ML385 يخفف من التقدم الخبيث لخلايا سرطان الرئة الغدي الناجم عن السيليكا من خلال مسار محور الالتهام الذاتي ROS / NRF2

سرطان الرئة الغدي هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم ، حيث يقدر عدد الحالات الجديدة بنحو 2 مليون حالة وفاة 1.76 مليون حالة وفاة كل عام¹. في السنوات الأخيرة ، ارتفع معدل الإصابة بسرطان الرئة الغدي بين الأشخاص الذين لم يدخنوا مطلقا ، والذي قد يكون مرتبطا بعوامل بيئية مثل تلوث الهواء². السيليكا هي ملوث بيئي شائع وقد تم تحديده كعامل ممرض محتمل لسرطان الرئة الغدي^{البشري 3}. يمكن أن تسبب السيليكا التهابا مزمنا مستمرا ، مما يؤدي إلى تسلل البلاعم والخلايا الليمفاوية والعدلات ، وإطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية والعوامل الالتهابية⁴. هذه البيئة المكروية الالتهابية طويلة الأمد تعزز حدوث سرطان الرئة الغدي^5،6. على الرغم من تأكيد الارتباط بين التعرض للسيليكا والسرطان الغدي في الرئة ، إلا أن آليتها الجزيئية المحددة لم يتم توضيحها بالكامل.

يلعب عامل النسخ NRF2 ، المشفر بواسطة جين NFE2L2 ، دورا مهما كمنظم رئيسي في الحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال الخلوية استجابة للإجهاد التأكسدي^7،8. في ظل الظروف العادية ، يتم تصنيف NRF2 وتحللها بواسطة مركب KEAP1-CUL3 ubiquitin ligase. تحت تحفيز الإجهاد التأكسدي أو المواد المحبة للكهرباء ، يتم تثبيط نشاط KEAP1 ، مما يسمح ل NRF2 بالتراكم بثبات ودخول النواة ، وبالتالي ممارسة الدور الدفاعي والتنظيمي للنواة⁹. ومع ذلك ، فإن التنشيط المفرط ل NRF2 في البيئة المكروية للورم قد يعزز تحلل السكر وبقاء الخلايا السرطانية عن طريق وقف تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية وتعزيز مقاومة موت الخلايا المبرمج^10،11. أثبتت الدراسات أن التعرض للسيليكا يمكن أن يؤدي إلى تنشيط غير طبيعي لمسار إشارات NRF2 ^12،13. لذلك ، قد يكون استهداف NRF2 استراتيجية فعالة للتدخل في التطور الخبيث لسرطان الرئة الغدي الناجم عن السيليكا¹⁴.

تهدف هذه الدراسة إلى توضيح ما إذا كان مثبط NRF2 ML385 يمنع التطور الخبيث الناجم عن السيليكا لسرطان الرئة الغدي عن طريق تنظيم مسار محور الالتهام الذاتي ROS / NRF2. أنشأنا نموذج فأر ناتج عن السيليكا لإعادة إنتاج السمات الرئيسية للمرض واستخدمنا طرقا تجريبية في المختبر لدراسة التفاعل بين البلاعم والخلايا السرطانية. وجدنا أن السيليكا تحفز التعبير عن الجزيئات الالتهابية والمناعية وعززت تكوين الورم من خلال مسار محور الالتهام الذاتي ROS / NRF2. عندما تم استخدام مثبط NRF2 (ML385) ، تباطأ التأثير المعزز للسيليكا على تكوين الورم ، مما يشير إلى أن مثبط NRF2 قد يلعب دورا في علاج أورام الرئة التي تسببها السيليكا.

تم الحصول على جميع الكتل المانحة من عينات مرضية أرشيفية تم جمعها بين عامي 2016 و 2018 في مستشفى هوايان الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية. تم إلغاء تحديد العينات قبل استخدامها ومعالجتها وفقا للبروتوكولات المعتمدة. لجنة الأخلاقيات في مستشفى هويان الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية ، KY-2024-250-01. تتبع تربية الفئران التجريبية والتخلص منها وتطبيقها بدقة اللوائح الخاصة بإدارة المختبر والمبادئ التوجيهية الدولية.

بناء نموذج فأر ناتج عن السيليكا
تحضير الفئران وتعليق السيليكا: قم بتربية ذكور الفئران C57BL / 6 ، بعمر 6-8 أسابيع ، في غرفة بدرجة حرارة غرفة 20-25 درجة مئوية ودورة ضوء 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة. لتحضير تعليق غبار السيليكون ، تم وزن 300 مجم من مسحوق غبار السيليكون بدقة وتعليقها في 10 مل من المحلول الملحي المعقم 1x الفوسفات. بعد ذلك ، تم دوامة الخليط بقوة وتذبذب لمدة 5 دقائق ، ثم تمت معالجته بالموجات فوق الصوتية في جهاز الموجات فوق الصوتية للحمام المائي لمدة 30 دقيقة لضمان تشتت موحد للجزيئات ومنع التراكم. التركيز النهائي لهذا المعلق الاحتياطي هو 30 مجم / مل. قم بتعقيمه عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قبل كل استخدام ، من الضروري الدوامة والرج مرة أخرى لمدة 2-3 دقائق لإعادة تعليق أي جزيئات مستقرة.

استنشقت الفئران معلق السيليكا من خلال الأنف. تم استخدام الماصة الدقيقة لإدخال المحلول ببطء وإسقاط في تجويف أنف الفئران. تم تقسيم الفئران إلى 6 مجموعات مع 20 فأرا في كل مجموعة. كان حجم الاستنشاق لكل مجموعة 10 ميكرولتر ، 30 ميكرولتر ، 50 ميكرولتر ، 70 ميكرولتر ، 90 ميكرولتر ، 200 ميكرولتر ، بتركيز 30 مجم / مل ، مرة واحدة يوميا لمدة 40 يوما متتاليا. عند الارتعاش ، أمسك الجلد خلف أذن الفأر بالإبهام والسبابة في اليد اليسرى ، وقم بتثبيت جسم وذيل الماوس بالأصابع الأخرى. تأكد من أن الماوس في وضع ضعيف مع إمالة رأسه قليلا للخلف للسماح باستنشاق المعلق بشكل طبيعي في الجهاز التنفسي. وجدنا أنه لم يكن هناك حدث وفاة بعد اليوم الثاني من استنشاق 10 ميكرولتر و 30 ميكرولتر و 50 ميكرولتر و 70 ميكرولتر من معلق السيليكا في الفئران ، بينما كان هناك حدث وفاة بعد اليوم الثاني من استنشاق 90 ميكرولتر و 200 ميكرولتر من معلق السيليكا في الفئران. لذلك ، كان الحد الأقصى لحجم استنشاق السيليكا في الفئران 70 ميكرولتر في اليوم.

عند التعامل مع السيليكا البلورية ، يجب أن يتم إجراؤها في خزانة السلامة الحيوية أو غطاء الدخان ، ويجب ارتداء أقنعة N95 والنظارات الواقية المقاومة للغبار وقفازات النتريل والملابس الواقية طوال العملية. عند تحضير التعليق ، يجب أن تكون الحركات لطيفة ، ويجب استخدام غرفة الوزن لتجنب توليد الهباء الجوي. يجب جمع جميع النفايات الملامسة للسيليكا في حاويات محكمة الغلق ذات مقاومة للثقب والتخلص منها وفقا للوائح النفايات الكيميائية الخطرة. يمنع منعا باتا مزجها بالقمامة العامة أو سكبها في المجاري. يجب جمع النفايات البيولوجية ، مثل وسط زراعة الخلايا ، في علب قمامة خاصة تحتوي على مطهرات وتعقيمها تحت ضغط عال. يجب وضع جثث وأنسجة في أكياس نفايات بيولوجية وتعقيمها تحت ضغط عال لمعالجة غير ضارة.

تقييم نجاح نموذج الفأر المستحث بالسيليكا. تقييم في نقاط زمنية مختلفة بعد استنشاق السيليكا ، أي في الأيام 3 و 14 و 40. تم وضع الفئران في أجهزة القتل الرحيم الحيوانية الاحترافية ، وتم إدخال ثاني أكسيد الكربون بمعدل تعبئة 30٪ -50٪ حجم / دقيقة. كانوا يتعرضون باستمرار حتى توقفوا عن التنفس. بعد تأكيد الوفاة ، تم تنفيذ عمليات لاحقة. تمت إزالة أنسجة الرئة. تم تثبيت أنسجة الرئة في محلول بارافورمالديهايد 4٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة. بعد التثبيت ، تم تجفيف الأنسجة بالكحول المتدرج ، وجعلها شفافة مع الزيلين ، ثم تم تضمينها في البارافين. تم إجراء المقاطع المستمرة باستخدام آلة تقطيع البارافين بسماكة 4-5 ميكرومتر للتلوين النسيجي اللاحق والتحليل الكيميائي المناعي. لا تتطلب أنسجة الرئة علاج إزالة الكلس. تم إجراء الفحص المرضي لأنسجة الرئة لتقييم توليد النموذج الناجح. كانت معايير نجاح بناء نموذج السحار السيليسي كما يلي: التهاب رئوي كبير ، والتليف ، وحدوث عقيدات السحار السيليسي.

تحليل تسلل الخلايا المناعية في نموذج الفأر الناجم عن السيليكا
تم تلطيخ أنسجة الرئة للفئران في اليوم 14 بعد استنشاق السيليكا بعلامات فلورية تحتوي على CD3e (نسبة التخفيف 1: 200) ، CD8a (نسبة التخفيف 1: 200) ، CD86 (نسبة التخفيف 1: 200) ، F4 / 80 (نسبة التخفيف 1: 200) ، و Nk1.1 (نسبة التخفيف 1: 200) لتصور الخلايا المناعية. قم بإصلاح أقسام الخلايا أو الأنسجة وحظرها باستخدام ألبومين مصل البقر بنسبة 5٪ (BSA) لمدة 1 ساعة لتقليل الارتباط غير المحدد. استخدام مصل طبيعي من نفس أصل النوع مثل الجسم المضاد الحاجب ، وتخفيف المصل باستخدام PBS بنسبة 1:10 ، وإضافة 100 ميكرولتر من المصل المخفف إلى العينة. ثم ، قم بمنع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للمصل بمنع الأجسام المضادة الداخلية. بعد الختم ، اشطفيه برفق 2x باستخدام PBS. الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على CD3e (نسبة التخفيف 1: 200) ، CD8a (نسبة التخفيف 1: 200) ، CD86 (نسبة التخفيف 1: 200) ، F4 / 80 (نسبة التخفيف 1: 200) ، و Nk1.1 (نسبة التخفيف 1: 200) تم تحضينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. بعد الغسيل باستخدام PBS ، تمت إضافة الجسم المضاد الثانوي الفلوري واحتضانه في الظلام لمدة ساعة واحدة.

تلطيخ ماسون والتحليل الكيميائي المناعي
تم إزالة الشمع من أقسام البارافين بالزيلين وترطيبها بالكحول المتدرج ، ثم تم استرجاع المستضد في مخزن سيترات الصوديوم مع درجة الحموضة 6.0 عن طريق المعالجة الحرارية عالية الضغط. للمعالجة الحرارية عالية الضغط ، ضع شرائح الأنسجة المنقوعة في مخزن مؤقت للإصلاح في فرن ميكروويف على نار متوسطة لمدة 8-12 دقيقة. تم حظر نشاط البيروكسيديز الداخلي بمحلول بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 20 دقيقة ، ثم تم حظر موقع الارتباط غير المحدد بنسبة 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف الأجسام المضادة الأولية NRF2 (1: 200) و CDK1 (1: 400) و VDAC1 (1: 500) ، واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسيل 3x باستخدام PBS ، أضف الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب الماعز المضاد للأرانب المسمى ب HRP (1: 500) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. خضعت أقسام البارافين لتلوين DAB ، وتلوين الهيماتوكسيلين ، وشفافية الجفاف ، وختم الجل المحايد للحصول على نتائج الكيمياء المناعية الجزيئية المقابلة. عند استخدام DAB لتطوير اللون ، يجب أن يكون تطور اللون المعتدل أصفر بني إلى بني بني ، ويجب أن تكون الخلفية واضحة. يتطلب كل من تطوير اللون المفرط (البني الداكن) وغير الكافي (الأصفر الفاتح) تحسين وقت تطوير اللون.

تم تحليل درجة التليف الرئوي شبه كميا باستخدام طريقة تسجيل Ashcroft¹⁵: لوحظت أقسام ملطخة بماسون تحت مجهر تكبير 100x ، وتم تقسيم أنسجة الرئة بشكل عشوائي إلى 8 مناطق. تم تسجيل كل منطقة وفقا لدرجة التليف (0-8 نقاط) ، مع النتيجة النهائية هي متوسط جميع المناطق: 0 نقطة (أنسجة الرئة الطبيعية) ، 1-2 نقطة (تليف خفيف) ، 3-4 نقاط (تليف معتدل) ، 5-8 نقاط (تليف شديد).

تم تحليل نتائج الكيمياء المناعية كميا باستخدام برنامج الصورة. تم اختيار خمسة حقول عالية التكبير بشكل عشوائي ، وتم قياس متوسط قيمة الكثافة البصرية (MOD) لكل حقل كمؤشر لمستوى تعبير البروتين.

دراسة تأثير السيليكا و ML385 على الالتهام الذاتي و ROS في خلايا RAW264.7
تمت زراعة كل من خلايا RAW264.7 و A549 (المقدمة من جامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا) باستخدام وسط DMEM عالي الجلوكوز المكمل ب 10٪ مصل أبقار الجنين (FBS) و 1٪ محلول الأجسام المضادة ثنائي النوعية من البنسلين والستربتومايسين. تمت زراعة الخلايا 1 × 10⁷ بشكل موحد في حاضنة بدرجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. تمت إضافة 5 ميكرولتر من معلق السيليكا 30 مجم / مل إلى 1 × 10⁵ خلايا / مل من خلايا RAW264.7. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، تم شطف الخلايا باستخدام PBS 3x ، وتم الكشف عن الالتهام الذاتي والإجهاد التأكسدي بواسطة مجسات ROS و LC3 والليزوزوم. في الوقت نفسه ، ML385¹⁶ ، وهو مثبط ل NRF2 ، تم استخدامه لتثبيط التعبير عن NRF2 (التركيز النهائي ل ML385: 5 ملي مولار / لتر). تم الكشف عن الالتهام الذاتي والإجهاد التأكسدي وفقا للخطوات التجريبية المذكورة أعلاه. تم تحليل الإجهاد التأكسدي وتدفق الالتهام الذاتي للمجموعتين إحصائيا.

التحليل الكيميائي المناعي لتعبيرات VDAC1 و CDK1 و p62 و NRF2 في أنسجة سرطان الرئة الغدي
تم فحص تعبيرات VDAC1 و CDK1 و p62 و NRF2 في 30 مريضا. تم الحصول على الأنسجة المصابة بسرطان الرئة الغدي والأنسجة السليمة المجاورة من مستشفى هوايان الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية وتم تحليلها بواسطة الكيمياء المناعية (IHC). تم تحليل نتائج IHC والتليف الرئوي إحصائيا. جمع بيانات المريض وفقا لمعلومات المريض في نظام المستشفى. الخطوات التجريبية المحددة هي كما يلي: تم إزالة الشمع من أقسام البارافين بالزيلين وترطيبها بالكحول المتدرج ، ثم تم إجراء معالجة المستضد في عازلة سترات الصوديوم بدرجة حموضة 6.0 عن طريق المعالجة الحرارية عالية الضغط. تم حظر نشاط البيروكسيديز الداخلي بمحلول بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 20 دقيقة ، ثم تم حظر موقع الارتباط غير المحدد بنسبة 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف الأجسام المضادة الأولية NRF2 (1: 200) و CDK1 (1: 400) و p62 (1: 500) و VDAC1 (1: 500) ، واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسيل 3x باستخدام PBS ، أضف الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب الماعز المسمى HRP (1: 500) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تطوير لون DAB ، تلطيخ الهيماتوكسيلين ، شفاف مجفف ، ختم اللثة المحايد. عند استخدام DAB لتطوير اللون ، يجب أن يكون تطور اللون المعتدل أصفر بني إلى بني بني ، ويجب أن تكون الخلفية واضحة. يتطلب كل من تطوير اللون المفرط (البني الداكن) وغير الكافي (الأصفر الفاتح) تحسين وقت تطوير اللون.

تحليل هجرة الخلايا والغزو
تمت دراسة تأثير ML385 والطافية من الحضانة المشتركة للسيليكا مع خلايا RAW264.7 على هجرة الخلايا وغزوها بعد احتضانها مع خط خلايا سرطان الرئة الغدي A549. تمت إضافة المادة الطافية لخلايا RAW264.7 المزروعة بالسيليكا لمدة 24 ساعة إلى خلايا A549. تم تقسيم الخلايا إلى مجموعة السيليكا ، ومجموعة السيليكا + ML385 ، ومجموعة PBS. مجموعة السيليكا: تمت إضافة 5 ميكرولتر من 30 مجم / مل من معلق السيليكا إلى 1 × 10⁵ خلايا / مل من خلايا RAW264.7. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية للخلية لاستخدامها لاحقا. تمت إضافة مجموعة السيليكا + ML385: 5 ميكرولتر من 30 مجم / مل من معلق السيليكا وتركيز نهائي قدره 5 ملي مولار / لتر ML385 إلى 1 × 10⁵ خلايا / مل من خلايا RAW264.7. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية للخلية لاستخدامها لاحقا. مجموعة PBS: تمت إضافة 5 ميكرولتر من PBS إلى 1 × 10⁵ خلايا / مل من خلايا RAW264.7. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية للخلية لاستخدامها لاحقا. أثناء فحص الخدش ، تم زرع خلايا A549 لأول مرة في ألواح مكونة من 12 بئرا بكثافة 5 × 10⁵ لكل بئر. بعد أن نمت الخلايا إلى 95٪ -100٪ اندماج ، تم عمل خدوش على الخلايا أحادية الطبقة باستخدام طرف ماصة معقمة 200 ميكرولتر. تم غسل الخلايا المقشرة برفق باستخدام برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، تم تغيير ظروف الاستزراع لتشمل 1٪ من الوسط الأساسي FBS والمواد الطافية لكل مجموعة معالجة للحفاظ على بقاء الخلية خلال الفترة التجريبية التي استمرت 7 أيام. تم جمع صور من نفس الموضع تحت مجهر مقلوب في 0 ساعة (اليوم 0) وفي اليوم السابع (اليوم 7) بعد الخدش ، على التوالي. أخيرا ، تم تحليل منطقة الخدش كميا ، وتم حساب معدل إغلاق الخدش باستخدام برنامج ImageJ لتقييم تأثير المادة الطافية من مجموعات العلاج المختلفة على قدرة ترحيل خلايا A549.

في الخلايا التي تمر عبر مسام ذات مقايسة غزو بحجم معين ، تم استخدام غرفة غشاء من البولي كربونات 8 ميكرومتر ، مع غشاء الغرفة العلوية المطلي مسبقا بهلام يحاكي البيئة خارج الخلية المخففة بنسبة 1: 8 لبناء حاجز غشاء قاعدي. تم تعليق خلايا A549 في معلق مصنوع عن طريق خلط وسط خال من المصل مع المواد الطافية لكل مجموعة معالجة بنسبة 1: 1 ثم تلقيحها في الغرفة العلوية (2 × 10⁴ خلايا لكل غرفة). في الحجرة السفلية ، تمت إضافة محلول مصنوع عن طريق خلط وسط يحتوي على 20٪ FBS مع المواد الطافية لمجموعات المعالجة المقابلة (مجموعة السيليكا + ML385 ، مجموعة السيليكا ، ومجموعة PBS) بنفس النسبة كجاذب كيميائي. تم جمع المواد الطافية لمجموعات العلاج المقابلة عن طريق الشفط من خلال مسدس ماصة في RAW264.7 بلعمة خلية السيليكا. بعد أن تم تحضين الخلايا بشكل مستمر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 7 أيام ، تمت إزالة الخلايا غير الغازية في الغرفة العلوية بمسحات قطنية ، وتم تثبيت الخلايا التي اخترقت الغشاء ووصلت إلى الغرفة السفلية بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد وملطخة ب 0.1٪ بنفسجي بلوراي. أخيرا ، تم اختيار عدد الخلايا الغازية بشكل عشوائي من 5 مجالات رؤية بواسطة مجهر ضوئي.

تحليل تأثير السيليكا و ML385 على موت الخلايا المبرمج لخلايا A549 باستخدام قياس التدفق الخلوي
تحضير الخلايا وتجميعها: تم جمع خلايا A549 المعالجة بالمواد الطافية لكل مجموعة معالجة (مجموعة PBS ، مجموعة السيليكا ، مجموعة السيليكا + ML385). تم غسل الخلايا برفق 2x باستخدام PBS المبرد مسبقا ، ثم أعيد تعليقها في مخزن مؤقت للربط 1x ، وتم تعديل كثافة الخلية إلى 1 × 10⁶ خلايا لكل أنبوب / 100 ميكرولتر. بعد ذلك ، تمت إضافة 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC و 5 ميكرولتر من محلول تلطيخ PI إلى تعليق الخلية ، وتم دوامها برفق للخلط ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، تمت إضافة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 1x إلى كل أنبوب واختباره على الفور على الجهاز. تم الكشف باستخدام مقياس التدفق الخلوي. متحمسا لليزر 488 نانومتر ، تم جمع إشارة التألق ل Annexin V-FITC من خلال قناة FITC ، وتم جمع إشارة التألق ل PI من خلال قناة PE. قبل التجربة ، تم استخدام عينات تلطيخ واحد لتعديل تعويض التألق للقضاء على التداخل الطيفي. عند إجراء تحليل البيانات ، حدد أولا مجموعة الخلايا المستهدفة في مخطط تشتت FSC-A / SSC-A وتخلص من الأجزاء. بعد ذلك ، تم استبعاد التصاقات الخلايا باستخدام مخطط تشتت FSC-H / FSC-A. أخيرا ، تم إنشاء بوابة للتمييز بين الخلايا الحية ، والخلايا المبرمج المبكرة ، والخلايا المبرمج / النخرية المتأخرة ، والخلايا التالفة ميكانيكيا. تم الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام برنامج FlowJo V10.

نموذج فأر السيليكا
في الشكل 1 ، تم إعطاء الفئران السيليكا عن طريق الأنف بجرعة 30 مجم / مل و 70 ميكرولتر لمدة 40 يوما متتاليا ، مما يضمن عدم حدوث أي أحداث وفاة في الفئران ويمكن إنشاء نموذج فأر السيليكا بنجاح. وفي الوقت نفسه ، تم استخدام تزقيم الفئران مع برنامج تلفزيوني كضوابط سلبية. كان الهدف هو القضاء على تأثير العملية والمذيب نفسه والتأكد من أن النمط الظاهري ناتج عن السيليكا على وجه التحديد. يوفر النسخ المتماثل الناجح لنموذج إصابة الرئة الناجم عن السيليكا أساسا ضروريا في الجسم الحي للبحث اللاحق حول آلية تقدم الأورام الخبيثة والتدخل الدوائي.

تحليل تسلل الخلايا المناعية في عقيدات الفئران التي تسببها السيليكا
في الشكل 2 ، من خلال الكشف عن تسلل الخلايا المناعية في عقيدات فئران السيليكا ، وجد أن هناك عددا كبيرا من تسلل الخلايا المناعية (خلايا CD3e + و CD8a + و CD86 + و F4 / 80 + و Nk1.1 +) في العقيدات ، والتي شاركت في تكوين وتطور مرض السيليكا الرئوي. يشير هذا إلى أن السيليكا تحفز بيئة مكروية للورم الالتهابي المستمر ، وهو عامل تعزيز رئيسي لحدوث الورم وتطوره ، وكذلك الأساس الفيزيولوجي المرضي لمشاركة مسار ROS / NRF2.

العلاقة بين التليف الرئوي الناجم عن السيليكا و NRF2 و CDK1 و VDAC1 في الفئران
من خلال الكشف عن التعبير عن الجزيئات المناعية في العقيدات ، وجد أن NRF2 (الهدف المثبط ML385) و CDK1 (المرتبط بدورة الخلية) و VDAC1 (المتورط في الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا) تم التعبير عنها بشكل كبير حول العقيدات وداخلها وكانت مرتبطة بالتليف الرئوي (الشكل 3).

تأثير السيليكا و ML385 على الالتهام الذاتي و ROS في خلايا RAW264.7
من خلال الزراعة المشتركة لخلايا السيليكا و RAW264.7 ، وجد أن السيليكا يمكن أن تحفز إنتاج البلعمة الذاتية. بعد 24 ساعة من الثقافة ، تم تقليل التوطين المشترك للبلعمة الذاتية والليزوزوم ، وتم تثبيط تدفق الالتهام الذاتي ، كما تم تقليل إنتاج ROS. عندما تمت إضافة ML385 (مثبط NRF2 ) ، تم تعزيز التوطين المشترك للبلعمة الذاتية والليزوزوم ، كما تم تحسين تدفق الالتهام الذاتي ، كما تمت زيادة ROS وفقا لذلك (الشكل 4).

تحليل تعبيرات VDAC1 و CDK1 و p62 و NRF2 في أنسجة سرطان الرئة الغدي بواسطة IHC
كما هو موضح في الشكل 5 ، يتم التعبير عن NRF2 (هدف مثبط ل ML385) و CDK1 (المتعلق بدورة الخلية) و VDAC1 (المتورط في الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا) و p62 (المشاركة في الالتهام الذاتي) بشكل كبير في أنسجة سرطان الرئة الغدي وتظهر اختلافات كبيرة مقارنة بالأنسجة المجاورة.

تأثير ML385 والطافية من الحضانة المشتركة للسيليكا مع خلايا RAW264.7 على هجرة خلايا A549 وغزوها
يمكن أن تعزز مادة السيليكا و RAW264.7 الطافية لزراعة الخلايا هجرة وتكاثر خلايا A549 ، بينما يمكن ل ML385 أن تثبط هذه العمليات بشكل كبير (كما هو موضح في الشكل 6). تشير هذه النتيجة إلى أن التأثير المعزز للورم للبيئة المكروية للبلاعم التي تسببها السيليكا يعتمد على مسار NRF2 . يمكن أن يؤدي تثبيط NRF2 إلى منع هذا التأثير المعزز للورم بشكل فعال ، وبالتالي تقليل التطور الخبيث للخلايا السرطانية.

تأثير السيليكا و ML385 على موت الخلايا المبرمج لخلايا A549
يوضح الشكل 7 أن مادة السيليكا والطافية لزراعة الخلايا RAW264.7 لها تأثير مثبط معين على موت الخلايا المبرمج للخلايا A549 ، ويمكن أن يعزز ML385 موت الخلايا المبرمج للخلايا A549.

كشفت هذه الدراسة عن المسار الميكانيكي الذي يعزز من خلاله التعرض للسيليكا التطور الخبيث لسرطان الرئة الغدي من خلال محور ROS / NRF2 / الالتهام الذاتي باستخدام كل من الطرق في الجسم الحي وفي المختبر . أكدت التجارب التي أجريت على أن الجزيئات الرئيسية لمسار إشارات NRF2 يتم تنشيطها بشكل كبير في البيئة المكروية للتليف الرئوي الناجم عن السيليكا. أظهرت تجارب الخلايا أن السيليكا تمنع بشكل مباشر التدفق الذاتي في البلاعم وتقلل من مستويات ROS ، ويمكن عكس هذا التأثير على وجه التحديد بواسطة مثبط NRF2 ML385. أظهرت دراسات الآلية أن البلاعم المعالجة بالسيليكا تعزز هجرة وغزو وتثبيط موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان الرئة الغدي عن طريق إفراز العوامل ، وهذا التأثير المعزز للورم يعتمد كليا على تنشيط مسار NRF2.

توفر البيانات:
يتم تضمين مجموعات البيانات التي تدعم اختتام هذه المقالة في المقالة.

الشكل 1: بناء نموذج السيليكا في الفئران. (أ) عالج الفئران باستنشاق السيليكا من الأنف (30 مجم / مل) بأحجام مختلفة (10 ميكرولتر ، 30 ميكرولتر ، 50 ميكرولتر ، 70 ميكرولتر ، 90 ميكرولتر ، 200 ميكرولتر). 20 فأر لكل جرعة استنشاق. (ب) منحنى بقاء الفأر. الحد الأقصى لكمية الاستنشاق هو 70 ميكرولتر / يوم. (ج) نتائج الملاحظة لتلوين HE النسيجي المرضي في الرئة في الفئران من مجموعة السيليكا ومجموعة PBS في اليوم 3 واليوم 14 واليوم 40. (د) النتائج الإحصائية لعدد العقيدات الرئوية التي لوحظت في الفئران تحت التكبير المنخفض ، اختبار t ، *** p <0.001 ، p = 0.004 ، t = 10.61 (اليوم 14) ، p = 0.0006 ، t = 10.02 (اليوم 40). ن = 9. تظهر أشرطة الخطأ خطأ قياسيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مراقبة تسلل الخلايا المناعية في الأنسجة العقدية للفئران من خلال تلطيخ التألق. تسلل عال للخلايا المناعية (CD3e + و CD8a + و CD86 + و F4 / 80 + و NK1.1 +) في عقيدات العقيدات الرئوية التي تسببها السيليكا في الفئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحليل العلاقة بين تعبيرات NRF2 و CDK1 و VDAC1 والتليف الناجم عن السيليكا من خلال الكيمياء المناعية (IHC) وتلوين ماسون. (أ) تعبيرات NRF2 و CDK1 و VDAC1 ونتائج تلطيخ ماسون. (ب) نتائج المركز الدولي للخدمات الإنسانية. (ج) تم إجراء تحليل إحصائي للتليف الرئوي بين مجموعة السيليكا ومجموعة PBS من الفئران. اختبار تي ، *** ص <0.001 ، ص = 0.0002 ، ر = 13.42 (NRF2) ، ص = 0.0008 ، ر = 9.247 (CDK1) ، ص = 0.0009 ، ر = 8.944 (VDAC1) ، ص = 0.0003 ، ر = 11.76 (تليف رئوي). ن = 9. تظهر أشرطة الخطأ خطأ قياسيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تأثير السيليكا على الالتهام الذاتي في خلايا RAW264.7 وتأثير تنظيم الالتهام الذاتي لمثبط NRF2 ML385. (أ) بعد احتضان السيليكا مع خلايا RAW264.7 لمدة 24 ساعة ، انخفض التوطين المشترك للبلعمة الذاتية (LC3) والجسيمات الحالة (أخضر). ومع ذلك ، عند إضافة ML385 ، زاد التوطين المشترك للبلعمة الذاتية والجسيمات الحالة (أصفر). (ب) بعد احتضان السيليكا مع خلايا RAW264.7 لمدة 24 ساعة ، انخفض ROS الناتج عن مجموعة السيليكا ، لكنه زاد بعد إضافة ML385. (ج) التحليل الإحصائي لتدفق ROS والالتهام الذاتي للمجموعتين ، اختبار t ، *** p <0.001 ، ص = 0.0005 ، ر = 10.59 (ROS) ، ص <0.0001 ، ر = 17.08 (البلعمة الذاتية). ن = 6. تظهر أشرطة الخطأ خطأ قياسيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التحليل الكيميائي المناعي لتعبيرات VDAC1 و CDK1 و p62 و NRF2 في أنسجة سرطان الرئة الغدي البشري. (أ) التعبيرات التفاضلية (VDAC1 و CDK1 و p62 و NRF2) بين أنسجة سرطان الرئة الغدية البشرية والأنسجة غير السرطانية المجاورة. (ب) التحليل الإحصائي للتعبير التفاضلي بين 30 حالة من حالات السرطان والأنسجة غير السرطانية المجاورة من مستشفى هوايان الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية ، اختبار t ، *** ص <0.001 ، ص <0.0001 ، ر = 8.322 (CDK1) ، ص <0.0001 ، ر = 16.4 (NRF2) ، ص <0.0001 ، ر = 15.47 (ص 62) ، ص <0.0001 ، ر = 17.75 (VDAC1). ن = 30. تظهر أشرطة الخطأ خطأ قياسيا. (ج) التحليل الإحصائي للتليف في أنسجة سرطان الرئة الغدي والأنسجة غير السرطانية المجاورة ، اختبار t ، *** ص <0.001 ، ص = 0.0009 ، ر = 8.854 (التليف). ن = 30. تظهر أشرطة الخطأ خطأ قياسيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تأثير ML385 والطافية من الحضانة المشتركة للسيليكا مع خلايا RAW264.7 على هجرة الخلايا وغزوها بعد احتضانها مع خط خلية سرطان الرئة الغدي A549. (أ) ينتج خدش الخلية في اليوم 0 واليوم 7 بعد الحضانة المشتركة للمادة الطافية و ML385 مع خلايا A549. (ب) النتائج الغازية للخلايا في اليوم 7 بعد الحضانة المشتركة للمادة الطافية و ML385 مع خلايا A549. (ج) إجراء تحليل إحصائي لنتائج فحص خدش الخلية. * ص <0.05 ، ** ص <0.01. اختبار t ، ص = 0.0020 ، ر = 22.43 (السيليكا + ML385 مقابل السيليكا) ، ص = 0.0135 ، ر = 8.510 (السيليكا + ML385 مقابل PBS) ، ص = 0.0143 ، ر = 8.281 (السيليكا مقابل PBS). ن = 6. تظهر أشرطة الخطأ خطأ قياسيا. (د) إجراء تحليل إحصائي لنتائج الفحص الغازي للخلايا. * ص <0.05 ، ** ص <0.01 ، اختبار تي ، ص = 0.0097 ، ر = 10.06 (السيليكا + ML385 مقابل السيليكا) ، ص = 0.0472 ، ر = 4.437 (السيليكا + ML385 مقابل PBS) ، ص = 0.0125 ، ر = 8.857 (السيليكا مقابل PBS). ن = 6. تظهر أشرطة الخطأ خطأ قياسيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: تحليل تأثير السيليكا و ML385 على موت الخلايا المبرمج لخلايا A549 من خلال قياس التدفق الخلوي. (أ) الكشف عن نتائج موت الخلايا المبرمج لخلايا A549 من خلال قياس التدفق الخلوي. (ب) إجراء تحليل إحصائي للنسبة المئوية للخلايا المبرمج. * ص <0.05 ، ** ص <0.01 ، اختبار تي ، ص = 0.0013 ، ر = 27.29 (السيليكا + ML385 مقابل السيليكا) ، ص = 0.0022 ، ر = 6.973 (السيليكا + ML385 مقابل PBS) ، ص = 0.0048 ، ر = 5.649 (السيليكا مقابل PBS). ن = 6. تظهر أشرطة الخطأ خطأ قياسيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.