مقالة منهجية

استخدام المعادلات لتقدير مخزون الجسم الكلي لفيتامين أ باستخدام طرق النظائر المستقرة

DOI:

10.3791/69370

⸱

يناير 16, 2026

1Institute for Global Nutrition and Department of Nutrition, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول معادلات لتقدير مخزون الجسم الكلي لفيتامين أ باستخدام منهجية تخفيف نظائر الريتينول، ويعرض لمحة موجزة عن استخدام التحليل الجزئي القائم على النموذج مع تصميم دراسة شاملة لتقدير متلازمة التكوين الجماعي والفردي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد طرق النظائر المستقرة لتقدير مخزون الجسم الكلي لفيتامين أ (TBS) كميا على مبدأ تخفيف النظائر. باختصار، يتم إعطاء جرعةفموية واحدة 2 H- أو 13فيتامين A الموسوم ب C للفرد، ويتم قياس تركيزات الريتينول الموسوم وغير الموسوم في البلازما بواسطة مطيافية الكتلة في وقت محدد مسبقا بعد الجرعة، عادة من 14 إلى 21 يوما. يتم حساب TBS باستخدام معادلة تخفيف نظائر الريتينول (RID) أو معادلة توازن الكتلة. تتطلب معادلات RID وتوازن الكتلة معلومات عن النشاط النوعي للريتينول في البلازما (SAp؛ أي نسبة التتبع إلى الأثر)، والتي يتم الحصول عليها من قياسات مطيافية الكتلة. كلا المعادلتين تتطلبان قيما للمعاملات لأخذ امتصاص وتخزين الجرعة الفموية من الريتينول الموسوم بالنظائر المستقرة عند تقدير TBS. يمكن استخدام القيم المنشورة للمعاملات في المعادلات. بدلا من ذلك، يمكن تحديد TBS من خلال التحليل الجزئي القائم على النماذج لبيانات الريتينول الحركية باستخدام برنامج WinSAAM للمحاكاة والتحليل والنمذجة. باختصار، يمكن استخدام تصميم دراسة فائقة الموضوع مع تحليل مقصور قائم على النموذج لبيانات حركية الريتينول في بلازما لتحديد TBS الجماعي والقيم الخاصة بالسكان لمعامل المركب (FaS)، والذي يستخدم لاحقا في معادلة RID لتحديد TBS الفردية. يتطلب تصميم الموضوع الفائق تقديرا لمتوسط تناول فيتامين أ في النظام الغذائي لمجموعة المشاركين، وأخذ عينات دم عند ~11-16 نقطة زمنية فوق ~28-91 يوم، مع 5-7 مشاركين لكل نقطة زمنية، لكن كل مشارك يقدم فقط 2-3 عينات دم. يمكن تقدير تركيز فيتامين أ في الكبد من TBS، باستخدام افتراض نسبة TBS الموجودة في الكبد وتقدير وزن الكبد. يتم تقييم حالة فيتامين أ من خلال مقارنة تركيز فيتامين أ المقدر في الكبد مع قيم القطع المقترحة لتصنيف الحالة عبر السلسلة الكاملة، من مخزون فيتامين أ الناقص إلى فائض مخازن الفيتامين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر طرق النظائر المستقرة تقديرا كميا لمخزون الجسم الكلي لفيتامين أ، ويمكن استخدامها لتقييم حالة فيتامين أ لدى الأطفال والبالغين في بيئات المجتمع1. نظرا لأنها توفر تقديرا كميا لمتلازمة السل عبر كامل امتداد الحالة، من النقص إلى المخزون الزائد، تعتبر أفضل الطرق غير المباشرة لتقييم حالة فيتامين أ لدى البشر1. على النقيض من ذلك، تستخدم تركيزات الريتينول أو بروتين الارتباط بالريتينول في المصل عادة لتقييم الحالة؛ ومع ذلك، فهي لا تعكس مخزون فيتامين أ في الجسم، إلا إذا كانت المخزونات منخفضة جدا، لأن الريتينول في المصل يخضع للتحكم الداخلي؛ علاوة على ذلك، تنخفض بشكل مؤقت أثناء الالتهاب، مما يعقد تفسير النتائج في الفئات التي تعاني من معدلات عدوى مرتفعة2. يوفر اختبار استجابة الجرعة النسبية المعدلة (MRDR) تقديرا لكفاية احتياطيات فيتامين أ في الكبد، لكنه لا يوفر تقديرا كميا لتركيز فيتامين أ في الكبد2. بشكل عام، تستخدم طرق النظائر المستقرة لدراسة استقلاب فيتامين أ وتقدير تأثير تدخلات فيتامين أ في الفئات المعرضة لخطر النقص 3,4,5,6,7,8,9,10. كما أنها مفيدة لتقييم خطر وجود كميات زائدة من فيتامين أ لدى الفئات المعرضة لمصادر متعددة لفيتامين أ، مثل الأطعمة المدعمة، ومكملات فيتامين أ ذات الجرعات العالية، و/أو مساحيق المغذيات الدقيقة 1,11. تعد هذه التطبيقات مهمة لفهم أيض فيتامين أ بشكل أفضل طوال دورة الحياة، وتحسين متطلبات فيتامين أ، وتقييم فعالية وسلامة تدخلات فيتامين أ التي تهدف إلى تحسين النتائج الغذائية والصحية بين الأطفال والنساء في سن الإنجاب في المجتمعات التي تعاني من فقر الموارد. يتم تقدير TBS باستخدام منهجية تخفيف نظائر الريتينول (RID) وأيضا معادلة RID أو معادلة توازن الكتلة. بدلا من ذلك، يمكن تقدير TBS من خلال التحليل الجزئي القائم على النماذج لبيانات حركية الريتينول البلازما باستخدام برنامج WinSAAM للمحاكاة والتحليل والنمذجة (www.winsaam.org) مع تصميم سوبرسبيد-12. باختصار، تتطلب هذه الطرق 1) إعطاء جرعة فموية واحدة من فيتامين A المستقر الموسوم بالنظير للمشاركين، 2) جمع 1-2 عينة دم ~14-21 يوما بعد إعطاء النظائر لطرق RID، (أو جمع 2-3 عينات دم لكل مشارك خلال 28-91 يوما، وتقدير متوسط تناول فيتامين أ الغذائي للمجموعة للتحليل الجزئي القائم على النماذج)، و3) الوصول إلى مطياف كتلة مناسب (GC-C-IRMS، GC/MS، LC/MS/MS) لقياس تركيزات الريتينول الموسوم وغير الموسومة في البلازما.

يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم إرشادات للمستخدمين الجدد لمنهجية RID حول كيفية حساب TBS باستخدام معادلة RID أو معادلة توازن الكتلة. بالإضافة إلى ذلك، تم تقديم نظرة عامة موجزة حول استخدام التحليل القسمي القائم على النموذج مع تصميم دراسة فائقة لتقدير TBS لمجموعة من المشاركين في الدراسة وللمشاركين الأفراد؛ ومع ذلك، فإن تفاصيل إجراء النمذجة القسمية لبيانات حركة الريتينول في البلازما تتجاوز نطاق هذا المخطوطة (لمزيد من المعلومات حول هذا النهج، انظر جرين وآخرون 12). للحصول على نظرة عامة على طرق نظائر فيتامين أ المستقرة، انظر ليتز وآخرون 1.

معادلة RID لتقدير TBS
تستخدم معادلة RID عندما تعطى جرعة فموية من فيتامين A الموسوم بالنظائر المستقرة لفرد، ويستخدم LC/MS/MS أو GC/MS لقياس الريتينول الموسوم وغير الموسوم في البلازما للحصول على النشاط الخاص بالريتينول في البلازما (SAp) (أي نسبة التتبع إلى التتبع في البلازما)13،14. يتطلب الأمر عينة دم واحدة بعد ~14-21 يوما من جرعة النظائر لتقدير TBS باستخدام معادلة RID. تستخدم معادلة RID الموضحة أدناه لتقدير TBS لدى البالغين والأطفال 15:

TBS = FA × S × (1/SAp)

حيث TBS هو ميكرومول من فيتامين A، وFa هو الجزء من جرعة التتبع الفموي لفيتامين A الذي يمتص ويوجد في مخازن الجسم عند وقت الت، وS هو نسبة النشاط النوعي للريتينول في البلازما (SAp) إلى ذلك الموجود في المخازن (SAs) في الوقت المناسب. SAP هو نشاط محدد لريتينول البلازما، يعبر عنه كجزء من الجرعة في البلازما: (موسوم بالريتينول / غير الموسوم + الموسوم) في البلازما / جرعة فموية من الريتينول الموسوم (μmol)12. لاحظ أن مساهمة الريتينول غير الموسوم في الريتينول الكلي في المقام تكون ضئيلة بعد 14-21 يوما من جرعة النظائر عندما يقدر عادة TBS. لمناقشة مفصلة لمعادلة RID، انظر غرين وآخرون 12.

نظرا لأن معاملي Fa و S يضربان في معادلة RID، يشار إليهما عادة بمعامل المركب FaS. القيم المنشورة لمعامل المركب FaS، المبنية على البالغين والأطفال النظريين الذين يعانون من نطاق واسع من TBS، متاحة في عدة أوقات بعد جرعة النظائر (الجدول 1؛ مقتبس من جرعة Greenو Green 15). يمكن استخدام هذه القيم في معادلة RID لحساب TBS للأفراد من مجموعات سكانية متشابهة15. بدلا من ذلك، يمكن استخدام التحليل الجزئي القائم على النموذج لبيانات حركة الريتينول في بلازما لتحديد القيم الخاصة بالسكان لمعامل المركب FaS 12,16.

معادلة توازن الكتلة لتقدير TBS:
تستخدم معادلة توازن الكتلة لحساب TBS عند إعطاء جرعة فموية من 13فيتامين A موسوم ب C للفرد، ويستخدم GC-C-IRMS لقياس تخصيب 13مئوية (13C/إجمالي C) في المصل10,17. تتطلب معادلة توازن الكتلة عينتين من الدم: عينة أساسية لقياس الوفرة الطبيعية 13مئوية في المصل، وعينة ثانية بعد 14 يوما من الجرعة لقياس 13تخصيب C في المصل. ومع ذلك، إذا كان الباحث مهتما بتقدير متوسط TBS لمجموعة من الأفراد، يمكن أخذ عينات دم أساسية من 5-6 مشاركين، ويمكن استخدام متوسط وفرة 13مئوية لهؤلاء الأفراد كتقدير لكمية الفرارة الأساسية 13Cفي المصل للأفراد في المجموعة. الوفرة الطبيعية ل 13مئوية هي ~1.1٪، ولكن نظرا لأن هذا قد يختلف حسب النظام الغذائي، يجب قياسها بدقة في المصل عند البداية لتصحيح وفرة 13مئوية بعد الجرعة، كما هو موضح في مثال أدناه10. تتطلب معادلة توازن الكتلة قياسات وفرة النظائر (13مئوية/إجمالي السيلبوريد) ل: 1) جرعة 13فيتامين أ الموسوم بالكربون (Fa)، 2) ريتينول المصل الأساسي (Fb)، و3) ريتينول المصل بعد الجرعة (Fc). تستخدم قياسات وفرة النظائر لحساب نسبة المتتبع إلى الأثر، وبالتالي TBS. تدرج عوامل إضافية في المعادلة لأخذ امتصاص وتخزين جرعة 13فيتامين A الموسوم ب C وقت تقييم TBS. لمناقشة مفصلة لمعادلة توازن الكتلة، انظر غانون وتانوميهاردجو10.

تستخدم معادلة توازن الكتلة الموضحة أدناه لتقدير TBS لدى البالغين أو الأطفال:

TBS = عامل x (1/TTR) x (عامل امتصاص عامل x للتخزين)

حيث أن TTR هو نسبة متتبع المصل إلى التتبع الأثري. العامل A يفسر فقدان 13متتبعا لفيتامين A الموسوم ب C بين وقت الجرعة وأخذ عينات الدم، ويحسب ك e-kt، حيث k = ln(2)/نصف عمر الريتينول، و t = أيام منذ جرعة10. يفترض أن عامل امتصاص جرعة التتبع هو 0.8-1.0 (80٪-100٪) للبالغين، أو 0.75-0.9 (75٪-90٪) للأطفالفي سن 10. يفترض أن عامل التخزين (نسبة TTR في المصل إلى المخازن) هو 0.8 عندما لا يتم التحكم في تناول فيتامين أ خلال فترة 14 يوما بين الجرعة وأخذ عينات الدم، أو 1.0 عندما يكون تناول فيتامين أ في النظام الغذائي منخفضا ومضبوطا10.

تقدير تركيز فيتامين أ في الكبد
يمكن تقدير إجمالي احتياطي الكبد من فيتامين أ بناء على نسبة الTBS الموجودة في الكبد. يفترض أن ~50٪ من TBS يكون في الكبد عندما تكون حالة فيتامين أ منخفضة و~80٪ عندما تكون حالة فيتامين أ كافية؛ تستند هذه الافتراضات إلى بيانات محدودة تظهر أن فيتامين أ في الكبد كنسبة مئوية من إجمالي الجسم يعتمد على حالة فيتامين أ ويمكن أن يتراوح بين ~40٪ و90٪ 18,19. هناك حاجة إلى مزيد من البيانات لتحديد كيفية تقدير فيتامين أ في الكبد كنسبة مئوية من إجمالي فيتامين أ في الجسم. حتى ذلك الحين، يمكن أن تكون المعلومات في الجدول 2 مفيدة لتقدير حالة فيتامين أ لفئة الدراسة لتحديد ما إذا كان يجب افتراض قيمة 50٪ أو 80٪. أيضا، إذا كان انتشار تركيزات الريتينول في المصل <0.7 ميكرومول/لتر ≤10٪ بين الأطفال من عمر 6-59 شهرا، يفترض أن حالة فيتامين أ في السكان كافية؛ لاحظ أن هذا الحد يتداخل مع فئة نقص فيتامين أ التي وضعتها منظمة الصحة العالمية كمشكلة صحية عامة خفيفة (الجدول 2)20,21. يتم حساب تركيز فيتامين أ في الكبد بناء على إجمالي احتياطيات الكبد بناء على وزن الكبد، والذي يمكن تقديره ب 3٪ من وزن الجسم للأطفال و2.4٪ من وزن الجسم للبالغينفي سن 22. بدلا من ذلك، يمكن تقدير وزن الكبد باستخدام مساحة سطح الجسم (BSA) ومعادلة التنبؤ23.

نظرة عامة على التحليل القسمي القائم على النموذج مع تصميم فائق الموضوع لتقدير TBS الجماعي والفردي
يمكن استخدام التحليل القسمي القائم على النماذج لدراسة حركيات الريتينول الفردية مع أخذ عينات متكررة، لكنه أثبت فائدته بشكل خاص في الفئات التي لا يكون فيها أخذ العينة المتكررة ممكنا، مثل الأطفال الصغار والأطفال في سن ما قبل المدرسة، وربما النساء الحوامل والمرضعات، في بيئات مجتمعية فقيرة الموارد 11,24,25,26,27. يستخدم التحليل القسمي القائم على النموذج مع تصميم دراسة فائقة الموضوع للتنبؤ بTBS لمجموعة المشاركين في الدراسة، ولتقدير القيم الخاصة بالسكان لمعامل المركب FaS، والذي يمكن استخدامه بعد ذلك لتحديد TBS للمشاركين الفرديين باستخدام معادلة RID12,24. يستخدم تصميم الشخص الفائق في البيئات المجتمعية لتقليل عدد عينات الدم المجمعة من كل فرد12، 24، 26. مثال على التصميم موضح في الجدول 3 لدراسة استمرت 91 يوما شملت 105 مشاركين و16 وقت أخذ عينات دم. في هذا المثال، يتناول كل مشارك جرعة فموية واحدة من نظير مستقر موسوم بفيتامين A، ويوفر عينة دم بعد 14 يوما من الجرعة لتقدير TBS لكل فرد باستخدام معادلة RID مع قيمة FaS المشتقة من النموذج عند 14 يوما؛ وعينة دم ثانية في إحدى المرات الخمسة عشر المتبقية للحصول على بيانات حركية الريتينول في بلازما المطلوبة للتحليل الجزئي القائم على النماذج. في هذا التصميم، يتم تعيين 7 أفراد لكل من أوقات أخذ عينات الدم الإضافية الخمسة عشر. بشكل عام، يعتبر 5 مشاركين في كل مرة كافيا، ولكن نظرا لأن بعض المشاركين قد يفوتون وقت عينة دم محدد، يوصى ب~7 أفراد في كل مرة. يتم تحليل البلازما بواسطة مطيافية الكتلة للحصول على قياسات للريتينول الموسوم وغير الموسوم، ويتم حساب نسبة جرعة نظائر فيتامين أ في البلازما (FDp). باختصار، يتم رسم متوسط هندسي FDp مقابل الزمن وملاءمة مع نموذج مقصور باستخدام برنامج WinSAAM 12,24,26. مثال على نموذج مكون من 8 أقسام لتمثيل أيض فيتامين أ في الجسم الكامل موضح في الشكل 115. يشمل النموذج حجرات تمثل البلازما فيتامين أ (الحجرة 5)، واثنين من حوضي تخزين فيتامين أ القابلين للتبادل (الحجران 6 (كبير) و7 (صغير)). يستخدم مجموع كتلة فيتامين أ في حجرات التخزين القابلة للتبادل كتقدير للسل الدماغي:

TBS (ميكرومول) = M(6) + M(7)

حيث M(I) هو ميكرومول فيتامين A في الحجرة I

يمكن حساب القيم الخاصة بالسكان للمعاملات Fa و S في أي وقت (t) خلال مدة دراسة فائقة الموضوع باستخدام المعادلات التالية12,24:

Fat = F(6)t + F(7)t

St = SApt / SAst = [F(5)t / M(5)] / {[F(6)t + F(7)t] / [M(6) + M(7)]}

حيث Fat هو الجزء من جرعة التتبع المبتلعة التي تم امتصاصها والعثور عليها في المخازن في الزمن t؛ F(I)t هو جزء من جرعة التتبع الموجودة في الحجرة I عند وقت t؛ St هو نشاط محدد في البلازما مقارنة بالمخازن في الوقت t؛ حمض الريتينول هو نشاط محدد للريتينول في البلازما (p) أو في المخزون (المخزون) في وقت التستوستيرون؛ وM(I) هو ميكرومول فيتامين A في الحجرة I. انظر غرين وآخرون 12 لمناقشة مفصلة حول التحليل القسمي القائم على النماذج.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيانات افتراضية؛ لم يشارك أي من المشاركين البشريين في هذه الدراسة.

1. تقدير TBS باستخدام معادلة RID

  1. لتقدير TBS باستخدام معادلة RI، استخدم بيانات المشاركين الافتراضية التالية:
    العمر: 25 سنة
    تركيز الريتينول الموسوم في البلازما: 0.0163 ميكرومول/لتر
    تركيز الريتينول غير المعلم في البلازما: 1.154 ميكرومول/لتر
    جرعة فيتامين أ الموسومة عن طريق الفم: 6.838 ميكرومول من الريبيوت
    معامل مركب منشور في 14 يوما15: 0.727
    ملاحظة: تعتمد كمية جرعة نظير فيتامين أ على نشاط فيتامين أ في مركب فيتامين أ الموسوم (عادة 2H أو 13ريتينيل أسيتات موسوم ب C) ويتم التعبير عنها كمكافئ ميكرومول ريتينول (RE). على سبيل المثال، إذا تم استخدام 2H 6-ريتينيل أسيتات للجرعة الفموية وكانت الجرعة مرغوبة 2000 ميكروغرام ريتينيل ريتينيل، يتم حساب جرعة 2H 6-ريتينيل أسيتات بناء على الأوزان الجزيئية ل 2H6-ريتينيل أسيتات (328.49 ميكروغرام/ميكرومول) و2H6-ريتينول (292.49 ميكروغرام/ميكرومول): 2000 × (328.49/292.49) = 2246 ميكروغرام 2H6-ريتينيل أسيتات. يتم حساب جرعة 2000 ميكروغرام ريتينول المعبر عنها بالميكرومول بقسمة الجرعة (ميكروغرام ريتينول) على الوزن الجزيئي ل 2H 6-ريتينول: 2000/292.49 = 6.838 ميكرومول.
  2. احسب SAp باستخدام المعادلة أدناه:
    SAp = [ريتينول موسوم / (موسوم بالريتينول + ريتينول غير معنون) في البلازما] / الجرعة (ميكرومول)
    استخدم بيانات المشاركين أعلاه لحل المعادلة:
    SAp = [0.0163 / (0.0163 + 1.154)] / 6.838 = 0.0020 ميكرومول
  3. احسب TBS باستخدام معادلة RID الموضحة أدناه:
    TBS = FaS x (1/SAp)
    استخدم بيانات المشاركين أعلاه للحصول على قيمة FaS ، وقيمةSAP المحسوبة من الخطوة 2:
    TBS = 0.727 x (1/0.0020) = 364 ميكرومول

2. تقدير TBS باستخدام معادلة توازن الكتلة

  1. لتقدير TBS باستخدام معادلة توازن الكتلة، استخدم بيانات المشاركين الافتراضية التالية:
    العمر: 4 سنوات
    Fa (مقدار كربونين موسوم بالإضافة إلى الوفرة الطبيعية): 0.11
    Fb: 0.010745
    Fc: 0.0110476
    جرعة التتبع المطبقة: 1.0 ميكرومول RE
    عوامل الامتصاص والتخزين:
    الامتصاص: 0.8
    التخزين: نسبة TTR في المصل إلى الكبد (النظام الغذائي غير خاضع للضبط): 0.8
    ملاحظة: يستخدم فيتامين A الموسوم ب 2 13C للجرعة، ويتم حساب وفرة النظائر للجرعة (Fa) كما يلي: ([13C2] موسوم بالتخليق + الوفرة الطبيعية (13C/20C إجمالا)10. القيمة المفترضة للامتصاص في هذا المثال هي 0.8؛ يمكن اختيار قيمة بين 0.8-1.0 بناء على عوامل قد تؤثر على امتصاص فيتامين أ في فئة الدراسة (أي أن معدلات الالتهاب/العدوى قد تقلل من الامتصاص1). لاحظ أن Fa هنا ليس هو نفسه معامل Fa في معادلة RID.
  2. احسب نسبة المتتبع إلى التتبع (TTR) باستخدام المعادلة الموضحة أدناه:
    TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
    حيث Fa = وفرة نظائر 13C في 13جرعة من فيتامين A الموسومة ب C; Fb = 13C وفرة نظائر ريتينول المصل عند القاعدة الأساسية؛ Fc = 13C وفرة نظائر ريتينول المصل بعد الجرعة
    استخدم قيم Fa وF b وFc من بيانات المشاركين أعلاه لحساب TTR:
    TTR = (0.0110476 - 0.010745) / (0.11 - 0.0110476) = 0.003058035
  3. ثم احسب 1/TTR
    1/TTR = 1 / 0.003058035 = 327.01
  4. بعد ذلك، احسب العامل a باستخدام المعادلة أدناه:
    العامل A = 13جرعة فيتامين A الموسومة ب C (μmol) × e-kt
    1. أولا، احسب k باستخدام المعادلة الموضحة أدناه:
      k=ln(2)/نصف عمر الريتينول
      اللوغاريتمية الطبيعية ل 2 (ln(2)) تساوي 0.693147181؛ يقدر عمر نصف الريتينول ب 32 يوما* للأطفال؛ باستخدام هذه المعلومات، نحسب k
      K      = 0.693147181 / 32 = 0.021660849
      *تستخدم القيم المقدرة لعمر نصف الريتينول (32 إلى 136 يوما للأطفال؛ 140 يوما للبالغين)؛ أو يمكن تقدير القيم بناء على معدل تحلل جرعة المتتبع لدى الأفراد في مجموعة ضابطة خلال الدراسة 3,10.
    2. بعد ذلك، احسب e-kt، حيث t هو الوقت (أيام منذ جرعة النظير؛ t = 14 يوما لمعادلة توازن الكتلة). استخدم هذه المعلومات مع القيمة المحسوبة ل k من الخطوة 4.1:
      e-KT = E-0.02166 × 14 = 0.738413073
    3. أخيرا، احسب العامل أ، باستخدام المعادلة الموضحة أدناه، وكمية جرعة النظير من بيانات المشاركين أعلاه (1.0 ميكرومول)، والقيمة المحسوبة ل e-kt
      العامل A = 13جرعة فيتامين A الموسومة ب C (μmol) × e-kt
      العامل A = 1.0 × 0.738413073 = 0.738413073
  5. احسب TBS باستخدام معادلة توازن الكتلة الموضحة أدناه:
    TBS = عامل x (1/TTR) لعامل x للامتصاص للتخزين
    استخدم العامل المحسوب a (0.738413073) والقيمة المحسوبة 1/TTR (327) من الخطوات أعلاه، والقيم الثابتة للامتصاص (0.8) والتخزين (0.8):
    TBS = 0.738413073 × 327 × 0.8 × 0.8 = 155 ميكرومول

3. تقدير فيتامين أ للكبد

  1. لحساب إجمالي احتياطيات فيتامين أ في الكبد وتركيز فيتامين أ في الكبد، استخدم بيانات المشاركين التالية:
    العمر: 25 سنة
    الوزن: 61.0 كجم
    الارتفاع: 156.8 سم
    TBS: 364 ميكرومول (تقدير RID)
    معدل انتشار تركيزات الريتينول في البلازما <0.7 ميكرومول/لتر في مجموعة الدراسة هو <2٪.
  2. أولا، احسب وزن الكبد بناء على مساحة سطح الجسم (BSA) باستخدام المعادلة الموضحة أدناه:
    BSA (م2) = sqrt [وزن الجسم (كجم) × الطول (سم)/3600]
    استخدم بيانات المشاركين أعلاه لحساب BSA:
    BSA (m2) = sqrt [61.0 × 156.8/3600] = 1.63 م2
  3. بعد ذلك، احسب وزن الكبد باستخدام المعادلة المناسبة الموضحة أدناه، والقيمة المحسوبة لتحليل BSA من الأعلى:
    إذا كانت مساحة سطح الجسم (BSA) هي <1:
    وزن الكبد (g) = 772 (g/m2) × مساحة سطح الجسم (BSA) - 38
    إذا كانت مساحة سطح الجسم (BSA) ≥1:
    وزن الكبد (g) = 772 (g/m2) × مساحة سطح الجسم (BSA)
    احسب BSA باستخدام المعادلة الموضحة أدناه؛ (لاحظ أن BSA هو ≥1 من الخطوة 2 أعلاه):
    وزن الكبد (g) = 772 (g/m2) × مساحة سطح الجسم (BSA)
    وزن الكبد (ج) = 772 (جم/متر2) × 1.63 م2 = 1258 جم
  4. وأخيرا، احسب تركيز فيتامين أ في الكبد باستخدام المعادلة الموضحة أدناه:
    تركيز فيتامين أ في الكبد = TBS (ميكرومول) * نسبة TBS الموجودة في الكبد/وزن الكبد (g)
    استخدم قيمة TBS من بيانات المشاركين أعلاه (364 ميكرومول)، والقيمة المفترضة 0.8 لنسبة TBS الموجودة في الكبد (يفترض أن حالة فيتامين A في مجتمع الدراسة كافية بناء على انتشار انخفاض الريتينول في المصل <2٪) والقيمة المحسوبة لوزن الكبد (1258 جم) من الأعلى:
    تركيز فيتامين أ في الكبد = 364 ميكرومول * 0.8 / 1258 = 0.232 ميكرومول/جم كبد

4. TBS المتوقعة بالنموذج للمجموعة

  1. لحساب TBS المتوقع بالنموذج لمجموعة (فئة الدراسة) باستخدام تصميم دراسة فائقة، استخدم نتائج النمذجة الافتراضية التالية من دراسة فائقة أجريت بين نساء في سن الإنجاب (للمزيد من التفاصيل حول هذا النهج، انظر غرين وآخرون):
    مخرجات النموذج الافتراضي:
    M(6) = 973.281 ميكرومول
    M(7) = 55.7646 ميكرومول
  2. احسب TBS للمجموعة باستخدام نموذج الموضوع الفائق المرفق والمعادلة أدناه:
    TBS = M(6) + M(7)
    استخدم كتلة فيتامين أ في القسمين 6 و7 (من مخرجات النموذج):
    TBS = 973.281 + 55.7646 = 1029 ميكرومول
    ملاحظة: مثال على كيفية حساب قيم معامل المركبات FaS بناء على مخرجات النموذج يتجاوز نطاق هذا النظرة العامة. لمزيد من المعلومات، انظر جرين وآخرون 12,15.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول أمثلة على كيفية تقدير TBS كميا لدى البالغين أو الأطفال باستخدام منهجية تخفيف نظائر الريتينول وأي من معادلة RID أو معادلة توازن الكتلة. تستخدم معادلة RID عندما يستخدم فيتامين A الموسوم ب 2H أو 13من فيتامين A الموسوم ب C للجرعة، بينما يستخدم LC/MS/MS أو GC/MS لقياس تركيزات الريتينول الموسوم وغير الموسوم بالبلازما. تتطلب معادلة RID معلومات عن النشاط النوعي لريتينول البلازما (نسبة المتعقب إلى المتتبع) باستخدام قياسات مطيافية الكتلة، والجرعة الفموية من فيتامين A الموسوم (μmol RE)، وقيمة لمعامل المركب FaS. القيم المنشورة لمعامل المركبات FaS متاحة؛ بدلا من ذلك، يمكن تقدير القيم الخاصة بالسكان من خلال النمذجة القسمية القائمة على النماذج لبيانات حركية الريتينول في بلازما. عادة ما تطبق معادلة RID بعد ~14 إلى 21 يوما من الجرعة، ولكن يمكن تطبيقها لاحقا إذا توفرت قيمة مقابلة لمعامل المركب FaS . قيمة TBS للمثال المعروض هنا كانت 364 ميكرومول.

تستخدم معادلة توازن الكتلة عندما يستخدم 13فيتامين A الموسوم ب C للجرعة، ويستخدم GC-C-IRMS لقياس وفرة نظائر 13C في البلازما. تتطلب معادلة توازن الكتلة نسبة المتعقب إلى التتبع (تم قياسها 13درجة مئوية من النظائر في البلازما) وقيم العوامل (المعاملات) لأخذ امتصاص وتخزين جرعة 13فيتامين أ الموسوم ب C في وقت تقييم TBS. تتوفر القيم المنشورة للمعاملات للاستخدام في المعادلة. يتم تطبيق معادلة توازن الكتلة بعد 14 يوما من الجرعة. قيمة TBS للمثال الموضح هنا كانت 155 ميكرومول.

يستخدم التحليل الجزئي القائم على النماذج لبيانات الريتينول الحركية في بلازما مع تصميم فائق الموضوع لتقدير TBS لمجموعة من المشاركين في الدراسة، ولتحديد قيم معامل FaS لتحديد TBS لاحقا للمشاركين الفرديين. يحسب TBS للمجموعة ككتلة فيتامين أ في مخزون فيتامين أ القابل للتبادل في الجسم؛ ويتم حساب TBS للمشاركين الفرديين في الدراسة بعد 14 يوما من الجرعة و/أو في أوقات لاحقة باستخدام قيمة النشاط النوعية لريتينول البلازما لكل مشارك (SAp) والقيمة المشتقة من النموذج لمعامل FaS في الوقت أو الأوقات المختارة مع معادلة RID. قيمة TBS للمثال الموضح هنا كانت 1029 ميكرومول.

يمكن تفسير نتائج TBS بتحويل TBS إلى تركيز فيتامين A في الكبد، ومقارنة تركيزات فيتامين A في الكبد مع قيم القطع لتصنيف حالة فيتامين A عبر السلسلة المستمرة؛ لاحظ أن قيم القطع من المخازن الناقصة إلى السامة التي اقترحت في 2015 من المرجح أن يتم تحسينها مع توفر المزيد من البيانات2. تركيز فيتامين أ في الكبد للمثال الموضح هنا كان 0.232 ميكرومول/جم كبد

الشكل 1
الشكل 1: نموذج قسمي لأيض فيتامين أ في الجسم كله لدى البشر. تمثل الدوائر مقصورات؛ المستطيلات هي عناصر تأخير؛ الأسهم بين المكونات هي معاملات انتقال كسري [L(I,J)s، أو نسبة الريتينول في الحجرة J المنقولة إلى الحجرة I كل يوم] وأزمنة التأخير [DT(I)s، أو الأيام التي تقضيها في عنصر التأخير I]. الحجرة 1 هي موقع إدخال التتبع المبتلع (*) وفيتامين أ الغذائي [U(1)]. تمثل المكونات 1 - 4 الهضم والامتصاص ومعالجة الكيلوميكرون حتى امتصاصها بواسطة الخلايا الكبدية (الحجرة 4)، مع إفراز الريتينول المرتبط ببروتين المرتبط بالريتينول إلى الحجرة البلازما 5، وهي موقع أخذ العينة (المثلث). يسمح المكون 8 بامتصاص الريتينول البلازما بشكل لا رجعة فيه بواسطة الأنسجة التي لا يعاد التدوير منها الريتينول. يمكن للريتينول في البلازما أيضا أن يتبادل مع فيتامين أ في حوضين خارج الأوعية الدموية (حجرة أكبر 6 ومقصورة أصغر 7)، حيث تكون الحجزائر 6 و8 مواقع فقدان لا رجعة فيه من النظام. VA = فيتامين A. تم تعديل هذا الرقم من15. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: القيم المقدرة لمعامل المركب FaS للبالغين والأطفال النظريين في أوقات محددة. يوصى بتطبيق معادلة RID لتقدير TBS عند 14 يوما أو بعد ذلك. الاختصارات: GM = المتوسط الهندسي؛ NA = غير قابل للتطبيق. تم تعديل هذا الجدول من15. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: حدود انتشار السكان لنقص فيتامين أ. الاختصارات: VAD = نقص فيتامين أ؛ MRDR = اختبار استجابة الجرعة النسبية المعدلة؛ منظمة الصحة العالمية = منظمة الصحة العالمية. تم تعديل هذا الجدول من21. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: عدد المشاركين في كل مرة لدراسة سوبر موضوحة لمدة 91 يوما. يتم أخذ عينات دم لجميع المشاركين (n=105) في اليوم الرابع عشر، ويتم تعيين كل مشارك عشوائيا إلى نقطة زمنية ثانية خلال الدراسة التي استمرت 91 يوما، بحيث يكون هناك على الأقل 7 مشاركين في كل مرة، ويقدم كل مشارك ما مجموعه عينتي دم. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باختصار، توفر طرق النظائر المستقرة تقديرات كمية لمتلازمة السل في البالغين والأطفال ويمكن تطبيقها في بيئات المجتمع1. يمكن تقدير TBS للبالغين والأطفال باستخدام منهجية تخفيف نظائر الريتينول إما باستخدام معادلة RID أو معادلة توازن الكتلة. على الرغم من أن المعادلتين تعتمدان على مبدأ تخفيف النظائر، إلا أن هناك بعض الاختلافات. باختصار، تتطلب معادلة RID عينة دم واحدة ويتم تطبيقها في ~14-21 يوما، ولكن يمكن تطبيقها أيضا في أوقات لاحقة إذا توفرت قيمة مقابلة لمعامل المركب FaS . تتوفر القيم المنشورة لمعامل المركب FaS في أوقات مختلفة بعد الجرعة لاستخدامها في معادلة RID15؛ بدلا من ذلك، يمكن تحديد القيم الخاصة بالسكان باستخدام التحليل الجزئي القائم على النماذج. معادلة توازن الكتلة تتطلب عينتي دم، واحدة في البداية والأخرى بعد 14 يوما من الجرعة. ومع ذلك، كما ذكر سابقا، إذا تم تقدير متوسط TBS لمجموعة ما، يمكن أخذ عينات دم أساسية من 5-6 مشاركين، ويمكن استخدام متوسط وفرة 13مئوية لهؤلاء الأفراد كتقدير لكمية الفرة الأساسية 13مئوية في المصل.

عند تطبيق معادلة RID، تشمل الاعتبارات المهمة التعبير عن الجرعة كنشاط فيتامين A (μmol RE) بدلا من ميكرومول من الريتينيل إستر الموسوم، وإذا تم استخدام قيم منشورة لمعامل FaS ، فمن المهم اختيار قيم FaS المشتقة من مجموعة سكانية مماثلة (أطفال أو بالغين) وتتوافق مع الوقت (يوم الدراسة) الذي يحصل فيهSAP على تم قياسها لتقدير TBS. عند تطبيق معادلة توازن الكتلة، من الضروري مراعاة الوفرة الطبيعية 13مئوية في جرعة 13فيتامين أ الموسوم ب C، وتصحيح وفرة 13C في المصل بعد الجرعة للكمية الطبيعية 13Cفي المصل عند البداية للحصول على تقديرات دقيقة ل TBS10.

يستخدم النمذجة القسمية القائمة على النماذج مع تصميم دراسة فائقة الموضوع في بيئات المجتمع لتقدير TBS الجماعي والقيم الخاصة بالسكان لمعامل FaS المركب خلال مدة الدراسة12,24. ميزة هذا النهج هي أن القيم المشتقة من النموذج لمعامل FaS المركب من المرجح أن توفر تقديرا أكثر دقة ل TBS للأفراد في المجموعة مقارنة بقيمة منشورة مشتقة من مجموعة سكانية مختلفة. يوفر هذا النهج أيضا مرونة أكبر في توقيت أخذ عينات الدم في الدراسات الميدانية. على سبيل المثال، إذا لم يكن المشارك متاحا في الوقت المخصص له لسحب دم RID، يمكن جمع عينة الدم في وقت لاحق، ويمكن استخدام القيمة المشتقة من النموذج لمعامل المركب FaS في معادلة RID لتقدير TBS 12,24.

يمكن تفسير نتائج TBS من خلال تحويل TBS إلى تركيز فيتامين A في الكبد، ومقارنة القيم مع الحدود المقترحة لتركيز فيتامين A في الكبد لتصنيف حالة فيتامين A عبر السلسلة الكاملة، من النقص إلى السامة2. على الرغم من أن الحدود المقترحة أشارت إلى أن >1 ميكرومول/جم للكبد يشير إلى فرط الفيتامينوزيس A، إلا أن الدراسات الحديثة أظهرت عدم وجود آثار جانبية بين 1-3 ميكرومول/جم، وأن التغيرات النسيجية تظهر عند >3 ميكرومول/جم11,28. هناك حاجة إلى مزيد من البيانات حول تركيزات فيتامين أ في الكبد وتأثيراتها الفسيولوجية على البشر لتحسين قيم القطع لفئات الحالة شبه السامة والسامة.

على الرغم من أن طرق النظائر المستقرة لتقييم حالة فيتامين أ توفر تقديرات كمية لمرض السل، وتعتبر أفضل الطرق لتقييم الحالة، إلا أنها لم تستخدم على نطاق واسع بعد بسبب التكلفة العالية نسبيا مقارنة بطرق التقييم الأخرى، وقلة الوصول إلى: النظائر المستقرة الموسومة بفيتامين أ والخبرة في إعداد وإعطاء الجرعات؛ مطيافية الكتلة والخبرة لإجراء تحليلات البلازما؛ الخبرة في تصميم الدراسات وتطبيق المعادلات لتقدير TBS؛ والخبرة في التحليل الجزئي القائم على النماذج لبيانات حركة الريتينول في بلازما. بالنسبة للمستخدمين الجدد، يعد الاستشارة/التعاون بين الخبراء أمرا بالغ الأهمية خلال مراحل التخطيط والتنفيذ والتحليل في الدراسة لضمان النجاح.

على الرغم من التحديات، شهدت السنوات الأخيرة تقدما في منهجية النظائر المستقرة مما سهل استخدامها في البيئات المجتمعية12،29. من المرجح أن تولد الدراسات المستقبلية التي تستخدم هذه المنهجية معلومات جديدة مهمة حول استقلاب فيتامين أ ومتطلباته طوال دورة الحياة، والفعالية الحيوية لكاروتينويدات بروفيتامين أ الغذائية، وفعالية وسلامة التدخلات لتحسين حالة فيتامين أ في الفئات المعرضة لخطر النقص.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف ليس لديه ما يكشفه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أشكر كورنيليا لوكل وفيرونيكا لوبيز-تيروس على الإرشادات حول مواضيع يجب تضمينها في هذا البروتوكول.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إكسلمايكروسوفتمايكروسوفت إكسل
حاسبة تكساس إنسترومنتس TI-30XIIS العلميةتكساس إنسترومنتسTI-30XII

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food and Nutr. 37, S87-S103 (2016).
  2. Tanumihardjo, S. A., et al. Vitamin A: biomarkers of nutrition for development. Am J Clin Nutr. 94 (2), 658s-665s (2011).
  3. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  4. Pinkaew, S., Udomkesmalee, E., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A-fortified rice increases total body vitamin A stores in lactating Thai women measured by retinol isotope dilution: a double-blind, randomized, controlled trial. Am J Clin Nutr. 113 (5), 1372-1380 (2021).
  5. Haskell, M. J., et al. Daily consumption of Indian spinach (Basella alba) or sweet potatoes has a positive effect on total-body vitamin A stores in Bangladeshi men. Am J Clin Nutr. 80 (3), 705-714 (2004).
  6. Jamil, K. M., et al. Daily consumption of orange-fleshed sweet potato for 60 days increased plasma beta-carotene concentration but did not increase total body vitamin A pool size in Bangladeshi women. J Nutr. 142 (10), 1896-1902 (2012).
  7. Tang, G., et al. Green and yellow vegetables can maintain vitamin A body stores in Chinese children. Am J Clin Nutr. 70, 1069-1076 (1999).
  8. Haskell, M. J., Jamil, K. M., Peerson, J. M., Wahed, M. A., Brown, K. H. The paired deuterated retinol dilution technique can be used to estimate the daily vitamin A intake required to maintain a targeted whole body vitamin A pool size in men. J Nutr. 141 (3), 428-432 (2011).
  9. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98, 1192-1199 (2013).
  10. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among Equations Used for Retinol Isotope Dilution in the Assessment of Total Body Stores and Total Liver Reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  11. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  12. Green, M. H., Green, J. B., Ford, J. L. Better Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method Are Possible with Deeper Understanding of the Mathematics and by Applying Compartmental Modeling. J Nutr. 150 (5), 989-993 (2020).
  13. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  14. Tang, G., Qin, J., Dolnikowski, G. G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9, 408-414 (1998).
  15. Green, M. H., Green, J. B. Use of Model-Based Compartmental Analysis and Theoretical Data to Further Explore Choice of Sampling Time for Assessing Vitamin A Status in Groups and Individual Human Subjects by the Retinol Isotope Dilution Method. J Nutr. 151 (7), 2068-2074 (2021).
  16. Ford, J. L., Green, J. B., Green, M. H. A Population-Based (Super-Child) Approach for Predicting Vitamin A Total Body Stores and Retinol Kinetics in Children Is Validated by the Application of Model-Based Compartmental Analysis to Theoretical Data. Curr Dev Nutr. 2 (11), nzy071(2018).
  17. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats with 13C4-retinyl acetate and gas chromatogrphy/combustion/isotope ratio mass spectrometry. J Nutr. 130 (11), 2844-2849 (2000).
  18. Institute of Medicine. Dietary reference intakes: vitamin A, vitamin K, arsenic, boron, chromium, copper, iodine, iron, manganese, molybdenum, nickel, silicon, vanadium and zinc. , National Academy Press. Washington, DC. (2001).
  19. Raica, N. Jr, Scott, B. S., Lowry, L., Sauberlich, H. E. Vitamin A concentration in human tissues collected from five areas in the United States. Am J Clin Nutr. 25, 291-296 (1972).
  20. Conditions for Scaling Back Universal Vitamin A Supplementation - Policy Brief. , Global Alliance for Vitamin A, Nutrition International, Helen Keller International, UNICEF. https://www.gava.org/resources-tools/ (2019).
  21. Indicators for assessing vitamin A deficiency and their application in monitoring and evaluating intervention programmes. , World Health Organization. https://www.who.int/nutrition/publications/micronutrients/vitamin_a_deficiency/WHO_NUT_96.10/en/ (1992).
  22. Olson, J. A. Recommended dietary intakes (RDI) of vitamin A in humans. Am J Clin Nutr. 45, 704-716 (1987).
  23. Yoshizumi, T., et al. A simple new formula to assess liver weight. Transplant Proc. 35 (4), 1415-1420 (2003).
  24. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  25. Lopez-Teros, V., et al. Use of a Super-child Approach to Assess the Vitamin A Equivalence of Moringa oleifera Leaves, Develop a Compartmental Model for Vitamin A Kinetics, and Estimate Vitamin A Total Body Stores in Young Mexican Children. J Nutr. 147 (12), 2356-2363 (2017).
  26. Lopez-Teros, V., et al. The "Super-Child" Approach Is Applied To Estimate Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Mexican Preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  27. Green, M. H., Lopez-Teros, V., Avila-Prado, J., Green, J. B. Direct Use of Plasma or Milk Vitamin A Specific Activity Data to Model Retinol Kinetics and Predict Vitamin A Stores in Theoretical Lactating Women. J Nutr. 152 (12), 2993-2999 (2022).
  28. Olsen, K., et al. Serum retinyl esters are positively correlated with analyzed total liver vitamin A reserves collected from US adults at time of death. Am J Clin Nutr. 108 (5), 997-1005 (2018).
  29. Green, M. H., Ford, J. L., Green, J. B. Inclusion of Vitamin A Intake Data Provides Improved Compartmental Model-Derived Estimates of Vitamin A Total Body Stores and Disposal Rate in Older Adults. J Nutr. 149 (7), 1282-1287 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A A A

مقالات ذات صلة