مقالة منهجية

قياس التداخل في الطبقة الحيوية لدراسة ارتباط مثبطات البروتين الغشائي: TACAN Mutant و GsMTx4 كنموذج

225 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69348

⸱

مايو 8, 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

في هذه المقالة

ملخص

توفر هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتحسين وإجراء تجارب التداخل الطبقي الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين بين الغشاء والليغاند لبروتينات الغشاء القابلة للذوبان في المساحف. باستخدام التفاعل بين طفرة M207A TMEM120A ومثبط الببتيدات GsMTx4 كنموذج، يوضح هذا السير تحضير البروتين، وتحميل المستشعرات الحيوية، وجمع البيانات الحركية.

الملخص

التداخل الطبقي الحيوي (BLI) هو تقنية فعالة في الفيزياء الحيوية تتيح التحليل الكمي في الوقت الحقيقي للتفاعلات الجزيئية الحيوية. على الرغم من استخدامها الشائع للبروتينات القابلة للذوبان، إلا أن تطبيقها على البروتينات الغشائية لا يزال تحديا بسبب المقاومة للماء والاعتماد على المنظفات. تقدم هذه الدراسة بروتوكول BLI محسن لتوصيف التفاعلات بين بروتين الغشاء المذاب في المغسلات ومثبط الببتيدات.

كنظام نموذجي، تم اختبار الببتيد المعدل للبوابة Grammostola mechanotoxin 4 (GsMTx4) ضد الطفرة الغشائية متعددة الوظائف TMEM120A M207A. تم تثبيت المتحور TMEM120A الموسوم ب FLAG على حساسات حيوية مضادة ل FLAG - تمثل إعدادا قائما على العلامات لكنه خال من الفلورية والإنزيمات - وتعرضه لتخفيفات متسلسلة من GsMTx4 لقياس معدلات الارتباط والتفكك.

يدمج البروتوكول تحسين المغسلات باستخدام لوريل مالتوز نيوبنتيل غليكول (LMNG) والتوصيف التكميلي بواسطة الفوتومترية الكتلية والفلوريميترية الماسحة التفاضلية (DSF). يتيح هذا السير إجراء قياسات حركية موثوقة ويتوافق مع الفحص متوسط الإنتاجية. قد يكون هذا النهج قابلا للتطبيق على أنظمة بروتين وربط الغشاء الأخرى حيث يتم الحفاظ على استقرار المنظفات. بشكل عام، تبرز الدراسة المعايير الرئيسية التي تؤثر على كفاءة التثبيت وتوصيل التحليل، مما يدعم الفائدة المحتملة ل BLI في تحليل المثبطات والدراسات الميكانيكية لتفاعلات البروتينات الغشائية.

المقدمة

تلعب بروتينات الغشاء أدوارا مركزية في العمليات الفسيولوجية الأساسية، بما في ذلك نقل الإشارات، ونقل الأيونات والمستقلبات، وتنظيم الغشاء. نظرا لمشاركتها في التواصل الخلوي والتوازن الداخلي، فهي تمثل نسبة كبيرة من أهداف الأدوية في التطوير السريري. فهم تفاعلات البروتين بين الغشاء والليغاند أمر بالغ الأهمية لتوضيح الوظيفة وتوجيه التصميم العلاجي. ومع ذلك، فإن الطبيعة الأمفيباتية لهذه البروتينات واعتمادها على بيئات الدهون تمثل تحديات كبيرة في التنقية والاستقرار والتوصيف الفيزيائي الحيوي.

تعد رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس السعرات الحرارية المتساوية الحرارية (ITC) من التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لدراسة حركية وديناميكا الحرارة لتفاعلات البروتين والليغاند بين الغشاء 1,2. عند تحسينهما بشكل مناسب، يمكن لكلا الطريقتين تقديم رؤى كمية مفصلة، حتى للبروتينات الغشائية التي تذاب في المغسلات أو معاد تشكيلها. كما تم تطبيق التحليل الحراري على المستوى المجهري (MST) بنجاح لتقييم ألفات الارتباط في الظروف شبه الأصلية، خاصة للبروتينات الغشائية³. ومع ذلك، يمكن أن تحد هذه الأساليب بسبب استهلاك كبير للعينات، أو صعوبات في الحفاظ على استقرار بروتين الغشاء، أو التوافق المحدود مع بعض أنظمة المنظفات.

التداخل الطبقي الحيوي (BLI) هو تقنية بصرية في الوقت الحقيقي تتيح القياس الكمي للتفاعلات الجزيئية الحيوية، بما في ذلك تلك التي تشمل بروتينات الغشاء الذائبة في المغسلة أو الأمفيبول. إلى جانب التقنيات الفيزيائية الحيوية المذكورة سابقا، يقدم BLI منصة فعالة تتيح القياس المباشر لحركيات الربط، بما في ذلك الارتباط (kon)، والتفكك (koff)، وثوابت تفكك التوازن (KD)، مع تركيزات عينة أقل وتكيف مباشر مع بروتينات الغشاء القابلة للذوبان في المنظفات أو الأقراص النانوية. ومن الجدير بالذكر أيضا أنه، مثل جميع التقنيات الفيزيائية الحيوية، لدى BLI حدوده الخاصة، والتي سيتم ذكرها في قسم النقاش.

يكتشف BLI التحولات في نمط التداخل للضوء الأبيض المنعكس من طرف المستشعر الحيوي، مع تغيرات في السماكة البصرية تتوافق مع أحداث الارتباط الجزيئي الحيوي. تسجل هذه الإزاحات (Δλ، بالنانومتر) كحساسات وتكون متناسبة مع الكتلة المرتبطة على سطح المستشعر. تم تطبيق BLI على نطاق واسع على تفاعلات البروتين-البروتين والبروتين-ليجاند (بما في ذلك الببتيدات والجزيئات الصغيرة) وهو مناسب لمستويات الألفة من النانومولر إلى ميكرومولر4. مرونته، استهلاكها المنخفض للعينات، وإعدادها البسيط نسبيا تجعله أداة مفيدة محتملة لدراسة بروتينات الغشاء القابلة للذوبان في المغسلة 5,6,7.

تقدم هذه الدراسة بروتوكول BLI لتوصيف التفاعل بين TMEM120A M207A، وهو بروتين غشائي، وجراميستولا ميكانوتوكسين 4 (GsMTx4)، وهو مثبط للببتيدات. تم اقتراح TMEM120A كقناة أيونية ميكانيكية حساسة تشارك في الكشف الميكانيكي عن الألم8؛ ومع ذلك، لا يزال نشاط قناة الأيونات مثيرا للجدل. أفادت عدة دراسات بغياب التيارات الحساسة للميكانيكية عند التعبير عن TMEM120A في أنظمة غير متجانسة مثل HEK293 أو خلايا CHO 1,9,10,11. حتى الآن، تمكنت أكثر من أربع دراسات تجميد للاختراق الكهرومغناطيسي (cryo-EM) في حل بنية TMEM120A في الحالة المغلقة، ولم يلاحظ أي تكوين مفتوح 1,9,10,11.

تشير محاكاة الديناميكا الجزيئية والتحليلات الكهربائية الفيزيولوجية إلى أن الميثيونين 207 (M207) في TMEM120A البشري البري قد يعمل كحاجز بوابة ضمن مسار توصيل الأيونات11. لقد ثبت أن طفرة هذا البقايا إلى الألانين (M207A) تزيد من نفاذية الأيونات، ربما عن طريق تغيير تعبئة الحلزون وإزاحة السلاسل الجانبية الكارهة للماء مثل Phe223. وبالتالي، تم اختيار متحول M207A لدراسات الارتباط مع GsMTx4.

GsMTx4 هو ببتيد معدل بوابة مشتق من سم العنكبوت ويثبط قنوات الكاتيونات الحساسة للميكانيكا. يتكون من تسلسل من 32 حمض أميني وله وزن جزيئي يتراوح بين 4 إلى 5 كيلو دالتون، بما في ذلك قنوات بيزو وTRP، وذلك بشكل أساسي عن طريق التفاعل مع طبقة الدهون الثنائية بدلا من حجب المسام مباشرة12,13. أظهرت الدراسات السابقة أن GsMTx4 يقلل من نشاط TMEM120A في أنظمة الطبقات الثنائية الاصطناعية8. في اختبارات BLI، تم تثبيت الطفرة TMEM120A M207A على حساسات حيوية مضادة للFLAG وتعرضت لتركيزات متزايدة من GsMTx4، مما سمح بقياس معدلات الارتباط (k on) والانفصال (koff).

يوفر هذا العمل بروتوكولا مفصلا لتحسين المنظفات والتحليل الحركي باستخدام التداخل الطبقي الحيوي (BLI). بينما لدى BLI بعض القيود، مثل احتمال حدوث تشوهات ناتجة عن تحميل زائد على المستشعرات أو تأثيرات نقل الكتلة وانخفاض الملاءمة لتفاعلات سرعة الارتباط (kon)، إلا أنه طريقة مفيدة لدراسة تفاعلات البروتين بين الغشاء والليجند تحت ظروف قابلة للذوبان في المغسلات المحكمة. البروتوكول مناسب للأنظمة ذات الارتباط المعتدل إلى المنخفض (عادة في النطاق النانوي المولي إلى الميكرومول) ويمكن تكييفه مع أهداف كارهة للماء أخرى عند تطبيق ضوابط وظروف العزل المناسبة.

البروتوكول

1. تنقية البروتينات وتحسين العينات

  1. زراعة الخلايا والانتقال
    1. ازرع خلايا تعليق HEK293T/SF17 في وسط خال من المصل مع إضافة 20 ملليموتر ل-جلوتامين في حاضنة هزة مضبوطة على 120 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية، 80٪ رطوبة، و8٪ ثاني أكسيد الكربون. الحفاظ على الخلايا من خلال المرور حتى المقطع الخامس؛ تسمح للخلايا بالوصول إلى كثافة تقارب 5 × 10⁶ خلايا/مل.
    2. قم بتحويل الخلايا باستخدام بلازميد M207A TMEM120A (FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) في متجه pCDNA3.1 باستخدام كاشف ترانسفيكشن تجاري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    3. قام الحبيبات بنقل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. خزن حبيبات الخلية عند -80 درجة مئوية حتى يتم تنقيتها.
  2. تحلل الخلايا وذوبانها (الشكل 1)
    1. إعادة تعليق حبيبة خلوية بحجم 30 مل في مخزن ذوبان يحتوي على 100 ملمولار 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES)، درجة حموضة 7.8؛ 300 مللي مولار NaCl; 0.5٪ (مع الوزن/الوزن) أو 4.98 ملليمولار نيوبنتيل غليكول لوريل مالتوز (LMNG)؛ كوكتيل مثبط بروتياز واحد؛ 50 ميكروغرام من DNase I؛ 10٪ (v/v) جليسرول.
    2. قم بتحليل الخلايا بالموجات فوق الصوتية عند سعة 25٪ باستخدام دورة نبضة تشغيل/20 ثانية إيقاف لمدة 15 دقيقة، مع إبقاء العينة على الثلج لمنع ارتفاع درجة الحرارة.
    3. قم بتصفية الليزات عن طريق الطرد المركزي عند 25,800 × جرام لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. تنقية الألفة باستخدام راتنج مضاد FLAG
    1. راتنج M2 المضاد لتوازن FLAG مع عازل توازن يحتوي على 25 ملليمولار HEPES، رقم الهيدروجيني 7.8؛ 200 ملليمول NaCl; 0.05٪ (بوزن الجهد) أو 0.4975 ملليمولار LMNG؛ 10٪ (v/v) جليسرول.
    2. حضن المادة الشفافة مع راتنج متوازن لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية على جهاز هزاز.
    3. اغسل الراتنج مرتين باستخدام محلول غسيل يحتوي على 25 ملليمولار HEPES، رقم حموضة 7.8؛ 150 مللي مولار NaCl; 0.05٪ (بوزن الجهد) أو 0.4975 ملليمولار LMNG؛ 10٪ (v/v) جليسرول.
    4. يتم إخراج البروتين المرتبط باستخدام مخزن إزرافي يحتوي على 25 ملليمولار HEPES، بدرجة حموضة 7.8؛ 400 ملليموتر NaCl؛ 0.001٪ (بالضبط/الجهد) أو 0.00995 مللي مولار LMNG؛ 10٪ (v/v) جليسرول؛ ببتيد FLAG بقوة 200 ميكروغرام/مل.
  4. كروماتوغرافيا التركيز واستبعاد الحجم (SEC)
    1. تركيز البروتين المفرو إلى ~500 ميكرولتر باستخدام وحدة مرشح طرد مركزي بقطع 30 كيلو دالتون.
    2. نفذ SEC باستخدام عمود استبعاد الحجم المشار إليه متوازنا مع HEPES 25 مللي مول، pH 7.8؛ 200 ملليمول NaCl; 0.00015٪ (بالضبط/العرض) أو 0.00149 مللي مولار LMNG.
    3. اجمع وتجميع الكسور القصوى المقابلة للبروتين المستهدف.
    4. تجمع الكسور المركزة إلى تركيز نهائي ~3 ملغ/مل. بعد تنقية الألفة، تأكد من أن مونومر بروتين M207A TMEM120A يظهر عند حوالي 43 كيلو دالتون على SDS-PAGE (الشكل 2A). بالنسبة ل SEC، تأكد من أن البروتين المنقى في LMNG يخرج كذروة تشتت أحادية تعادل حوالي 150 كيلو دالتون، والتي تمثل دايمر M207A TMEM120A مع ميسيل منظف LMNG (الشكل 2B).
      ملاحظة: أحيانا قد يظهر شريط بروتين الأحادي حوالي 50 كيلو دالتون، وهو أمر شائع في البروتينات الغشية القابلة للذوبان في المنظف، حيث أن غلي عينات بروتين الغشاء ليس أمرا شائعا.

2. تحليل الاستقرار الحراري باستخدام الفلوريمتري التفاضلي النانوي (NanoDSF)

  1. قم بتخفيف بروتين M207A المنقى TMEM120A إلى 0.15 ملغ/مل في مخزن SEC (25 ملليموتر HEPES، رقم الهيدروجينات 7.8، 200 ملليمولار NaCl، 0.00015٪ LMNG).
  2. تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في شعيرات شعرية عالية الحساسية.
  3. قم بإجراء اختبار التحول الحراري على جهاز NanoDSF مع ارتفاع درجة حرارة من 25 °م إلى 90 °م.
  4. استخدم برامج متوافقة لإعداد الاختبار وإجراء التحليل الآلي.
  5. تأكد من أن منحنى انتقال حراري واحد (Tm) مرئي، مما يشير إلى حدث انطواء تعاوني (الشكل 3).

3. الفوتومترية الكتلية لتحديد الحالة الأوليغوميرية

  1. جهز عينة مخففة إلى 80 نانومالتر في مخزن SEC (25 ملليموتر HEPES، رقم الهيدروجيني 7.8، 200 ملليمويل NaCl، 0.00015٪ LMNG).
  2. ضع العينة في شرائح متوافقة مع فوتومترية الكتلة منظفة مسبقا.
  3. احصل على البيانات باستخدام الإعدادات القياسية وقم بالمعايرة باستخدام معايير البروتين.
  4. معالجة البيانات باستخدام برامج التحليل لإنشاء مخططات توزيع الكتلة (الشكل 4A-C).

4. بروتوكول التداخل الطبقي الحيوي (BLI)

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول اختبار BLI الحركي المصمم لدراسة التفاعلات بين TMEM120A M207A المعلم بعلامة FLAG والروابط مثل GsMTx4، باستخدام صيغة ميكرولوح 384 بئر. على الرغم من تطويره ل TMEM120A، يمكن تكييف سير العمل لبروتينات غشائية أخرى. أجريت جميع التجارب باستخدام منصة تداخل بصري مع مجسات FLAG لتثبيت TMEM120A M207A المحمل علامة FLAG. تم استخدام لوحة دقيقة سوداء ببئر 384 بئر مع مخزن كروماتوغرافي استبعاد الحجم (SEC) محسن يحتوي على 25 مللي مولار HEPES، 200 ملليمولار NaCl، 0.00015٪ (مع الفولت) LMNG، و0.0005٪ Tween-20، ودرجة حموضة 7.8. تم تضمين Tween-20 لتقليل الارتباط غير النوعي. تم الحفاظ على تركيز البروتين عند 250 نانومال، وأجريت جميع الفحوصات بشكل تكراري لضمان قابلية التكرار.

  1. اعتبارات تصميم الاختبار
    1. توازن درجة الحرارة
      1. قبل بدء اختبار BLI، قم بتسوية جميع مكونات الاختبار - بما في ذلك المخازن، والعينات، ومجسات الاستشعار الحيوية - إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية). أثناء جمع البيانات، حافظ على درجة حرارة الاختبار عند 30 درجة مئوية، وهو ما يوصى به في التحليلات الحركية لتحسين استقرار البروتين، وارتباط الليغاند، وقابلية التكرار.
        ملاحظة: تضمن هذه الخطوة التوازنية ملفات حركية متسقة وتقلل من التشاؤلات الناتجة عن تقلبات درجة الحرارة أثناء التجربة. امنح الوقت الكافي (على الأقل 10-15 دقيقة) لتصل جميع المواد المفكشة والمستشعرات الحيوية إلى التوازن الحراري قبل بدء الاختبار.
    2. ترطيب وتجديد المستشعر
      1. ترطيب حساسات FLAG الجديدة في 250 ميكرولتر من المخزن المتوافق مع BLI (مخزن SEC يحتوي على 25 مللي مولار HEPES، 200 ملليمول NaCl، 0.00015٪ مع الفولت/فولت LMNG، و0.0005٪ Tween-20، pH 7.8) في لوحة Max لمدة لا تقل عن 10 دقائق قبل الاستخدام.
        ملاحظة: تعامل مع أجهزة الاستشعار الحيوية بعناية باستخدام ملقط نظيف وخال من الغبار لتجنب التلوث، الذي قد يتداخل مع التقاط الإشارة ويؤدي إلى نتائج غير متسقة. لإعادة استخدام المستشعر، قم بإجراء إعادة توليد باستخدام مخزن Q (0.3 ميجا جلايسين، رقم الهيدروجيني 3.8). الترطيب المناسب والتجديد ضروريان للحفاظ على أداء المستشعرات وقابليتها للتكرار، خاصة عند العمل مع بروتينات الغشاء القابلة للذوبان في المنظف، والتي تكون حساسة للظروف البيئية.
    3. التعامل مع المخزن المؤقت
      1. تجنب فقاعات الهواء عند صرف السوائل، لأنها قد تتداخل مع اكتساب الإشارة البصرية.
    4. تركيب وثبات المخزن
      1. استخدم حاجزا يقلل من التفاعلات غير المحددة مع الحفاظ على وظيفة البروتين. بالنسبة ل TMEM120A M207A، جهز المخزن الذي يحتوي على 25 ملليمولار HEPES، 200 ملليمول NaCl، 0.00015٪ (بدون ضخ) LMNG، 0.0005٪ (مع الوزن/الوزن) Tween 20، pH 7.8.
    5. تثبيت البروتين
      1. تحسين تحميل الليجاند لتحقيق تشبع مستشعر بنسبة 50-80٪. استخدم تركيزا ثابتا من البروتين عند 250 نانومتر، مع مدة تحميل نموذجية تبلغ حوالي 120 ثانية. قم بتحميل TMEM120A M207A (250 نانومتر) على المستشعر الحيوي لمدة 120 ثانية لتحقيق تشبع بنسبة 50-80٪.
      2. تأكد من أن إشارة المستشعر البيولوجي تصل إلى 50 - 80٪ من أقصى سعة ربط أثناء مرحلة التحميل.
        ملاحظة: قد تشير الإشارات التي تقل عن 50٪ إلى عدم كفاية تثبيت البروتين، في حين أن الإشارات فوق 80٪ قد تسبب قيودا في نقل الكتلة أو عائقا استريائي، مما قد يؤثر على القياسات الحركية.
      3. لتقييم تأثيرات النقل الكتلي المحتملة، قم بإجراء تجربة تحكم يتم فيها الحفاظ على تركيز المحلل (مثل 100 نانومالتر GsMTx4) ثابتا مع تغيير مستويات التحميل في TMEM120A-M207A على حساسات FLAG الحيوية (الشكل التكميلي S1).
        ملاحظة: لم تكن القياسات الحركية اللاحقة - بما في ذلك الارتباط، والتفكك، وتوافق الارتباط العالمي، وتحديد kon وk off - مختلفة بشكل ملحوظ عن تلك التي تم الحصول عليها في الاختبار الرئيسي. تشير هذه النتيجة إلى أن TMEM120A التحميل ضمن نطاق 50-80٪ لا يسبب تشوهات كبيرة في النقل الكتلي، مما يؤكد أن مستوى تحميل المستشعرات الحيوية مناسب للتحليل الحركي الموثوق.
    6. تقدير KD
      1. تحديد الألفة المرتبطة (KD) من خلال اختبار تركيزات المحلل (GsMTx4) بمستويات 0 ميكرومو، 5 ميكرومولار، 10 ميكرومولار، 20 ميكرومولار، 30 ميكرومولار، 50 ميكرومولار، و100 ميكرومولار.
    7. ضوابط الإشارة الخلفية
      1. تضمين ضوابط مناسبة لطرح إشارات الخلفية بدقة وضمان قياسات حركية موثوقة.
      2. استخدم مسبار FLAG مرجعي لأخذ الارتباط أو الانحرافات غير المحددة التي قد تحدث أثناء الاختبار.
        ملاحظة: يجب ألا يكون هذا المجس المرجعي مثبتا للبروتين المستهدف، ويعمل كأساس لتصحيح الإشارة المستلصة من المجسات التي تحتوي على العينة.
      3. اطرح إشارة المرجع من إشارة العينة لتحليل التفاعلات المحددة فقط بين TMEM120A M207A الموسوم بعلم FLAG والتحليلات.
        ملاحظة: تحقق من أن مسبار FLAG المرجعي يظهر إشارة قليلة طوال الاختبار. يشير خط الأساس المستقر والمنخفض إلى ارتباط غير محدد لا يذكر. إذا تذبذبت أو زادت إشارة المرجع، أعد تقييم تركيب المخزن المؤقت أو التعامل مع المجسات أو تحضير العينة لتقليل التفاعلات غير المحددة قبل المضي قدما في التحليل الحركي.
  2. تكوين معلمات الاختبار الأساسية لتحليل الحركيات
    1. اضبط تردد جمع البيانات على 5 هرتز لجمع 5 نقاط بيانات في الثانية (موصى به لجميع اختبارات الحركة).
    2. اختر صيغة اللوحة ذات 384 بئر .
    3. اضبط سرعة الهزاز إلى 1,000 دورة في الدقيقة ودرجة الحرارة بين المحيط و30 درجة مئوية (30 درجة مئوية المستخدمة في هذه التجربة لتحقيق أفضل نتائج الحركية).
  3. قم بضبط إعداد اللوحة.
    1. انتقل إلى تبويب إعداد اللوحة وحدد تعيينات الآبار لكل من لوحة 384 بئر ولوحة ماكس.
    2. تعيين وظائف البئر على لوحة 384 بئر.
      ملاحظة: تم تلخيص الرموز والتعليقات المستخدمة لكل من لوحة 384 بئر ولوحة ماكس في الجدول التكميلي S1.
      1. وضع علامة على الآبار حسب الدور: المخزن المؤقت، البروتين (التحميل)، الليغاند (العينة).
      2. ضع تعليقات على آبار تحميل البروتين بتركيز (مثل 250 نانومال) للاختبارات الحركية.
        ملاحظة: التسمية الدقيقة ضرورية لحساب kon و KD (انظر الشكل الإضافي S2A).
    3. قم بتكوين خريطة اللوحة الكبرى (لوحة المسبار).
      1. تعيين مجسات حساسات حيوية للآبار المناسبة.
      2. إذا كان هناك تخطيط لتجديد المجسات، خصص آبارا لمخازن التجديد والتعادل. ضع علامة واضحة على هذه الآبار في البرنامج لضمان الأتمتة المناسبة أثناء التجديد (انظر الجدول التكميلي S2).
        ملاحظة: تكون مخزن الاختبار من 25 مللي مولار HEPES (رقم الهيدروجيني 7.8)، 200 ملليمول NaCl، 0.00015٪ (بدون الحمض الخام) LMNG، و0.0005٪ (v/v) Tween-20. تم تنفيذ خطوة التجديد لمجسات الاستشعار الحيوية المضادة ل FLAG باستخدام مخزن Q يحتوي على 0.3٪ جلايسين (pH 3.8)، تلاها خطوة تعادلية باستخدام مخزن الاختبار (25 ملليمولار HEPES، 200 ملليمولار NaCl، 0.00015٪ LMNG، و0.0005٪ Tween-20، pH 7.8).
  4. اختر تبويب خطوات الاختبار .
    1. انتقل إلى تبويب خطوات الفحص لتكوين سير عمل الفحص الحركي. حدد مواقع الآبار لكل مرحلة اختبار، بما في ذلك خط الأساس، وتحميل البروتين، والارتباط، والتفكك (انظر الشكل التكميلي S3).
    2. اختر نوع الخطوة المناسب من القائمة المنسدلة. تأكد من أن خطوات الارتباط والتفكك موسومة بشكل صحيح لتحليل حركي دقيق.
    3. أدخل مدة كل خطوة بالثواني لتحديد أوقات التعريض لجميع مراحل التفاعل.
      1. اضبط مدة الخطوة الأساسية للسماح بتوازن المستشعر قبل تحميل البروتين (60 ثانية).
      2. حدد مدة خطوة تحميل البروتين لتحقيق مستويات تثبيت الليغاند المرغوبة (60 ثانية) (الشكل 5).
      3. اضبط مدة خطوة الارتباط للسماح بربط التحليل الكافي (300 ثانية) (الشكل 5).
      4. اضبط مدة خطوة التفكيك لالتقاط حركيات فك الارتباط التحليلي بشكل كاف (600 ثانية) (الشكل 5).
    4. اضبط سرعة الهزاز (RPM) لكل خطوة للحفاظ على خلط متسق وجودة بيانات مثلى (1000 دورة في الدقيقة).
  5. خطوة المحاذاة والتصفية (انظر الشكل التكميلي S4 والشكل التكميلي S5)
    1. قم بتصحيح البيانات الخام عن طريق تعديل نطاق البيانات حسب الحاجة لإزالة التشوهات من الخطوات الحركية.
    2. لمحاذاة محور Y، قم بمحاذاة البيانات في بداية خطوة الربط عن طريق اختيار الارتباط تحت نوع الخطوة محاذاة وتفعيل خيار البدء .
    3. تفعيل خيار تصحيح التداخل للحفاظ على الاستمرارية بين الخطوات أثناء الاختبارات الحركية القياسية.
    4. التصفية: تطبيق تنعيم البيانات لتقليل ضوضاء الإشارة دون تشويه الاتجاهات. اختر معالجة لمقارنة البيانات الملساء مع الإشارات الخام.
  6. حدد خطوة مرجعية (انظر الشكل الإضافي S6).
    1. حدد مسبار مرجعي باختيار مسبار المرجع والنقر على زر مسبار المرجع .
    2. اختر مجسات العينة بالنقر على أرقام الأعمدة المقابلة لمجسات العينة.
    3. لتعريف دالة الطرح، افتح محرر الصيغ، اضغط على تعديل الصيغة، وحدد دالة الطرح لإزالة الخلفية.
    4. مراجعة عرض الجدول للتأكد من تطبيق طرح المرجع بشكل صحيح.
  7. خطوة تركيب الربط
    1. انتقل إلى تبويب التركيب وحدد معلمات التحليل (الشكل التكميلي S7).
    2. اختيار البيانات: يشمل كل من مراحل الارتباط والتفكك للتوافق الحركي المحلي. استبعد المؤشرات الشاذة يدويا إذا كانت تظهر تركيب منحنى سيء أو إشارة غير منتظمة.
    3. اختيار نموذج الربط: اختر نموذج الربط 1:1 ليتناسب مع البيانات ما لم يلاحظ سلوك معقد. راجع المنحنيات والمكونات المتبقية للتحقق من ملاءمة النموذج.
    4. استراتيجية الملاءمة: اختر واحدة من استراتيجيات الملاءمة التالية بناء على جودة البيانات وأهداف التجريب:
      1. المحلي: يتناسب مع تركيز كل محلل بشكل فردي، مما يسمح بتقييم مستقل لحركة الارتباط والتفكك.
      2. العالمي: يتناسب مع جميع تركيزات التحليل في نفس الوقت باستخدام مجموعة واحدة من المعلمات الحركية، مما يوفر نموذجا عاما لمجموعة البيانات.
      3. كامل: يتناسب مع مرحلتي الارتباط والتفكك عالميا عبر جميع التركيزات.
      4. جزئي: يناسب فقط مرحلة الارتباط، متجاهلا الانفصال.
        ملاحظة: تم تحليل بيانات BLI باستخدام نموذج ربط لانغموير بنسبة 1:1 مع تركيب محلي كامل. يضمن التوافق المحلي معالجة كل تركيز محلل بشكل مستقل، مما يوفر تمثيلا دقيقا لحركية الارتباط مع تقليل التشوهات الناتجة عن التباين في مرحلة التفكيك. يتجنب هذا النهج التوافق الزائد في المناطق ذات الإشارات المتغيرة أو غير المستقرة، مما يسمح بتقدير أكثر موثوقية للمعلمات الحركية (k تشغيل وk إيقاف) (الجدول 1 والجدول 2).
  8. التحليل الحركي
    1. مراجعة المنحنيات الملاءمة وبواقيا: فحص المنحنيات الملاءمة والبواقي المقابلة لتقييم جودة وصحة النموذج. تأكد من أن البواقي موزعة عشوائيا حول الصفر دون انحرافات منهجية (انظر الشكل 4E للبواقي الممثلة).
    2. استبعاد البيانات غير الملاءمة: إزالة تركيزات المحللات التي تظهر إشارات مسطحة أو صاخبة أو غير موثوقة لتحسين دقة النموذج بشكل عام.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استبعاد تركيز 10 ميكرومولار من التركيب بسبب تداخله مع مجموعة بيانات 5 ميكرومول، مما قد يشوه تقدير المعلمات الحركية (انظر الشكل 6A,B).

النتائج

تم التعبير عن طفرة TMEM120 M207A في خلايا تعليق HEK293SF-17 باستخدام متجه pCDNA3.1 يشفر علامة FLAG ذات طرفي N الشكل 1. مكن النقل العابر من التعبير عن البروتين المؤتلف. بعد حصاد الخلية، تم إذوبان بروتينات الغشاء في محلول نيوبنتيل غليكول (LMNG) من لوريل مالتوز بنسبة 0.5٪، وهو منظف غير أيوني مناسب للحفاظ على ذوبانية البروتين الغشائي.

تم تنقية الأجزاء القابلة للذوبان باستخدام راتنج M2 المضاد ل FLAG. تم غسل الراتنج باستخدام محلول يحتوي على 0.01٪ LMNG لإزالة البروتينات غير المرتبطة تحديدا، وتم إزعاج TMEM120 M207A في محلول يحتوي على 0.001٪ LMNG. تم تركيز الإزالة باستخدام مرشحات طرد مركزي بوزن جزيئي يصل إما إلى 30 كيلو دالتون أو 100 كيلو دالتون، حسب إنتاج العينة. تم إجراء المزيد من التنقية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). تم تنفيذ الخطوة النهائية ل SEC في مخزن يحتوي على 0.00015٪ LMNG، مما أنتج ملف تفريغ أحادي التشتت يتوافق مع تحضير بروتين متجانس ومستقر مناسب للتحليلات الهيكلية والوظيفية اللاحقة (الشكل 2B).

يتم تلخيص التحسين والتوصيف الفيزيائي الحيوي للنماذج المميزة بعلم TMEM120 M207A في الشكل 2. تم تأكيد التعبير والتنقية بواسطة SDS-PAGE، الذي أظهر نطاقا واحدا بقوة تقارب 50 كيلو دالتون. كانت الهجرة الملحوظة أعلى قليلا من الوزن الجزيئي المتوقع للشكل الأحادي (الشكل 2A)، ويرجح أن ذلك بسبب العينة غير المسلوقة قبل الرحلان الكهربائي. عرض كروماتوجرام SEC ذروة متماثلة واحدة تتدفق عند حجم يتوافق مع كتلة جزيئية ظاهرة تقارب 150 كيلو دالتون في LMNG بنسبة 0.00015٪ (مع الفولت) (الشكل 2B)، متوافقا مع TMEM120A الديمر M207A في مصفوف مغسل LMNG. يظهر هذا السلوك في الإزالة مجموعة بروتينية متجانسة وأحادية التشتت، مما يجعله مناسبا للتوصيف الفيزيائي الحيوي في المراحل اللاحقة.

تم تحليل خصائص ميسيل المغسلة في LMNG تحت ظروف العزل التجريبي باستخدام الفوتومترية الكتلية. أجريت القياسات في مخزن SEC بتركيزات متفاوتة من LMNG في غياب البروتين لتقييم مساهمة ميسيلز المغسلة في الكتلة الجزيئية الصافية. عند 0.001٪ (w/v) LMNG، وهو تركيز أعلى من تركيز الميسيل الحرج (CMC)، تم اكتشاف الذروة السائدة عند حوالي 69 كيلو دالتون، وهو ما يتوافق مع الميسيل الخفيف وحده دون أي بروتين مرتبط (الشكل 4A). عندما تم تقليل تركيز LMNG إلى 0.0001٪ (w/v)، تحت CMC، انتقل النوع الرئيسي إلى ~48 كيلو دالتون، مما يشير إلى وجود تجمعات أصغر متبقية أو تجمعات شبه ميسيلرية بدون بروتين (الشكل 4B). لاحقا (الشكل 4C)، تم تخفيف TMEM120A M207A في مخزن SEC يحتوي على تركيزات مختلفة من LMNG لتقييم حالته الأوليغوميرية بواسطة الفوتومترية الكتلية. عند 0.00001٪ LMNG (~20x أقل من CMC، الماجنتا)، لوحظ ذروة سائدة عند حوالي 42 كيلو دالتون، تتوافق مع المونومر TMEM120A M207A. عند 0.00015٪ من LMNG (~10x تحت CMC، أزرق)، أشار السكان الرئيسيون عند ~86 كيلو دالتون إلى وجود ديمر. زيادة تركيز LMNG إلى 0.001٪ (~2x فوق CMC، البرتقالي) أدى إلى نوع رئيسي ~150 كيلو دالتون، متوافقا مع مركبات مصارف البروتين. عند 0.002٪ LMNG (~4x فوق CMC، اللون الأخضر)، تم اكتشاف توزيع واسع يتمركز بالقرب من 180 كيلو دالتون، يمثل تجمعات أكبر مرتبطة بالميسيل أو أوليغومرات من الرتبة الأعلى. تظهر هذه النتائج أن تركيز LMNG داخل مخزن SEC يؤثر بشكل كبير على الحالة الأوليغوميرية الواضحة ل TMEM120A M207A، مع ملاحظة توازن الأحادي-الثنائي تحت CMC وتكوين مركب البروتين المنظف السائد فوق CMC.

تم تقييم الاستقرار الديناميكي الحراري ل TMEM120A M207A الذي جمع من القمة الرئيسية للSEC ومحفوظ في مخزن SEC (25 ملليمولار HEPES، 200 مللي مولار NaCl، 0.00015٪ (مع الفولت) LMNG، pH 7.8) من خلال تحليل إزالة الطبيعة الحرارية. أظهر البروتين نقطة انحناء عند حوالي 46 درجة مئوية، تتوافق مع درجة انصابه (Tm) تحت هذه الظروف القابلة للذوبان بالمنظف. تشير قيمة Tm هذه إلى استقرار حراري متوسط، مما يشير إلى أن TMEM120A M207A يحتفظ بتكوين مطوي بشكل صحيح داخل الميسيلز LMNG لكنه قد يبدأ في التكسير أو التجمع عند درجات حرارة أعلى.

يظهر التداخل الطبقي الحيوي (BLI) ألفة ارتباط ميكرومولار بين TMEM120A M207A وGsMTx4T. توضح الآثار في الشكل 5 خمس خطوات تجريبية: (1) خط الأساس، (2) تحميل العينة TMEM120A M207A، (3) خط الأساس لإزالة الارتباط غير النوعي والفائض TMEM120A M207A، (4) ارتباط، و(5) التفكك. يتم رسم تحول الطول الموجي (نانومتر) مع مرور الوقت لزيادة تركيزات GsMTx4 (0، 5، 10، 20، 30، 50، و100 ميكرومتر) التي تتفاعل مع TMEM120A M207A الثابت.

خلال الأساس الأولي (الخطوة 1)، بقيت الإشارة مستقرة، مؤكدة توازن المستشعر في المخزن المؤقت. TMEM120A تحميل M207A (الخطوة 2) أدى إلى زيادة مميزة في الإشارة، تتوافق مع ~50-80٪ تشبع المجسات عبر الحساسات. أظهرت مرحلة التحميل استجابة منحنية قليلا بدلا من هضبة حادة، مما قد يعكس حدا جزئيا في نقل الكتلة، حيث يكون انتشار M207A TMEM120A سطح المستشعر أبطأ من معدل الارتباط — وهو تأثير شائع في البروتينات القابلة للذوبان في الغشاء أو المنظف والتي يمكن أن تؤثر على تغطية السطح الظاهرة.

الخطوة الأساسية التالية (الخطوة 3) أزالت فعليا TMEM120A M207A غير مربوطة أو مربوطة بشكل فضفاض. خلال مرحلة الارتباط (الخطوة 4)، أدى زيادة تركيزات GsMTx4 إلى زيادات واضحة تعتمد على التركيز في تغير طول الموجة. أثناء التفكك (الخطوة 5)، تم وضع المستشعر الحيوي في مخزن SEC يحتوي على LMNG عند ~10x تحت CMC. أظهرت أول 5-10 ثوان من التفكك انخفاضا سريعا في الإشارة، من المحتمل أن يمثل إفرارا سريعا ل GsMTx4 من المواقع المتاحة بسهولة، تلاه تلاشي أبطأ قد يعكس TMEM120A مجمعات M207A-GsMTx4 الأكثر استقرارا مع حركيات تفكك بطيئة. ظلت إشارات المجسات المرجعية ثابتة طوال التجربة، مما يشير إلى ارتباط غير محدد بسيط للغاية. بشكل عام، تظهر هذه البيانات تفاعلات محددة TMEM120A M207A-GsMTx4؛ ومع ذلك، يجب تفسير الحركيات المرصودة بحذر بسبب بيئة المنظفات وتأثيرات النقل الكتلي المحتملة.

أظهرت حساسات الارتباط والتفكك للبيانات المعالجة بعد طرح المجس المرجعي (الشكل 6A) استجابات تعتمد على التركيز ل GsMTx4 في نطاق 5-100 ميكرومولار. زيادة تركيزات الروابط أدت إلى تحولات طول موجية أعلى تدريجيا، تلتها انخفاض تدريجي وبطيء خلال مرحلة التفكك التي تبلغ 200 ثانية. تم استبعاد مجموعة بيانات 10 ميكرومولار من التركيب بسبب التداخل مع أثر 5 ميكرومولايت، مما حسن جودة النموذج بشكل عام.

تم إجراء التحليل الحركي باستخدام نموذج لانغموير للارتباط والتفكك بنسبة 1:1 مع استراتيجية ملاءمة محلية كاملة، حيث تم تكييف تركيزات المحللات الفردية بشكل مستقل ضمن إطار حركي مشترك (الشكل 6B). كانت المنحنيات الملاءمة (الحمراء) متوافقة جيدا مع الآثار التجريبية، مما أعطى ثابت تفكك تقديري (KD) في نطاق الميكرومولر المنخفض. لم يكشف التحليل المتبقي (الشكل 6C) عن انحرافات منهجية كبيرة، مما يشير إلى أن النموذج المطبق كان مناسبا لمجموعة البيانات. قد تعكس الفروقات الطفيفة التي لوحظت خلال مرحلة الارتباط المبكرة محدوديات في نقل الكتلة أو تأثيرات بيئة ميسيل المنظف. تظهر أمثلة إضافية على منحنيات الارتباط والتفكك المتوافقة، والمخططات المتبقية، وإحصائيات التوافق عبر نسخ الاختبارات المتعددة ومواقع المجسات في الشكل التكميلي S8.

في البيانات الخام (الشكل 5)، أظهرت أول 5-10 ثوان من التفكك انخفاضا سريعا في الإشارة، مما يمثل على الأرجح انفعارا سريعا ل GsMTx4 من المواقع المتاحة بسهولة، تليه تحلل أبطأ قد يعكس TMEM120A مجمعات M207A-GsMTx4 الأكثر استقرارا مع حركية تفكك بطيئة. لذلك، في الجدول 2، تمت إزالة أول 100 ثانية من التفكك من التركيب. يشير غياب الانحراف المنهجي إلى توافق جيد مع نموذج لانغموير المحلي الكامل 1:1 ل TMEM120A M207A في جميع التركيزات المختبرة (الشكل 7).

كشف التحليل الحركي لارتباط GsMTx4 ب TMEM120A M207A عن ارتباط يعتمد على التركيز وسلوكيات تفكك عبر نطاق الرابطة 5-100 ميكرومولار (الجدول 1). ارتفعت ثوابت معدل الارتباط المرصود (kon) بشكل طفيف مع ارتفاع تركيز GsMTx4، حيث تراوحت من حوالي 1.0 × 10⁻⁶ إلى 3.2 × 10-6 1/M·s، بينما بقيت ثوابت معدل التفكك المقدرة (koff) قريبة من الصفر ضمن الخطأ التجريبي، مما يشير إلى مرحلة تفكك بطيئة أو ضئيلة تحت الظروف المختبرة. كانت ثوابت تفكك التوازن المحسوبة (Kd) في النطاق المنخفض إلى المتوسط للميكرومولر (~0.8-3.3 ميكرومولار)، متوافقة مع تفاعل ألفة متوسطة. أدى التوافق الكامل المحلي باستخدام نموذج ارتباط لانغموير 1:1 إلى نتائج تركيب عالية الجودة عبر جميع تركيزات GsMTx4، مع معاملات ارتباط تجاوزت 0.99 وقيم منخفضة نسبية χ2 لكل من مرحلتي الارتباط والتفكك (الجدول 1). كانت ثوابت تفكك التوازن المحسوبة متسقة عبر التركيزات والتكرارات، مع قيم KD في النطاق الميكرومولاري المنخفض (~1-2 ميكرومولار)، مما يشير إلى ارتباط معتدل لكنه محدد بين TMEM120A M207A و GsMTx4.

أظهرت مجموعات البيانات المكررة عند كل تركيز قابلية للتكرار، كما تشير معاملات الارتباط العالية (R² > 0.99) لكل من التوافق بين الارتباط والتفكك. كانت القيم الكاملة والنسبية χ² منخفضة وقابلة للمقارنة عبر النسخ المكررة، مما يدعم متانة نموذج ارتباط لانغموير بنسبة 1:1 المطبق في التحليل. عند تركيزات الليغاند الأعلى (≥50 ميكرومولار)، لوحظت قيم kon وKD زيادة طفيفة، والتي قد تعكس تأثيرات نقل الكتلة الطفيفة أو التباين السطحي المحلي بدلا من التغيرات الحقيقية في الألفة. يتم توضيح الاتساق الحركي عبر عدة نسخ ومواقع مجسات بشكل أكبر في الشكل التكميلي S9.

تظهر الملفات الحركية أن GsMTx4 يتفاعل بشكل محدد ومستقر مع TMEM120A M207A، مكولا مجمعات مستقرة نسبيا تتميز بالتفكك البطيء وارتباط الميكروموللار.

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل التنقية لطفرة M207A TMEM120A المعبر عنها في خلايا تعليق HEK293SF-17. نظرة عامة تخطيطية لإجراء تنقية البروتينات. تم التعبير عن TMEM120A M207A من بلازميدات pCDNA3.1 في خلايا HEK293SF-17. تم إذابة الخلايا في نسبة LMNG بنسبة 0.5٪، تلتها تنقية الألفة باستخدام راتنج M2 المضاد ل FLAG. تم غسل الراتنج باستخدام محلول يحتوي على 0.01٪ من LMNG لإزالة البروتينات غير المرتبطة تحديدا. تم تدشين TMEM120A M207A في مخزن يحتوي على 0.001٪ LMNG. تم تركيز المحلول باستخدام مرشحات قطع الوزن الجزيئي بقوة 100 كيلو دالتون أو 30 كيلو دالتون، ثم تم تنقيه أكثر بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم في مخزن يحتوي على 0.00015٪ LMNG. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: كروماتوغرافيا استبعاد الحجم وصفحة SDS لنموذج TMEM120A M207A المنقى في مسحوق LMNG (A) SDS-PAGE من TMEM120A M207A الموسوم بعلامة FLAG تم تنقيه بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يظهر نطاق البروتين عند ~50 كيلو دالتون في المسار 1، وهو ما يتوافق مع المونومر المتوقع. (B) ملف SEC لمادة TMEM120A M207A المنقاة على عمود SEC في مخزن SEC (25 مللي مولار HEPES، 200 ملليمولار NaCl، 0.00015٪ LMNG، pH 7.8). يشير إخراج البروتين إلى نوع أحادي التشتت السائد المناسب للاختبارات الفيزيائية الحيوية في المراحل السفية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: الفلوريمترية الماسحة التفاضلية ل TMEM120A مادة M207A المنقاء في LMNG. يكشف DSF عن نقطة انحراف حرارية عند 46 درجة مئوية، مما يدل على الاستقرار الحراري للبروتين تحت ظروف العزل المختبرة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: توصيف TMEM120A M207A المنقى في منظف LMNG باستخدام تقنية الفوتومترية الكتلية. (أ، ب) الفوتومترية الكتلية لمخزن SEC مع تركيزات LMNG متغيرة. عند 0.001٪ من LMNG (فوق تركيز الميسيل الحرج، CMC)، يكون الوزن الجزيئي الظاهر ~69 كيلو دالتون، ويتوافق بشكل أساسي مع ربات LMNG. عند 0.0001٪ من كثافة الكثافة الطويلة (عشرة أضعاف أقل من CMC)، تظهر الذروة عند ~48 كيلو دالتون. (ج) تحليل القياس الضوئي الكتلي لتأثيرات تركيز LMNG على أوليغوميريزيشن TMEM120A. TMEM120A في 0.00001٪ LMNG (~20x أقل من CMC، الماجنتا) يظهر تجمعا رئيسيا بحوالي 42 كيلو دالتون (مونومر). في 0.00015٪ LMNG (~10x أقل من CMC، أزرق)، يلاحظ عدد ~86 كيلو دالتون، يتوافق مع الديمر. في نسبة LMNG بنسبة 0.001٪ (~2x فوق CMC، برتقالي)، يتوافق نوع رئيسي عند ~150 كيلو دالتون مع مركبات مصارف البروتين. في LMNG بنسبة 0.002٪ (~4x فوق CMC، أخضر)، يشير التوزيع الواسع المتمركز عند ~180 كيلو دالتون إلى تجمعات أكبر مرتبطة بالميسيل أو أوليغومرات من الرتبة الأعلى. تظهر هذه النتائج أن تركيز LMNG يؤثر بشكل كبير على الحالة الأوليغومية الظاهرة ل TMEM120A، حيث يلاحظ توازن الأحاد-دايمر أسفل CMC وتكون مركب مغسل البروتين السائد فوق CMC. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: بيانات خام من برنامج يظهر TMEM120A تفاعلات M207A-GsMTx4. تظهر التداخل الطبقي الحيوي أن TMEM120A (M207A) يرتبط بمثبط القنوات الميكانيكاني GsMTx4 بألفة ميكرومولرية. يوضح الشكل بيانات استجابة BLI الخام التي تم الحصول عليها من برنامج Gator Prime، موضحا المراحل الخمسة الرئيسية للاختبار: (1) خط الأساس الأولي، حيث بقيت الإشارة مستقرة؛ (2) تثبيت البروتين (التحميل)، مما يؤدي إلى زيادة حوالي 1.5 نانومتر في انحراف الطول الموجي؛ (3) الخط الأساسي الثاني، الذي يسمح بإزالة البروتين غير المرتبط أو المرتبط بشكل فضفاض؛ (4) مرحلة الارتباط (ربط الليجند)، حيث أدى زيادة تركيزات GsMTx4 إلى زيادة استجابة تصل إلى ~5.5 نانومتر خلال 300 ثانية؛ و(5) مرحلة التفكك (تحرير الليغاند)، التي تظهر تدهورا تدريجيا للإشارة على مدى 600 ثانية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: حركيات الارتباط بين TMEM120A M207A مع ببتيد GsMTx4. (A) تفاعل مستشعرات الارتباط والتفكك ل TMEM120A M207A مع GsMTx4 عند خمسة تركيزات: 5 ميكرومولار، 20 ميكرومولار، 30 ميكرومولار، 50 ميكرومولار، و100 ميكرومولار. تم استبعاد مجموعة بيانات 10 ميكرومولار من التركيب بسبب التداخل مع منحنى 5 ميكرومولار، مما حسن ملاءمة النموذج بشكل عام. تشير الخطوط الحمراء المتقطعة الرأسية إلى بداية ونهاية مرحلة التفكك. (ب) تم تركيب حساسات الحساسات باستخدام نموذج لانغموير المحلي الكامل 1:1 لتفكك الارتباط. تمثل المنحنيات الحمراء النموذج الملاءم، بينما تتوافق الآثار التجريبية مع بيانات الارتباط والتفكك المقاسة لكل تركيز GsMTx4 (نسختان لكل حالة). (ج) مخططات متبقية تظهر الانحراف بين البيانات التجريبية والنموذج الملاءم لكل من مرحلتي الارتباط والتفكيك، مما يؤكد جودة الملاءمة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: مخططات متبقية تتوافق مع منحنيات الربط الملائمة المعروضة. يمثل كل مخطط البواقي (الفرق بين البيانات التجريبية والنموذج المعدل) لتركيز واحد من GsMTx4: 5 ميكرومولار، 20 ميكرومولار، 30 ميكرومولار، 50 ميكرومولار، و100 ميكرومولار. تعرض البواقي كانحراف إزاحة (نانومتر) مقابل الزمن (ثوان)، وتظهر توزيعا عشوائيا حول الصفر عبر مرحلتي الارتباط والتفكك. يشير غياب الانحراف المنهجي إلى توافق جيد لنموذج لانغموير المحلي الكامل 1:1 ل TMEM120A M207A في جميع التركيزات المختبرة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: ملخص المعاملات الحركية لارتباط TMEM120A M207A ب GsMTx4. تم الحصول على المعلمات الحركية من التركيب الكامل المحلي باستخدام نموذج ارتباط لانغموير 1:1. يتم الإبلاغ عن الارتباط (k on)، والتفكك (koff)، وثوابت المعدل المرصود (kobs)، ومواضي تفكك التوازن (KD) لكل تركيز GsMTx4 وتتكرر. تم تقييم جودة الملاءمة باستخدام قيم R² و χ² لمراحل الاكتمال، والارتباط، والانفصال. عبر جميع التركيزات، أظهرت التوافقات معاملات ارتباط عالية (R² > 0.99) وقيم نسبية منخفضة من χ²، مما يشير إلى أداء نموذجي موثوق. ملاحظات: يشير M Conc. إلى تركيز GsMTx4 (ميكروM). يمثل kobs ثابت المعدل المرصود الذي يعكس عمليات الارتباط والتفكك المجمعة. تعكس الأخطاء المبلغ عنها في kobs، kon، وkoff عدم اليقين في الملاءمة. تشير قيم R² إلى مدى ملاءمة المراحل الكاملة، والمراحل الارتباطية، والانفصال. تمثل قيم χ² النسبية مقاييس جودة الملاءمة المتطابعة، بينما تشير قيم χ² المطلقة إلى انحراف متبقي بين البيانات المرصودة والبيانات الملاءمة. الاختصارات: kعلى = ثابت معدل الارتباط (1/M·s); koff, = ثابت معدل التفكك (1/ث)؛ kobs = ثابت معدل المراقبة (1/ث)؛ KD = ثابت تفكك التوازن؛ Rmax = أقصى استجابة؛ Req = استجابة توازنية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: معاملات المعالجة وبواقي التوافق الحركي. معلمات المعالجة: بداية الارتباط، 0 ثانية؛ نهاية الاتحاد، 300 ثانية؛ بداية الانفصال، 100 ثانية؛ نهاية التفكك، 300 ثانية. القيمة الدنيا R²، 0.9؛ القيمة القصوى χ²، 8. خطوة المحاذاة: نهاية بخطوة واحدة (المؤشر = 1، المتوسط = 0). تم تطبيق التصحيح بين الخطوات خلال مرحلة الارتباط. متوسط الجمعية، 50؛ متوسط الانفصال، 0. تم تعطيل تنعيم سافيتسكي-غولاي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الشكل التكميلي S1: تجربة تحسين لتحميل تركيزات مختلفة من بروتين TMEM120A M207A على مجسات مضادة ل FLAG بتركيز ثابت (100 نانومال) من ببتيد GsMTx4. (أ) مستشعرات BLI خام تظهر الخطوات الخمس للقياس الحركي: (1) خط الأساس في مخزن SEC أو مخزن الاختبار (25 ملي مولار HEPES، pH 7.8؛ 200 ملي مولار NaCl؛ 0.00015٪ (مع الحمض الخام) LMNG؛ 0.0005٪ (v/v) Tween-20); (2) تحميل أربعة تركيزات مختلفة من TMEM120A M207A على مسبار FLAG، مع استخدام المسبار المرجعي (البرتقالي) كتحكم سلبي لتأكيد غياب الارتباط غير النوعي؛ (3) عند الخطوة الثانية من خط القاعدة؛ (4) مرحلة الارتباط، و(5) مرحلة الفصل. (ب) نموذج الربط العالمي 1:1 يتناسب مع تركيزات M207A الأربعة TMEM120A التي تتفاعل مع ببتيد GsMTx4 بقوة 100 نانومل. (ج) مخططات متبقية لكل من مرحلتي الارتباط والتفكك، تظهر انحرافات طفيفة عن النموذج المناسب (<0.05 نانومتر). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي S2: إعداد اللوحة وتكوين الاختبار. (أ) تصميم الصفيحة للوحة ببئر 384، حيث يمكن تعيين معلمات مختلفة. تتوافق العينات مع الليجند (GsMTx4) بتركيزات مختلفة. تشير الآبار البرتقالية إلى TMEM120 بروتين M207A عند 250 نانومال. تمثل الآبار تكرارات البروتين عند 250 نانومتر، وتم استخدام نفس المخزن لخطوات الأساس والارتباط والتفكك. (B) عرض ماكس لوح يظهر أربعة مجسات حساسات حيوية مضادة ل FLAG: مسبار مرجعي واحد وثلاثة مجسات لتكرارات البروتين. تم ترطيب جميع المجسات مسبقا في مخزن الاختبار، ثم إعادة توليدها في مخزن Q، وتم تحييدها في مخزن الاختبار. تم استخدام نفس المخزن خلال مراحل الأساسي، والارتباط، والانفصال. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: دورات إعداد الاختبار، بما في ذلك خط الأساس، تحميل البروتين، خط الأساس الثاني، الارتباط، والانفصال. الاختصارات: B = المخزن المؤقت; L = حمل; 0، 5، 10، 20، 30، 50، و100 = تركيزات GsMTx4 بالميكروموتر. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي S4: سير عمل تحليل الحركيات الجديدة (K). اختر أيقونة التجربة ، التي توفر نظرة عامة على جميع الاختبارات التي أجريت ضمن تجربة واحدة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي S5: سير عمل تحليل الحركيات الجديدة (K).أيقونة المحاذاة والتصفية، حيث يمكن مراجعة وتحليل البيانات الخام لكل من مراحل الارتباط والتفكيك. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي S6: سير عمل تحليل الحركيات الجديدة (K).تعيين أيقونة المرجع، تستخدم لاختيار المستشعر المرجعي المناسب لطرح الخلفية وتفسير البيانات بدقة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي S7: خطوات تركيب الربط في سير عمل التحليل الحركي. إعدادات معلمات التوافق الحركي المستخدمة لتحليل بيانات تفاعل الربط. يفترض النموذج تفاعلا بنسبة 1:1 مع موقع ربط واحد من الرابط. يتم تعيين نوع التركيب على المحلي، حيث يتناسب كل منحنى تركيز بشكل مستقل وليس بشكل عام. خيار التركيب الكامل مع تفعيل الغرزة الكاملة يشمل كامل منحنيات الارتباط المستمر والتفكك. يتم تعيين فترات زمنية لمراحل الارتباط والانفصال من 0 إلى 300 ثانية ومن 0 إلى 200 ثانية على التوالي. في الخلفية، يوضح رسم المطابقة الربطية، والرسم البياني المتبقي، ومنحنيات الاختبار الفردية جودة الملاءمة والتغير التجريبي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي S8: خطوات تركيب الربط في سير عمل التحليل الحركي. رسم بياني لتركيب الربط يظهر مراحل الارتباط والتفكك عبر عدة اختبارات يتكرر ومواقع المجسات (C1 و D1). يقيم الرسم البياني المتبقي أدناه جودة الملاءمة، مع بقايا تشير إلى الفروق بين البيانات التجريبية والنموذج الملاءم؛ القيم القريبة من الصفر تعكس ملاءمة جيدة. يلخص الجدول المرافق إحصائيات التوافق، بما في ذلك قيم R² الكاملة، وقيم الارتباط R²، والتفكك R²، وقيم كاي تربيع (X²) لكل نسخة مكررة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S9: خطوات تركيب الربط في سير عمل التحليل الحركي. تحليل حركي لتفاعلات الارتباط من عدة نسخ ومواقع مجسات (C1 و D1). يعرض تغير استجابة المستشعر (nm) مع مرور الوقت مراحل الارتباط والتفكك، حيث يتم ترميز كل منحنى بالألوان حسب الاختبار وموضع المسبار. الخط الأحمر المتقطع الرأسي يحدد الانتقال بين مراحل الارتباط (0-300 ثانية) ومراحل التفكك. فيما يلي، يذكر الجدول المعلمات الحركية المشتقة من ملاءمة نموذج الربط 1:1، بما في ذلك تركيز التحليل (M Conc.)، ثابت معدل الارتباط (kon)، ثابت معدل التفكك (koff)، الأخطاء، وثابت التفكك في التوازن (KD). جودة التوافق المتسقة تدعم متانة القياسات الحركية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول الإضافي S1: جدول يوضح الرموز المستخدمة في كل من لوحة 384 بئر ولوحة ماكس. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي S2: المعاملات الحركية التي تم الحصول عليها لأربعة تركيزات من TMEM120A M207A المحملة على حساسات FLAG الحيوية التي تتفاعل مع ببتيد GsMTx4 بقوة 100 نانومل، باستخدام قيم كون وكوف ثابتة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

لا يزال توصيف تفاعلات البروتينات الغشائية تحديا بسبب الحاجة إلى تنقية دقيقة للبروتين، وتحسين تركيز المنظفات بعناية، وتصميم دقيق للاختبارات. تقدم هذه الدراسة سير عمل مفصل ل TMEM120A M207A، يوضح كل من التنقية والتحليل الحركي باستخدام GsMTx4 مع التداخل الطبقي الحيوي (BLI).

خطوات حرجة وتحسين:
كانت إحدى الخطوات الحرجة المهمة هي تركيز المنظفات، التي تم تحديدها كعامل رئيسي لاستقرار البروتين. شملت عملية التنقية إذابة الخلايا باستخدام عازل يحتوي على 0.5٪ LMNG، تلاها غسل متسلسل بنسبة 0.005٪ LMNG، والاستبعاد ب 0.001٪ LMNG، وعملية الكروماتوغرافيا النهائية بإقصاء الحجم (SEC) في مخزن يحتوي على 0.00015٪ LMNG. هذه الاستراتيجية المغسلة، المبنية على تركيز الميسيل الحرج المنخفض (CMC) ومعدل التباطؤ في LMNG، وفرت استقرارا محسنا للبروتين في الميسيلز أثناء التنقية. احتوى مخزن SEC على مسحوق غسيل بتركيز أقل بعشرة أضعاف من CMC الخاص ب LMNG (0.001٪)، مما قلل فعليا من تأثيره على الفحوصات الفيزيائية الحيوية في المراحل النهائية. تم تأكيد تجانس البروتينات وغياب التجمع باستخدام تحليل مطيافية الكتلة واستقرار الحرارة. توضح الشكل 2، الشكل 3، والشكل 4 التحسين الناجح للتنقية وتثبيت البروتين في تركيزات منظفات تحت CMC.

تم التحكم بعناية في تثبيت البروتين على المستشعر البيولوجي لتحقيق تشبع 50-80٪ من المجسات. مستوى تحميل بين 50-80٪ قد يسبب بعض القيود على النقل الجماعي؛ ومع ذلك، تم اختيار هذا النطاق لتوفير قوة إشارة كافية في نظام BLI، حيث كانت المجسات تتحرك بين الآبار أثناء الاختبار. ساعد تحقيق هذا المستوى من تثبيت الليغاند في الحفاظ على جودة إشارة ثابتة، رغم أن هذه المستويات تحمل لها مزايا وحدود محتملة. كان تضمين مسبار مرجعي أمرا حاسما لتجارب BLI.

تجربة ضابطة إضافية تم فيها اختبار أربعة مستويات مختلفة من TMEM120A الثابتة بتركيز ببتيد واحد (100 نانومال). هذه البيانات مدرجة الآن في المخطوطة المنقحة (الشكل التكميلي S1). زيادة كمية البروتين الثابت أنتجت إشارات تحميل أعلى، لكن في جميع الحالات، ظل التحول أقل من 1 نانومتر من خط الأساس (الشكل التكميلي S1A). قمنا بالإبلاغ عن منحنيات الارتباط والتفكك المتوافقة باستخدام نموذج ربط عالمي 1:1، كما أدرجنا المخططات المتبقية التي تظهر فروقا صغيرة غير ذات دلالة إحصائية بين البيانات المعدلة والبيانات التجريبية.

في الاختبارات الحركية الرئيسية (تحليل 5-100 ميكرومولار)، أظهرت ثوابت المعدل المعدلة الاتجاهات المتوقعة المعتمدة على التركيز. تراوحت قيم kعلى القطع بين حوالي 1.48 × 10⁻⁴ إلى 1.43× 10⁻³ s⁻¹، بينما تراوحت قيم kعلى القيم بين 1.12 × 10² إلى 1.26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹. هذه التغيرات التدريجية عبر سلسلة التركيز تتوافق مع سلوك الارتباط والتفكك الطبيعي المعتمد على التحليل.

في تجربة التحكم، حيث تم اختبار مستويات تحميل المجسات المختلفة عند تركيز واحد للتحليل (100 نانومال)، أظهرت جميع الآثار الأربعة ثوابت حركية متشابهة جدا. كانت قيم k الانحراف ثابتة 1.42 × 10⁻¹ s⁻¹، وقيم k على النقاط كانت باستمرار 2.76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ عبر جميع مستويات التحميل. يشير هذا النقص في التنوع إلى أن لا الارتباط ولا مرحلتي التفكك لم تتأثرا بكثافة المجسات، أو قيود نقل الكتلة، أو إعادة ربط التحليلات.

ومن المتوقع أيضا أن يظهر التفكك عند 100 نانومتر بشكل أسرع في تجربة التحكم. تركيز التحليل 100 نانومتر أقل تقريبا من ال KD، وعند تركيزات أقل بكثير من KD يكون المركب أقل استقرارا، والإشغال الفعلي منخفض. في مثل هذه الظروف، يتقدم التفكك بسرعة أكبر لأن الألفة المرتبطة تكون أضعف عند تركيزات المحللات المنخفضة، وإعادة الارتباط خلال مرحلة التفكك تكون ضئيلة. يتماشى هذا السلوك مع ما يلاحظ عادة عندما يكون تركيز المحلل أقل بكثير منKD (K).

مجتمعة، يدعم اتساق المعلمات الحركية عبر أحمال المجسات والسلوك المتوقع عند تركيزات منخفضة للتحليل فكرة أن ثوابت المعدل المرصودة تعكس خصائص الارتباط الحقيقية بدلا من الآثار الناتجة عن التحميل السطحي أو تأثيرات نقل الكتلة.

حركيات الربط والتفسير:
تم إجراء التحليل الحركي باستخدام نموذج لانغموير للارتباط والتفكك بنسبة 1:1 مع استراتيجية ملاءمة محلية كاملة، حيث تم تكييف تركيزات المحللات الفردية بشكل مستقل ضمن إطار حركي مشترك (الشكل 6B). تم اختيار هذا النهج بدلا من التوافق العالمي التقليدي لأن بعض مجموعات البيانات، خصوصا عند تركيزات الليغاند المنخفضة، أظهرت تداخلات طفيفة أو انحرافات في الطور المبكر يحتمل أن تكون ناجمة عن قيود النقل الكتلي وتأثيرات ميسيل المغسلة على انتشار البروتين. يفترض التوافق العالمي أن جميع الآثار تتبع نفس السلوك الحركي بدقة، والذي يمكن أن يتأثر عندما يختلف الوصول إلى السطح أو البيئة الدقيقة المحلية قليلا بين التركيزات. سمح التوافق المحلي الكامل بنمذجة كل تركيز محلل بشكل مستقل مع الحفاظ على إطار حركي متسق، مما يضمن أن المعلمات المشتقة تعكس بدقة السلوك عند كل تركيز. تطابقت المنحنيات الملاءمة (الحمراء) بشكل وثيق مع الآثار التجريبية، مما أعطى ثابت تفكك تقديري (KD) في نطاق الميكرومولر المنخفض. لم يكشف التحليل المتبقي (الشكل 6C) عن انحرافات منهجية كبيرة، مما يدعم ملاءمة النموذج لهذه التفاعلات مع البروتينات الغشية المذوبة بالمغسل.

أظهرت TMEM120A M207A و GsMTx4 قيم KD في النطاق الميكرومولاري المنخفض (∼0.8-3.3 ميكرومولار). زاد معدل الارتباط (k on) بشكل طفيف مع تركيز الليجند، بينما ظل معدل التفكك (koff) بطيئا جدا، مما يشير إلى تكوين مركب مستقر. من المرجح أن تدهور الإشارة السريع الأولي خلال أول 5-10 ثوان من التفكك يعكس مواقع ارتباط سهلة الوصول، بينما يمثل الطور الأبطأ تفاعلات أكثر استقرارا (الشكل 6A). تسلط هذه الملاحظات الضوء على أهمية اختيار نوافذ التفكك بعناية والنظر في حدود النقل الكتلي عند تحليل البروتينات الغشائية القابلة للذوبان في المغسلة (الجدول 2).

القيود وحل المشكلة:
يجب النظر في عدة قيود للبروتينات الغشائية الذائبة في المغسلة مثل TMEM120A M207A. يمكن أن تحدث تأثيرات نقل الكتلة خلال مرحلة الارتباط المبكرة، حيث قد ينتشر البروتين ببطء إلى سطح المستشعر الحيوي، مما قد يشوه القياسات الحركية قليلا. من الممكن أن يتسبب التحميل الزائد في المستشعرات إذا تجاوز تشبع المجس النطاق الموصى به 50-80٪، مما قد يحد من دقة التحليل الحركي العالمي ويؤثر على قيم كون وكوف. قد تؤثر التأثيرات المعتمدة على المنظفات على استقرار البروتينات، أو الحالة الأوليغوميرية، أو سهولة الوصول إلى الأسطح، خاصة عند التركيزات فوق أو بالقرب من CMC. تشمل العوامل الإضافية انحراف بسيط في خط القاعدة، والارتباط غير النوعي، والتحديات في التقاط حركية التفكك البطيء جدا.

يمكن التخفيف من العديد من هذه المشكلات بتعديلات بسيطة: تقليل تحميل البروتين لتجنب التشبع الزائد، تحسين تركيب المخزن المؤقت (buffer)، وإدراج مجسات مرجعية لتصحيح انحراف القاعدة أو الإشارات غير المحددة. في هذه الدراسة، أدى المخزن المؤقت ل SEC الذي يحتوي على 0.00015٪ من LMNG وتركيزات منخفضة من Tween-20 إلى تقليل الارتباط غير النوع مع الحفاظ على استقرار البروتين. كان اختيار نافذة التفكك بعناية للتوافق الحركي، إلى جانب القياسات المكررة والتحليل المتبقي، مهما أيضا لتأكيد موثوقية المعلمات الحركية. تعزز هذه الاستراتيجيات عموما قابلية التكرار وتساعد في توليد بيانات أكثر قوة وقابلية للتفسير. تم استخدام التوافق الكامل المحلي بدلا من التوافق العالمي لأخذ الفروق الطفيفة بين الآثار عند تركيزات الليغاند الفردية في الاعتبار، مما يضمن أن المعاملات الحركية تعكس بدقة سلوك كل مجموعة بيانات.

BLI وتقنيات الفيزياء الحيوية الأخرى:
مقارنة برنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس السعرات الحرارية بالمعايرة المتساوية الحرارية (ITC)، يقدم التداخل الطبقي الحيوي (BLI) عدة مزايا عملية لتحليل تفاعلات البروتين بين الغشاء والليجاند. مثل SPR وITC، يمكن ل BLI تقديم رؤى مفصلة حول تفاعلات الربط، بما في ذلك معدلات الارتباط (kon)، معدلات التفكك (koff)، وثوابت التفكك التوازن (KD)، دون الحاجة إلى أنظمة ميكروفلويدية معقدة أو تركيز بروتين مرتفع14. تسمح صيغة البئر المفتوح، الغمر والقراءة بتبادل سريع للمخزن المؤقت ومعالجة متوازية لعدة عينات، مما يدعم إنتاجية تجريبية أعلى. على عكس ITC الذي يتطلب كميات كبيرة من البروتين النقي جدا ويوفر بيانات ديناميكية حرارية، يمكن ل BLI قياس معدلات تكوين المعقد والتفكك من تركيز العينة الأدنى في النانو مولار. كما أن BLI متوافق مع الدواسات التي تحتوي على المنظفات أو الدهون، مما يجعله مناسبا للبروتينات الغشائية منخفضة الإنتاجية أو غير المستقرة التي يصعب دراستها باستخدام طرق الفيزياء الحيوية الأخرى. على الرغم من هذه المزايا، تظل التقنيات التكميلية مثل SPR أو ITC مفيدة لتأكيد الاتساق الديناميكي الحراري والتحقق المتقاطع من معاملات الارتباط تحت ظروف خالية من المنظفات وظروف المنظف، لكنها تتطلب تركيزا عاليا من البروتين3.

اتجاهات مستقبلية:
يمكن توسيع هذا السير لدراسة بروتينات الغشاء الأخرى، أو تفاعلات البروتين مع الدهون، أو فحص معدلات الجزيئات الصغيرة. يمكن أن يوفر دمج BLI مع الأساليب المتعامدة مثل الفوتومترية الكتلية، أو التوصيف الهيكلي، أو التجميد الكهرومغناطيسي (cryo-EM) رؤى أكثر تفصيلا حول القلة القليلة القياسية، والقياس القياسي، وآليات الربط. قد تمكن المزيد من التحسين أيضا من تحليل الليغاندات عالية التقارب، أو التفاعلات متعددة التكافؤ، أو المجمعات في بيئات دهنية أكثر تشابها بالسكان الأصليين.

في الختام، يسمح التحكم الدقيق في تثبيت البروتينات، وتركيز المنظفات، وظروف العزل ل BLI بتوليد بيانات حركية موثوقة وقابلة للتكرار لبروتينات TMEM120A M207A وبروتينات الغشاء المشابهة الصعبة. على الرغم من وجود قيود متأصلة، توفر الطريقة منصة قوية لدراسة التفاعلات المحددة بين البروتين والليجاند ذات الألفة المتوسطة تحت ظروف تجريبية محددة جيدا.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر بصدق منصة أبحاث جامعة ملبورن، منشأة توصيف البروتين في ملبورن (MPC)، على دعمها في تنقية البروتين وتوصيفه. حظي البحث بدعم منحة أفكار من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) (2020/GNT2000934 إلى I.R.) والمجلس الأسترالي للأبحاث (مراكز تدريب التحول الصناعي، IC200100052 إلى I.R. وM.M.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008Purification
Anti-FLAG probeGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220-10MLPurification
BioRenderBioRenderhttps://biorender.comFigure 1 creation 
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich9048-46-8Mass photometry
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019Cell culture
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High PerformanceEppendorfNAPurification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMerck11836170001Purification
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-Aldrich9003-98-9Purification
ExpiFectamine 293 Transfection KitThermofisherA14524Transfection
Gator Bio softwareGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061Cell culture
GsMTx4 trifluoroacetateSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growthATCCATCC CRL11268Cell culture
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)ThermofisherA50940Purification
Max PlateGator Bio130062BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001Purification
Prometheus High Sensitivity CapillariesNano TemperPR-C006Thermodynamic stability
Prometheus PantaNano TemperNAThermodynamic stability
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell DisrupterQsonicaNAPurification
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44Purification
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-LinkerGenScript BiotechNAPlasmid
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNAMass photometry

المراجع

  1. Rong, Y., et al. TMEM120A contains a specific coenzyme A-binding site and might not mediate poking- or stretch-induced channel activities in cells. eLife. 10, e71474(2021).
  2. Livnat-Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real-time measurements of membrane protein-receptor interactions using surface plasmon resonance (SPR). J Vis Exp. (93), e51937(2014).
  3. Kovachka, S., Soule, P., Mus-Veteau, I. Microscale thermophoresis to evaluate the functionality of heterologously overexpressed membrane proteins in membrane preparations. Methods Mol Biol. 2507, 445-461 (2022).
  4. Ciesielski, G. L., Hytönen, V. P., Kaguni, L. S. Biolayer interferometry: a novel method to elucidate protein-protein and protein-DNA interactions in the mitochondrial DNA replisome. Methods Mol Biol. 1351, 223-231 (2016).
  5. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12, 791-800 (2009).
  6. Apiyo, D. O. Biolayer interferometry (Octet) for label-free biomolecular interaction sensing. Handbook of Surface Plasmon Resonance. Schasfoort, R. B. N. , 2nd edn, Royal Society of Chemistry. 356-397 (2017).
  7. Egan, D., Slaybaugh, C., Wang, R. Getting started: kinetics assay using bio-layer interferometry. Gator Bio Technical Note. , (2023).
  8. Beaulieu-Laroche, L., et al. TACAN is an ion channel involved in sensing mechanical pain. Cell. 180 (5), 956-967.e17 (2020).
  9. Niu, Y., et al. Analysis of the mechanosensor channel functionality of TACAN. eLife. 10, (2021).
  10. Xue, J., et al. TMEM120A is a coenzyme A-binding membrane protein with structural similarities to ELOVL fatty acid elongase. eLife. 10, e71220(2021).
  11. Chen, X., et al. Cryo-EM structure of the human TACAN in a closed state. Cell Rep. 38, 110445(2022).
  12. Suchyna, T. M. Piezo channels and GsMTx4: two milestones in our understanding of excitatory mechanosensitive channels and their role in pathology. Prog Biophys Mol Biol. 130, 244-253 (2017).
  13. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  14. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic surface plasmon resonance sensors: from principles to point-of-care applications. Sensors (Basel). 16 (8), 1175(2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GsMTx4 TMEM120A FLAG
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة