يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير الفلوري الكمي لعدوى فيروس ألفا من أجل فحوصات مضادات الفيروسات

64 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69384

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يُقدم هذا البحث بروتوكولاً قوياً وقابلاً للتكيف للتصور المستمر لإصابات الفيروسات الألفاوية (alphavirus). ويوفر هذا البروتوكول منهجاً لاستقصاء تضاعف الفيروسات الألفاوية وتقييم فعالية المركبات المضادة للفيروسات على المستوى الخلوي استناداً إلى التصوير الفلوري.

الملخص

يوفر المجهر الفلوري نهجاً عالي الحساسية ومتعدد الاستخدامات لاستقصاء عدوى الفيروسات الألفاوية (alphavirus) على المستوى الخلوي. ومن خلال دمج الفيروسات الموسومة فلورياً مع تحليل الصور الكمي، تتيح هذه الطريقة توصيفاً مكانياً وزمنياً مفصلاً لديناميكيات العدوى، بما في ذلك الكشف عن الاختلافات الدقيقة في حركية التضاعف والانتشار من خلية إلى أخرى. ويتمثل الهدف المركزي لهذا البروتوكول في تطبيقه في فحوصات مسح مضادات الفيروسات. حيث يوفر التحديد الكمي لشدة الفلورة القائم على الصور وسيلة قوية وقابلة للتكرار لتقييم فعالية المركبات المضادة للفيروسات، مما يسمح بالكشف المبكر والحساس عن التأثيرات المثبطة في الخلايا المصابة. وهذا يسهل تحديد النتائج الواعدة للمضادات الفيروسية ويدعم تقييم الاستجابات المعتمدة على الجرعة. كما أن هذا النهج مناسب تماماً للدراسات المقارنة لسلالات الفيروسات الألفاوية المختلفة أو الطفرات، حيث تصبح الاختلافات في سلوك التضاعف وأنماط الانتشار واضحة بسهولة. وبفضل مرونته، وتوافقه مع خطوط خلوية متعددة، وتكامله المباشر في منصات التصوير الآلية، تصبح هذه الطريقة قابلة للتوسع ومناسبة لحملات المسح عالية الإنتاجية. وبشكل عام، يساهم هذا البروتوكول في تطوير اكتشاف وتقييم الاستراتيجيات المضادة للفيروسات. ونظراً لأن العديد من الفيروسات الألفاوية تسبب أمراضاً بشرية وبيطرية خطيرة، وتفتقر إلى علاجات مضادة للفيروسات معتمدة، وتستمر في التوسع جغرافياً مع ظهور فاشيات جديدة، فإن تحديد مضادات فيروسية جديدة يظل أولوية ملحة. وبناءً على ذلك، يمثل سير العمل القائم على الفلورة مساهمة قيمة وفي وقتها لأبحاث الفيروسات الألفاوية الحديثة.

المقدمة

تعد الفيروسات الألفاوية (Alphaviruses) فيروسات غشائية ذات حمض ريبونوكليك (RNA) أحادي السلسلة وموجب الاتجاه، وتنتمي إلى عائلة Togaviridae1,2,3. وتنتقل هذه الفيروسات بشكل أساسي عن طريق البعوض، وهي مسؤولة عن مجموعة من الأمراض التي تصيب البشر والحيوانات. ويشمل جنس الفيروسات الألفاوية عدة فيروسات ذات أهمية طبية، مثل فيروس شيكونغونيا (CHIKV)، وفيروس سيندبيس، وفيروس التهاب الدماغ والنسيج الشبكي الخيلي الشرقي، وفيروس التهاب الدماغ والنسيج الشبكي الخيلي الفنزويلي4,5. وتسبب هذه المسببات المرضية أعراضاً تتراوح بين الأمراض الحمية والطفح الجلدي وصولاً إلى المضاعفات العصبية الشديدة6. ومما يثير القلق أن فيروس CHIKV قد عاود الظهور كشأن صحي عام رئيسي؛ فمنذ بداية عام 2025 وحده، تم الإبلاغ عن أكثر من 220,000 حالة في 14 دولة، مما أدى إلى وفاة 80 شخصاً على الأقل7. ورغم انخفاض معدل الوفيات، إلا أن نسبة كبيرة من المصابين يعانون من آلام مفاصل مزمنة، مما قد يؤدي إلى إعاقة طويلة الأمد وانخفاض في القدرة على الحركة8. ولتطوير استراتيجيات مضادة للفيروسات وموجهة، من الضروري التوصل إلى فهم أكثر شمولاً لعملية تضاعف الفيروسات الألفاوية والتفاعلات بين المضيف والممرض. وفي الوقت ذاته، تظهر بعض الفيروسات الألفاوية، مثل فيروس غابة سيمليكي (SFV)، إمراضية منخفضة لدى البشر، على الرغم من اشتراكها في تشابه جيني وهيكلي كبير مع الفيروسات الألفاوية الأكثر ضراوة. وهذا يجعل SFV نموذجاً مثالياً لدراسة الفيروسات الألفاوية دون تشكيل خطر كبير على صحة الإنسان9,10,11.

تُعد المقايسات التقليدية مثل مقايسات اللويحات (plaque assays)، ومقايسة الجرعة المعدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50% (TCID50)، وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ذات قيمة عالية في تقدير العيارات الفيروسية والتعبير الجيني، ولكنها تقتصر على قياسات نقطة النهاية وتتطلب تحلل الخلايا أو تثبيتها. ونتيجة لذلك، لا يمكنها رصد ديناميكيات العدوى مباشرة داخل الخلايا نفسها بمرور الوقت12,13. ولمعالجة هذه القصور، يوفر التصوير الفلوري في الوقت الحقيقي نهجاً قوياً وغير مدمر لمراقبة حركية العدوى عبر نقاط زمنية متعددة. كما أن استخدام الفيروسات الموسومة فلورياً، مثل SFV الموسوم بـ mCherry، يتيح التصوير المباشر والتقدير الكمي لإشارة الفيروس المراسل وانتشاره في الخلايا الحية14,15. ولإجراء التجارب الموصوفة هنا، تم استخدام خطوط خلوية شائعة الاستخدام في أبحاث الفيروسات المنقولة بالمفصليات. وتُعد خلايا U4.4، المشتقة من يرقات Aedes albopictus، خلايا بعوض تدعم التضاعف الفعال للعديد من الفيروسات المنقولة بالمفصليات وتسهل الدراسات المتعلقة بالتفاعلات بين الناقل والفيروس16,17. وبالتوازي مع ذلك، توفر خلايا BHK-21، وهي خط خلوي ثديي شبيه بالأرومات الليفية مشتق من نسيج كلية هامستر صغير، نظام عائل فقاري يسمح بالعدوى ويُستخدم بشكل متكرر لإكثار الفيروسات ومقايسات علم الفيروسات الجزيئي18.

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل مراقبة تعبير المراسل الفيروسي وتوصيف المركبات المضادة للفيروسات، باستخدام مثبطات الفوران كمثال. الفوران هو إنزيم تحويل البروتين الأولي الموجود في العديد من حقيقيات النوى، ويلعب دوراً رئيسياً في تفعيل طلائع عوامل النمو، والهرمونات، وميتالوبروتيناز المصفوفة، وبروتينات البلازما، والمستقبلات19,20. وتستغل العديد من الفيروسات الألفاوية الفوران لشطر وتفعيل بروتيناتها السطحية، وهي خطوة حاسمة للتكاثر الناجح20. ومثبطات الفوران هي مركبات مصممة تركيبياً تعمل على حجب نشاط الفوران، وبالتالي تقليل التكاثر الفيروسي21,22,23. ونظراً لمحدودية توفر البروتوكولات الموحدة للتحليل القائم على المجهر الفلوري الآلي لإصابات الفيروسات الألفاوية باستخدام قارئ متعدد الأوضاع لتصوير الخلايا، يتم توفير سير عمل مفصل لتوصيف المركبات المضادة للفيروسات في خلايا aedine. يوضح البروتوكول خطوات زراعة الخلايا، وإنتاج الفيروس، والعدوى، والمعالجة بمركب مضاد للفيروسات (مثبط الفوران)، والتصوير الفلوري، وتحليل الصور. ومع ذلك، يمكن تكييف الطرق الموصوفة هنا بسهولة مع فيروسات أخرى وعلامات فلورية بديلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. السلامة البيولوجية

ملاحظة: إن فيروس غابة سيمليكي المسمى بـ mCherry المعاد تركيبه (SFV-mCherry) والمستخدم في هذا البروتوكول معدل وراثياً24,25,26. وبسبب دمج جين مراسل فلوري، يُصنف هذا الفيروس ككائن معدل وراثياً، مما يجعله خاضعاً لمتطلبات تنظيمية واحتوائية إضافية. قد يتطلب العمل الذي يتضمن فيروسات ألفا أخرى، ولا سيما الفيروسات الأكثر إمراضية مثل CHIKV، تصاريح واحتواءات إضافية.

  1. نظف كابينة السلامة البيولوجية باستخدام مطهر مناسب وقم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 min على الأقل قبل وبعد إجراء المقايسات الفيروسية.
  2. تخلص من جميع المواد الملوثة وفقًا للوائح السلامة البيولوجية المحلية. اجمع النفايات الصلبة والسائلة بشكل منفصل في حاويات قابلة للتعقيم بالبخار (autoclavable) وقم بتعقيمها بجهاز autoclave قبل التخلص منها.

2. تحضير المركبات المضادة للفيروسات

ملاحظة: تُعد مثبطات الفوران MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide)، وMI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide)، وMI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide) المستخدمة في هذه الدراسة، أمثلة على المركبات المضادة للفيروسات التي تم اختيارها للاختبار. وقد استُخدم مثبط الفوران MI-1148 كعنصر تحكم سلبي في مقايسة السمية الخلوية وكعنصر تحكم إيجابي في المقايسة المضادة للفيروسات.

  1. أذِب المركبات المضادة للفيروسات في مذيب مناسب. استخدم الماء المعقم قدر الإمكان لتجنب التأثيرات السامة للخلايا. يمكن استخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو الميثانول بتركيز أقصاه 2% (v/v). ويوصى باستخدام محلول مخزون بتركيز 10 mM في الماء المعقم.
  2. خزّن المحاليل المخزونة عند درجة حرارة -20 °C، وذلك بناءً على الاستقرار والقابلية للذوبان، ما لم تحدد الشركة المصنعة خلاف ذلك.

3. زراعة الخلايا

  1. قم بزراعة خلايا U4.4 في وسط Leibovitz's L-15 المدعم بـ 10% مصل جنين البقري (FBS)، و1% من الأحماض الأمينية غير الأساسية لوسط MEM، و1% من مرق تريبتوز الفوسفات، و1% جلوتامين، و1% بنسلين/ستريبتومايسين (Pen/Strep) (كثافة الاستزراع: حوالي 1 × 106 خلية/قارورة T25، حجم المزرعة: 5 mL). حافظ على الخلايا عند درجة حرارة 28 °C. قم بتمرير خلايا U4.4 بنسبة 1:6 مرة واحدة أسبوعياً، مع تعديل كثافات الاستزراع وفقاً للاحتياجات التجريبية.
    ملاحظة: تتوافق سلالات خلوية إضافية، مثل خلايا C6/36، مع هذا البروتوكول أيضاً. ويمكن استخدام أوساط ومكملات بديلة حسب الاقتضاء. كما أن إضافة المضادات الحيوية اختيارية ويمكن الاستغناء عنها.
  2. قم بزراعة خلايا كلية الهامستر الصغير (BHK-21) في وسط Dulbecco's Modified Eagle's Medium المدعم بـ 10% FBS، و1% جلوتامين أو التوازن الساكن، ΣFx=0، رسم بياني، تحليل توازن القوة، مخطط الاستقرار الميكانيكي.‑alanyl‑التوازن الساكن، ΣFx=0، رسم بياني، تحليل توازن القوة، مخطط الاستقرار الميكانيكي.‑glutamine، و1% Pen/Strep (كثافة الاستزراع: حوالي 1 × 106 خلية/قارورة T75، حجم المزرعة: 10 mL). حافظ على الخلايا عند درجة حرارة 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO2. قم بتمرير الخلايا بنسبة 1:12 كل 4-5 أيام، مع إمكانية تعديل كثافات الاستزراع حسب المتطلبات.
  3. تأكد من بقاء الخلايا صحية وتتكاثر بنشاط.

4. إنتاج الفيروس

  1. تحضير مخزونات SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) في خلايا BHK-21.
    1. زراعة خلايا BHK-21 (كثافة الاستزراع: حوالي 1 × 105 خلية/بئر، حجم المزرعة: 500 µL) في طبق زراعة خلايا شفاف بـ 24 بئراً تحت الظروف الموضحة أعلاه.
    2. عند وصول درجة التلاقي إلى 90% تقريباً (التلاقي المستهدف: حوالي 2 × 105 خلية)، يتم ترنسفكشن خلايا BHK-21 باستخدام بلازميد SFV6-2SG-mCherry بواسطة كاشف ترنسفكشن في وسط عدوى (DMEM مضاف إليه 1% Pen/Strep و 0.2% bovine serum albumin). ولذلك، يتم تخفيف 1 µL من كاشف الترنسفكشن في 25 µL من وسط منخفض المصل.
    3. في أنبوب منفصل، يتم تخفيف 0.5 µg من DNA البلازميد و 1 µL من مادة مضافة مملوكة في 25 µL من وسط منخفض المصل. تضاف محلول DNA المخفف إلى المحلول الذي يحتوي على كاشف الترنسفكشن المخفف، ويُحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تضاف 50 µL من المعقد الناتج إلى الخلايا.
      ملاحظة: يمكن استخدام كواشف ترنسفكشن أخرى، شريطة أن تكون متوافقة مع خط الخلايا المحدد، وقد تختلف التعليمات حسب الكاشف المستخدم.
    4. بعد 48 ساعة من الترنسفكشن، يتم جمع السائل العلوي المحتوي على الفيروس باستخدام ماصة، وتقسيمه إلى حصص بحجم 250 µL في أنابيب خالية من DNA/RNA، وتخزينها عند -80 °C.
  2. المعايرة بواسطة مقايسة TCID50.
    1. زراعة خلايا BHK-21 (كثافة الاستزراع: حوالي 2 × 104 خلية/بئر، حجم المزرعة: 100 µL) في طبق أسود مخصص للتصوير بـ 96 بئراً تحت الظروف الموضحة أعلاه.
    2. إذابة حصة من الفيروس، وتحضير تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف لعينة الفيروس في أوساط العدوى (15 µL عينة فيروس + 135 µL وسط عدوى)، والتخلص من الوسط القديم، ثم إضافة 100 µL من التخفيفات إلى الخلايا.
    3. تحضين الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% CO₂، ومن ثم استبدال اللقاح بـ 100 µL من وسط عدوى جديد.
    4. بعد 48 ساعة من العدوى (hpi)، يتم تقييم التضاعف الفيروسي عن طريق قياس الفلورة باستخدام قارئ أطباق متعدد الأنماط للتصوير (وصف تفصيلي في القسم 7) وتحديد التأثير المرضي الخلوي الناتج عن العدوى الفيروسية. تُحسب قيمة TCID50 بناءً على طريقة Reed-Muench28 وتُحول إلى عيارات فيروسية تقديرية (PFU/mL) باستخدام تقريب Poisson القياسي الذي يعتبر أن 1 TCID50 تعادل 0.7 PFU.

5. تحديد السمية الخلوية

  1. قم بزراعة خلايا U4.4 (كثافة الاستزراع: حوالي 3 × 104 خلية/بئر، حجم الاستزراع: 100 µL) في طبق زراعة خلايا شفاف مكون من 96 بئرًا تحت الظروف الموصوفة أعلاه.
    ملاحظة: تم استزراع الخلايا في الآبار الخارجية (الصفوف A و H؛ والأعمدة 1 و 12) ولكن تم استبعادها من التحليل التجريبي لتجنب تأثيرات الحواف، بما في ذلك زيادة التبخر.
  2. عند وصول الخلايا إلى درجة تلاقي 90% (درجة التلاقي المستهدفة: حوالي 6 × 104 خلية)، عـالج الخلايا بتركيزات 100 و 50 و 25 و 12.5 µM من مثبطات الفوران MI-1130 و MI-1131 في حجم إجمالي قدره 100 µL. أضف MI-1148 (بنفس تركيزات MI-1130 و MI-1131)، وخلايا غير معالجة، وخلايا معالجة بالماء كضوابط سلبية، والـ ionomycin (بتركيز 100 µM في المقايسة) كضابط إيجابي للسمية الخلوية.
  3. بعد 48 ساعة من المعالجة (hpt)، قم بتقييم حيوية الخلايا باستخدام مقايسة مضيئة تعتمد على تقدير كمية ATP. أضف حجمًا مساويًا من كاشف المقايسة المضيئة إلى كل بئر (بنسبة 1:1 بالنسبة لوسط الاستزراع)، ورج الطبق لمدة 2 min لضمان تحلل الخلايا، ثم قم بالحضانة لمدة 10 min في الظلام قبل قياس اللمعان.
    ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام مقايسات أخرى لحيوية الخلايا تعتمد على مبادئ كشف مختلفة.
  4. سجل اللمعان في طبق 96 بئرًا أسود أو أبيض باستخدام القارئ متعدد الأنماط.

6. العدوى الفيروسية والمعالجة بمركب مضاد للفيروسات

  1. قم بزراعة خلايا U4.4 (كثافة الاستزراع: 3 × 104 خلية/بئر تقريبًا، حجم المزرعة: 100 µL) في طبق أسود من فئة التصوير مكون من 96 بئرًا تحت الظروف الموصوفة أعلاه.
    ملاحظة: تم استزراع الخلايا في الآبار الخارجية (الصفوف A و H؛ والأعمدة 1 و 12) ولكن تم استبعادها من التحليل التجريبي لتجنب تأثيرات الحواف، بما في ذلك زيادة التبخر.
  2. قم بإصابة الخلايا (الاندماج المستهدف: 6 × 104 خلية تقريبًا) بفيروس SFV-mCherry بمضاعف إصابة (MOI) قدره 0.01 في وسط L-15 غير مدعم باستخدام حجم تلقيح قدره 100 µL، ثم قم بالتحضين لمدة 1 h عند 28 °C.
    ملاحظة: يجب استخدام مخزونات الفيروسات المراسلة ذات الممرات المنخفضة فقط، خاصة عند العمل مع مضاعفات إصابة منخفضة جدًا وإصابات تستمر لعدة أيام.
  3. قم بتخفيف مثبطات الفورين MI-1130 و MI-1131 و MI-1148 إلى تركيزات نهائية تبلغ 100 و 50 و 25 و 12.5 µM في طبق منفصل من نوع V-bottom مكون من 96 بئرًا باستخدام وسط L-15 مدعم. قم بتحضير 110 µL لكل بئر للسماح بزيادة قدرها 10%، وانقل 100 µL (الحجم النهائي) إلى الخلايا. بالنسبة للمجموعات الضابطة، استخدم خلايا مصابة معالجة بالمذيب الخاص بالمركبات المضادة للفيروسات وخلايا مصابة تحتوي على الفيروس فقط كمجموعة ضابطة سلبية. كما يجب إضافة خلايا غير مصابة وغير معالجة لقياس الفلورة الخلفية.
  4. بعد فترة الإصابة التي استمرت 1 h، قم بإزالة اللقاح وانقل 100 µL من مثبطات الفورين المخففة من أطباق V-bottom إلى الأطباق السوداء من فئة التصوير.
  5. قم بتحضين الخلايا عند 28 °C.

7. التصوير الفلوري للخلايا الحية، والتحليل الكمي للصور، وعرض البيانات

  1. قياس تعبير المراسل الفيروسي عبر المجهر الفلوري (راجع Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6, and Supplementary Figure 7 لإعداد البرنامج).
    1. عند 24 و 48 ساعة بعد الإصابة (hpi)، صبغ نويات الخلايا بإضافة 8 µL من محلول صبغ نووي نافذ للخلايا لكل بئر. يتم التحضين لمدة 30 دقيقة عند 28 °C.
      ملاحظة: يمكن مراقبة الإصابة في نقاط زمنية متعددة. ومع ذلك، فإن القياسات عند 48 ساعة بعد الإصابة توفر أقوى إشارة (راجع Supplementary Figure 8) وتسمح بتقييم التأثيرات المضادة للفيروسات بشكل أكثر موثوقية. وتعتبر القراءات عند 24 ساعة أو النقاط الزمنية المتوسطة ممكنة، ولكن تمديد التحضين لما بعد 48 ساعة يزيد من خطر النمو المفرط للخلايا. اختر درجة تلاحم خلوي مناسبة في بداية التجربة لضمان عدم نمو الخلايا بشكل مفرط بحلول النقطة الزمنية المختارة للقراءة. سيؤدي ذلك إلى تجنب إعاقة العد الدقيق للخلايا.
    2. بعد التحضين (وبالإضافة إلى الغطاء الشفاف)، أضف رقاقة ختم شفافة تغطي الجزء العلوي من الطبق لضمان السلامة.
      ملاحظة: عند استخدام جهاز تصوير، من الضروري اختيار نوع الطبق الصحيح. ستختلف إعدادات الإضاءة وزمن التكامل والكسب بناءً على الجين المراسل. يوصى بشدة بإجراء قياسات أولية لتحديد المعايير المثلى. تتوفر إعدادات الإضاءة والتكامل والكسب الأولية المستخدمة لإنشاء البروتوكول تحت الظروف المعطاة في Supplementary Figure 2، حيث تم وصف إعداد البرنامج بالتفصيل.
    3. التقط صوراً كاملة للبئر باستخدام تقنية تجميع الصور (أربعة حقول لكل بئر بتكبير 4x) باستخدام القارئ متعدد الأنماط.
    4. قياس شدة الفلورة الحمراء باستخدام مكعب مرشح Texas Red (الإثارة: 586/15 nm؛ الانبعاث: 647/57 nm).
    5. تحديد إجمالي عدد الخلايا باستخدام قناة DAPI بالإعدادات التالية (الإثارة: 377/50 nm؛ الانبعاث: 447/60 nm).
  2. التحليل الكمي للصور (راجع Supplementary Table 1 للبيانات الخام).
    ملاحظة: بالنسبة لقياسات الفلورة، تم استخدام قارئ تصوير للأطباق الدقيقة. يمكن العثور على المعايير التفصيلية المستخدمة في هذا المقايسة في Supplementary Figure 2.
    1. معالجة الصور باستخدام برنامج تصوير مناسب.
    2. باستخدام لوحة تقليل البيانات، اختر تجميع الصور (Image Stitching) لقنوات DAPI و Texas Red لإنشاء صورة واحدة من الآبار.
    3. أضف إحصائيات الصور (Image Statistics) واختر الكثافة الإجمالية (Total intensity) في قناة Texas Red المجمعة. طبق المعالجة المسبقة للصور (Image Preprocessing) لإزالة ضجيج الخلفية من قناة DAPI المجمعة.
    4. تشغيل التحليل الخلوي (Cellular Analysis) على قناة DAPI المجمعة والمعالجة مسبقاً.
    5. حساب متوسط شدة الفلورة الحمراء لكل خلية عن طريق طرح متوسط فلورة آبار التحكم غير المصابة وغير المعالجة من كل بئر معالج، ثم قسمة النتيجة على إجمالي عدد الخلايا في البئر المقابل.
  3. استكشاف الأخطاء وإصلاحها
    1. مراقبة استقرار التركيز أثناء القياس، خاصة في قياسات التصوير الطويلة أو عند استخدام أطباق حساسة لدرجة الحرارة.
    2. تفعيل التركيز التلقائي وزيادة تكرار التركيز التلقائي إذا لوحظ انزياح في التركيز. قلل من سرعة الالتقاط أو اترك الأطباق لتتوازن مع درجة حرارة الجهاز قبل التصوير إذا استمر الانزياح.
    3. استخدم أطباقاً مخصصة للتصوير لضمان جودة إشارة ثابتة أثناء الالتقاط. امنع التسرب الضوئي والتعرض المفرط من خلال تجنب الإضاءة المفرطة وأزمنة التكامل الطويلة.
    4. خفض شدة الإثارة، أو تقصير زمن التكامل، أو تقليل الكسب حتى يتم تجنب تشبع الإشارة. تحقق من أن قنوات الفلوروفور مفصولة جيداً واضبط إعدادات المرشح حسب الحاجة.
      ملاحظة: التسرب الضوئي بين DAPI و mCherry منخفض بشكل عام ولكنه يعتمد على بنية المراسل المستخدمة (مثل GFP).
    5. تجنب التلاحم المفرط للخلايا للحفاظ على حركية إصابة مناسبة وحساسية المقايسة. في حالة حدوث تلاحم مفرط، قلل وقت التحضين قبل القياس.
    6. مراقبة التأثيرات المرتبطة بالصبغة على حيوية الخلايا وجودة الإشارة، خاصة عند التركيزات العالية. قلل تركيز الصبغة أو قصر أوقات التحضين إذا لوحظت سمية مرتبطة بالصبغة أو خلفية فائقة التشبع.
    7. تحضير وتخزين الأصباغ وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة للحفاظ على استقرار الإشارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يُقدم هذا العمل بروتوكولاً تفصيلياً لمراقبة انتشار فيروس ألفا (alphavirus) وتقييم المركبات المضادة للفيروسات (مثل مثبطات الفوران) باستخدام المجهر الفلوري في تنسيق الأطباق متعددة الآبار. ولإثبات تصور التأثيرات المثبطة للتعبير عن المراسل الفيروسي، تم اختيار ثلاثة مثبطات للفوران تم تخليقها مسبقاً لاختبارها في الخط الخلوي U4.4 المستمد من البعوض من جنس Aedes، وهي: MI-1148 وMI-1130 وMI-1131. يوضح الشكل 1 نظرة عامة على سير العمل التجريبي.

قبل تقييم الفعالية المضادة للفير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توفر القدرة على مراقبة تضاعف الفيروسات الأبجدية (alphavirus) في الوقت الفعلي منظوراً تتابعياً وتراكمياً مقارنة باختبارات نقطة النهاية التقليدية. ويعد بروتوكول تصوير الخلايا الحية متعدد الفترات الزمنية نموذجاً مفيداً لدراسة الفيروسات الأبجدية، حيث يوفر منصة ديناميكية لمراقبة الانتشار الفيروسي.

يعتمد نجاح هذا البروتوكول على عدة عوامل. أولاً، من المهم تقييم السمية الخلوية للمركبات قبل إجراء مقايسة مضاد الفيروسات لاستبعاد النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن موت الخلايا. وبمجرد إتمام تقييم التأثير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نتوجه بالشكر إلى الأستاذ الدكتور أندريس ميريتس من جامعة تارتو بإستونيا، والأستاذ الدكتور أندرياس بيتشلماير من جامعة ميونخ التقنية بألمانيا، لتوفير pCMV-SFV6-2SG-mCherry. كما نشكر الأستاذة الدكتورة ستيفاني بيكر من جامعة الطب البيطري في هانوفر بألمانيا على توفير خلايا C6/36. ونشكر الأستاذ الدكتور تورستن شتاينميتزر من جامعة ماربورغ بماربورغ في ألمانيا على توفير مثبطات الفوران. تم دعم هذا العمل من خلال برنامج المبادرة الإقليمية لتطوير التميز العلمي والاقتصادي التابع لوزارة التعليم العالي والبحث والفنون في ولاية هيسين عبر مركز LOEWE لعلم الجينوم للتنوع البيولوجي الانتقالي (LOEWE-TBG) تحت رمز التمويل: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52، ومن قبل BMFTR (مشروع ASCRIBE-منحة رقم 01KI2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألبومين بقري، الجزء الخامس، الرقم الهيدروجيني 7.0الرحلان الكهربائي من SERVA11930.03
وسط DMEM المستقر على طاولة المختبرThermo Fisher ScientificA4192101
خلايا BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH، إيبلهايم، ألمانيا603126
دورق زراعة الخلايا، 50 مل، 25 سم2بوليسترين، غطاء لولبي بمرشح أحمر، شفاف، CELLSTAR، مستنبت للخلايا، معقمGreiner Bio-One690175
صفيحة دقيقة لزراعة الخلايا، 24 بئراً، بوليستيرين (PS)، قاع مسطح، (بئر مدخني)، شفافة، CELLSTAR، زراعة نسيجية (TC)، غطاء بحلقات تكثيف، معقمةGreiner Bio-One662160
لوحة مجهرية لزراعة الخلايا، 96 بئراً، بولي ستيرين (PS)، قاع مسطح (F-bottom)، (بئر مدخني)، µشفاف، أسود، CELLSTAR، مزرعة خلوية (TC)، غطاء بحلقات تكثيف، معقمGreiner Bio-One655090
صفيحة ميكروية لاستنبات الخلايا، 96 بئراً، بوليسترين، قاع مسطح، (بئر مدخني)، شفافة، CELLSTAR، متوافقة مع زراعة الأنسجة، غطاء بحلقات تكثيف، معقمةGreiner Bio-One655180
صفيحة ميكروية لزراعة الخلايا، 96 بئراً، بوليستيرين (PS)، قاع على شكل حرف V، شفافةGreiner Bio-One651101
كاشطة الخلاياVWR734-2602
مقايسة CellTiter-Glo لقياس حيوية الخلايا بالتلألؤ البيولوجيPromegaG7573
جهاز Cytation 5 متعدد الأنماط لقراءة وتصوير الخلاياBiotek
مكعب مرشح DAPI 1225100بيوتكالإثارة: 377/50 نانومتر؛ الانبعاث: 447/60 نانومتر
وسط دولبكو المعدل من وسط إيجل (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
مصل جنين البقرFisher Scientific11550356
مثبط الفورين MI-1130هذه الدراسة
مثبط الفوران MI-1131هذه الدراسة
مثبط فورين MI-1148هاردس وآخرون 2015.  يرجى تقديم النص المراد ترجمته. لقد قدمت رابط DOI فقط، ومن أجل ضمان الدقة العلمية والالتزام بالمعايير المهنية لترجمة محتوى JoVE، أحتاج إلى النص المصدري الكامل باللغة الإنجليزية للبدء في عملية الترجمة إلى اللغة العربية. 
برنامج Gen5 Primeبيوتك (Biotek)
ملح كالسيوم أيونوميسين، 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
وسط ليبوفيتز L-15، مكمل GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
كاشف ترانسفكشن Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
الأحماض الأمينية غير الأساسية لوسط MEM (تركيز 100 ضعف)Thermo Fisher Scientific11140050
لوحة ميكروية، بوليستيرين (PS)، 96 بئراً، ذات قاع مسطح (بئر مدخني)، سوداء، Fluotrac، ارتباط متوسطGreiner Bio-One655076
كاشف NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
بنسلين-ستريبتومايسين (10,000 وحدة/مل)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryالأستاذ الدكتور أندريس ميريتس (جامعة تارتو، إستونيا) والأستاذ الدكتور أندرياس بيشلماير (جامعة ميونيخ التقنية، ألمانيا)
مكعب مرشح Texas Red 1225102 Biotekطول موجة الإثارة: 586/15 نانومتر؛ طول موجة الانبعاث: 647/57 نانومتر
مرق تريبتوز فوسفات Thermo Fisher Scientific18050039
خلايا U4.4معهد فريدريش لوفلر، المعهد الفيدرالي لأبحاث صحة الحيوان، غرايفسفالد، ألمانيا
سدادة Viewseal، شفافةGreiner Bio-One676070

المراجع

  1. Powers, A. M. Togaviruses: Alphaviruses. eLS. , (2014).
  2. Shaw, A. R., Feinberg, M. B. Vaccines. Clinical Immunology. , Elsevier. (2008).
  3. Gould, E. A., et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Research. 87 (2), 111-124 (2010).
  4. Lim, E. X. Y., Lee, W. S., Madzokere, E. T., Herrero, L. J. Mosquitoes as suitable vectors for alphaviruses. Viruses. 10 (2), (2018).
  5. de Caluwé, L., Ariën, K. K., Bartholomeeusen, K. Host factors and pathways involved in the entry of mosquito-borne alphaviruses. Trends in Microbiology. 29 (7), 634-647 (2021).
  6. Adizie, T., Adebajo, A. O. Travel- and immigration-related problems in rheumatology. Best practice & research. Clinical Rheumatology. 28 (6), 973-985 (2014).
  7. ECDC Chikungunya virus disease worldwide overview: Situation update. , (2025).
  8. Paixão, E. S., et al. Chikungunya chronic disease: a systematic review and meta-analysis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 112 (7), 301-316 (2018).
  9. Atkins, G. J., Sheahan, B. J., Liljeström, P. The molecular pathogenesis of Semliki Forest virus: a model virus made useful. The Journal of General Virology. 80 (Pt 9), 2287-2297 (1999).
  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
  11. Teppor, M., et al. Semliki Forest virus chimeras with functional replicase modules from related alphaviruses survive by adaptive mutations in functionally Important Hot Spots. Journal of Virology. 95 (20), (2021).
  12. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  13. Shan, L., Yang, D., Wang, D., Tian, P. Comparison of cell-based and PCR-based assays as methods for measuring infectivity of Tulane virus. Journal of Virological Methods. 231, 1-7 (2016).
  14. Omokungbe, B., et al. Gene silencing in the aedine cell lines C6/36 and U4.4 using long double-stranded RNA. Parasites & Vectors. 17 (1), 255(2024).
  15. Centurión, A., Omokungbe, B., Stiehler, S., Vilcinskas, A., Hardes, K. Inhibition of Semliki Forest virus replication with long double-stranded RNA in Aedes albopictus cells. Virus Research. 357, 199584(1995).
  16. Weger-Lucarelli, J., et al. Adventitious viruses persistently infect three commonly used mosquito cell lines. Virology. 521, 175-180 (2018).
  17. Attarzadeh-Yazdi, G., et al. Cell-to-cell spread of the RNA interference response suppresses Semliki Forest virus (SFV) infection of mosquito cell cultures and cannot be antagonized by SFV. Journal of Virology. 83 (11), 5735-5748 (2009).
  18. Gahmberg, C. G., Simons, K. Isolation of plasma membrane fragments from BHK21 cells. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B: Microbiology and immunology. 78 (2), 176-182 (1970).
  19. Thomas, G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 3 (10), 753-766 (2002).
  20. Garten, W. Characterization of proprotein convertases and their involvement in virus propagation. Activation of Viruses by Host Proteases. , Springer. Cham. 205-248 (2018).
  21. Becker, G. L., Hardes, K., Steinmetzer, T. New substrate analogue furin inhibitors derived from 4-amidinobenzylamide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (16), 4695-4697 (2011).
  22. Hardes, K., et al. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. ChemMedChem. 10 (7), 1218-1231 (2015).
  23. Hardes, K., et al. Elongated and shortened peptidomimetic inhibitors of the proprotein convertase furin. ChemMedChem. 12 (8), 613-620 (2017).
  24. Pennemann, F. L., et al. Cross-species analysis of viral nucleic acid interacting proteins identifies TAOKs as innate immune regulators. Nature Communications. 12 (1), 7009(2021).
  25. Andersen, L. L., et al. Systematic P2Y receptor survey identifies P2Y11 as modulator of immune responses and virus replication in macrophages. The EMBO Journal. 42 (23), (2023).
  26. Huang, Y., Urban, C., Hubel, P., Stukalov, A., Pichlmair, A. Protein turnover regulation is critical for influenza A virus infection. Cell Systems. 15 (10), 911-929 (2024).
  27. Hardes, K. Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin [Doctoral Dissertation]. , Philipps-Universität Marburg. (2014).
  28. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  29. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  30. Yang, P., et al. Imaging of viral replication in live cells by using split fluorescent protein-tagged reporter flaviviruses. Virology. 603, 110374(2025).
  31. Jose, J., Taylor, A. B., Kuhn, R. J. Spatial and temporal analysis of alphavirus replication and assembly in mammalian and mosquito cells. mBio. 8 (1), (2017).
  32. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PloS One. 9 (5), (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفحص المضاد للفيروساتالمجهر الفلوريتحليل الصورديناميكيات العدوىحركية التكاثرالانتشار من خلية إلى أخرىالفحص عالي الإنتاجيةالمركبات المضادة للفيروسات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.