مقالة بحثية

ML385 يخفف من التقدم الخبيث لخلايا سرطان الرئة الغدي الناجم عن السيليكا من خلال مسار محور الالتهام الذاتي ROS / NRF2

482 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69382

⸱

أكتوبر 31, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, 2Department of Medical Laboratory, Huaian Hospital of Huaian City, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 6Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 7Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, 8Department of Blood Transfusion, Shanghai Pudong New Area People's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

تستخدم هذه الدراسة نماذج حيوانية وخلاوية للتحقيق فيما إذا كان مثبط NRF2 ML385 يخفف من التطور الخبيث الناجم عن السيليكا لسرطان الرئة الغدي من خلال مسار محور الالتهام الذاتي ROS / NRF2.

الملخص

يرتبط التعرض للسيليكا بزيادة خطر الإصابة بسرطان الرئة الغدي ، لكن آليته الجزيئية لا تزال غير واضحة. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء بروتوكول تجريبي قابل للتكرار لاستكشاف كيف يمنع مثبط العامل النووي العامل 2 المرتبط بالكريات الحمراء 2 (NRF2) ML385 التطور الخبيث الناجم عن السيليكا لسرطان الرئة الغدي عن طريق تنظيم مسار محور الالتهام الذاتي ROS / NRF2. أولا ، تم إنشاء نموذج السحار السيليسي عن طريق التروية داخل الأنف لمعلق السيليكا في الفئران C57BL / 6. تم تقييم درجة التليف الرئوي عن طريق تلطيخ ماسون ، وتم تحليل تسلل الخلايا المناعية عن طريق التألق المناعي ، وتم الكشف عن تعبيرات NRF2 ، والكيناز المعتمد على السيكلين 1 (CDK1) ، وقناة الأنيون المعتمدة على الجهد 1 (VDAC1) في أنسجة الرئة بواسطة الكيمياء المناعية. بعد ذلك ، في التجارب المختبرية ، تمت معالجة خط خلية البلاعم RAW264.7 بالسيليكا. تم تقييم مستويات التدفق الذاتي والإجهاد التأكسدي بواسطة التوطين المشترك للجسيم الليزوزومي LC3 ومجسات ROS ، وتم إجراء التدخل باستخدام مثبط NRF2 ML385. أخيرا ، تم تحليل تأثيرات ML38 على الهجرة والغزو وموت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان الرئة الغدي عن طريق فحص الخدش ، والخلايا التي تمر عبر مسام ذات مقايسة بحجم معين ، وقياس التدفق الخلوي. أظهرت النتائج أن السيليكا يمكن أن تحفز التليف الرئوي ، وتسلل الخلايا المناعية ، وتنظيم NRF2 و CDK1 و VDAC1 في الفئران (ص < 0.001) ، وتمنع التدفق الذاتي للبلاعم وتقليل مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية. يمكن ل ML385 عكس هذه التأثيرات (ص < 0.05). يوفر هذا البروتوكول عملية تجريبية كاملة من بناء النموذج في الجسم الحي إلى أبحاث الآلية في المختبر ، مما يوفر مسارا تقنيا تشغيليا لدراسة الآلية الجزيئية لسرطان الرئة الغدي المرتبط بالسيليكا والاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف NRF2.

المقدمة

سرطان الرئة الغدي هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم ، حيث يقدر عدد الحالات الجديدة بنحو 2 مليون حالة وفاة 1.76 مليون حالة وفاة كل عام1. في السنوات الأخيرة ، ارتفع معدل الإصابة بسرطان الرئة الغدي بين الأشخاص الذين لم يدخنوا مطلقا ، والذي قد يكون مرتبطا بعوامل بيئية مثل تلوث الهواء2. السيليكا هي ملوث بيئي شائع وقد تم تحديده كعامل ممرض محتمل لسرطان الرئة الغديالبشري 3. يمكن أن تسبب السيليكا التهابا مزمنا مستمرا ، مما يؤدي إلى تسلل البلاعم والخلايا الليمفاوية والعدلات ، وإطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية والعوامل الالتهابية4. هذه البيئة المكروية الالتهابية طويلة الأمد تعزز حدوث سرطان الرئة الغدي5،6. على الرغم من تأكيد الارتباط بين التعرض للسيليكا والسرطان الغدي في الرئة ، إلا أن آليتها الجزيئية المحددة لم يتم توضيحها بالكامل.

يلعب عامل النسخ NRF2 ، المشفر بواسطة جين NFE2L2 ، دورا مهما كمنظم رئيسي في الحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال الخلوية استجابة للإجهاد التأكسدي7،8. في ظل الظروف العادية ، يتم تصنيف NRF2 وتحللها بواسطة مركب KEAP1-CUL3 ubiquitin ligase. تحت تحفيز الإجهاد التأكسدي أو المواد المحبة للكهرباء ، يتم تثبيط نشاط KEAP1 ، مما يسمح ل NRF2 بالتراكم بثبات ودخول النواة ، وبالتالي ممارسة الدور الدفاعي والتنظيمي للنواة9. ومع ذلك ، فإن التنشيط المفرط ل NRF2 في البيئة المكروية للورم قد يعزز تحلل السكر وبقاء الخلايا السرطانية عن طريق وقف تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية وتعزيز مقاومة موت الخلايا المبرمج10،11. أثبتت الدراسات أن التعرض للسيليكا يمكن أن يؤدي إلى تنشيط غير طبيعي لمسار إشارات NRF2 12،13. لذلك ، قد يكون استهداف NRF2 استراتيجية فعالة للتدخل في التطور الخبيث لسرطان الرئة الغدي الناجم عن السيليكا14.

تهدف هذه الدراسة إلى توضيح ما إذا كان مثبط NRF2 ML385 يمنع التطور الخبيث الناجم عن السيليكا لسرطان الرئة الغدي عن طريق تنظيم مسار محور الالتهام الذاتي ROS / NRF2. أنشأنا نموذج فأر ناتج عن السيليكا لإعادة إنتاج السمات الرئيسية للمرض واستخدمنا طرقا تجريبية في المختبر لدراسة التفاعل بين البلاعم والخلايا السرطانية. وجدنا أن السيليكا تحفز التعبير عن الجزيئات الالتهابية والمناعية وعززت تكوين الورم من خلال مسار محور الالتهام الذاتي ROS / NRF2. عندما تم استخدام مثبط NRF2 (ML385) ، تباطأ التأثير المعزز للسيليكا على تكوين الورم ، مما يشير إلى أن مثبط NRF2 قد يلعب دورا في علاج أورام الرئة التي تسببها السيليكا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على جميع الكتل المانحة من عينات مرضية أرشيفية تم جمعها بين عامي 2016 و 2018 في مستشفى هوايان الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية. تم إلغاء تحديد العينات قبل استخدامها ومعالجتها وفقا للبروتوكولات المعتمدة. لجنة الأخلاقيات في مستشفى هويان الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية ، KY-2024-250-01. تتبع تربية الفئران التجريبية والتخلص منها وتطبيقها بدقة اللوائح الخاصة بإدارة المختبر والمبادئ التوجيهية الدولية.

بناء نموذج فأر ناتج عن السيليكا
تحضير الفئران وتعليق السيليكا: قم بتربية ذكور الفئران C57BL / 6 ، بعمر 6-8 أسابيع ، في غرفة بدرجة حرارة غرفة 20-25 درجة مئوية ودورة ضوء 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة. لتحضير تعليق غبار السيليكون ، تم وزن 300 مجم من مسحوق غبار السيليكون بدقة وتعليقها في 10 مل من المحلول الملحي المعقم 1x الفوسفات. بعد ذلك ، تم دوامة الخليط بقوة وتذبذب لمدة 5 دقائق ، ثم تمت معالجته بالموجات فوق الصوتية في جهاز الموجات فوق الصوتية للحمام المائي لمدة 30 دقيقة لضمان تشتت موحد للجزيئات ومنع التراكم. التركيز النهائي لهذا المعلق الاحتياطي هو 30 مجم / مل. قم بتعقيمه عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قبل كل استخدام ، من الضروري الدوامة والرج مرة أخرى لمدة 2-3 دقائق لإعادة تعليق أي جزيئات مستقرة.

استنشقت الفئران معلق السيليكا من خلال الأنف. تم استخدام الماصة الدقيقة لإدخال المحلول ببطء وإسقاط في تجويف أنف الفئران. تم تقسيم الفئران إلى 6 مجموعات مع 20 فأرا في كل مجموعة. كان حجم الاستنشاق لكل مجموعة 10 ميكرولتر ، 30 ميكرولتر ، 50 ميكرولتر ، 70 ميكرولتر ، 90 ميكرولتر ، 200 ميكرولتر ، بتركيز 30 مجم / مل ، مرة واحدة يوميا لمدة 40 يوما متتاليا. عند الارتعاش ، أمسك الجلد خلف أذن الفأر بالإبهام والسبابة في اليد اليسرى ، وقم بتثبيت جسم وذيل الماوس بالأصابع الأخرى. تأكد من أن الماوس في وضع ضعيف مع إمالة رأسه قليلا للخلف للسماح باستنشاق المعلق بشكل طبيعي في الجهاز التنفسي. وجدنا أنه لم يكن هناك حدث وفاة بعد اليوم الثاني من استنشاق 10 ميكرولتر و 30 ميكرولتر و 50 ميكرولتر و 70 ميكرولتر من معلق السيليكا في الفئران ، بينما كان هناك حدث وفاة بعد اليوم الثاني من استنشاق 90 ميكرولتر و 200 ميكرولتر من معلق السيليكا في الفئران. لذلك ، كان الحد الأقصى لحجم استنشاق السيليكا في الفئران 70 ميكرولتر في اليوم.

عند التعامل مع السيليكا البلورية ، يجب أن يتم إجراؤها في خزانة السلامة الحيوية أو غطاء الدخان ، ويجب ارتداء أقنعة N95 والنظارات الواقية المقاومة للغبار وقفازات النتريل والملابس الواقية طوال العملية. عند تحضير التعليق ، يجب أن تكون الحركات لطيفة ، ويجب استخدام غرفة الوزن لتجنب توليد الهباء الجوي. يجب جمع جميع النفايات الملامسة للسيليكا في حاويات محكمة الغلق ذات مقاومة للثقب والتخلص منها وفقا للوائح النفايات الكيميائية الخطرة. يمنع منعا باتا مزجها بالقمامة العامة أو سكبها في المجاري. يجب جمع النفايات البيولوجية ، مثل وسط زراعة الخلايا ، في علب قمامة خاصة تحتوي على مطهرات وتعقيمها تحت ضغط عال. يجب وضع جثث وأنسجة في أكياس نفايات بيولوجية وتعقيمها تحت ضغط عال لمعالجة غير ضارة.

تقييم نجاح نموذج الفأر المستحث بالسيليكا. تقييم في نقاط زمنية مختلفة بعد استنشاق السيليكا ، أي في الأيام 3 و 14 و 40. تم وضع الفئران في أجهزة القتل الرحيم الحيوانية الاحترافية ، وتم إدخال ثاني أكسيد الكربون بمعدل تعبئة 30٪ -50٪ حجم / دقيقة. كانوا يتعرضون باستمرار حتى توقفوا عن التنفس. بعد تأكيد الوفاة ، تم تنفيذ عمليات لاحقة. تمت إزالة أنسجة الرئة. تم تثبيت أنسجة الرئة في محلول بارافورمالديهايد 4٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة. بعد التثبيت ، تم تجفيف الأنسجة بالكحول المتدرج ، وجعلها شفافة مع الزيلين ، ثم تم تضمينها في البارافين. تم إجراء المقاطع المستمرة باستخدام آلة تقطيع البارافين بسماكة 4-5 ميكرومتر للتلوين النسيجي اللاحق والتحليل الكيميائي المناعي. لا تتطلب أنسجة الرئة علاج إزالة الكلس. تم إجراء الفحص المرضي لأنسجة الرئة لتقييم توليد النموذج الناجح. كانت معايير نجاح بناء نموذج السحار السيليسي كما يلي: التهاب رئوي كبير ، والتليف ، وحدوث عقيدات السحار السيليسي.

تحليل تسلل الخلايا المناعية في نموذج الفأر الناجم عن السيليكا
تم تلطيخ أنسجة الرئة للفئران في اليوم 14 بعد استنشاق السيليكا بعلامات فلورية تحتوي على CD3e (نسبة التخفيف 1: 200) ، CD8a (نسبة التخفيف 1: 200) ، CD86 (نسبة التخفيف 1: 200) ، F4 / 80 (نسبة التخفيف 1: 200) ، و Nk1.1 (نسبة التخفيف 1: 200) لتصور الخلايا المناعية. قم بإصلاح أقسام الخلايا أو الأنسجة وحظرها باستخدام ألبومين مصل البقر بنسبة 5٪ (BSA) لمدة 1 ساعة لتقليل الارتباط غير المحدد. استخدام مصل طبيعي من نفس أصل النوع مثل الجسم المضاد الحاجب ، وتخفيف المصل باستخدام PBS بنسبة 1:10 ، وإضافة 100 ميكرولتر من المصل المخفف إلى العينة. ثم ، قم بمنع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للمصل بمنع الأجسام المضادة الداخلية. بعد الختم ، اشطفيه برفق 2x باستخدام PBS. الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على CD3e (نسبة التخفيف 1: 200) ، CD8a (نسبة التخفيف 1: 200) ، CD86 (نسبة التخفيف 1: 200) ، F4 / 80 (نسبة التخفيف 1: 200) ، و Nk1.1 (نسبة التخفيف 1: 200) تم تحضينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. بعد الغسيل باستخدام PBS ، تمت إضافة الجسم المضاد الثانوي الفلوري واحتضانه في الظلام لمدة ساعة واحدة.

تلطيخ ماسون والتحليل الكيميائي المناعي
تم إزالة الشمع من أقسام البارافين بالزيلين وترطيبها بالكحول المتدرج ، ثم تم استرجاع المستضد في مخزن سيترات الصوديوم مع درجة الحموضة 6.0 عن طريق المعالجة الحرارية عالية الضغط. للمعالجة الحرارية عالية الضغط ، ضع شرائح الأنسجة المنقوعة في مخزن مؤقت للإصلاح في فرن ميكروويف على نار متوسطة لمدة 8-12 دقيقة. تم حظر نشاط البيروكسيديز الداخلي بمحلول بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 20 دقيقة ، ثم تم حظر موقع الارتباط غير المحدد بنسبة 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف الأجسام المضادة الأولية NRF2 (1: 200) و CDK1 (1: 400) و VDAC1 (1: 500) ، واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسيل 3x باستخدام PBS ، أضف الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب الماعز المضاد للأرانب المسمى ب HRP (1: 500) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. خضعت أقسام البارافين لتلوين DAB ، وتلوين الهيماتوكسيلين ، وشفافية الجفاف ، وختم الجل المحايد للحصول على نتائج الكيمياء المناعية الجزيئية المقابلة. عند استخدام DAB لتطوير اللون ، يجب أن يكون تطور اللون المعتدل أصفر بني إلى بني بني ، ويجب أن تكون الخلفية واضحة. يتطلب كل من تطوير اللون المفرط (البني الداكن) وغير الكافي (الأصفر الفاتح) تحسين وقت تطوير اللون.

تم تحليل درجة التليف الرئوي شبه كميا باستخدام طريقة تسجيل Ashcroft15: لوحظت أقسام ملطخة بماسون تحت مجهر تكبير 100x ، وتم تقسيم أنسجة الرئة بشكل عشوائي إلى 8 مناطق. تم تسجيل كل منطقة وفقا لدرجة التليف (0-8 نقاط) ، مع النتيجة النهائية هي متوسط جميع المناطق: 0 نقطة (أنسجة الرئة الطبيعية) ، 1-2 نقطة (تليف خفيف) ، 3-4 نقاط (تليف معتدل) ، 5-8 نقاط (تليف شديد).

تم تحليل نتائج الكيمياء المناعية كميا باستخدام برنامج الصورة. تم اختيار خمسة حقول عالية التكبير بشكل عشوائي ، وتم قياس متوسط قيمة الكثافة البصرية (MOD) لكل حقل كمؤشر لمستوى تعبير البروتين.

دراسة تأثير السيليكا و ML385 على الالتهام الذاتي و ROS في خلايا RAW264.7
تمت زراعة كل من خلايا RAW264.7 و A549 (المقدمة من جامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا) باستخدام وسط DMEM عالي الجلوكوز المكمل ب 10٪ مصل أبقار الجنين (FBS) و 1٪ محلول الأجسام المضادة ثنائي النوعية من البنسلين والستربتومايسين. تمت زراعة الخلايا 1 × 107 بشكل موحد في حاضنة بدرجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تمت إضافة 5 ميكرولتر من معلق السيليكا 30 مجم / مل إلى 1 × 105 خلايا / مل من خلايا RAW264.7. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، تم شطف الخلايا باستخدام PBS 3x ، وتم الكشف عن الالتهام الذاتي والإجهاد التأكسدي بواسطة مجسات ROS و LC3 والليزوزوم. في الوقت نفسه ، ML38516 ، وهو مثبط ل NRF2 ، تم استخدامه لتثبيط التعبير عن NRF2 (التركيز النهائي ل ML385: 5 ملي مولار / لتر). تم الكشف عن الالتهام الذاتي والإجهاد التأكسدي وفقا للخطوات التجريبية المذكورة أعلاه. تم تحليل الإجهاد التأكسدي وتدفق الالتهام الذاتي للمجموعتين إحصائيا.

التحليل الكيميائي المناعي لتعبيرات VDAC1 و CDK1 و p62 و NRF2 في أنسجة سرطان الرئة الغدي
تم فحص تعبيرات VDAC1 و CDK1 و p62 و NRF2 في 30 مريضا. تم الحصول على الأنسجة المصابة بسرطان الرئة الغدي والأنسجة السليمة المجاورة من مستشفى هوايان الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية وتم تحليلها بواسطة الكيمياء المناعية (IHC). تم تحليل نتائج IHC والتليف الرئوي إحصائيا. جمع بيانات المريض وفقا لمعلومات المريض في نظام المستشفى. الخطوات التجريبية المحددة هي كما يلي: تم إزالة الشمع من أقسام البارافين بالزيلين وترطيبها بالكحول المتدرج ، ثم تم إجراء معالجة المستضد في عازلة سترات الصوديوم بدرجة حموضة 6.0 عن طريق المعالجة الحرارية عالية الضغط. تم حظر نشاط البيروكسيديز الداخلي بمحلول بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 20 دقيقة ، ثم تم حظر موقع الارتباط غير المحدد بنسبة 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف الأجسام المضادة الأولية NRF2 (1: 200) و CDK1 (1: 400) و p62 (1: 500) و VDAC1 (1: 500) ، واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسيل 3x باستخدام PBS ، أضف الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب الماعز المسمى HRP (1: 500) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تطوير لون DAB ، تلطيخ الهيماتوكسيلين ، شفاف مجفف ، ختم اللثة المحايد. عند استخدام DAB لتطوير اللون ، يجب أن يكون تطور اللون المعتدل أصفر بني إلى بني بني ، ويجب أن تكون الخلفية واضحة. يتطلب كل من تطوير اللون المفرط (البني الداكن) وغير الكافي (الأصفر الفاتح) تحسين وقت تطوير اللون.

تحليل هجرة الخلايا والغزو
تمت دراسة تأثير ML385 والطافية من الحضانة المشتركة للسيليكا مع خلايا RAW264.7 على هجرة الخلايا وغزوها بعد احتضانها مع خط خلايا سرطان الرئة الغدي A549. تمت إضافة المادة الطافية لخلايا RAW264.7 المزروعة بالسيليكا لمدة 24 ساعة إلى خلايا A549. تم تقسيم الخلايا إلى مجموعة السيليكا ، ومجموعة السيليكا + ML385 ، ومجموعة PBS. مجموعة السيليكا: تمت إضافة 5 ميكرولتر من 30 مجم / مل من معلق السيليكا إلى 1 × 105 خلايا / مل من خلايا RAW264.7. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية للخلية لاستخدامها لاحقا. تمت إضافة مجموعة السيليكا + ML385: 5 ميكرولتر من 30 مجم / مل من معلق السيليكا وتركيز نهائي قدره 5 ملي مولار / لتر ML385 إلى 1 × 105 خلايا / مل من خلايا RAW264.7. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية للخلية لاستخدامها لاحقا. مجموعة PBS: تمت إضافة 5 ميكرولتر من PBS إلى 1 × 105 خلايا / مل من خلايا RAW264.7. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية للخلية لاستخدامها لاحقا. أثناء فحص الخدش ، تم زرع خلايا A549 لأول مرة في ألواح مكونة من 12 بئرا بكثافة 5 × 105 لكل بئر. بعد أن نمت الخلايا إلى 95٪ -100٪ اندماج ، تم عمل خدوش على الخلايا أحادية الطبقة باستخدام طرف ماصة معقمة 200 ميكرولتر. تم غسل الخلايا المقشرة برفق باستخدام برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، تم تغيير ظروف الاستزراع لتشمل 1٪ من الوسط الأساسي FBS والمواد الطافية لكل مجموعة معالجة للحفاظ على بقاء الخلية خلال الفترة التجريبية التي استمرت 7 أيام. تم جمع صور من نفس الموضع تحت مجهر مقلوب في 0 ساعة (اليوم 0) وفي اليوم السابع (اليوم 7) بعد الخدش ، على التوالي. أخيرا ، تم تحليل منطقة الخدش كميا ، وتم حساب معدل إغلاق الخدش باستخدام برنامج ImageJ لتقييم تأثير المادة الطافية من مجموعات العلاج المختلفة على قدرة ترحيل خلايا A549.

في الخلايا التي تمر عبر مسام ذات مقايسة غزو بحجم معين ، تم استخدام غرفة غشاء من البولي كربونات 8 ميكرومتر ، مع غشاء الغرفة العلوية المطلي مسبقا بهلام يحاكي البيئة خارج الخلية المخففة بنسبة 1: 8 لبناء حاجز غشاء قاعدي. تم تعليق خلايا A549 في معلق مصنوع عن طريق خلط وسط خال من المصل مع المواد الطافية لكل مجموعة معالجة بنسبة 1: 1 ثم تلقيحها في الغرفة العلوية (2 × 104 خلايا لكل غرفة). في الحجرة السفلية ، تمت إضافة محلول مصنوع عن طريق خلط وسط يحتوي على 20٪ FBS مع المواد الطافية لمجموعات المعالجة المقابلة (مجموعة السيليكا + ML385 ، مجموعة السيليكا ، ومجموعة PBS) بنفس النسبة كجاذب كيميائي. تم جمع المواد الطافية لمجموعات العلاج المقابلة عن طريق الشفط من خلال مسدس ماصة في RAW264.7 بلعمة خلية السيليكا. بعد أن تم تحضين الخلايا بشكل مستمر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 7 أيام ، تمت إزالة الخلايا غير الغازية في الغرفة العلوية بمسحات قطنية ، وتم تثبيت الخلايا التي اخترقت الغشاء ووصلت إلى الغرفة السفلية بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد وملطخة ب 0.1٪ بنفسجي بلوراي. أخيرا ، تم اختيار عدد الخلايا الغازية بشكل عشوائي من 5 مجالات رؤية بواسطة مجهر ضوئي.

تحليل تأثير السيليكا و ML385 على موت الخلايا المبرمج لخلايا A549 باستخدام قياس التدفق الخلوي
تحضير الخلايا وتجميعها: تم جمع خلايا A549 المعالجة بالمواد الطافية لكل مجموعة معالجة (مجموعة PBS ، مجموعة السيليكا ، مجموعة السيليكا + ML385). تم غسل الخلايا برفق 2x باستخدام PBS المبرد مسبقا ، ثم أعيد تعليقها في مخزن مؤقت للربط 1x ، وتم تعديل كثافة الخلية إلى 1 × 106 خلايا لكل أنبوب / 100 ميكرولتر. بعد ذلك ، تمت إضافة 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC و 5 ميكرولتر من محلول تلطيخ PI إلى تعليق الخلية ، وتم دوامها برفق للخلط ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، تمت إضافة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 1x إلى كل أنبوب واختباره على الفور على الجهاز. تم الكشف باستخدام مقياس التدفق الخلوي. متحمسا لليزر 488 نانومتر ، تم جمع إشارة التألق ل Annexin V-FITC من خلال قناة FITC ، وتم جمع إشارة التألق ل PI من خلال قناة PE. قبل التجربة ، تم استخدام عينات تلطيخ واحد لتعديل تعويض التألق للقضاء على التداخل الطيفي. عند إجراء تحليل البيانات ، حدد أولا مجموعة الخلايا المستهدفة في مخطط تشتت FSC-A / SSC-A وتخلص من الأجزاء. بعد ذلك ، تم استبعاد التصاقات الخلايا باستخدام مخطط تشتت FSC-H / FSC-A. أخيرا ، تم إنشاء بوابة للتمييز بين الخلايا الحية ، والخلايا المبرمج المبكرة ، والخلايا المبرمج / النخرية المتأخرة ، والخلايا التالفة ميكانيكيا. تم الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام برنامج FlowJo V10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نموذج فأر السيليكا
في الشكل 1 ، تم إعطاء الفئران السيليكا عن طريق الأنف بجرعة 30 مجم / مل و 70 ميكرولتر لمدة 40 يوما متتاليا ، مما يضمن عدم حدوث أي أحداث وفاة في الفئران ويمكن إنشاء نموذج فأر السيليكا بنجاح. وفي الوقت نفسه ، تم استخدام تزقيم الفئران مع برنامج تلفزيوني كضوابط سلبية. كان الهدف هو القضاء على تأثير العملية والمذيب نفسه والتأكد من أن النمط الظاهري ناتج عن السيليكا على وجه التحديد. يوفر النسخ المتماثل الناجح لنموذج إصابة الرئة الناجم عن السيليكا أساسا ضروريا

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد سرطان الرئة الغدي أحد الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم ، وتتزايد معدلات الإصابة والوفيات عامابعد عام 17. تصنف السيليكا على أنها مادة مسرطنة من الفئة 1 للإنسان من قبل الوكالة الدولية لأبحاث السرطان ، ويزداد خطر الإصابة بسرطان الرئة الغدي مع التعرض المهني التراكمي18،19،20،21. أثبتت الدراسات السابقة أن الس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

شكرا لأعضاء الفريق على دعمهم ومساهمتهم في هذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة من قبل المختبر الرئيسي للحد من عمق الغبار الصناعي والصحة والسلامة المهنية لمعاهد التعليم العالي في آنهوي (رقم AYZJSGXLK202202006) ، صندوق بدء تشغيل مواهب المستشفيات الشعبية في شنغهاي بودونغ في المنطقة الجديدة (رقم PRYYH202501).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بيوغولد ترانسويلبيوتايم بيوتكنولوجي  FTW067-48lnsترانسويل
CD3eبكالوريوس علوم الحيوية561827قرص CD3e للعبة FITC Hamster المضادة للفئران (145-2C11)
CD86بكالوريوس علوم الحيوية105013CD86
CD8aبكالوريوس علوم الحيوية100713CD8a
CDK1أبكامab133327ضد CDK1
مجموعة كشف الخلايا المبرمجةبيوتايم بيوتكنولوجي  C1062Lكشف الخلايا المبرمجة
DAPIبيوتايم بيوتكنولوجي  P0131-25 ملDAPI
آلة التضمينبي إس جي الطبيةBM450Aآلة التضمين
F4/80بكالوريوس علوم الحيوية123109F4/80
جهاز تجفيف الأنسجة الأوتوماتيكي بالكامللايكا بيوسيستمزASP3005جهاز تجفيف الأنسجة الأوتوماتيكي بالكامل
شرائح المجهر الزجاجيسيتوتست250124A1شرائح المجهر الزجاجي
H& صبغة Eبيوتايم بيوتكنولوجي  C0105MH& صبغة E
طقم IHCتقنية الأبسين الحيويةABS996-5mlطقم IHC
مسبار LC3بيوتايم بيوتكنولوجي  C3018Mمسبار LC3
شفرات ميكروتوم منخفضة الارتفاعثيرمو فيشر3052835شفرات ميكروتوم منخفضة الارتفاع
مسبار ليزوسومبيوتايم بيوتكنولوجي  C1046مسبار ليزوسوم
قلم التحديدديليSK109قلم التحديد
صبغة ماسونبيوتايم بيوتكنولوجي  C0189Mصبغة ماسون
ماتريكس-جلبيوتايم بيوتكنولوجي  C0371-5 مللاصق المصفوفة
ميكروتوملايكا بيوسيستمزقطع النواة النسيجيةميكروتوم
ML385أبكامab287109مثبط NRF2
NK1.1بكالوريوس علوم الحيوية561117NK1.1
NRF2أبكامab1809Yمناهضة NRF2
ص62أبكامAB20735ضد p62
شمع البارافينسولاربيولوجياYA0012شمع البارافين
مجموعة اختبار أنواع الأكسجين التفاعليبيوتايم بيوتكنولوجي  S0033Mمسبار ROS
السيليكاسيغما ألدريتشS5631السيليكا البلورية
VDAC1أبكامab34726مضاد VDAC1

المراجع

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Liang, D., et al. Lung Cancer in Never-Smokers: A Multicenter Case-Control Study in North China. Front Oncol. 9, 1354(2019).
  3. Olsson, A., et al. Lung Cancer Risks Associated with Occupational Exposure to Pairs of Five Lung Carcinogens: Results from a Pooled Analysis of Case-Control Studies (SYNERGY). Environ Health Perspect. 132 (1), 017005(2024).
  4. Sato, T., Shimosato, T., Klinman, D. M. Silicosis and lung cancer: current perspectives. Lung Cancer Targets Ther. 9, 91-101 (2018).
  5. Nakano-Narusawa, Y., et al. Single Intratracheal Quartz Instillation Induced Chronic Inflammation and Tumourigenesis in Rat Lungs. Sci Rep. 10 (1), 6647(2020).
  6. Hornung, V., et al. Silica crystals and aluminum salts activate the NALP3 inflammasome through phagosomal destabilization. Nat Immunol. 9 (8), 847-856 (2008).
  7. Dodson, M., et al. Modulating NRF2 in Disease: Timing Is Everything. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 59, 555-575 (2019).
  8. Bae, T., Hallis, S. P., Kwak, M. K. Hypoxia, oxidative stress, and the interplay of HIFs and NRF2 signaling in cancer. Exp Mol Med. 56 (3), 501-514 (2024).
  9. Yamamoto, M., Kensler, T. W., Motohashi, H. The KEAP1-NRF2 System: a Thiol-Based Sensor-Effector Apparatus for Maintaining Redox Homeostasis. Physiol Rev. 98 (3), 1169-1203 (2018).
  10. Weiss-Sadan, T., et al. NRF2 activation induces NADH-reductive stress, providing a metabolic vulnerability in lung cancer. Cell Metabol. 35 (3), 487-503.e7 (2023).
  11. Rojo de la Vega, M., Chapman, E., Zhang, D. D. NRF2 and the Hallmarks of Cancer. Cancer Cell. 34 (1), 21-43 (2018).
  12. Chen, G., et al. n-BuOH extract of Bletilla striata exerts chemopreventive effects on lung against SiO2 nanoparticles through activation of Nrf2 pathway. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 82, 153445(2021).
  13. Song, J., Meng, H., Deng, G., Lin, H. Sustainable Release Selenium Laden with SiO2 Restoring Peripheral Nerve Injury via Modulating PI3K/AKT Pathway Signaling Pathway. Int J Nanomed. 19, 7851-7870 (2024).
  14. Zuo, L., et al. The Nrf2-HMOX1 pathway as a therapeutic target for reversing cisplatin resistance in non-small cell lung cancer via inhibiting ferroptosis. Cell Death Disc. 11 (1), 287(2025).
  15. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
  16. Xu, C., et al. ML385, an Nrf2 Inhibitor, Synergically Enhanced Celastrol Triggered Endoplasmic Reticulum Stress in Lung Cancer Cells. ACS Omega. 9 (43), 43697-43705 (2024).
  17. Qiu, Z., et al. Proteomic characteristics of lung adenocarcinoma tumors that are small but highly invasive. Med Adv. 1 (4), 340-352 (2023).
  18. Christiani, D. C. Occupational Exposures and Lung Cancer. Am J Respirat Crit Care Med. 202 (3), 317-319 (2020).
  19. Requena-Mullor, M., et al. Association between Crystalline Silica Dust Exposure and Silicosis Development in Artificial Stone Workers. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5625(2021).
  20. Wang, Z., et al. Erchen decoction alleviates silicosis by attenuating ferroptosis and fibrosis in alveolar macrophages via modulating the P53/HMOX1 pathway. J Ethnopharmacol. 352, 120227(2025).
  21. Zhou, Y., Zhang, W., Wu, D., Fan, Y. The effect of silica exposure on the risk of lung cancer: A meta-analysis. J Biochem Mol Toxicol. 37 (4), e23287(2023).
  22. Liu, W., et al. Nrf2 Protects Against Oxidative Stress Induced By SiO2 Nanoparticles. Nanomedicine. 12 (19), 2303-2318 (2017).
  23. Li, S., et al. SiO2 particles induce pulmonary fibrosis by modulating NLRP3 through the ROS/Keap1/Nrf2 signaling pathway in rats. Food Chem Toxicol Int J Published Brit Ind Biol Re Associat. 202, 115520(2025).
  24. Wang, G., et al. Nrf2 mediates the effects of shionone on silica-induced pulmonary fibrosis. Chinese Med. 19 (1), 88(2024).
  25. Tian, Y., et al. Nebulized inhalation of LPAE-HDAC10 inhibits acetylation-mediated ROS/NF-κB pathway for silicosis treatment. J Controlled Release. 364, 618-631 (2023).
  26. Baird, L., Yamamoto, M. The Molecular Mechanisms Regulating the KEAP1-NRF2 Pathway. Mol Cell Biol. 40 (13), e00099-e00120 (2020).
  27. Kreß, J. K. C., et al. The integrated stress response effector ATF4 is an obligatory metabolic activator of NRF2. Cell Rep. 42 (7), 112724(2023).
  28. Xie, B., Wang, S., Jiang, N., Li, J. J. Cyclin B1/CDK1-regulated mitochondrial bioenergetics in cell cycle progression and tumor resistance. Can Lett. 443, 56-66 (2019).
  29. Odle, R. I., Florey, O., Ktistakis, N. T., Cook, S. J. CDK1, the Other "Master Regulator" of Autophagy. Trends Cell Biol. 31 (2), 95-107 (2021).
  30. Liu, Y., et al. Hypoxia-induced GPCPD1 depalmitoylation triggers mitophagy via regulating PRKN-mediated ubiquitination of VDAC1. Autophagy. 19 (9), 2443-2463 (2023).
  31. Yuan, M., et al. IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling. Redox Biol. 52, 102289(2022).
  32. Shi, Q., et al. SPOP mutations promote p62/SQSTM1-dependent autophagy and Nrf2 activation in prostate cancer. Cell Death Differentiat. 29 (6), 1228-1239 (2022).
  33. Zheng, Y., et al. Melatonin Alleviates the Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion-Induced Pyroptosis of HEI-OC1 Cells and Cochlear Hair Cells via MT-1,2/Nrf2 (NFE2L2)/ROS/NLRP3 Pathway. Mol Neurobiol. 60 (2), 629-642 (2023).
  34. Cords, L., et al. Cancer-associated fibroblast phenotypes are associated with patient outcome in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 42 (3), 396-412.e5 (2024).
  35. Wu, F., et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer. Nat Comm. 12 (1), 2540(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NRF2 ROS NRF2

مقالات ذات صلة