مقالة منهجية

توليد فعال وسريع لخلايا CAR-T والخلايا القاتلة الناتجة عن السيتوكينات في الأجهزة القابلة للتوسع بواسطة GMP

1.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69369

⸱

ديسمبر 5, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للتوسع لتوسيع منتجات علاجات الخلايا التبنية (ACT)، وهي مستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR)-خلايا T وخلايا قاتلة مستحثة بالسيتوكينات (CIK)، باستخدام أجهزة التوسع السريع النافذ للغاز (G-Rex)، مما يثبت نموا فعالا وقويا في بيئة ذات صلة سريرية.

الملخص

لقد تقدمت علاجات الخلايا التبنية (ACT) بسرعة في السنوات الأخيرة، حيث لعبت دورا محوريا في العلاج المناعي للسرطان وأثرت بشكل كبير على نتائج العلاج. خطوة حاسمة في تطوير العلاج الخلوي، سواء في المراحل ما قبل السريرية أو السريرية، هي عملية التصنيع. تتطلب طرق الزراعة الثابتة التقليدية معالجة الخلايا بشكل متكرر وغالبا ما تكون محدودة بسبب انخفاض تبادل الغازات وإمداد العناصر الغذائية، مما قد يؤثر على إنتاجية الخلية والنمط الظاهري. هنا، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة وقابلا للتكرار وقابل للتوسع لتوسع خارج الجسم الحي لمنتجين من ACT، وهما مستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR)-T وخلايا القاتل المحفز بالسيتوكينات (CIK)، باستخدام أجهزة التوسع السريع النافذ للغاز (G-Rex). تم تصميم أجهزة جي ريكس خصيصا لتعزيز تبادل العناصر الغذائية ودعم الزراعة عالية الكثافة مع تدخل المستخدم المحدود. من بين مختلف مناهج ACT، أظهرت خلايا CAR-T نجاحا ملحوظا في علاج الأورام الخبيثة الدموية، مما سهل تقدما سريعا من البحث التجريبي إلى التطبيقات السريرية. بالإضافة إلى خلايا CAR-T، تم تطبيق خلايا CIK على نطاق واسع في التجارب السريرية بسبب نمطا ظاهريا مميزا وغياب الآثار الجانبية المرتبطة بالعلاج، ومرض الطعم ضد المضيف (GvHD). يحدد هذا البروتوكول الخطوات الفنية الرئيسية لكلا نوعي الخلايا، بدءا من عزل وزرع خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs). لفترة وجيزة، تحفز PBMCs بأجسام مضادة مضادة CD3/CD28، تليها نقل فيروجي عدسي لتوسيع خلايا CAR-T، أو باستخدام إنترفيرون-γ (IFN-γ)، والأجسام المضادة المضادة CD3، وإنترلوكين 2 (IL-2) للحصول على خلايا CIK. يستخدم القياس الخلوي التدفق لمراقبة قابلية العيش والنمط الظاهري للخلايا، وتجرى اختبارات وظيفية لتأكيد الإمكانات العلاجية للمنتج الخلوي والتحقق من قابلية التوسع للنهج. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول حلا عمليا لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المؤثرة في بيئة ما قبل السريرية، مما يسهل التطبيق السريري مع عدة مجموعات من الخلايا المناعية. وأخيرا، يقدم حلا قابلا للتوسع لتصنيع خلايا المؤثر عالية الإنتاجية.

المقدمة

أصبح العلاج بالخلايا التبنية (ACT) ركيزة مهمة للعلاجات المتقدمة لعلاج السرطان. يعتمد هذا النهج على إعطاء منتجات خلوية موسعة خارج الجسم الحي لتحقيق فعالية مضادة للأورام1. حتى الآن، تم استخدام العديد من أنواع الخلايا في ACT، بدءا من الأساليب غير المحددة، مثل القاتل الطبيعي (NK)2، القاتل المحفز بالسيتوكينات (CIK)3,4، القاتل الطبيعي T (NKT)5، أو γδ الخلايا التائية6، إلى الخلايا المحددة والشخصية للغاية، مثل الخلايا اللمفاوية المتسللة للأورام (TILs)7 والعلاجات الهندسية القائمة على الخلية، مثل مستقبل المستضد الكيميري (CAR)1. 8 وخلايا مستقبلات الخلايا التائية (TCR)9،10.

خلايا CAR-T هي خلايا تائية معدلة وراثيا تولد بواسطة نقل الفيروس خارج الجسم للتعبير عن مستقبل مناعي صناعي مصمم للتعرف على هدف جزيئي محدد. يتكون هيكل CAR من جسم مضاد متغير سلسلة واحدة (scFv) خاص بالمستضد، مدمج مع مجالات الإشارة داخل الخلية، بما في ذلك سلسلة TCRζ والجزيئات التحفيزية التكلفة (التحفيز التنافسي). عند تفاعل المستضدات، يرسل المجال داخل الخلية إشارات تنشيط تعزز تكاثر الخلايا التائية ونشاط مضاد الأورام11.

خلايا CIK هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا اللمفاوية التائية المنشطة التي تكتسب تعبيرا عن CD56 أثناء التوسع خارج الجسم من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) أو دم الحبل السري (UCB)12. يشمل هذا التوسع التحفيز باستخدام الإنترفيرون-γ (IFN-γ)، وهو الجسم المضاد وحيد النسيلة المضاد ل CD3، والإنترلوكين-2 (IL-2)، يليه الزراعة في IL-2 لمدة 14 يوما. تشبه خلايا CIK وظيفيا كلا من الخلايا NK وT، حيث تمارس نشاطا مضادا للأورام من خلال آليات مستقلة وتابعة لمعقد التوافق النسيجي الرئيسي 13,14,15,16. تسمح هذه الخصائص باستخدام خلايا CIK في كل من البيئات العلاجية الوجينية والذاتية مع تقليل خطر مرض الطعم ضد المضيف (GvHD)17.

في الممارسة السريرية، تتطلب كل من علاجات خلايا CAR-T وCIK إعطاء أعداد كبيرة من الخلايا. يتم حقن خلايا CAR-T بكمية تتراوح بين 50-200 مليون جرعة لكل مريض18. وبالمثل، تعطى خلايا CIK عادة بجرعات تصل إلى 10 مليارات خلية في كل حقن، وغالبا ما يتلقى المرضى عدة حقن حسب بروتوكول العلاج19. طرق زراعة الخلايا التقليدية باستخدام القوارير أو الصفائح غير فعالة وتستغرق وقتا طويلا وتتطلب تمريرا متكررا، مما يجعل التوسع واسع النطاق غير ممكن ويزيد من خطر التلوث. تسمح الأنظمة الآلية أو شبه الآلية التي تستخدم مزارع الأكياس أو المفاعلات الحيوية بالتوسع على نطاق واسع لكنها تعاني من حدود، مثل إجهاد القص أو الحاجة إلى تعديلات كثافة وتدفق التروية المتوسط المتكرر20،21، والتعامل مع دفعة واحدة في كل مرة، مما يؤدي إلى تكاليف مرتفعة في السياقات الأكاديمية والصناعية. في هذا الوضع التحدي، يمثل جهاز التمدد السريع النافذ للغاز (G-Rex) بديل، وهو طريقة زراعة ثابتة تتميز بغشاء سيليكون في قاع البئر، يضمن تبادلا فعالا للأكسجين وزيادة ارتفاع الأوعية، مما يسمح بسعة متوسطة عالية الحجم. وبالتالي، يدعم النظام نمو الخلايا دون استبدال الوسط أو تعديل الكثافة22،23. أظهرت أنظمة G-Rex-M قابلية توسع تصل إلى 5000 مل، وهي متوافقة مع أنظمة الحصاد الآلي، مما يوفر منصة زراعة خالية من التلوث ومغلقة يمكن ترجمتها بسهولة من بيئة أكاديمية إلى سريرية لتطوير المنتجات الطبية العلاجية المتقدمة (ATMPs).

في الإجراء الموضح، استفدنا من مزايا وخصائص أجهزة G-Rex لتحسين بروتوكول التوسع لكل من خلايا CAR-T وCIK. أثبتنا أن كلا نوعي الخلايا يمكن توسيعهما وتوسيع حجمهما بكفاءة، مع الحفاظ على نمط ظاهري ووظيفي متسق عبر أنظمة الزراعة المختلفة. يظهر الشكل 1 نظرة تخطيطية لبروتوكول التوسع لكل من خلايا CIK وCAR-T النموذجية.

الشكل 1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكولات توسيع خلايا CAR-T وCIK باستخدام أجهزة زراعة G-24 أو G-6M. يتم توسيع خلايا CAR-T وCIK من خلايا PBMC المعزولة بدءا من اليوم 0. لتوسيع خلايا CAR-T، تحفز PBMCs في اليوم الأول بأجسام مضادة مضادة ل CD3 ومضادة ل CD28، وتم تعديلها وراثيا في اليوم الثاني، ثم تزرع بمكملات hIL-7 و hIL-15 كل 3-4 أيام، مع الحصاد النهائي للاختبارات الوظيفية في اليوم التاسع. في صيغة G-6M، تقتصر مكملات السيتوكين على اليوم الثاني، دون الحاجة إلى تغذية إضافية للسيتوكين طوال فترة الزراعة. لتوسيع خلايا CIK، يتم تحفيز PBMCs في اليوم الأول باستخدام rhIFN-γ وفي اليوم الثاني بالأجسام المضادة المضادة CD3 وrhIL-2، والذي يعطى كل 3-4 أيام. في G-24، يتطلب تغيير متوسط بالتزامن مع مكمل السيتوكين. يتم جمع خلايا CIK في اليوم الرابع عشر لإجراء اختبارات وظيفية لاحقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

تم الحصول على معاطف بوفي مجهولة الهوية من متبرعين أصحاء تم اختبارها سابقا لعدم وجود تلوث بالممرض (مثل فيروس نقص المناعة البشرية، وفيروس الورم الوريدي الوردي (HCV، وفيروس التهاب الجلد الوريدي الوردي، والزهري) من بنك الدم في مستشفى بادوفا قبل الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة. تم التلاعب بعينات الدم داخل خزائن السلامة البيولوجية المعتمدة، وارتدى الموظفون معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).

ملاحظة: تم إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بناقلات الفيروسات العدسية تحت ظروف السلامة الحيوية المستوى 2 (BSL-2)، وفقا للإرشادات المؤسسية. يتطلب التعامل مع ناقل اللينتيفيروس احتياطات إضافية، بما في ذلك ارتداء القفازات المزدوجة. تم تعقيم النفايات البيولوجية الخطرة (بما في ذلك المواد الفيروسية، والخلايا المحولة، والعينات المشتقة من الإنسان) قبل التخلص منها، بينما تطلبت النفايات الكيميائية (بما في ذلك الأصباغ الفلورية والكواشف) فصلها وفقا لبروتوكولات النفايات الخطرة المؤسسية. لاحظ أن متطلبات السلامة البيولوجية المحددة قد تختلف بين المؤسسات ويجب التحقق منها قبل تنفيذ البروتوكول.

1. عزل PBMCs

  1. عزل PBMCs من معاطف بوفي السليمة من المتبرعين أو عينات الدم المحيطية باستخدام الطرد المركزي بتدرج الكثافة. قم بتخفيف طبقة البوفي بحجم مماثل من محلول محلول الفوسفات المعقم 1x (PBS) ووضع طبقة من الدم المخفف بعناية فوق نفس حجم اللمفوبريب في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل. التخفيف ب 1x PBS ليس ضروريا للدم الطرفي. الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بدون فرامل.
  2. بعد الطرد المركزي، اجمع طبقة PBMCs عند واجهة البلازما-لمفوبوب واغسلها ب PBS معقم 1x. يقوم بالطرد المركزي وإعادة تعليق PBMCs في وسط زراعة الخلايا المكونة للدم (CM) مع مكمل بنسبة 1٪ بنسلين/ستريبتوميسين (فيما يلي cCM). قيم عدد الخلايا وقابليتها للبقاء باستخدام اختبار استبعاد Trypan Blue.

2. توسع خلايا CAR-T من أنابيب PBMC في أوعية زراعة G-24

  1. تفعيل PBMCs (اليوم 0)
    1. أعد تعليق 2 ×10 6 من PBMCs معزولة حديثا في 2 مل من cCM مع إضافة 5٪ لمصل البقر الجنيني (FBS) (فيما يلي cCM-F)، مما يؤدي إلى كثافة بذر نهائية تبلغ 1 × 106 PBMCs/سم2/مل، ونقلها إلى بئر وعاء زراعة G-Rex (G-24) مكون من 24 بئرا. زرع عدد الآبار بقدر عدد حالات النقل المختلفة التي يجب تنفيذها في اليوم الأول (الخطوة 2.2- اليوم 1).
    2. أضف 4 ميكرولتر من مضاد CD3 (درجة وظيفية نقية، تركيز نهائي: 0.2 ميكروغرام/مل) و20 ميكرولتر من مضاد CD28 (درجة وظيفية نقية، تركيز نهائي: 1 ميكروغرام/مل) مباشرة إلى كل بئر لتنشيط الخلايا التائية. الخلايا الزراعية في حاضنة رطبة تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. نقل الخلايا التائية باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية (اليوم الأول)
    1. بعد التحفيز طوال الليل، يتم جمع وعد الخلايا التائية المنشطة باستخدام اختبار استبعاد Trypan Blue لتقييم قابلية البقاء. احسب 1 ×10 6 من الخلايا المنشطة القابلة للحياة لكل بئر من G-24 (مساحة البئر 2 سممربع)، مما يعادل كثافة بذر 0.5 × 106 خلايا/سم². نقل الخلايا في أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
    2. تحضير وسط التحويل لكل بئر عن طريق دمج حجم ناقل الفيروسي المناسب بناء على تركيز (TU/mL) لتحضير ناقل الفيروسات العدسية (هنا، فيروس العدسة CD19-CAR-BBζ المأخوذ من مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال25؛ تعدد العدوى (MOI) 20)، مع 5 ميكرولتر من كبريتات البروتامين المعزز للنقل (يتم الحصول على محلول مخزون 8 ملغ/مل عن طريق إذابة كبريتات البروتامين في 1x PBS وترشيح معقم باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر؛ التركيز النهائي بقوة 50 ميكروغرام/مل). استخدم وسط CM مع 5٪ FBS بدون إضافة البنسلين/الستربتوميسين للوصول إلى حجم نهائي 0.8 مل/بئر (0.4 مل/سم²). للتحكم غير المحولة (UTD)، حضر وسط النقل الموصوف مع تجنب إضافة ناقل الفيروس العدسي.
    3. أعد تعليق الخلايا الحبيبية (الخطوة 2.2.1) في 0.8 مل/بئر من وسط النقل وغطيها في بئر G-24 جديد. حضن الليلة عند حرارة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظة: إذا كان هناك تخطيط لنقل عدة آبار بنفس ناقل الفيروس، حضر خليطا رئيسيا من وسط النقل الذي يحتوي على الفيروس وكبريتات البروتامين بتركيز مطلوب. اخلط جيدا لضمان التجانس. ثم نجمع 0.8 مل من هذا الخليط الرئيسي في كل أنبوب من الخلايا المثقفة بحبيبات لضمان ظروف نقل متسقة عبر جميع العينات.
  3. زراعة وتوسع خلايا CAR-T (من اليوم الثاني إلى اليوم التاسع)
    1. في اليوم الثاني، زد حجم الزراعة إلى الحجم النهائي 8 مل/بئر بإضافة 7.2 مل من cCM-F الطازج، مع إضافة إنترلوكين-7 البشري (hIL-7) وإنترلوكين-15 البشري (hIL-15) بتركيز نهائي 10 نانوغرام/مل لكل منهما (حجم السيتوكينات المحسوب مع الأخذ في الاعتبار الحجم الإجمالي 8 مل لكل بئر).
    2. في اليوم الخامس، قم بتجديد وسط الزراعة بإزالة 6 مل من الوسط المكيف بعناية من كل بئر دون إزعاج الخلايا في قاع البئر واستبداله ب 6 مل من cCM-F الطازج مع hIL-7 و hIL-15 (التركيز النهائي: 10 نانوغرام/مل حسب الأخذ في الاعتبار الحجم الإجمالي 8 مل لكل بئر). إذا كنت تعمل مع عدة آبار، حضر مزيجا رئيسيا من وسائط cCM-F مع سيتوكينات hIL-7 و hIL-15 لضمان توزيع متساو للسيتوكينات.
    3. في اليوم التاسع، يتم توسيع خلايا CAR-T بكفاءة وجاهزة للتطبيقات اللاحقة. لجمع خلايا CAR-T، قم بإزالة 5 مل من الوسائط المكيفة بلطف وتخلص منها. باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر، أعد تعليق خلايا CAR-T في ال 3 مل المتبقية من الوسائط وانقلها إلى أنبوب بسعة 15 مل. عد خلايا CAR-T وتحقق من صلاحيتها باستخدام اختبار استبعاد Trypan Blue. عادة، يتم الحصول على حوالي 3 ×10 خلايا CAR-T (3.24 ± 1.67 ×10 7 خلايا) من كل بئر G-24 (الجدول التكميلي 1).

3. توسع CIK في سفن الزراعة التابعة لمجموعة G-24

  1. تفعيل PBMCs (اليوم 0)
    1. بذور 1 ×10 6 أنابيب PBMC معزولة حديثا لكل بئر في وعاء زراعة G-24، والتي تتوافق مع كثافة 0.5 × 106/سم2، في 8 مل من cCM مع إضافة إنترفيرون-γ البشري المؤتلف: (rhIFN-γ، التركيز النهائي: 1000 وحدة دولية/مل). حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  2. تحفيز وتوسع خلايا CIK (من اليوم الأول إلى اليوم الرابع عشر)
    1. في اليوم الأول، بعد 22-24 ساعة من تحفيز rhIFNγ، أضيف مباشرة إلى كل بئر 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة CD3 (التركيز النهائي: 50 نانوغرام/مل) و4 ميكرولتر من الإنترلوكين-2 البشري المؤتلف (rhIL-2، التركيز النهائي: 500 وحدة دولية/مل). حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    2. كل 3 إلى 4 أيام (في اليوم 5 و9 و12 من زراعة الخلايا)، استبدل 6 مل من الوسط المعالج ب cCM طازج وrhIL-2 (التركيز النهائي: 500 وحدة دولية/مل)، مع حساب التركيز النهائي ل rhIL-2 بالنسبة للحجم الكامل البالغ 8 مل.
    3. في اليوم الرابع عشر، اجمع خلايا CIK عن طريق التخلص من 5 مل من الوسائط المعدلة وإعادة تعليقها في ال 3 مل المتبقية من الوسط المحالف. انقل الخلايا إلى أنبوب بحجم 15 مل وقيم العدد الكلي للخلايا وصلاحيتها باستخدام اختبار استبعاد تريبان بلو. عادة ما يتم الحصول على حوالي 8 ×10 خلايا CIK كتلة (8.6 ± 4.58 × 107 خلايا) من كل بئر (الجدول التكميلي 2).
      ملاحظة: أثناء تغيرات الوسط، استنشق السوبرناتانت بحذر، مع الانتباه لعدم إزعاج طبقة الخلايا أو ملامسة الغشاء النافذ للغاز. قد يؤثر تلف الغشاء على تبادل الغازات ويؤثر سلبا على بقاء الخلايا.

4. تصنيع خلايا CAR-T وCIK واسعة النطاق

ملاحظة: يمكن بسهولة توسيع بروتوكولات توسع خلايا CAR-T وCIK الموصوفة في القسمين 2 و3 إلى أجهزة زراعة G-Rex أكبر، وتحديدا صيغة G-6M. عند الانتقال من صيغة G-24 (مساحة السطح: 2 سم2) إلى جهاز G-6M (مساحة السطح: 10 سم2)، تحافظ على جميع التراكيز والكثافات ثابتة، بينما تزداد جميع الأحجام والكميات المطلقة بنسبة 5 أضعاف لتتناسب مع مساحة السطح المتزايدة. هذا يعني أن كثافة البذر الخلوي، وتركيزات مكملات الوسط، وتركيزات السيتوكين تبقى دون تغيير، لكن إجمالي حجم الوسط، وعدد الخلايا المزروعة، والكميات المطلقة من السيتوكينات المضافة سيتم زيادتها بشكل متناسب. تتيح هذه الميزة القابلة للتوسع انتقالا سلسا من بروتوكولات البحث الصغيرة إلى التصنيع قبل السريري أو السريري المبكر دون الحاجة إلى تعديلات كبيرة في البروتوكول، مما يحافظ على خصائص خلايا المؤثر المتسقة.

  1. توسع خلايا CAR-T في أجهزة صيغة G-6M
    1. قم بتفعيل PBMCs في اليوم 0 ونقل الفيروسات العدسية في اليوم 1، كما هو موضح في القسم 1، مع الحفاظ على جميع التركيزات والكثافات مع زيادة الحجم والكميات المطلقة بمقدار 5 أضعاف.
    2. في اليوم الثاني، ارفع حجم الزراعة إلى إجمالي 100 مل باستخدام وسط cCM-F. احسب وأضف hIL-7 و hIL-15 لتحقيق التركيز النهائي 10 نانوغرام/مل وفقا لذلك.
      ملاحظة: على عكس صيغة G-24، يسمح التصميم الأطول لجهاز G-6M بحجم متوسط أكبر، مما يتيح إمدادات منتظمة من العناصر الغذائية والسيتوكين طوال فترة الزراعة دون الحاجة لاستبدال الوسائط (نهج "املأ ونسى" ). لذلك، لا حاجة لأي سايتوكينات إضافية في اليوم الخامس.
    3. لجمع خلايا CAR-T في اليوم التاسع، تخلص حوالي 90 مل من الوسط من كل بئر باستخدام ماصة مصلية وأعد تعليق الخلايا في ال 10 مل المتبقية. انقل الخلايا إلى أنبوب بحجم 15 مل واستخدمها في الاختبارات التالية.
  2. توسع خلايا CIK في أجهزة صيغة G-6M
    1. قم بإجراء بذر PBMCs في اليوم 0 وفقا للبروتوكول الموضح في القسم 3 وزيادة جميع الأحجام والكواشف بمقدار 5 أضعاف لتتناسب مع تنسيق الجهاز الأكبر (G-6M).
    2. في اليوم الأول، قم بضبط حجم الزراعة إلى إجمالي 100 مل باستخدام وسائط cCM. أضف تركيزا نهائيا قدره 500 وحدة دولية/مل rhIL-2 و50 نانوغرام/مل مضاد CD3 لكل بئر.
    3. مكمل 500 وحدة دولية/مل rhIL-2 كل 3-4 أيام (اليوم 5، 9، و13) لكل بئر دون تغيير متوسط.
    4. احصد خلايا CIK في اليوم 14 عن طريق إزالة حوالي 90 مل من وسط من كل بئر باستخدام ماصنة مصلية. أعد تعليق الخلايا في ال 10 مل المتبقية، ثم نقلها إلى أنبوب بحجم 15 مل، واستخدمها في الاختبارات التالية.

5. توصيف النمط الظاهري لخلايا المؤثرة بواسطة قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: في نهاية بروتوكول التوسع، يتم إجراء تحليل علامات السطح بواسطة قياس التدفق الخلوي على خلايا CAR-T وCIK لتقييم نمطاتهما، بما في ذلك الحالات التمايزية المميزة، مثل: ساذجة (CD45RA+CD62L+)، الذاكرة المركزية (CM، CD45RA-CD62L+)، ذاكرة المؤثرات (EM، CD45RA-CD62L-)، وذاكرة المؤثرات CD45RA إيجابية (EMRA، CD45RA+CD62L-؛ الشكل الإضافي 1A-B).

  1. اجمع 3 ×10 أو 5 خلايا لكل أنبوب صبغ. غسل الخلايا في 1x PBS مع 1٪ FBS (PBS-F)، وجهاز طرد مركزي بقوة 300 x g لمدة 5 دقائق، وأعد تعليق حبيبات الخلية في محلول خليط الأجسام المضادة 50 ميكرولتر المحضر في محلول تلوين (جزء واحد من محلول بقعة بريليانت وجزء واحد PBS-F) وفقا للوحة التلوين المطلوبة (الجدول 1 والجدول 2).
  2. حضن الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء، ثم غسل الخلايا الملطخة وجهاز الطرد المركزي. إذا كانت هناك حاجة لخطوة صبغ ثانية، قم بإجراء التلوين باستخدام خليط الأجسام المضادة المحدد، كما هو موضح سابقا (الخطوة 5.1).
  3. وأخيرا، اغسل الخلايا والصبغة بصبغة قابلة للحياة، هنا صبغة قابلة للإصلاح 780 (FVS780)، في 50 ميكرولتر من 1x PBS، وتحتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء. لا يلزم إجراء خطوة غسل بعد التلوين القابل للحياة. بعد الحضانة، أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل عينة، ثم البدء في جمع تدفق الخلايا الخلوية. تظهر استراتيجية البوابات التفصيلية في الشكل التكميلي 1A-B.
هدفاستنساخالفلوروكرومالتركيز/التخفيفقصد
الخطوة الأولى في التلوينrhCD19-His//2 ميكروغرام/ملكشف جزيئات CAR
الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة
خطوة الغسيل
الخطوة الثانية للصبغصفحتهGG11-8F3.5.1التربية البدنية1/50كشف جزيئات CAR
CD3UCHT1BV5101/40النسب
CD4SK3BV6501/40النسب
CD8RPA-T8BV4211/20النسب
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83نضوج
CD62LDREG-56FITC1/10القفز، التفعيل
الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة
خطوة الغسيل
الخطوة الثالثة للصبغFVS780//1/5000التمييز بين الخلايا الحية/الميتة
الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة

الجدول 1: لوحة الأجسام المضادة المستخدمة في تلوين خلايا CAR-T. لوحة التلوين المستخدمة لتقييم تعبير CAR، ونمط الخلايا التائية، وحالة التمايز. يتم الإبلاغ عن استنساخ الأجسام المضادة، والتركيز، والفلوروكروم المترافقة لكل هدف مهم.

هدفاستنساخالفلوروكرومالتخفيفقصد
الخطوة الأولى في التلوينCD56HCD56التربية البدنية1/40النسب
NKG2D1D11ناقل الحركة الجنوية1/83التنشيط
CD3UCHT1BV5101/40النسب
CD4SK3BV6501/40النسب
CD8RPA-T8BV4211/20النسب
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83نضوج
CD62LDREG-56FITC1/10القفز، التفعيل
الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة
خطوة الغسيل
الخطوة الثانية للصبغFVS780//1/5000التمييز بين الخلايا الحية/الميتة
الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة

الجدول 2: لوحة الأجسام المضادة المستخدمة في تلوين خلايا CIK. لوحة التلوين استخدمت لتقييم مجموعات CIK الفرعية، والنمط الظاهري، وحالة التمايز. يتم الإبلاغ عن استنساخ الأجسام المضادة، والتركيز، والفلوروكروم المترافقة لكل هدف مهم.

6. تقييم النشاط الخلوي السام المحدد لخلايا CAR-T وCIK

ملاحظة: يتم قياس النشاط السام الخلوي لخلايا CAR-T وCIK عن طريق تزاريتها المشتركة مع الخلايا المستهدفة عند نسبة الخلايا المؤثرة إلى الهدف (E:T) المطلوبة. يعتمد نوع الاختبار على نوع الخلايا المستهدفة، سواء كانت مشتقة من أورام صلبة أو أورام خبيثة دموية. في هذا البروتوكول، نصف اختبار قياس تدفق الخلايا الفلورية المعتمد على صبغة الخلايا الفلورية للخلايا المعلقة واختبار تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA) القائم على الممانعة للخلايا الملتصقة.

  1. اختبار قياس تدفق الخلايا الفلورية المعتمد على صبغة الخلايا الفلورية
    ملاحظة: يمكن تقييم السمية الخلوية الخاصة بالمستضد ضد الأورام الخبيثة الدموية باستخدام اختبار تدفق الخلايا المعتمد على صبغة الخلايا الفلورية. قبل الزراعة المشتركة، يتم وسم الخلايا المستهدفة بصبغة فلورية لتمكين التعرف عليها. بعد الزراعة المشتركة مع الخلايا الفعالة، يتم تقييم موت الخلايا المستهدفة عن طريق التلوين بصبغة قابلة للحياة. يسمح تحليل تدفق الخلايا بقياس كمية القتل الخاص بالمستضدات، بناء على نسبة الخلايا الفلورية غير الحية الإيجابية للصبغة.
    1. لكل حالة زراعة مشتركة، اجمع 2 × 10 خلايامستهدفة وأعد تعليقها في 400 ميكرولتر من وسط الزراعة الكامل لتحقيق تركيز نهائي 5 ×10 5 خلايا/مل. أضف صبغة فلورية بتركيز نهائي 5 ميكرومولار (هنا صبغة سيل تريس البنفسجية، CTV). احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، محميا من الضوء. بعد الحضانة، اغسل الخلايا مرة واحدة بوسط كامل وأعد تعليق الحبيبة بتركيز نهائي 4 ×10 5 خلايا/مل.
    2. قم بتوزيع 500 ميكرولتر من تعليق الخلية المستهدفة الملونة (هنا 2 × 105 من خلايا راجي كنموذج خلية هدف تعليق CD19+ ) في أنابيب نظيفة بحجم 5 مل وفقا للإعداد التجريبي. تأكيد نجاح التلوين باستخدام قياس تدفق الخلايا الخلوية من خلال تحديد الخلايا المستهدفة كخلايا موجبة للصبغة الفلورية (SSC-A مقابل CTV). يوصى بحوالي 98٪ من الخلايا الفلورية الإيجابية للصبغة.
    3. بالتوازي، يعد ويعد خلايا المؤثر (هنا 5 ×10 6 من خلايا CD19 CAR-T) لكل حالة زراعة مشتركة. غسل الخلايا وأعد تعليقها في وسط الزراعة الكامل بتركيز مناسب لمطابقة نسبة المؤثر إلى الهدف (E:T) المطلوبة. أضف 500 ميكرولتر من تعليق خلية المؤثرة إلى كل أنبوب متوافق يحتوي على خلايا الهدف.
      1. لتحقيق نسبة E:T 25:1، أضف 5 ×10 خلايا CD19 CAR-T ذات تأثير 6 إلى 2 × 10 خلاياهدف راجي 5 في كل أنبوب، وحضر عددا من الأنابيب المطلوبة في التصميم التجريبي.
    4. حضن الزراعة المشتركة لمدة 6 ساعات عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تضمين حالة تحكم تحتوي فقط على الخلايا المستهدفة لقياس موت الخلايا التلقائي. هذا التحكم مهم لتمييز الموت الخلفي عن السمية الخلوية الخاصة بالخلايا الفعالة.
    5. اغسل الخلايا المزروعة معا وصبغها بصبغة FVS780 حيوية مخففة ب 1x PBS (التخفيف النهائي 1:5000). احتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، محميا من الضوء. اغسل الخلايا وأعد تعليق الحبيبة النهائية في 600 ميكرولتر من مخزن PBS-F. تابع جمع التدفق الخلوي لتقييم سمية الخلايا الخاصة بالخلية المؤثرة.
      1. نفذ استراتيجية بوابات مقياس تدفق الخلايا الخلوية كما يلي: حدد الخلايا المستهدفة كخلايا موجبة للصبغة الفلورية (SSC-A مقابل CTV)، ثم ضمن هذه المجموعة المئوية للخلايا المستهدفة الميتة (SSC-A مقابل FVS780، الشكل التكميلي 1C). حساب التحلل النوعي عن طريق طرح موت الخلية المستهدفة التلقائي (٪FVS780+ ضمن CTV+ في حالة الهدف فقط) من سمية الخلايا الخاصة بالخلية المؤثرة (٪FVS780+ ضمن CTV+ في حالة الزراعة المشتركة بين المؤثر-الهدف).
  2. اختبار تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA)
    ملاحظة: اختبار RTCA هو طريقة لتقييم النشاط السام للخلايا المؤثرة ضد الخلايا المستهدفة الملتصقة26. يتم اكتشاف موت الخلايا المستهدفة كفرق في إشارة المقاومة بسبب انفصال الخلايا عن لوحة E المتراكمة جيدا في جهاز xCELLigence. قم بإجراء اختبار RTCA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة الموصى به لضمان أداء الاختبار الأمثل وقابلية التكرار.
    1. تستهدف الخلايا الفرعية قبل يوم واحد من الاختبار (اليوم -1) لضمان وصولها إلى 60٪-80٪ التقاء بحلول اليوم 0. هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على الخلايا في حالة تكاثر نشط في بداية التجربة. يفضل استخدام الخلايا المستهدفة بين الممرات 5-20، مع ما لا يقل عن أسبوع واحد (3-4 مرات) بعد الذوبان لضمان الأداء الأمثل للخلية.
    2. في اليوم 0، أضف بعناية 50 ميكرولتر من وسط الزراعة إلى كل بئر من الصفيحة E، وربط اللوحة داخل الجهاز، واحصل على الإشارة الخلفية. ثم انقل الصفيحة إلى غطاء المحرك لإجراء خطوة زرع الخلايا.
    3. عد الخلايا المستهدفة وانقل العدد الإجمالي المطلوب إلى أنبوب نظيف. أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسط الزراعة لتحقيق التركيز المطلوب للزرع في صفيحة E، ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة إلى كل بئر (هنا 4 × 104 من خلايا MCF-7 كنموذج خط خلية ورم ملتصقة). حافظ على اللوحة داخل الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة لضمان تثبيت الخلايا المستهدفة بشكل متساو. شغل اللوحة داخل الجهاز عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون وابدأ عملية الاستحواذ في الوقت الحقيقي (فترة استحواذ 15 دقيقة لمدة 22 ساعة).
      ملاحظة: قم بإجراء تعديل معايرة الخلايا المستهدفة قبل استخدام خط خلية مستهدف جديد، كما اقترح المصنع.
    4. في اليوم الأول (حوالي 20-22 ساعة بعد التلقيح المستهدف)، عد الخلايا المؤثرة وأعد تعليقها في وسط زراعة جديد، مع تعديل تركيز الخلية لتحقيق نسبة المؤثر إلى الهدف (E:T) المطلوبة. على سبيل المثال، لتحقيق نسبة E:T 10:1، أضف 4 × 10خلايا CIK مؤثرة إلى 4 × 10خلايا هدف 4 MCF-7 لكل بئر.
    5. جهز كل حالة علاجية في نسخ تقنية باستخدام صفيحة U-bottom معقمة بسعة 96 بئر وقم بتوازنها لمدة 15 دقيقة عند 37°C. توزيع 50 ميكرولتر من تعليق خلية المؤثر لكل حالة باستخدام مناصورة متعددة القنوات. أعد لوحة E إلى الجهاز واستمر في عملية الاقتناء الفورية (فترة الاستحواذ 15 دقيقة لمدة 24 ساعة). احسب التحلل النوعي باستخدام المعادلة التالية:
      المعادلة 1

النتائج

يوفر البروتوكول الموضح هنا سير عمل فعال وقوي لتوسيع وهندسة الخلايا المؤثرة خارج الجسم الحي من PBMCs المعزولة، وهي خلايا CAR-T وCIK. تتطلب هذه الطريقة الحد الأدنى من التلاعب بالخلايا وتستفيد من قدرة تبادل الغاز في أجهزة G-Rex، مما يوفر توافرا أفضل للمغذيات وأكسجة مقارنة بأنظمة الزراعة الثابتة التقليدية23,24. ميزة رئيسية لهذا البروتوكول هي قابليته للتدرج من أجهزة صغيرة الحجم ذات 24 بئر (G-24)، المناسبة للدراسات قبل السريرية، إلى أجهزة 6M الأكبر حجما (G-6M)، المتوافقة مع احتياجات التصنيع التحويلي أو السريري، دون الحاجة لأي تغييرات في البروتوكول سوى التوسع النسبي.

باستخدام هذا البروتوكول، تم توسيع كل من خلايا CAR-T وCIK بنجاح بالتوازي من خلايا PBMC المتبرعة الصحية بصيغتي G-24 وG-6M، كما هو موضح في الأقسام 2-4. في نهاية فترة الزراعة، أظهر كلا النوعين من الخلايا توسعا عاليا للطيات وقابلية للبقاء على قيد الحياة، مع انتشار مماثل بين صيغتي الأجهزة (الشكل 2، الجدول التكميلي 1، الجدول التكميلي 2)، مما يبرز قابلية تكرار البروتوكول عبر مقاييس الزراعة المختلفة.

للتحقق من قابلية التوسع لأجهزة الزراعة، تم توصيف الخلايا المؤثرة بشكل أكثر ظاهريا ووظيفيا. بالنسبة لخلايا CAR-T في CD19، قمنا بقياس تعبير CAR وقمنا بتقييم مجموعات CD4+ وCD8+، مع ملاحظة هيمنة خلايا T CAR+ CD8+ من CD19 (الشكل 3A-B، الجدول التكميلي 1). بالنسبة لخلايا CIK، قمنا بتقييم تكرار مجموعات T (CD3+CD56-)، NK (CD3-CD56+)، وCIK (CD3+CD56+) (الشكل 3D)، بالإضافة إلى تعبير المستقبل المنشط NKG2D (الشكل 3E، الجدول التكميلي 2). علاوة على ذلك، لاحظنا ظواهر متشابهة بشكل عام وتعبيرا عن علامات سكانية محددة بين صيغ زراعة G-24 وG-6M لكل من خلايا CAR-T وCIK. تم تحليل حالة التمايز لكل من منتجات خلايا CD19 CAR-T وCIK من خلال تلوين CD62L وCD45RA (الشكل 3C-F، الجدول التكميلي 1، الجدول التكميلي 2)، كاشفا عن ذاكرة متشابهة وأنماط مؤثرة بين الخلايا المزروعة بصيغتي G-24 وG-6M. تظهر هذه النتائج أن توسيع نطاق العملية لا يضر بسلامة الظاهرة أو حالة التمايز لمجموعات الخلايا الفعالة الموسعة.

وأخيرا، لتقييم القوة الوظيفية، استخدمنا اختبارات سمية خلوية محددة للهدف. أظهرت كل من خلايا CAR-T وCIK المتوسع في أي من الجهازين نشاطا محللا خلويا قويا، مما أكد الحفاظ على الخصائص الوظيفية عبر المقاييس (الشكل 4). بشكل عام، تدعم هذه النتائج ملاءمة المنتجات الموسعة للتطبيقات اللاحقة في النماذج ما قبل السريرية وربما الاختبارات السريرية.

الشكل 2
الشكل 2: تكاثر وفعالية خلايا CAR-T وCIK من CD19. تم جمع خلايا CAR-T (n = 5) وخلايا CIK (n = 6) المتوسلة من PBMCs في صفائح G-24 وG-6M في اليوم التاسع واليوم الرابع عشر من التوسع، على التوالي، لإجراء عد الخلايا وتقييم زيادة الطية (A-C) ونسبة (B-D) للخلايا الصالحة. تمثل المخططات التكرارية التعبير المتوسط ± الانحراف المعياري (SD)، والنقاط تشير إلى المتبرعين الفرديين (انظر الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2 للقيم الفردية). تم تحليل البيانات بواسطة اختبار t ثنائي الطرف متعدد (A-C) أو اختبار ترتيب أزواج ويلكوكسون متعدد ذي الذيلين (B-D)، مع تصحيح هولم-سيداك للمقارنات المتعددة (*p < 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: تقييم النمط الظاهري لخلايا CAR-T وCIK في CD19 تم توسيعه في أجهزة G-24 وG-6M. تم تحليل تعبير جزيئات CAR على خلايا CAR-T في CD19 (n = 5) بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم (أ) كفاءة التحويل في بروتوكولات التوسع G-24 وG-6M، بالإضافة إلى التعبير عن (B) CD4+/CD8+ و(C) المجموعات الفرعية الساذجة/الذاكرة في مجموعة CD3+CAR+. تم تحليل النمط الظاهري لخلايا CIK الضخمة (n = 6) بواسطة قياس التدفق الخلوي لدراسة (D) نسبة CIK (CD3+CD56+)، NK (CD3-CD56+) وT (CD3+CD56-)، بالإضافة إلى تعبير (E) NKG2D و(F) الساذجة/الذاكرة في مجموعة CD3+CD56+ الفرعية (G-24 n=5، G-6M n=6). ساذج (CD45RA+CD62L+)، الذاكرة المركزية (CM، CD45RA-CD62L+)، ذاكرة المؤثرات (EM، CD45RA-CD62L-)، وذاكرة المؤثرات إيجابية CD45RA (EMRA، CD45RA+CD62L-). تمثل المخططات التكرارية التعبير المتوسط ± SD، والنقاط تشير إلى المتبرعين الفرديين (انظر الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2 للقيم الفردية). تم تحليل البيانات بواسطة اختبار t ثنائي الطرف (B-C-D-F) أو اختبار ترتيب ويلكوكسون المطابقة ذو الذيلين (A-E)، مع تصحيح هولم-سيداك للمقارنات المتعددة (*p < 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4
الشكل 4: تقييم سمية خلايا CAR-T وخلية CIK في CD19. (أ) تم إجراء تحلل محدد لخلايا CAR-T من CD19 (برتقالي، n = 5) أو خلايا UTD غير المحولة (رمادي، n = 5) ضد خط خلايا ليمفوما بوركيت راجي (كنموذج خط خلية معلقة) بواسطة اختبار قتل قائم على القياس الخلوي التدفق لمدة 6 ساعات. تظهر النتائج كمتوسط تحلل نوعي ± SD. (B) تمت مراقبة سمية خلايا CIK المزروعة إما في G-24 (أزرق فاتح، n = 7) أو G-6M (أزرق داكن، n=6) ضد خط خلايا MCF-7 لسرطان الثدي (كنموذج خط خلوي ملتصق) كل 15 دقيقة على مدى 24 ساعة باستخدام محلل خلوي في الوقت الحقيقي. تظهر النتائج كمتوسط تحلل نوعي ± SEM. تم تحليل البيانات بواسطة اختبار مان-ويتني، تصحيح هولم-سيداك للمقارنات المتعددة (*p < 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: استراتيجية البوابات المستخدمة لتحليل قياس تدفق الخلية. مخططات تمثيلية توضح استراتيجيات البوابة ل (أ) خلية CAR-T و(ب) توصيف خلايا CIK الظاهرية، و(ج) اختبار السمية الخلوية المعتمد على صبغة الخلايا الفلورية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: النمو، والقابلية للبقاء والنمط الظاهري لزراعة خلايا CD19 CAR-T من المتبرعين الأفراد. يظهر العدد الكلي للخلايا، وزيادة عدد الطيات، وقابلية البقاء، والتوصيف الظاهري لخلايا CD19-CAR التائية التي تم جمعها في اليوم التاسع من الزراعة في أجهزة G-24 وG-6M لكل متبرع. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: النمو، القابلية، والنمط الظاهري لزراعة خلايا CIK من المتبرعين الأفراد. يظهر العدد الكلي للخلايا، وزيادة عدد الطيات، وقابلية البقاء، والتوصيف الظاهري لخلايا CIK التي تم جمعها في اليوم 14 من الزراعة في أجهزة G-24 وG-6M لكل متبرع. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يوضح هذا البروتوكول تنفيذ منصة فعالة وقابلة للتوسع لتوليد منتجين مختلفين من ACT، وهما خلايا CAR-T وCIK، من أجهزة PBMC باستخدام أنظمة زراعة G-Rex. قمنا بتطبيق اختبارات إثبات المفهوم والاختبارات الظاهرية للتحقق من قابلية التوسع لهذا النهج. أظهرنا أن النمط الظاهري ونشاط الخلايا الموسعة يتم الحفاظ عليه أثناء التوسع، مما يضمن ملاءمة النظام للتطبيقات البحثية والترجمة السريرية المباشرة. في الواقع، أثبتنا بنجاح أن كل من خلايا CAR-T وCIK يمكن توسيعهما بكفاءة مع إنتاج عالي للخلايا، مع الحفاظ على نمط مؤثر وظيفي وسمية خلايا قوية خاصة بالمستضد عبر أجهزة الزراعة المختلفة.

وبالاقتران مع تقنية الغشاء النافذ للغاز في أجهزة الزراعة، يؤدي هذا البروتوكول إلى حركة توسع أسرع، ويقلل من التعامل اليدوي، ويسمح بتحقيق إنتاجية عالية ومتسقة بين المتبرعين. تجعل هذه الميزات البروتوكول قابلا للتكرار وأقل استهلاكا للجهد مقارنة بأنظمة الزراعة القياسية 20,21، والتي غالبا ما تتضمن تبادلات متعددة للوسائط وزيادة خطر فقدان الخلايا والتلوث.

علاوة على ذلك، يتيح هذا البروتوكول الانتقال السلس عبر مقاييس التصنيع: من الأنظمة المفتوحة الصغيرة (G-24، المناسبة للأبحاث ما قبل السريرية والفحص، مثل هياكل CAR، تركيبات السيتوكين، أو تباين المتبرعين) إلى الأنظمة المفتوحة على نطاق أكبر (G-6M، للتحقق قبل GMP)، وفي النهاية إلى أنظمة مغلقة أكبر (لإنتاج GMP). كما هو موضح في هذه الدراسة، فإن التقدم من أنظمة صغيرة النطاق إلى أنظمة مفتوحة أكبر يتطلب فقط تعديلات نسبية في الحجم ومدخلات الخلايا بالنسبة لحجم الجهاز، وهو ما يمثل ميزة عملية كبيرة. وبالمثل، فإن التنفيذ الوحيد المطلوب للانتقال من الأنظمة المفتوحة إلى المغلقة لتصنيع GMP، وبالتالي لتكييف بروتوكول G-6M مع الإنتاج على نطاق واسع GMP، هو استخدام كواشف GMP المناسبة وأجهزة نظام مغلقة (G-10M-CS بمساحة سطح 10 سممربع، تتوافق مع بئر G-6M واحد، أو G-100M-CS بمساحة سطحية 100 سم²). وهو ما يتوافق مع نظير G-100M المفتوح) دون أي تعديل إضافي على البروتوكول نفسه. تختلف هذه الأجهزة المغلقة عن نظيراتها المفتوحة في دمج وصلات أنابيب معقمة لمعالجة الوسائط الآلية، والتي تعمل بالتعاون مع مضخة معالجة السوائل (GatheRex) لإنشاء بيئة مغلقة بالكامل. يلغي هذا النهج المغلق الأنظمة التبادل اليدوي للوسائط ويقلل من مخاطر التلوث، مما يجعله مناسبا تماما لبيئات التصنيع المتوافقة مع GMP حيث التعقيم وقابلية التكرار أمران أساسيين. ومن الجدير بالذكر أن قابلية التوسع تمثل ميزة حاسمة لسد الفجوة بين الاكتشاف المبكر والترجمة السريرية، خاصة في البيئات الأكاديمية أو التقنية الحيوية المبكرة ذات الموارد المحدودة.

ينبغي أن يأخذ تنفيذ هذا البروتوكول نحو الامتثال الكامل لمعايير GMP في النظر في الانتقال من وسائط تحتوي على FBS إلى تركيبات خالية من المصل والزينو، تماشيا مع الاتجاهات التنظيمية الحالية من إدارة الغذاء والدواء ووكالة إدارة الغذاء والدواء الكهربائية، وذلك للقضاء على التباين من دفعة إلى أخرى، وإزالة مخاطر التلوث المحتملة للجينجين، وتعزيز الامتثال التنظيمي27.

علاوة على ذلك، يوفر الحد الأدنى من التدخل المطلوب من نظام التوسعة المقترح منصة مثالية لتنفيذ التنميط الظاهري متعدد الأبعاد28 عن طريق تقليل العوامل الناتجة عن الإجراءات التي قد تعيق التحليل الظاهري أثناء إجراءات التصنيع. بالإضافة إلى ذلك، بعيدا عن خلايا CAR-T وCIK، يمكن للنظام أن يكون قابلا للتكيف العالي مع مجموعات الخلايا اللمفاوية الأخرى والخلايا المناعية الهندسية، مما يوسع فائدته في تطوير العلاج المناعي29,30.

على الرغم من أن البروتوكول قوي ولا يتطلب تعديلات، إلا أن بعض الخطوات ضرورية بشكل خاص للنجاح. لتوسع خلايا CIK، فإن توقيت إضافة السيتوكينات ضروري لضمان التمايز والتوسع الأمثل. بالنسبة لخلايا CAR-T، يجب أن يحدث النقل بعد 24 ساعة من التفعيل لتعظيم الكفاءة، ويجب إذابة الليكوات الفيروسية العدسية مرة واحدة فقط، حيث أن دورات التجمد والذوبان المتكررة تقلل بشكل كبير من كفاءة النقل31.

يساهم التنوع البيولوجي بين تحضيرات الخلايا الأولية بشكل طبيعي في الفروق في معدلات التوسع والنشاط الوظيفي، مما يعكس تنوع المتبرعين. يمكن إدارة هذا التباين الحتمي والجوهري بفعالية من خلال إجراء توسعات متوازية من عدة متبرعين، مما يضمن نتائج قوية وقابلة للتكرار عبر التجارب.

في الختام، يتيح هذا البروتوكول توسعا سريعا وقابلا للتوسع وموثوقا لخلايا اللمفاوية الفعالة الوظيفية مباشرة من أنابيب PBMC، مما يوفر مرونة لكل من البحث في المراحل المبكرة والترجمة السريرية واسعة النطاق. يمكن تكييف هذا النظام بسهولة مع أنواع الخلايا المختلفة والتعديلات الجينية، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات لتطوير العلاج المناعي.

شكر وتقدير

تم توفير بناء CAR بموجب هيئة النقل والتقنية من قبل مستشفى أبحاث الأطفال سانت جود. وقد دعم هذا العمل منحة ScaleReady G-Rex لعام 2025؛ جامعة بادوفا - SOMMAGGIO_BIRD24_01؛ مؤسسة AIRC تحت 5x1000 2019 - برنامج ID. 22759؛ Alleanza Contro il Cancro، Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. حصل هذا البحث على تمويل "ريسيركا كورينتي" من وزارة الصحة الإيطالية لتغطية تكاليف النشر. تم إنشاء المجسمات باستخدام برنامج GraphPad Prism 9 و BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مخزن بقع بريليانتبكالوريوس العلوم الحيوية566349
الجسم المضاد للقرص 28، مضاد للبشرميلتيني بيوتيك130-093-375نسخة 15E8
الأجسام المضادة CD3، مضادة للبشرميلتيني بيوتيك130-093-387نسخة مستنسخة OKT3
CD3 BV510بكالوريوس العلوم الحيوية740147نسخة UCHT1
CD314 APC (NKG2D)الأسطورة الحيوية320808نسخة 1D11
CD4 BV650بكالوريوس العلوم الحيوية563875نسخة SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5بكالوريوس العلوم الحيوية563429نسخة HI100
CD56 PEالأسطورة الحيوية318306نسخة HCD56
CD62L FITCبكالوريوس العلوم الحيوية555543نسخة مستنسخة FREG-56
CD8 BV450بكالوريوس العلوم الحيوية562428نسخة RPA-T8
مجموعة تكاثر الخلايا البنفسجية من CellTraceثيرموفيشر العلميC34557
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)ثيرموفيشر العلميD2650
دولبيكو وبرايم؛ محلول ملحي مخزن الفوسفات (D-PBS)سيغما ألدريتشD5652
لوحة E رقم 16أجيلينت5469813001
مصل البقر الجنيني (FBS)، القيمةثيرموفيشر ساينتيفيكA5256701
صبغة قابلية للإصلاح 780 (FVS780)بكالوريوس العلوم الحيوية565388
لوحة بئر جي-ريكس 24 ويلسون وولف80192M
لوحة بئر جي-ريكس 6M  ويلسون وولف80660M
حل مخزن HEPESلونزاECM0180D
جسمه المضادميلتيني بيوتيك130-120-718
هيومن ألبومين 20٪سي إس إل بيهرينج
بروتين IL-15 المؤتلف البشريبيبروتك200-15
بروتين IL-7 المؤتلف البشريبيبروتك200-07
LSRFortessa X-20بكالوريوس العلوم الحيوية
لمفوبريتتقنيات الخلايا الستيمية18060
MCF-7ATCCHTB-22خط خلايا سرطان الثدي  
البنسلين والستربتوميسينلونزاECB3001D
المحلول الفسيولوجي (0.9٪ كلوريد الصوديوم)مونيكو
كبريتات البروتامينسيغما ألدريتشP3369
راجيATCCCCL-86سلسلة خلايا بوركيت اللمفوما 
IFN-غاما الإنسان المؤتلفR& دي سيستمز285-IF-100/CF
IL-2 المؤتلف (Proleukin)نوفارتيس
rhCD19-HisإنفيتروجينA42607
معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI-1640)يوروكلونECB9006L
إل-جلوتامين مستقرلونزاECB3004D
محلول تريبان-بلوسيغما ألدريتشT8154
تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي ب xCELLigenceأجيلينت
X-VIVO 15 وسط خلية مسبب للدموية خالية من المصللونزا02-053Q

المراجع

  1. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  2. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  3. Cappuzzello, E., et al. How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits. Front Immunol. 14, 1229540(2023).
  4. Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. 30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective. J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).
  5. Bayatipoor, H., et al. Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed. Med Oncol. 40, 29(2022).
  6. Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. Cancer immunotherapy by γδ T cells. Science. 386, 6717(2024).
  7. Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option. J Immunother Cancer. 6, 102(2018).
  8. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  9. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).
  10. Zhang, J., Wang, L. The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review. Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).
  11. Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  12. Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells. Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).
  13. Palmerini, P., et al. A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks. Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).
  14. Pietà, A. D., et al. Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells. J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).
  15. Pievani, A., et al. Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity. Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).
  16. Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies. OncoImmunology. 5, e1199311(2016).
  17. Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells. Front Immunol. 15, 1459175(2024).
  18. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).
  19. Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).
  20. Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy. J Biol Eng. 15, 13(2021).
  21. Smith, T. A. CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25. Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).
  22. Ludwig, J., Hirschel, M. Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform. Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).
  23. Vera, J. F., et al. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J Immunother. 33, 305-315 (2010).
  24. Bajgain, P., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex "M" series. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).
  25. Talleur, A. C., et al. Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy. Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).
  26. Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system. J Vis Exp. (66), e3683(2012).
  27. Eberhardt, F., et al. Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells. Int J Mol Med. 52, 58(2023).
  28. Cadiñanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).
  29. Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor. Front Immunol. 15, 1412378(2024).
  30. Noldner, P. K., et al. Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing. Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).
  31. Bandeira, V., et al. Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks. Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CAR T G Rex 2
توليد فعال وسريع لخلايا CAR-T والخلايا القاتلة الناتجة عن السيتوكينات في الأجهزة القابلة للتوسع بواسطة GMP
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.