مقالة منهجية

تحديد مواقع مستقبلات أستيل كولين النيكوتين العصبية في الغشاء البلازما والخلايا الخلوية باستخدام التصوير الكمي في الخلايا الثديية

DOI:

10.3791/69371

⸱

ديسمبر 19, 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول التعبير وقياس وحدات مستقبلات الأستيل كولين العصبية باستخدام خط الخلايا الثديية Neuro-2a. تمكن العلامات الفلورية الحساسة للرقم الهيدروجيني والمجهر الكونفوكلي تقييما دقيقا لموقع المستقبلات في غشاء البلازما مقارنة بتلك المعبر عنها في الحجرات داخل الخلايا المحايدة لدرجة الحموضة، مما يسهل دراسة تنقل nAChR والتعديل الدوائي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد قياس مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية العصبية (nAChRs) المعبر عنها على غشاء البلازما في خلايا الثدييات أمرا مهما لتطوير علاجات جديدة انتقائية للأهداف ولدراسة بروتينات الشابرون التي تعدل حركة المستقبلات. تقدم هذه الدراسة مجموعة قوية من المنهجيات للتعبير عن كل من nAChR المتجانسة وغير المتجانسة في خلايا Neuro2a (N2a) الثديية، ولقياس توطينها السطحي مقابل داخل الخلايا باستخدام علامات فلورية حساسة لدرجة الحموضة. pHuji والفلوورين فوق البروج (SEP) هما بروتينان حساسان لدرجة الحموضة يمكن هندستهما لوضع علامات على البروتينات المؤتلفة، مما يسمح برؤية التوزيع المكاني لوحدات nAChR. تصدر هذه العلامات الفلورية عند درجة حموضة محايدة لكنها تخمد في البيئات الحمضية. لتتبع التوزيع النسبي الداخلي مقابل البلازما لوحدات α7 وα4 وβ2 nAChR، يتم ربط إما pHuji أو SEP بالطرف C لكل تركيب DNA. للتعبير عن α7-pHuji مع الرافق، أو (α4-SEP؛ β2-pHuji) في خلايا N2a، يستخدم كاشف نقل DNA قائم على الدهون. يتم حضن كاشف التحويل والحمض النووي البلازميدي بشكل منفصل في وسط مصل مختزل في درجة حرارة الغرفة، ثم يدمجان لتشكيل مركبات حمض نووي دهني تسهل توصيل البلازميدات إلى الخلايا. بعد الحضانة، يتم تصوير الخلايا باستخدام مجهر كونفوكال للخلايا الحية تحت ظروف ذات درجة حموضة عالية ومنخفضة أو في وجود رابطة فلورية انتقائية من النوع الفرعي. يتم تحليل الصور باستخدام فلورة الخلايا الكلية المصححة في قنوات الفلوروفور ذات الصلة، مما يوفر معلومات كمية حول توزيع الوحدات الفرعية nAChR الموسومة بالفلورسنت بين غشاء البلازما وأقسام الداخل الخلوي. يتيح التصوير الكونفوكلي للخلايا الحية تتبع مواقع وحدات nAChR في الوقت الحقيقي لتمييز الفروق بين مجموعات المستقبلات الداخلية والسطحية. يتم تحقيق التعبير القوي في غشاء البلازما ل α7-pHuji أو (α4-SEP؛ β2-pHuji) خلال 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. يمكن تكييف هذه الطريقة لتشمل مرافقين إضافيين، أو وحدات فرعية مساعدة، أو روابط فلورية لدراسة تهريب nAChR، والتعديل الدوائي، والتغيرات المرتبطة بالأمراض في تعبير nAChR.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية العصبية (nAChRs) هي قنوات أيونية عبر الغشاء اللغاني المعبر عنها عبر الغشاء البلازما للعديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية، والخلايا الدبقية، والخلايا المناعية. تتكون هذه المستقبلات من وحدات فرعية α (α2-α10) أو β (β2-β4) تتجمع لتشكيل أنواع فرعية متجانسة أو غير متجانسة، حيث تعد α7 وα4β2 nAChRs الأكثر وفرة في الدماغ 1,2. ارتبط اختلال تنظيم هذه الأنواع الفرعية بمرض الزهايمر، واضطراب استخدام النيكوتين، والصرع المرتبط بالنوم، ومرض باركنسون، واضطراب الاكتئاب الشديد، وغيرها من الحالات العصبية والنفسية 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . تعد الطرق السريعة والموثوقة للتعبير عن nAChR وقياسها ضرورية لفهم آليات المرض ولتطوير علاجات انتقائية مستهدفة. ومع ذلك، فإن تحقيق تعبير قوي من هذه المستقبلات في غشاء البلازما غالبا ما يكون تحديا ويستغرق وقتا طويلا. الطريقة الموضحة هنا تتيح تعبيرا قويا عن السطح ل nAChR خلال حوالي 24 ساعة بعد نقل الحمض النووي، ويمكن دمجها مع الليغاندات أو بروتينات الشابرون التي تعدل حركة المستقبلات.

توجد عدة طرق للتعبير عن nAChR، بما في ذلك النقل المؤقت للحمض النووي أو توليد خطوط خلايا مستقرة تعبر عن النوع الفرعي المطلوب. على الرغم من أن إنشاء خطوط خلايا مستقرة مفيد للدراسات طويلة الأمد التي تشمل نفس النوع الفرعي من المستقبلات، إلا أن العملية تتطلب جهدا كبيرا وقد تستغرق عدة أشهر. بمجرد تأسيسها، قد تظهر هذه الخطوط الخلوية تعبيرا متغيرا في المستقبلات عبر الممرارات، أو فقدان التعبير مع مرور الوقت، أو تحيز الانتقاء للنسخ المستنسخة ذات وظيفة المستقبل أو الكثافة غير المثالية13. انخفاض درجة حرارة الحضانة من 37 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية، أو إضافة مرافق جزيئية مثل النيكوتين، أو تمديد مدة الحضانة يمكن أن يعزز التعبير السطحي 13,14,15. وتزداد هذه القيود بشكل خاص في nAChR غير المتجانسة، التي تتطلب تجميع ونقل الوحدات الفرعية بشكل صحيح، وللدراسات التي تركز على تنظيم المستقبلات بمساعدة المرافقة. لذلك، من الضروري التحقق الروتيني لتعبير النوع الفرعي المستقبلي عبر الممرات عند العمل مع خطوط الخلايا المستقرة التي تعبر عن nAChR.

غالبا ما يهتم الباحثون بمتغيرات الوحدات الفرعية nAChR ووحدات البروتين المساعدة أو المرافقة، وبالتالي يحتاجون إلى التعبير عن مجموعة متنوعة من الحمض النووي بسرعة متتالية للسماح بمرونة سريعة في تحاليلها. يعد التعبير العابر ل nAChRs ميزة في هذا الصدد لأن العملية يمكن إكمالها بسرعة، مما يسمح للباحث بدراسة أنواع متعددة من المستقبلات أو الظروف التجريبية دون الانتظار لأشهر لتوليد خطوط خلايا مستقرة. ومن الشائعات، حتى مع التعبير العابر، أن العديد من nAChR تبقى داخل الخلية بعد 24 ساعة من التحفيز عند 37 درجة مئوية، مما يتطلب فترات حضانة إضافية > 48 ساعة16,17. على سبيل المثال، بدون بروتين الشابرون المقاوم لمثبطات كولينستيراز-3، يتم التعبير فقط ~1٪ من α7 nAChR على غشاء بلازما لخلايا SHE-P الثديية18. مع التعبير المشترك ل RIC-3، يتم اكتشاف حوالي 20٪ من α7 nAChRs على السطح. بينما يمثل هذا تحسنا، يظل إجمالي وفرة المستقبلات منخفضا. يمكن أن يعزز التعبير المشترك بين α7 nAChRs وNACHO التعبير السطحي، رغم أنه لا يزال أقل من 40٪ من إجمالي سكان المستقبلات يمر إلى غشاء البلازما19. نهج آخر يتضمن حضانة الخلايا المنقولة عند 30 درجة مئوية لتحسين تعبير غشاء البلازما20,21. بالنسبة ل α4β2 nAChRs، يؤدي هذا الانخفاض في درجة الحرارة إلى زيادة في كثافة مستقبلات السطح بمقدار خمسة أضعاف دون زيادة مماثلة في إجمالي بروتين الوحدةالفرعية 21. ومع ذلك، يتطلب هذا التحسين يوما إضافيا على الأقل واستخداما أكبر للمستهلكات والكواشف والأجهزة.

يقدم العمل المعروض مجموعة من الطرق المحسنة للتعبير عن وقياس أنواع فرعية محددة من nAChR خلال 24 ساعة من النقل في خلايا N2a الثديية، محققا حوالي 83٪ ل α7، و77٪ ل α4، و56٪ للوحدات الفرعية β2 المتمركزة في غشاء البلازما. في حالة α7 nAChRs، يمكن قياس تعبير غشاء البلازما باستخدام α7 الانتقائي الفلوري الموسوم ب α-بونغاروتوكسين (αBTX) أو من خلال وسم فلوري مؤتلف. لوضع علامة على كل وحدة فرعية، يتم هندسة البروتينات الفلورية الحساسة للرقم الهيدروجيني pHuji والفلوورين فوق البروج (SEP)22,23,24 على الطرف C لوحدات nAChR الفردية25,26. pHuji وSEP هما نسختان حساستان لدرجة الحموضة من البروتينات الفلورية الحمراء والخضراء، على التوالي، تتوهج عند pH 7.4 ولكن يتم تقييدها تحت ظروف أكثر حموضة27,28. مع كبت فلورة SEP وpHuji عند pH < 6، تعكس أي إشارة داخل الخلية فلورات تقع في أقسام محايدة بدلا من غشاء البلازما. يجدر بالذكر أن بعض العضيات، مثل جهاز جولجي، لها تلال حمضي؛ وبالتالي، لا يتم اكتشاف الفلوروفورات المرتبطة بمنطقة الطرف C من وحدات nAChR الفرعية أثناء عبور الوحدات الفرعية عبر مسار الإفرازات29. الفرق بين الفلورة الكلية عند pH 7.5 وتلك عند pH < 6 يمثل الإشارة الناتجة عن nAChR الموجودة على غشاء البلازما. التقاط الصور باستخدام المجهر الكونفوكالي الحي يوفر دقة مكانية عالية، مما يتيح تحديد مواقع الوحدات الفرعية بدقة. بالإضافة إلى ذلك، يسمح إجراء جميع التجارب على الخلايا الحية لكل خلية بأن تكون بمثابة تحكم مستقل، مع مراعاة التفاوت في تعبير البروتين بين الخلاياضمن كل مجموعة علاج. يمكن تكييف هذه الطريقة لتشمل بروتينات شابرون إضافية، مثل NACHO أو غيرها، للتحقيق في تهريب nAChR. تشمل التطبيقات الإضافية التعديل الدوائي، ودمج الوحدات الفرعية المساعدة، وتحليل التغيرات المرتبطة بالأمراض في تعبير nAChR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تصف الإجراء التالي الطرق التي تم استخدامها بنجاح لنقل خط خلية N2a بشكل مؤقت بوحدات nAChR (الشكل 1). يتم تحقيق تعبير قوي من غشاء البلازما خلال 24 ساعة، كما يلتقطه المجهر الكونفوكالي للخلايا الحية.

figure-protocol-1
الشكل 1: عرض تخطيطي للطرق الفردية المعروضة في البروتوكول. تنمو الخلايا حتى تصل إلى 70٪-80٪ في أطباق التصوير. ثم تعالج الخلايا بمادة التحويل ومركب الحمض النووي. (الأعلى) بعد 24 ساعة، يمكن معالجة الخلايا بواسطة رابطة فلورية موسومة لوضع علامات على الوحدات الفرعية المعبر عنها على غشاء البلازما ثم تصويرها باستخدام مجهر كونفوكلي. (الأسفل) بدلا من ذلك، بالنسبة لجينات الوحدات الفرعية nAChR التي تم تعديلها ليتم وسمها ببروتين حساس للرقم الهيدروجيني بعد 24 ساعة من النقل، يمكن تصوير الخلايا حية باستخدام مجهر كونفوكال لالتقاط الفلورة الكاملة للخلايا. ثم يتم تغيير مخزن التصوير pH 7.4 إلى مخزن التبريد pH 5.5. سيوقف هذا التألق للبروتينات الحساسة لدرجة الحموضة المرتبطة بوحدات nAChR الموجودة على غشاء البلازما في الخلية، مما يسمح فقط ببقاء الوحدات الداخلية فلورية. يتم تصوير نفس الخلايا مرة أخرى. يتم إجراء تحليل الصور باستخدام ImageJ لقياس تعبير الوحدات الفرعية الداخلية والخارجية. يمكن تعديل هذه الإجراءات لتشمل البروتينات المساعدة والمساعدة. تم إنشاؤه في BioRender. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. نقل N2a nAChR العابر

ملاحظة: تم اختيار خط الخلايا N2a لأنه يظهر نمطا عصبيا وتعبيرا داخليا منخفضا ل nAChRs. جينات الوحدات الفرعية α7-pHuji وα4-SEP وβ2-pHuji محفوظة بشكل فردي في ناقل التعبير pcDNA3.1(+) للثدييات. بروتين الشابرون NACHO يعبر عنه من pREP9 (الذي أهداه الدكتور ر. لورينغ من جامعة نورث إيسترن بسخاء). في جميع الخطوات، استخدم تقنيات التعقيم واعمل داخل خزانة السلامة البيولوجية. ارتد معطف مختبر نظيف، ونظارات أمان، وقفازات. نظف جميع المواد التي تدخل أو تخرج من خزانة السلامة الحيوية بنسبة 70٪ إيثانول. تصف الخطوات التالية النقل في طبق زجاجي مغلف بولي-دي-ليسين مقاس 35 مم، وهو مناسب للتصوير. يمكن تعديل الأحجام حسب الحاجة لأواني الزراعة المختلفة.

  1. خلايا زراعة N2a في قارورة زراعة أنسجة T25 (أو مشابهة) تحتوي على وسط أساسي من إيجل (EMEM) مدعومة ب 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) وإذا لزم الأمر، 100 U/mL بنسلين و100 ميكروغرام/مل ستريبتومايسين. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ حتى تصل الخلايا إلى ~90٪ من التلاصق. تخيل باستخدام هدف مجهر ضوئي 4x.
  2. راقب التقاء المياه يوميا باستخدام مجهر خفيف واستبدل وسط النمو كل يوم إلى يومين للحفاظ على الظروف المثلى. عندما تصل الخلايا إلى ~90٪ من التلاقط، تكون جاهزة للمرور إلى أطباق التصوير.
  3. سخن جميع المواد المائلة إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء. نظف خزانة السلامة الحيوية وجميع المواد بنسبة 70٪ إيثانول قبل بدء الإجراء.
    تحذير: 70٪ إيثانول سائل وبخار شديد الاشتعال يمكن أن يسبب تهيجا شديدا للعين. ابتعد عن الحرارة، الشررر، اللهب المفتوح، ومصادر الإشعال الأخرى. خزن في مكان جيد التهوية مع حاويات مغلقة بإحكام. ارتد قفازات واقية وواقي للعين/الوجه عند التعامل. في حال ملامسة الجلد أو العينين، اشطفها فورا بالماء واطلب الرعاية الطبية إذا استمر التهيج. يمكن استخدام مطهر بديل، مثل محلول مبيض بنسبة 5٪-10٪، بدلا من ذلك.
  4. استنشق الوسط القديم من القارورة واغسل الخلايا ب 5 مل من PBS. أضف 1 مل من التربسين إلى القارورة وحرك بلطف. حضن الخلايا حتى ترتفع الخلايا (<5 دقائق). لمنع فرط الهضم، أضف فورا 4 مل من وسط نمو EMEM واستخدم الماصة بلطف لتكوين تعليق خلية واحدة.
  5. باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي، حدد تركيز الخلايا وحساب الحجم المطلوب لوسط نمو EMEM لضبط التعليق بحيث يحتوي 1 مل على 0.5-2 × 10⁵ خلايا.
  6. ضع لوح 1 مل من تعليق الخلية لكل طبق 35 مم وأضف وسط نمو EMEM كاف ليصل الحجم الكلي إلى 2 مل. حضن الليلة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الخلايا جاهزة للنقل عند التقاء بنسبة 70٪-80٪.
  7. في يوم النقل، يتم استخدام المواد الساخنة مسبقة إلى 37 درجة مئوية، لإذابة حمض نووي nAChR بالكامل ورفع مادة التحويل إلى درجة حرارة الغرفة. نظف جميع الكواشف بإيثانول بنسبة 70٪ قبل وضعها في خزانة السلامة البيولوجية.
  8. للتعبير عن α7 nAChRs: في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، قم بتخفيف 4 ميكروغرام من α7 (1 ميكروغرام/μL) و1 ميكروغرام من NACHO (1 ميكروغرام/ميكرولتر) من الحمض النووي البلازميدي بشكل قطري في وسط مصل مختزل (بدون مضاد حيوي) إلى حجم نهائي 250 ميكرولتر. اخلط بلطف عن طريق استخدام الماصات بعد إضافة الحمض النووي.
    1. للتعبير عن α4β2 nAChRs: تخفيف 4 ميكروغرام من كل وحدة فرعية من الحمض النووي في ما مجموعه 250 ميكرولتر من وسط المصل المختزل. اخلط بلطف عن طريق استخدام الماصات. ضبط نسبة كل وحدة فرعية لتحسين التعبير عن أشكال المستقبلات المحددة.
    2. للتعبير عن α4β2 nAChRs مع بلازميد إضافي، أضف كميات متساوية من كل حمض نووي بلازميدي. يعمل البروتين الفلوري الأزرق mTagBFP2³¹ الموجود في pcDNA3.1(+) كبلازميد تحكم ويمكن استبداله بأي بلازمة α4β2.
  9. اخلط مادة تحويل الحمض النووي بلطف قبل الاستخدام. في أنبوب منفصل للطرد المركزي الدقيق، قم بتخفيف 8 ميكرولتر من مادة التحويل بشكل قطري في 250 ميكرولتر من وسط مصل مختزل. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تابع الخطوة التالية خلال 25 دقيقة.
  10. بعد 5 دقائق، ادمج الحمض النووي المخفف مع كاشف النقل المخفف (المجموع = 500 ميكرولتر) بشكل إسقاطي. اخلط بلطف عن طريق التسديد واحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تظل مركبات الحمض النووي والدهون مستقرة لمدة تصل إلى 6 ساعات.
  11. أثناء تكون المجمعات، قم بإزالة أطباق الزراعة من الحاضنة واستبدال الوسط ب 1 مل من EMEM الخالي من المصل (بدون مضادات حيوية).
  12. أضف 500 ميكرولتر من مركب كاشف DNA-transfection بشكل إسقاطي إلى كل طبق (الحجم النهائي = 1.5 مل). اخلط بلطف عن طريق تحريك الطبق لضمان توزيع متساو عبر الطبق، خصوصا على سطح الزجاج القاعي. حضانة الوسط عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم استبدل الوسط بعد 4-6 ساعات لتعزيز صحة الخلايا.

2. وسم الخلايا الحية لα7 nAChRs المعبر عنها بغشاء البلازما باستخدام αBTX Alexa Fluor 647

ملاحظة: يتم إجراء الإجراء التالي عادة بعد 24 ساعة من عملية النقل. حماية αBTX أليكسا فلور 647 (αBTX-AF647) من الضوء لمنع تدمير الفلوروفور الضوئي.

  1. سخن جميع الكواشف مسبقا إلى 37 درجة مئوية وأذابت محلول αBTX-AF647 (2.3 ميكرومتر). نظفه بنسبة 70٪ إيثانول وضعه في خزانة السلامة البيولوجية.
  2. استرجع الطبق الذي يحتوي على الخلايا التي تم نقلها بحمض نووي α7 وNACHO من الحاضنة، ونظف الخارج بنسبة 70٪ إيثانول، وضعه في خزانة السلامة البيولوجية.
  3. تخلص من الوسط القديم عن طريق شفط الفراغ. لغسل الخلايا، أضف 2 مل من وسط نمو EMEM الطازج.
  4. أزل وسط الغسيل عن طريق الشفط بالتفريغ. أضف 2 مل من وسط نمو EMEM إلى الأطباق.
  5. استبدال الكمية المناسبة من الوسط ب αBTX-AF647 لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 80 نانومتر. حضن الحوض طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  6. في الصباح، استخدم PBS مسبقا أو وسط تصوير مفضل ونظفه بنسبة 70٪ إيثانول. الانتقال إلى خزانة السلامة البيولوجية.
  7. أزل الخلايا المعدلة من الحاضنة، نظفها، وضعها في خزانة السلامة البيولوجية.
  8. أزل الوسط القديم الذي يحتوي على αBTX-AF647 وضعه في حاوية نفايات مناسبة.
  9. اغسل الخلايا ب 2 مل من PBS لمدة 3 مرات و10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. تزيل الشطفات الليغاند غير المربوطة والحطام، ويمكن تعديل الوقت لتلبية احتياجات الباحث. أزل PBS بعد كل غسل.
  10. أضف 2 مل من PBS أو وسط تصوير مفضل وتابع تصوير الخلايا باستخدام مجهر كونفوكلي.

3. تصوير الخلايا الحية لα7-pHuji nAChRs الكلي والداخلي

ملاحظة: الإجراء التالي يستخدم بلازميد α7-pHuji pcDNA3.1 مصنوع داخليا مع الشابرون NACHO. تم استخدام بروتوكول مشابه للتعبير عن α4-SEP و β2-pHuji في pcDNA3.1 باستخدام البلازميد التحكم mTagBFP2 pcDNA3.1، كما هو موضح في قسم النتائج. حماية العينات من الضوء طوال العملية لمنع تدمير الفلوروفور الضوئي.

  1. جهز مخزن تصوير pH 7.4 (الجدول 1) ومخزن تبريد pH 5.5 (الجدول 2) كما هو موضح23.
  2. تدفئ الكواشف إلى 37 درجة مئوية، ثم نظفه ب 70٪ إيثانول، ثم انقله إلى خزانة السلامة الحيوية. أزل الخلايا المعدلة من الحاضنة، ونظفها بنسبة 70٪ إيثانول، وضعها في خزانة السلامة البيولوجية.
  3. أزل الوسط القديم عن طريق الشفط. اشطف الطبق ب 2 مل من PBS لمدة 3 مرات و10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. أضف 2 مل من مخزن تصوير pH 7.4.
  4. أحضر الطبق إلى المجهر الكونفوكلي. أدخل طبق التصوير مع عازل تصوير pH 7.4 في حامل الشريحة وضع الحامل في الحجرة البيئية المسخنة مسبقا على المجهر الكونفوكلي.
  5. قم بتوصيل أنبوب المضخة البدائية بحامل صحن التصوير وأغلق الحجرة.
  6. افتح برنامج التصوير واختر الليزرات للفلوروفورات المعنية (pHuji 566/598 nm، α4-SEP 499/520 nm، β2-pHuji 568/603 nm، و mTagBFP2 359/461 nm).
  7. امسح الطبق لتحديد مكان الخلايا للتصوير باستخدام هدف 10x-60x. زد التكبير إذا رغبت واضبط عمق التركيز حسب الحاجة.
  8. ضبط شدة الليزر وحساسية الكاشف لرؤية الفلورة بدون إشارة خلفية. قم بضبط الفتحة لزيادة إشارة الفلورة إذا لزم الأمر.
  9. اختر الدقة المفضلة والتقط الصورة الواحدة باستخدام الهدف المطلوب (مثلا، 60x).
  10. سجل الموقع على خريطة الطبق لإعادة نقل نفس الخلايا بعد تغيير المخزن إلى مخزن تبريد pH 5.5.
  11. كرر عملية التصوير لعدة مناطق على الطبق، مع تسجيل كل موقع جديد. استخدم نفس إعدادات الالتقاط لجميع الصور (مجموعات التجربة والمجموعة) لتمكين المقارنات الصحيحة.
  12. مع إبقاء خط المخرج متصلا فقط بمضخة التبيض، قم بشفط مخزن pH 7.4 ببطء من الطبق إلى حاوية نفايات.
  13. عندما يتم إزالة معظم المخزن (دون تجفيف الخلايا)، انقل خط المدخل إلى مخزن التبريد pH 5.5.
  14. شغل مضخة التوازي لإضافة عازل pH 5.5 ببطء (1.5 مل/دقيقة) إلى الطبق، مع التأكد من بقاء الخلايا متصلة.
  15. شغل المضخة لمدة 20 دقيقة، مع ملاحظة أن المخزن يتدفق بشكل صحيح داخل وخارج الطبق.
  16. أوقف المضخة وحضن الخلايا باستخدام مخزن التبريد pH 5.5 لمدة 20 دقيقة إضافية للسماح بالتوازن.
  17. لتكرار التصوير، قم بتحميل المواقع المحفوظة من الجلسة السابقة للعودة إلى نفس المناطق.
  18. تأكد من صحة عمق البؤرة وموقعها، حيث قد تتغير بعد تبادل المخزن المؤقت.
  19. كرر التصوير في جميع المواقع المحفوظة باستخدام حالة التبريد الهيدروجيني (pH).
الكاشفالتركيز (mM)
NaCl135
KCl5
إم جي سيإل 21.8
هيبس20
د-جلوكوز1
اضبط المحلول إلى درجة الحموضة 7.4

الجدول 1: وصفة التصوير المؤقت. تم جمع الكواشف التالية معا، وتم تعديل المحلول إلى درجة الحموضة 7.4.

الكاشفالتركيز (mM)
NaCl135
KCl5
إم جي سيإل 20.4
CaCl21.8
MES20
د-جلوكوز1
اضبط المحلول إلى درجة الحموضة 5.5

الجدول 2: وصفة المخزن للتبريد. تم خلط الكواشف التالية معا، وتم تعديل المحلول الناتج إلى درجة حموضة 5.5.

4. قياس الصورة

ملاحظة: تشرح هذه الطريقة كيفية تحليل صور الخلايا باستخدام ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة، بيثيسدا، ماريلاند) وطريقة فلورة الخلايا الكلية المصححة (CTCF)32.

  1. افتح ImageJ وافتح الصورة ليتم تحليلها. ستظهر الصورة كمكدس مع فصل كل قناة ملتقطة ضمن نفس الإطار.
  2. انتقل إلى قناة الطور . إذا كانت الصورة ساطعة جدا (وهو أمر شائع للمناطق الفارغة أو الخلفية)، اختر عملية > تعزيز التباين، ثم اضغط على موافق.
  3. باستخدام أداة العدسة المكبرة، قم بتكبير (+) على خلية واحدة. باستخدام أداة الاختيار الحرة، تتبع مخطط الخلية في قناة الطور.
  4. انتقل إلى قناة الفلورسنت المقابلة للفلوروفور المعني. قم بإعداد القياسات المطلوبة باختيار تحليل > مجموعة القياسات. تأكد من فحص المساحة، القيمة الرمادية المتوسطة، والكثافة المتكاملة .
  5. لقياس المنطقة المحددة، اختر تحليل > قياس أو اضغط Command + M (ماك) / Ctrl + M (ويندوز).
  6. خذ ثلاث قياسات خلفية عن طريق تتبع المناطق الفارغة بالقرب من الخلية. كرر الخطوات لعدد الخلايا المطلوب.
  7. ستظهر بيانات القياس في نافذة نتائج منفصلة في ImageJ. انسخ هذه البيانات والصقها في Excel للتحليل.
  8. احسب متوسط الخلفية من القياسات الثلاثة للخلفية.
  9. احسب قيمة CTCF لكل خلية باستخدام الصيغة التالية:
    CTCF=الكثافة المتكاملة−(مساحة الخلية × متوسط التألق الخلفي)
  10. كرر هذه العملية لعدة خلايا وصور لكل مجموعة تجريبية (وحالة الرقم الهيدروجيني إذا كان ذلك مناسبا). تصدير جميع النتائج إلى برنامج تحليل البيانات للمعالجة الإحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا لإجراءات النقل المذكورة أعلاه، تم التعبير المشترك عن α7 nAChRs وبروتين NACHO chaperone في خلايا N2a. تم وسم كل من الخلايا غير المنقولة والمستمرة ب αBTX-AF647 بعد 24 ساعة من نقل الحمض النووي. نظرا لأن αBTX غير قابل للنفاذ في الغشاء، فإن جميع الفلورة المكتشفة تأتي من مستقبلات موجودة على غشاء البلازما. في الشكل 2A,A′، لوحظ تلوين ضعيف ب αBTX-AF647 في خلايا N2a غير المنقولة، كما هو متوقع. تعبر خلايا N2a بشكل داخلي عن كمية صغيرة من α7 nAChR، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعالج المنهجيات المقدمة للتعبير عن وقياس وحدات nAChR الفرعية في خلايا N2a الثديية التحديات طويلة الأمد في تحقيق تعبير سريع (~24 ساعة) ووفير (> 60٪) من غشاء البلازما لاكتشاف المخدرات، وتحديد موقعها، ودراسات الاتجار. من نقاط القوة الرئيسية لهذه المجموعة من البروتوكولات قدرتها على التكيف مع كل من nAChRs المتجانسة (α7) وغير المتجانسة (α4β2)، ومن المرجح أن تكون قابلة للتطبيق على أنواع nAChR الأخرى، إلى جانب التعبير المشترك لبروتينات الشابرون. من خلال الاستفادة من العلامات الحساسة لدرجة الحموض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في شكر جيمس جانوسو على خبرته في المجهر التقني ومركز البحوث التحويلية في الأيض (المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم P20GM130443) لدعمهم نواة المجهر في جامعة ألاسكا فيربانكس. وقد تم دعم جهود LW جزئيا من خلال تمويل صندوق الاستثمار في التعليم العالي، الذي قدمته ولاية ألاسكا عبر جامعة ألاسكا. وقد دعمت جهود SMS جائزة التنمية المؤسسية (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابعة للمعاهد الوطنية للصحة بموجب المنحة رقم P20GM103395. تم دعم البحث المنشور من قبل المعهد الوطني للصحة النفسية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (MMW برقم الجائزة R03MH135358) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (MMW برقم الجائزة R16GM150455) التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين-إيدتا (1X) جيبكو25200-056كاشف انفصال الخلايا
ألفا-بونغاروتوكسين أليكسا فلور 647إنفيتروجينB35450اقتران ألفا-بونغاروتوكسين
خزانة السلامة الحيوية بمستوى BSL 1نويرNU-425-400منطقة عمل زراعة الخلايا المعقمة
كلوريد الكالسيومأفينتور/VWRBDH9224مكون المخزن المؤقت
D-(+)-جلوكوزميلي بور سيغما G8270مكون المخزن المؤقت
EMEM مع إل-جلوتامينATCC30-2003وسط الخلية
الحمض النووي الخالي من السموم الداخليةمصنوع داخليا باستخدام مجموعات زيموغير قابل للتطبيقDNAs nAChR المستخدمة في التحويلات العابرة للخلايا
أنابيب الطرد المركزي الدقيق الخالية من السموم الداخلية، 0.5 مل & nbsp;أفينتور/VWR89000-010الحمض النووي وتحضير النقل
أنابيب الطرد المركزي الدقيق الخالية من السموم الداخلية، 1.5 مل & nbsp;أفينتور/VWR20170-038الحمض النووي وتحضير النقل
مصل الأبقار الجنينيأفينتور/VWR97068-085مكمل المصل
فلوفيو FV10iأوليمبوسFV10iالمجهر الكونفوكلي
أطباق ماتيك ذات القاع الزجاجيماتيكP35GC-0-10-Cأطباق التصوير
جراف باد بريزم المجلد 10منشور جراف بادhttps://www.graphpad.com/featuresبرامج تحليل البيانات
هيبسميلي بور سيغما H3375مكون المخزن المؤقت
ليبوفيكتامين 2000إنفيتروجين11668019كاشف النقل
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومالعلم الحراري413410025مكون المخزن المؤقت
ماء MESميلي بور سيغما M5287مكون المخزن المؤقت
mTagBFP2-pBADAddGene 54572سيتم استخدام الحمض النووي الضابط للنقل الخلوي العابر&nb;
الخلايا العصبية 2a (N2a)مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكيةCCL-131الخلايا المستخدمة في نقل الحمض النووي والتعبير عن nAChR
أوبتي-ممجيبكو31985-070وسط مصل مخفض
البنسلين/الستربتوميسينأفينتور/VWRK952-100mLالمضاد الحيوي
مضخة التوازيجيلسونميني بولس 3تغير المخزن المؤقت عند التصوير  
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتجودة بيولوجية119-069-131حاجز المحلول الملحي
مساعد البيبيتدروموند 140084نقل سائل دقيق
رؤوس البيبت (معقمة وخالية من السموم الداخلية، 1000 ميكرولتر)راينين30389216نقل سائل دقيق
رؤوس البيبيت (معقمة وخالية من السموم الداخلية، 20 ميكرولتر)راينين30389229نقل سائل دقيق
رؤوس البيبت (معقمة وخالية من السموم الداخلية، 250 ميكرولتر)راينين30389246نقل سائل دقيق
البيبيت، الصفحة 10رينين L-10XLSنقل سائل دقيق
بيبيت، P100رينين L-100XLSنقل سائل دقيق
بيبيت، P1000رينين L-1000XLSنقل سائل دقيق
كلوريد البوتاسيومميلي بور سيغما P3911مكون المخزن المؤقت
الماصات المصلية (معقمة وخالية من السموم الداخلية، 10 مل)أفينتور/VWR89130-898نقل سائل دقيق
الماصات المصلية (معقمة وخالية من السموم الداخلية، 25 مل)أفينتور/VWR89130-900نقل سائل دقيق
الماصات المصلية (معقمة وخالية من السموم الداخلية، 5 مل)أفينتور/VWR76201-710نقل سائل دقيق
الماصات المصلية (معقمة وخالية من السموم الداخلية، 50 مل)أفينتور/VWR75816-088نقل سائل دقيق
كلوريد الصوديومأفينتور/VWRBDH9286مكون المخزن المؤقت
قارورة زراعة الأنسجةفالكون353109زراعة الصحون
مجموعة ZymoPure II بلازميد ماكسيبريبأبحاث زيموD4203-A + D4203-Bإنتاج الحمض النووي الخالي من السموم الداخلية
α 4-سبتمبر & nbsp;خدمات تخليق الجينات العلمية ثيرموفيشر & nbsp;  https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlخدمات تخليق الجينات المخصصة
α 7-فوجيتويست بايوساينسhttps://www.twistbioscience.com/خدمات تخليق الجينات المخصصة
β 2-فوجيخدمات تخليق الجينات العلمية ثيرموفيشر & nbsp;  https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlخدمات تخليق الجينات المخصصة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
  2. Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann New York Acad Sci. 757 (1), 48-72 (1995).
  3. Picard, F., et al. Alteration of the in vivo nicotinic receptor density in ADNFLE patients: a PET study. Brain. 129 (8), 2047-2060 (2006).
  4. Breese, C. Abnormal Regulation of High Affinity Nicotinic Receptors in Subjects with Schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 23 (4), 351-364 (2000).
  5. De Luca, V., Voineskos, S., Wong, G., Kennedy, J. L. Genetic interaction between α4 and β2 subunits of high affinity nicotinic receptor: analysis in schizophrenia. Exp Brain Res. 174 (2), 292-296 (2006).
  6. Maskos, U., et al. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436 (7047), 103-107 (2005).
  7. Picciotto, M. R., et al. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391 (6663), 173-177 (1998).
  8. Staley, J. K. Human Tobacco Smokers in Early Abstinence Have Higher Levels of β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors than Nonsmokers. J Neurosci. 26 (34), 8707-8714 (2006).
  9. Gotti, C., Zoli, M., Clementi, F. Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance. Trends Pharmacol Sci. 27 (9), 482-491 (2006).
  10. Mineur, Y. S., Mose, T. N., Blakeman, S., Picciotto, M. R. Hippocampal α7 nicotinic ACh receptors contribute to modulation of depression-like behaviour in C57BL/6J mice. British J Pharmacol. 175 (11), 1903-1914 (2018).
  11. Fernandes, S. S., et al. Enhanced cholinergic-tone during the stress induce a depressive-like state in mice. Behav Brain Res. 347, 17-25 (2018).
  12. Ren, J. M., Zhang, S. L., Wang, X. L., Guan, Z. Z., Qi, X. L. Expression levels of the α7 nicotinic acetylcholine receptor in the brains of patients with Alzheimer's disease and their effect on synaptic proteins in SH-SY5Y cells. Mol Med Rep. 22 (3), 2063-2075 (2020).
  13. Letchworth, S. R., Whiteaker, P. Progress and Challenges in the Study of α6-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem Pharmacol. 82 (8), 862-872 (2011).
  14. Nelson, M. E., et al. Functional Properties of Human Nicotinic Achrs Expressed by Imr-32 Neuroblastoma Cells Resemble Those of α3β4 Achrs Expressed in Permanently Transfected Hek Cells. J General Physiol. 118 (5), 563-582 (2001).
  15. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits *. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  16. Harkness, P. C., Millar, N. S. Inefficient cell-surface expression of hybrid complexes formed by the co-assembly of neuronal nicotinic acetylcholine receptor and serotonin receptor subunits. Neuropharmacology. 41 (1), 79-87 (2001).
  17. Dhara, M. Polyamine regulation of ion channel assembly and implications for nicotinic acetylcholine receptor pharmacology. Nat Commun. 11 (1), (2020).
  18. Vallés, A. S., Roccamo, A. M., Barrantes, F. J. Ric-3 chaperone-mediated stable cell-surface expression of the neuronal α7 nicotinic acetylcholine receptor in mammalian cells. Acta Pharmacol Sinica. 30 (6), 818-827 (2009).
  19. Dawe, G. B., et al. α7 nicotinic acetylcholine receptor upregulation by anti-apoptotic Bcl-2 proteins. Nat Comm. 10 (1), (2019).
  20. Peng, J. H., et al. Inducible, heterologous expression of human α7-nicotinic acetylcholine receptors in a native nicotinic receptor-null human clonal line. Brain Res. 825 (1-2), 172-179 (1999).
  21. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  22. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  25. O'Brien, B. C. V., Weber, L., Hueffer, K., Weltzin, M. M. SARS-CoV-2 spike ectodomain targets α7 nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 299 (5), 104707(2023).
  26. O'Brien, B. C. V., et al. The human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a host target for the rabies virus glycoprotein. Front Cell Infect Microbiol. 14, (2024).
  27. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  28. Sankaranarayanan, S., Angelis, D. D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophy J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  29. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J General Physiol. 143 (1), 51-66 (2013).
  30. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  31. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  32. Fitzpatrick, M. Measuring cell fluorescence using ImageJ. , http://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html#measuring-cell-fluorescence-using-imagej (2025).
  33. Srinivasan, R., et al. Nicotine up-regulates α4β2 nicotinic receptors and ER exit sites via stoichiometry-dependent chaperoning. J Gen Physiol. 137 (1), 59-79 (2011).
  34. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  35. Matta, J. A., et al. NACHO Mediates Nicotinic Acetylcholine Receptor Function throughout the Brain. Cell Rep. 19 (4), 688-696 (2017).
  36. Flores, C. M., Rogers, S. W., Pabreza, L. A., Wolfe, B. B., Kellar, K. J. A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat brain is composed of alpha 4 and beta 2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol Pharmacol. 41 (1), 31-37 (1992).
  37. Mazzaferro, S., Whiteman, S. T., Alcaino, C., Beyder, A., Sine, S. M. NACHO and 14-3-3 promote expression of distinct subunit stoichiometries of the α4β2 acetylcholine receptor. Cell Mol Life Sci. 78 (4), 1565-1575 (2021).
  38. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  39. Fasoli, F., et al. In vivo chronic nicotine exposure differentially and reversibly affects upregulation and stoichiometry of α4β2 nicotinic receptors in cortex and thalamus. Neuropharmacology. 108, 324-331 (2016).
  40. Wada, E., et al. Distribution of alpha2, alpha3, alpha4, and beta2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: A hybridization histochemical study in the rat. J Comparative Neurol. 284 (2), 314-335 (1989).
  41. Zoli, M., Léna, C., Picciotto, M. R., Changeux, J. P. Identification of Four Classes of Brain Nicotinic Receptors Using β2 Mutant Mice. J Neurosci. 18 (12), 4461-4472 (1998).
  42. Briggs, C. A., et al. and Low-Sensitivity Subforms of α4β2 and α3β2 nAChRs. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 11-12 (2006).
  43. Weltzin, M. M., George, A. A., Lukas, R. J., Whiteaker, P. Distinctive single-channel properties of α4β2-nicotinic acetylcholine receptor isoforms. PLoS One. 14 (3), e0213143(2019).
  44. Moroni, M., Bermudez, I. Stoichiometry and Pharmacology of Two Human α4β2 Nicotinic Receptor Types. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 95-96 (2006).
  45. Nelson, M. E., Kuryatov, A., Choi, C. H., Zhou, Y., Lindstrom, J. Alternate Stoichiometries of α4β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 63 (2), 332-341 (2003).
  46. Tapia, L., Kuryatov, A., Lindstrom, J. Ca2+ Permeability of the (α4)3(β2)2 Stoichiometry Greatly Exceeds That of (α4)2(β2)3 Human Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 71 (3), 769-776 (2007).
  47. Eaton, J. B., et al. The Unique α4(+)/(−)α4 Agonist Binding Site in (α4)3(β2)2 Subtype Nicotinic Acetylcholine Receptors Permits Differential Agonist Desensitization Pharmacology versus the (α4)2(β2)3 Subtype. J Pharmacol Exp Ther. 348 (1), 46-58 (2014).
  48. Mazzaferro, S., et al. Additional Acetylcholine (ACh) Binding Site at α4/α4 Interface of (α4β2)2α4 Nicotinic Receptor Influences Agonist Sensitivity. J Biol Chem. 286 (42), 31043-31054 (2011).
  49. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Bio Chem. 286 (36), 31241-33124 (2011).
  50. Asokan, A., Cho, M. J. Exploitation of Intracellular pH Gradients in the Cellular Delivery of Macromolecules. J Pharma Sci. 91 (4), 903-913 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Neuro2a ImageJ

مقالات ذات صلة