل فردي في اللوحة المكونة من 96 بئرا. بمجرد إنشاء النمو النسيلي ، قلل تركيز G-418 إلى 400 ميكروغرام / مل للحفاظ على الاختيار.
  8. انقل المستنسخة جيدة النمو بالتتابع إلى ألواح 12 بئرا ، ثم إلى قوارير T-25 وأخيرا T-75 حسب الحاجة ، حتى يصل كل استنساخ إلى ~ 1 × 106 خلايا.
  9. اجمع كريات الخلية المزدوجة على فترات منتظمة. قم بتخزين حبيبات عند -20 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الجيني. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتخزين حبيبات متجانسة في 500 ميكرولتر من كاشف Trizol عند -20 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي وتخليق (كدنا).
    تنبيه: يجب التعامل مع كاشف Trizol بحذر نظرا لسميته وطبيعته المسببة للتآكل في غطاء الدخان الكيميائي أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية ، ويجب وضع ملصقات على المواد الملوثة للتخلص من النفايات الخطرة.
  10. استخراج الحمض النووي الجيني من المستنسخة المختارة باستخدام استخراج الفينول كلوروفورم التقليدي ، متبوعا بترسيب الإيثانول.
    تنبيه: الفينول: الكلوروفورم سام وتآكل ، ويجب التعامل معه في غطاء دخان كيميائي أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية. التخلص من النفايات المحتوية على الفينول والكلوروفورم كنفايات كيميائية خطرة.
  11. تأكد من إعادة تعليق الحمض النووي بالكامل في ماء خال من النوكلياز أو مخزن مؤقت TE. قم بقياس تركيز الحمض النووي ونقاوته باستخدام مقياس الطيف الضوئي قبل الشروع في التطبيقات النهائية.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذا الحمض النووي في تجارب المصب مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل و Pyrosequencing لتقييم كفاءة التحرير اللاجيني.
  12. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من كريات الخلايا باستخدام كاشف تريزول ، متبوعا بهطول الأيزوبروبانول29. تعامل مع عينات الحمض النووي الريبي بحذر من خلال ضمان الكواشف والمستهلكات الخالية من RNase ، والحفاظ على العينات عند 4 درجات مئوية أثناء الإجراء.
    ملاحظة: سيتم استخدام إجمالي الحمض النووي الريبي لتخليق (كدنا) باستخدام مجموعة النسخ العكسي.

4. تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد وجود كلا الظواهر في المستنسخة

  1. احصد ما يقرب من 5 × 105 خلايا من كل استنساخ مزرعة ، بعد تعليق الخلايا جيدا. جهاز طرد مركزي عند 7,000 × جم لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية. تخلص من الوسط الطاف.
  2. اغسل الخلية عن طريق إعادة تعليقها في 1× PBS. جهاز طرد مركزي مرة أخرى تحت نفس الظروف.
  3. تخلص من المادة الطافية ، تاركا حجما صغيرا ، أعلى بقليل من مستوى الحبيبات. استخدم 1 ميكرولتر من تعليق الخلية مباشرة كقالب ل PCR.
  4. بدلا من ذلك ، استخدم 200 نانوغرام من الحمض النووي الجيني المنقى المستخرج من المستنسخة المنقولة.
    ملاحظة: يوفر تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر من الخلايا المغسولة طريقة فحص سريعة ولكنه قد يؤدي إلى نتائج متغيرة. للحصول على خصوصية وحساسية أعلى ، استخدم الحمض النووي الجيني المنقى كقالب.
  5. قم بإعداد المزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 1.
  6. استخدم مجموعتين من البادئات ، مع برايمر أمامي مشترك يستهدف تسلسل dCas9 وبادئات عكسية منفصلة خاصة بكل متجه مستجيب لاجيني (الجدول التكميلي 3).
  7. اتبع شروط ركوب الدراجات الموضحة في الجدول 2.
  8. قم بتشغيل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الاغاروز أو قم بتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري للتحقق من أحجام المنتجات: 230 نقطة أساس للناقل المحتوي على DNMT3A و 205 نقطة أساس للناقل المحتوي على HDAC1 (الشكل 3 ج). قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي (مزيج من كلا البلازميدات بتركيز 10-20 نانوغرام) لتأكيد أحجام النطاق المتوقعة والتحقق من كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتضمين عنصر تحكم بدون قالب (NTC).
الكاشفالتركيز النهائي / الكمية
10× عازلة1×
التمهيدي الأمامي1 μΜ
الاشعال العكسية0.5 ميكرومتر
دنا200 نانوغرام
البوليميراز1.25 [و]
dNTPs200 ميكرومتر لكل منهما
ماء خال من النوكليازإلى 50 ميكرولتر

الجدول 1: مزيج تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من الظهور.

درجدرجة الحرارة ، درجة مئويةالوقتعدد الدورات
التمسخ الأولي953 دقائق1
التمسخ9530 ثانية30
الصلب5830 ثانية
امتداد721 دقيقة
التمديد النهائي725 دقائق1

الجدول 2: شروط دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من الجزء.

5. تحليل التسخين الحراري المستهدف

  1. عالج الحمض النووي الغندي (1.5 ميكروجرام) المستخرج من المستنسخة المنقولة باستخدام مجموعة تحويل ثنائي الكبريتيت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تصميم بادئات تحيط بمواقع CpG داخل المنطقة التنظيمية المستهدفة من قبل التركيبات. استخدم أداة تصميم برايمر ثنائي الكبريتيت المخصصة. اتبع إرشادات التصميم هذه:
    1. قم بتحويل منطقة تنظيم جزيرة CpG أو موقع CpG إلى النسخة المحولة من ثنائي الكبريتيت.
    2. صمم برايمر أمامي وعكسي لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي المحول إلى ثنائي الكبريتيت. قم بتضمين ملصق البيوتين على برايمر واحد (عادة ما يكون العكس) لتثبيت الخرز المطلي بالستريبتافيدين.
    3. صمم برايمر تسلسل (18-25 نقطة أساس) داخليا لمنتج PCR ، في اتجاه المنبع من أول CpG محل اهتمام. كمنطقة مستهدفة ، حدد نافذة 100 نقطة أساس في المنبع أو المصب من موقع ربط sgRNA لتقييم التعديلات اللاجينية المحلية المحتملة.
    4. تجنب مواقع CpG ضمن تسلسلات التمهيدي لضمان تضخيم غير متحيز.
    5. اختر زوجا أوليا بدرجة برنامج تصميم الفحص أكبر من 75٪ وتصنيف جودة "مرتفع" (أزرق) ، مما يشير إلى أن تحليل البرنامج لم يحدد أي مشاكل أو مخاوف.
      ملاحظة: للحصول على تسلسلات التمهيدي المصممة لاستهداف جزيرة CpG 326 ، راجع الجدول التكميلي 3. تم تصميم البادئات للارتباط في المناطق التي تحيط بمواقع ربط sgRNA1 و sgRNA2 ، مما يسمح بتسلسل مواقع CpG المحيطة بالمواقع المستهدفة.
  3. قم بإعداد تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميراز DNA عالي الدقة عالي الدقة محسن لقوالب ثنائي الكبريتيت.
  4. إجراء Pyrosequencing:
    1. اربط منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل البيوتينيل بحبيبات السيفاروز المطلية بالستريبتافيدين وعزل الحمض النووي أحادي الشريطة باستخدام محطة عمل pyrosequencing.
    2. أضف برايمر التسلسل إلى الحمض النووي أحادي الشريطة في المخزن المؤقت للتلدين. سخني المزيج إلى 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، ثم اتركيه ليبرد تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإجراء تفاعلات التسلسل باستخدام أداة المسح الحراري وترتيب الإعفاء المحدد أثناء تصميم البرايمر.
  5. تحليل البيانات:
    1. استخدم برنامج مخصص للحرارة لتحديد النسبة المئوية للمثيلة في كل موقع من مواقع CpG.
    2. قارن مستويات المثيلة بين المستنسخة المنقولة وغير المنقولة. تقييم كفاءة التحرير (الشكل 3D). ضع في اعتبارك إجراء اختبار t غير مقترن ثنائي الذيل لمقارنة مستويات المثيلة بين عناصر التحكم غير المعالجة وكل استنساخ تم نقله في كل موقع CpG على حدة.

6. تخليق (كدنا) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي لتحليل تعبير dCas

  1. قم بإعداد إجمالي الحمض النووي الريبي (1,100 نانوغرام لكل تفاعل) المستخرج من المستنسخة المنقولة في 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. احتفظ بالعينات على الجليد.
  2. قم بتجميع مزيج التخلص من الحمض النووي الجيني على الجليد: امزج 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمسح gDNA ، وعينة الحمض النووي الريبي التي تحتوي على 1,100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي ، والماء الخالي من RNase إلى الحجم النهائي 14 ميكرولتر. احتضن لمدة دقيقتين عند 42 درجة مئوية ، ثم ضعه على الثلج.
  3. قم بإعداد المزيج الرئيسي للنسخ العكسي على الثلج: امزج 4 ميكرولتر من RT Buffer مع 1 ميكرولتر من اشعال RT ، وأضف 1 ميكرولتر من النسخ العكسي.
  4. امزج 14 ميكرولتر من مزيج إزالة الحمض النووي الجيني مع 6 ميكرولتر من مزيج النسخ العكسي الرئيسي إلى حجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر. تخلط برفق وتحتضن عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بإلغاء تنشيط النسخ العكسي عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: قم بتخزين (كدنا) في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  5. قم بتخفيف (كدنا) من جميع العينات 1: 1 بالماء الخالي من النوكلياز. استخدم (كدنا) المخفف لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي النهائي ، باستخدام نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي مع بادئات خاصة ب dCas (الجدول التكميلي 3):
    1. قم بإعداد مزيج 4× الرئيسي ومزيج التفاعل وفقا للجدول 3. أضف (كدنا) المخفف إلى المزيج والماصة برفق لضمان الخلط الشامل.
      ملاحظة: قم بإعداد التفاعلات في نسخ مكررة على الأقل لجميع النسخ قم بتضمين عنصر تحكم سلبي (كدنا من خلايا K562 غير المعالجة) و NTC.
    2. قم بتحميل 9 ميكرولتر من مزيج التفاعل في كل بئر من لوحة PCR. قم بإعداد نظام PCR باستخدام ظروف الدورة المعروضة في الجدول 4.
    3. حدد قناة صبغ FAM للكشف وابدأ التشغيل.
    4. بعد الانتهاء ، قم باسترداد العينات وتحليل البيانات.
      ملاحظة: يقوم Digital PCR بالإبلاغ عن النتائج كنسخ لكل ميكرولتر من التفاعل.
    5. اضرب القيمة المبلغ عنها (نسخ/ميكرولتر) في حجم التفاعل (10 ميكرولتر) للحصول على إجمالي النسخ لكل تفاعل. اقسم هذه القيمة على كمية (كدنا) في التفاعل للحصول على نسخ لكل نانوغرام (كدنا) (ما يعادل إدخال نانوغرام الحمض النووي الريبي).
      ملاحظة: إذا تم اتباع البروتوكول الدقيق ، تبدأ كل عينة ب 1,100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي في تفاعل RT 20 ميكرولتر (55 نانوغرام / ميكرولتر). بعد التخفيف 1: 1 ، يكون تركيز العمل 27.5 نانوغرام / ميكرولتر ، وبما أنه يتم إضافة 1 ميكرولتر إلى كل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فإن هذا يتوافق مع 27.5 نانوغرام من (كدنا) (مكافئ الحمض النووي الريبي) لكل تفاعل.
ماستر ميكس (4×)
الكاشفالتركيز النهائي / الكمية
25× صبغة خضراء SYBR2×
5× مزيج PCR الرقمي4×
ماء خال من النوكليازإلى 100 ميكرولتر
مزيج رد الفعل
الكاشفالتركيز النهائي / الكمية
4× ميكس رئيسي1×
التمهيدي الأمامي1 μΜ
التمهيدي العكسي1 μΜ
(كدنا) (مخفف)1 ميكرولتر
ماء خال من النوكليازإلى 10 ميكرولتر

الجدول 3: 4× مزيج رئيسي ومزيج تفاعل لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي لتعبير dCas.

درجدرجة الحرارة ، درجة مئويةالوقتعدد الدورات
التمسخ الأولي9610 دقائق1
التمسخ965 ث40
التلدين / التمديد6015 ثانية

الجدول 4: ظروف ركوب الدراجات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتحقيق فيما إذا كانت أدوات التحرير اللاجينية المستهدفة الخاصة بنا يمكن أن تحفز تغييرات مثيلة الحمض النووي الخاصة بالموقع في جزيرة ZBTB7A CpG 326 ، قمنا أولا بإنشاء نواقل عرضية تشفر dCas9 مدمجة إما إلى DNMT3A (CD) أو HDAC1 ، جنبا إلى جنب مع العديد من sgRNAs المصممة مع المواقع المستهدفة داخل جزيرة CpG 326. لقد شاركنا في البداية في تحويل خلايا K562 مع مجموعات من هذه البلازميدات لتقييم ما إذا كان التوصيل المتزامن ل sgRNA ووحدات المستجيب يمكن أن يؤدي إلى تعديلات جينية قابلة للتكرار....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي تصميم sgRNAs عالية التحديد. التأثيرات غير المستهدفة هي قيد معروف لأنظمة التحرير اللاجينية المستندة إلى كريسبر ، والتي يمكن أن تنشأ غالبا من الخيانة الزوجية الملزمة ل dCas9 ، بالإضافة إلى النشاط غير المحدد لمجالات المستجيب. لتقليل ذلك ، يجب تصميم sgRNAs باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية التي تعمل على تحسين النشاط العالي على الهدف والحد الأدنى من الربط خارج الهدف30. يوصى باستخدام أدوات التصميم والتحقق من صحة المواقع غير الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية أو غير مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم إيرين ديريكي وفاسيليكي تشاندرو من خلال زمالة مدتها ثلاث سنوات (المنحة رقم 80706) من الحساب الخاص لصناديق البحث (ELKE) في الجامعة اليونانية المفتوحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مزيج Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)أنظمة حيوية تطبيقيةA52490
AgeI-HF NEBR3552
AscINEBR0558
AseINEBR0526
بامهاي-إتش إفNEBR3136
فرز خلايا اللحن BD FACSBD
بغلNEBR0144
BspEINEBR0540
خليط محلول ديوكسينيوكليوتيد (dNTP) (10 مللي مولار لكل منها)NEBN0447
مستوى السكر العالي في DMEM مع جلوتامين مستقر، مع وسط بيروفيات الصوديومبيوويستL0103
بوليميراز DNA I، جزء كبير (كلينو)NEBM0210
DNMT3A (CD)، تسلسلات HDAC1IDT
دريم تاك DNA بوليميراز  ثيرمو ساينتفيكEP0712
إبيتيكتتشياغن59104مجموعة تحويل البيسلفيت 
مجموعة إيبيتكت بيسلفايتتشياغن59104
Esp3INEBR0734
مصل الأبقار الجنينيجيبكوA5256701
مضاد حيوي انتقائي جينيسين (G418 سلفات)جيبكو11811031
مجموعة النقل لليبوفيكتامين 3000إنفيتروجينL3000015
NEB®   5-ألفا كفأنت E. coli  (كفاءة عالية)NEBC2987I
NEB®   5-ألفا F'Iq  كفؤة E. coli  (كفاءة عالية)NEBC2992H
نسيج نيوكليوسبين  ماشيري-ناجل740952.50
PBS، محلول 10x pH 7.4لونزاBE17-517Q
محلول البنسلين-ستربتوميسين 100xبيوويستL0022
متجه pGuideتقنيات أوريجينGE100042
فينول: الكلوروفورم: الكحول الأزوأميل 25:24:1 مشبع ب 10 ملليموتر تريس، درجة حموضة 8.0، 1 ملليمول EDTAسيغما-ألدرتشP2069
البادئات، sgRNAs يوروفين
تصميم اختبار بايرومارك تشياغنالإصدار 2.0أداة تصميم برايمر بيسلفيت 
كواشف بايرومارك جولد Q24تشياغن970802
مجموعة PCR من PyroMark  تشياغن978703
بايرومارك Q24 MDxتشياغنPyrosequencing workstation 
PyroMark Q24 Software تشياغنv2.0.8برنامج Pyrosequencing  
س5 ومرخص؛ بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةNEBM0491
مجموعة النسخ العكسي QuantiTectتشياغن205311
مجموعة الألواح QuantStudio Absolute Q MAP16أنظمة حيوية تطبيقيةA52865نظام PCR الرقمي 
صبغة SYBR Green I Nucleic Acid Gel، مركز 10,000x في DMSOإنفيتروجينS7563
ليغاز الحمض النووي T4NEBM0202
كيناز متعدد النوكليوتيدات T4NEBM0201
واشع تريزولإنفيتروجين15596026

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firdaus, Z., Li, X. Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues. Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).
  2. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: from laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 1-12 (2024).
  3. Wang, S. E., Jiang, Y. -H. Novel epigenetic molecular therapies for imprinting disorders. Mol Psychiatry. 28 (8), 3182-3193 (2023).
  4. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  5. Ptak, C., Petronis, A. Epigenetics and complex disease: from etiology to new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48 (1), 257-276 (2008).
  6. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Res. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  7. Sapozhnikov, D. M., Szyf, M. Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9. Nat Commun. 12 (1), 5711(2021).
  8. Kwon, D. Y., Zhao, Y. -T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nat Commun. 8 (1), 15315(2017).
  9. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  10. Giehrl-Schwab, J., et al. Parkinson's disease motor symptoms rescue by CRISPRa-reprogramming astrocytes into GABAergic neurons. EMBO Mol Med. 14 (5), e14797(2022).
  11. Moreno, A. M., et al. In situ gene therapy via AAV-CRISPR-Cas9-mediated targeted gene regulation. Mol Ther. 28 (8), 1931(2020).
  12. Sokka, J., et al. CRISPR activation enables high-fidelity reprogramming into human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 17 (2), 413-426 (2022).
  13. Galonska, C., et al. Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints. Nat Commun. 9 (1), 1-9 (2018).
  14. Lin, L., et al. Genome-wide determination of on-target and off-target characteristics for RNA-guided DNA methylation by dCas9 methyltransferases. GigaScience. 7 (3), 1-19 (2018).
  15. Kennedy, M. E., Cullen, R. B. Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: a revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology. 479 - 480, 213-220 (2015).
  16. Rothe, M., Modlich, U., Schambach, A. Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 453-468 (2013).
  17. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  18. Hanzawa, N., et al. Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Sci Rep. 10 (1), 1-14 (2020).
  19. O'Geen, H., Tomkova, M., Combs, J. A., Tilley, E. K., Segal, D. J. Determinants of heritable gene silencing for KRAB-dCas9 + DNMT3 and Ezh2-dCas9 + DNMT3 hit-and-run epigenome editing. Nucleic Acids Res. 50 (6), 3239-3253 (2022).
  20. Sgourou, A., Routledge, S., Spathas, D., Athanassiadou, A., Antoniou, M. N. Physiological levels of HBB transgene expression from S/MAR element-based replicating episomal vectors. J Biotechnol. 143 (2), 85-94 (2009).
  21. Lazaris, V. M., et al. Non-viral episomal vector mediates efficient gene transfer of the β-globin gene into K562 and human haematopoietic progenitor cells. Genes. 14 (9), 1774(2023).
  22. Mulia, G. E., Picanço-Castro, V., Stavrou, E. F., Athanassiadou, A., Figueiredo, M. L. Advances in the development and the applications of nonviral, episomal vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1076-1095 (2021).
  23. Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J., Lipps, H. J. A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res. 27 (2), 426-428 (1999).
  24. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  25. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  26. Brezgin, S., Kostyusheva, A., Kostyushev, D., Chulanov, V. Dead Cas systems: types, principles, and applications. Int J Mol Sci. 20 (23), 6041(2019).
  27. Holmes, D. S., Quigley, M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem. 114 (1), 193-197 (1981).
  28. Harwood, A. J. The rapid boiling method for small-scale preparation of plasmid DNA. Methods Mol Biol. 58, 265-367 (1996).
  29. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  30. Labuhn, M., et al. Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications. Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).
  31. Hofacker, D., et al. Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects. Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).
  32. Yang, Q., et al. EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning. Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).
  33. Mu, W., et al. Machine learning methods for predicting guide RNA effects in CRISPR epigenome editing experiments. bioRxiv. , (2024).
  34. Batra, S. S., et al. Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing. bioRxiv. , (2025).
  35. Stavrou, E. F., et al. Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells. Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).
  36. Stavrou, E. F., et al. The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells. Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).
  37. Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).
  38. Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon. BMC Cell Biol. 8, 33(2007).
  39. Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency. Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).
  40. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  41. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  42. Ewaisha, R., Anderson, K. S. Immunogenicity of CRISPR therapeutics-critical considerations for clinical translation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1138596(2023).
  43. Raghavan, R., et al. Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy. Nat Commun. 16 (1), 105(2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

dCas9 HDAC1 CRISPR

مقالات ذات صلة