Method Article

توليد نموذج قائم على عضويات البروستاتا للفأر لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض

DOI:

10.3791/69385

⸱

February 27th, 2026

 ,  , 
1Host Pathways in Urinary Tract Infections Group, Institute of Molecular Infection Biology, University of Würzburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول توليد نموذج قائم على عضويات البروستاتا في الفأر ينمو في أبعاد ثنائية الأبعاد. يشمل ذلك التفكك العضوي، وزرع الخلايا، والتمايز، وتقييم سلامة الظهارة، والعدوى المجهزة في المختبر بالإشريكية القولونية الممرضة للبول. يوفر النموذج إمكانية الوصول إلى القمة ومناسب لدراسة تفاعلات المضيف مع الممرض، متغلبا على قيود الأنظمة العضوية ثلاثية الأبعاد التقليدية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرجال المتقدمون في السن يتأثرون بشدة بأمراض البروستاتا، مثل فرط تنسج البروستاتا الحميد، التهاب البروستاتا، وسرطان البروستاتا. معا، تساهم هذه الحالات بشكل كبير في العبء الصحي العالمي وهي سبب رئيسي للأمراض لدى الرجال. لقد غيرت نماذج العضويات نمذجة الأمراض من خلال السماح بتكرار الميزات الرئيسية لبنية الظهارة ووظيفتها في المختبر. ومع ذلك، فإن البنية المغلقة للفومين للعضويات تحد من الوصول التجريبي إلى سطح القمة، مما يعيق دراسات تفاعلات المضيف مع الممرض. لتجاوز هذه التحديات، أنشأنا نظام زراعة ذو صلة فسيولوجية حيث يتم زرع الخلايا المستمدة من عضويات البروستاتا للفئران كنموذج ثنائي الأبعاد (2D). يحافظ هذا النهج على الخصائص الظهارية الأساسية مع توفير وصول مباشر إلى السطح القمي. يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة تفكك عضويات البروستاتا الناضجة في الفأر والظروف المثلى للبذر لدعم ارتباط الخلايا وتكاثرها وتمايزه. أكد المجهر المناعي الفلوري التعبير عن علامات خاصة بالبروستاتا في النموذج القائم على العضوية وأظهر تمثيلا دقيقا لتنظيم نسيج البروستاتا الخلوي. أكدت قياسات TEER، إلى جانب التلوين ب F-actin وتوصيلات الوصلات الضيقة، تمايز الخلايا وتكوين الحواجز. أظهرت عدوى النموذج بالإشريكية القولونية الممرضة (UPEC) فائدته في دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض. يوفر هذا النموذج منصة قيمة لدراسة بيولوجيا ظهارة البروستاتا وآليات المرض، وهو مناسب بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض وتقييم استراتيجيات العلاج المحتملة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غدة البروستاتا هي عضو صغير يقع أسفل المثانة ويحيط بالإحليل. إنه عضو أساسي في الجهاز التناسلي الذكري، ووظيفته الرئيسية هي إنتاج سائل البروستاتا. هذا السائل يمثل ما يصل إلى 30٪ من بلازما السائل المنوي، وهو ضروري لتغذية وحماية الحيوانات المنوية خلال رحلتها عبر الجهاز التناسلي الأنثوي1. أمراض البروستاتا، مثل التهاب البروستاتا، وتضخم البروستاتا الحميد، وسرطان البروستاتا، منتشرة بشكل كبير وتمثل عبئا كبيرا على الرعاية الصحية حول العالم 2,3,4,5. بينما يتم دراسة فرط تنسج البروستاتا الحميد وسرطان البروستاتا بشكل مكثف، لا تزال التهاب البروستاتا، وخاصة التهاب البروستاتا البكتيري، غير مدروسة بشكل كاف نسبيا. يؤثر التهاب البروستاتا على ما يصل إلى 16٪ من الرجال حول العالم 6,7، مع تشكل العدوى البكتيرية حوالي 10٪ من الحالات. على الرغم من انتشاره، لا يزال التهاب البروستاتا البكتيري غير مفهوم جيدا. سلالات الإشريكية القولونية (E. coli)، وتحديدا الإشريكية القولونية الممرضة (UPEC)، هي السبب الرئيسي لالتهاب البروستاتا البكتيري 8,9.

لا تزال الأبحاث في الآليات الجزيئية لعدوى البروستاتا محدودة بسبب غياب نماذج فسيولوجية ذات صلة في المختبر. اعتمدت معظم الدراسات حول أمراض البروستاتا تقليديا على خطوط الخلايا أو نماذج حيوانية. على وجه الخصوص، تم استخدام خطوط الخلايا السرطانية أو المتحولة مثل LNCaP أو RWPE-1 على نطاق واسع لنمذجة مرض البروستاتا والاستجابة للعلاج 10,11,12,13. ومع ذلك، تفتقر هذه النماذج إلى تركيب الخلايا وتعقيد ظهارة البروستاتا الصحية أو السرطانية. علاوة على ذلك، استخدمت العديد من الدراسات الأخرى نماذج حيوانية (معظمها نماذج فئران) لدراسة فرضيات مختلفة حول عدوى البروستاتا، الاستجابة المناعية، نمو أورام البروستاتا، والنقائل 14,15,16,17. على الرغم من أن هذه النماذج كانت الأكثر تقدما ومعلوماتا حتى الآن، إلا أنها عادة ما تثير مخاوف أخلاقية، وتتطلب وقتا وموارد كبيرة، وقد تكون مكلفة. بدلا من ذلك، تم استخدام إزالة الأنسجة خارج الجسم الحي وزراعة الخلايا الأولية أيضا في دراسات قصيرة الأمد لاستجابات الأنسجة للأدوية أو تطور السرطان 18,19,20. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لها عمر محدود، وغالبا ما يكون توفر الأنسجة البشرية الطازجة محدودا.

ظهرت الزراعة العضوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة كبديل واعد لنمذجة الأنسجة الظهارية في المختبر. على عكس خطوط الخلايا التقليدية، تحتفظ الأعضاء بخصائص رئيسية للظهارة الأصلية، مثل التغاير الخلوي، والبنية الخاصة بالنسيج، والخصائص الوظيفية 21,22,23. على عكس الزراعة الخلوية الأولية أو الزراعة الخارجية خارج الجسم، يمكن توسيع وعبور المزارع العضوية على مدى فترة طويلة دون أن تصبح متقدمة في السن. تجعل هذه الخصائص الأنظمة العضوية مناسبة بشكل خاص لدراسة المرض وتفاعلات المضيف مع الممرض في سياق فسيولوجي ذو صلة. تم توليد عضويات البروستاتا من أنسجة بشرية صحية وسرطانية، وكذلك من نماذج فئران، واستخدمت بشكل رئيسي في أبحاث سرطان البروستاتا 24,25,26. ومع ذلك، بالنسبة لدراسات العدوى، يشكل الهيكل ثلاثي الأبعاد للعضويات تحديا كبيرا، ويرجع ذلك أساسا إلى محدودية الوصول إلى سطح الخلية المضيئة. تقليديا، كانت الأعضاء ثلاثية الأبعاد السليمة تتعرض للإصابة إما عن طريق حقن العامل الممرض بمجهزة دقيقة، أو بتفكيك العضوية إلى شظايا أو خلايا منفردة قبل الحضانة مع الممرض23. هنا، يمكن أن يؤثر التفاوت في الحجم والبنية ثلاثية الأبعاد على قابلية التكرار وسرعة الإنتاج. كبديل، توفر الأورگنويدات ذات الخروج المؤقت طريقة لتجاوز قيود صعوبة الوصول إلى التلومين. زراعة الأعضاء المعلقة، سواء في ألواح زراعة الأنسجة ذات الارتباط المنخفض جدا أو على الأسطح المغطاة بمواد سطحية غير لاصقة، يحفز انعكاسا في قطبية العضويات. نتيجة لذلك، يواجه سطح القمة للخارج، مما يسمح بالوصول المباشر لدراسات عدوى الممرضات 27,28. ومع ذلك، لا يمكن الحفاظ على هذه الزراعة على المدى الطويل، كما أن التغيرات في حجم الأعضاء وعدد الخلايا تعقد تحديد تعدد العدوى (MOI). بالإضافة إلى ذلك، لم تفهم بعد الآليات الكامنة وراء عكس القطبية وتأثيراتها على الخلايا العضوية. لتجاوز قيود العضويات كنماذج العدوى المختبرية، تم تطوير نماذج عضوية يمكن الوصول إليها من القمة باستخدام عضويات من أعضاء مثل المعدة والأمعاء أو الرئة 29,30,31. تحافظ هذه الأنظمة على السمات الظهارية الرئيسية وتسمح بتسهيل التلاعب والتصوير والتعرض المسيطر عليه للممرضات و/أو الأدوية. ومع ذلك، فإن ظروف الزراعة التي تسمح بالتمايز الخلوي لا تنتقل دائما من الزراعة العضوية إلى نماذج الزراعة ثنائية الأبعاد 31,32.

هنا، نصف بروتوكولا لإنشاء نموذج ظهاري للبروستاتا يمكن الوصول إليه من الناحية العرضية باستخدام عضويات البروستاتا للفئران. تم تطوير هذا النموذج والتحقق منه سابقا في مختبرنا، حيث أظهرنا تشابه قوي مع نسيج البروستاتا الأصلي وأهميته في دراسات بيولوجيا العدوى التي تشمل UPEC32. يحاكي النظام عن كثب تركيب الخلايا وقطبية ظهارة البروستاتا، مع توفير إمكانية تحسين التلاعب التجريبي. علاوة على ذلك، نثبت قابليتها لدراسة تفاعلات المضيف والممرض في البروستاتا، موفرة بديلا أكثر قابلية للعمل للنماذج في الجسم الحي ، ونظاما أكثر صلة فسيولوجيا مقارنة بخطوط الخلايا التقليدية أو النماذج العضوية ثلاثية الأبعاد.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان أخلاقي: جميع إجراءات الحيوانات امتثلت لإرشادات العناية والاستخدام للحيوان في جامعة فورتسبورغ وتمت الموافقة عليها بموجب اللوائح المؤسسية والحكومية ذات الصلة. تم استخدام فئران WT فقط التي تم إعدامها في معهدنا من قبل مجموعات بحثية أخرى لأغراض مستقلة في هذه الدراسة. لم يتم التضحية بأي حيوانات خصيصا لهذا العمل، وفقا لمبادئ 3R (الاستبدال، الاختزال والتنقيح).

ملاحظة: البروتوكول المعروض هنا مبني على دراسة سابقة نشرها المؤلفون32. يجب تنفيذ جميع الخطوات الموضحة هنا في خزانة معقمة للسلامة البيولوجية باستخدام تقنيات المعقمة المناسبة والمعدات الوقائية الشخصية المناسبة. تم توليد عضويات البروستاتا في الفأر من فئران C57BL/6 وتم الحفاظ عليها في ثقافة ثلاثية الأبعاد، كما تم وصفها سابقا25,26. واتباع مبادئ 3R، تم التبرع ببروستاتا الفئران من قبل منشأة الحيوانات من فئران WT ساذجة غير معالجة (عمرها على الأقل 6 أشهر) تم التضحية بها لأسباب أخرى. لفترة وجيزة، تم تفريم وعملية هضم البروستاتا في خطوتين باستخدام الكولاجيناز وإنزيم TrypLE Express. ثم تم زرع الخلايا في قطرات من المصفوفة خارج الخلية (ECM) لتوليد الأعضاء ثلاثية الأبعاد. تمت إضافة وسيط الثقافة إلى الثقافة ويتم تجديده كل 3 أيام. تم تمرير الزراعة العضوية ثلاثية الأبعاد مرة واحدة في الأسبوع واستخدامها في التلقيح ثنائي الأبعاد من الفقرة الثالثة فصاعدا. تم استخدام عضويات البروستاتا التي عمرها أسبوع واحد لزرع النموذج القائم على العضوية العضوية على سطح ثنائي الأبعاد وفقا للبروتوكول الحالي. لا يلزم تغطية ألواح زراعة الأنسجة ببروتينات ECM لهذا البروتوكول.

1. توليد نموذج قائم على عضويات البروستاتا

  1. عزل الأورجينويد ثلاثي الأبعاد
    1. استنشق الوسط من العدد المطلوب من الآبار العضوية ثلاثية الأبعاد من صفيحة تحتوي على 24 بئرا. استبداله ب 500 ميكرولتر من adDMEM/F12+/+ لكل بئر (انظر جدول المواد).
    2. استخدم ماصة P1000 لتعطيل سقوط ECM ميكانيكيا. اجمع التعليق في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. اجمع فقط بئرين كحد أقصى لكل أنبوب.
    3. قم بتعبئة adDMEM/F12+/+ حتى 10 مل. بلطف اقلب الأنبوب 3-4 مرات لخلطه. الطرد المركزي عند 450 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. الاضطراب العضوي ثلاثي الأبعاد إلى خلايا مفردة
    1. استنشق السوبرناتان. أعد تعليق الحبيبة في 2 مل من إنزيم TrypLE Express المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مع 10 ميكرومولار RHOKi.
    2. حضن في حمام ماء عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم ماصة P1000 لخلط تعليق الخلية كل 5 دقائق.
      ملاحظة: تحقق من تعليق الخلية تحت مجهر مقلوب باستخدام هدف 4x للتحقق من أن الخلايا مفردة إلى حد كبير. تجمعات صغيرة من 2-3 خلايا مقبولة. عادة ما تكون 15 دقيقة من الحضانة كافية، لكن يمكن تمديدها إذا لزم الأمر.
    3. أضف 10 مل من adDMEM/F12+/+. بلطف اقلب الأنبوب 3-4 مرات لخلطه. الطرد المركزي عند 450 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. تعليق الطلاء أحادي الخلية
    1. استنشق السوبرناتانت دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الزراعة مع إضافة 10 ميكرومولار RHOKi (300 ميكرولتر من وسط الزراعة لكل بئر من العضوية ثلاثية الأبعاد المستخدمة في الخطوة 1.1.1).
      ملاحظة: يتكون وسط الزراعة من: وسط النسر المعدل من Advance Dulbecco، 10 ملم L−1 HEPES، 1x جلوتا ماكس، 1x B27، 1 ملليمولار N-أستيل سيستيين، 10٪ وسط مكيف نوجين، 10٪ R-سبوندين 1 وسط محالف، 50 نانوغرام·مل-1 EGF، 1 نانومال 5α-ديهيدروتستوستيرون (DHT)، 0.2 ميكرومولار TGFβi، و100 نانوغرام·مل-1 بريموسين (انظر جدول المواد). لتجارب العدوى، استخدم وسط الزراعة بدون بريموسين.
    2. عد عدد الخلايا في التعليق باستخدام غرفة عد نويباور.
    3. تخفيف تعليق الخلية في وسط الزراعة مع 10 ميكرومولار RHOKi إلى تركيز 62,500 خلية·مل-1. استخدم 200 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر للزرع على ألواح بسعة 48 بئر (زراعة الأنسجة المعالجة من المصنع، انظر جدول المواد) أو 300 ميكرولتر لكل بئر على شرائح μ الحجرة (انظر جدول المواد). ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: كل بئر من الأورجانويدات ثلاثية الأبعاد، مستخدم في الخطوة 1.1.1. عادة ما تنتج حوالي 200,000 خلية.
    4. بعد يوم واحد، يتم تثبيت معظم الخلايا المفردة على السطح ثنائي الأبعاد. غير وسيط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة. يتم الوصول إلى الالتقاء خلال 7 أيام.
      ملاحظة: تأكد من إضافة RHOKi فقط للبذر الأولي وليس للتغييرات اللاحقة في الوسط.
  4. تمييز النموذج القائم على العضوية العضوية.
    ملاحظة: اتبع الخطوات التالية للحصول على نموذج متمايز، قائم على العضويات، مثري بخلايا ضوئية.
    1. أضف 10 نانومالتر DHT إلى تعليق الخلية (الخطوة 1.3.3). استخدم وسط الزراعة مع 10 نانوميل DHT لتغيرات الوسط اللاحقة (كل 2-3 أيام).
      ملاحظة: إذا لم يضاف DHT إلى تعليق الخلية (وتغير الوسط لاحقا)، فسيتم إثراء النموذج القائم على العضوية بخلايا قاعدية.

2. قياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER)

  1. تم زرع تعليق الخلية العضوية بتركيز 62,500 خلية·مل-1، باستخدام 300 ميكرولتر (تم الحصول عليه في الخطوة 1.3.3.) على شريحة PET μ ب8 آبار مع 40 قطبا كهربائيا لكل بئر (انظر جدول المواد). أضف 300 ميكرولتر من وسط الزراعة الموصوف في 1.3.1 إلى أحد الآبار التي لا تحتوي على خلايا.
    ملاحظة: يستخدم البئر الخالي من الخلايا كفتحة للقياسات.
  2. ربط شريحة μ بنظام تحليل الخلايا القائم على المقاومة (انظر جدول المواد) مع محطة ال 16 بئر الموضوعة داخل حاضنة زراعة الأنسجة. قس مؤشر TEER على 400 هرتز لمدة 7 أيام. غير وسيط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة.

3. التلوين بالفلورة المناعية

ملاحظة: لهذه الطريقة، تأكد من أن الخلايا تزرع في شرائح μ الحجرة (انظر جدول المواد)، وهي متوافقة مع تطبيقات المجهر عالية الدقة.

  1. عند النقطة الزمنية المحددة، قم بإزالة الوسط، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS. ثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (تجنب التعرض للضوء).
    تحذير: قد يسبب 4٪ بارافورمالديهايد رد فعل تحسسي في الجلد، وأضرارا خطيرة في العين، ويشتبه في أنه يسبب السرطان. استخدم دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE). تجنب استنشاق الغبار والأبخرة والغازات والضباب والأبخرة أو الرشاشات. ارتد قفازات واقية وتأكد من بقاء الملابس الملوثة داخل المختبر حتى يتم تطهيرها بشكل صحيح. تخلص من المحتويات والحاويات من خلال منشأة معتمدة للتخلص من النفايات.
  2. بعد التثبيت، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (5 دقائق لكل منها). قم بنفخ الخلايا بنسبة 0.5٪ من ترايتون X-100 (انظر جدول المواد) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: يسبب ترايتون X-100 تهيجا للجلد وأضرارا خطيرة في العين. إنه سام جدا للحياة المائية وله تأثيرات طويلة الأمد وقد يسبب اضطرابا للغدد الصماء في البيئة. عند التعامل، ارتد قفازات واقية، وحماية للعينين، ووجه. تخلص من المحتويات والحاويات من خلال منشأة معتمدة للتخلص من النفايات. تجنب إطلاق النار في البيئة.
  3. اغسل الخلايا مرتين ب 1x PBS (كل واحدة 5 دقائق). قم بحجب الخلايا باستخدام حاجز العزل (1٪ BSA في PBS، انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في العزل الحاجز (1٪ BSA في 1x PBS) وحضن الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية على منصة هزاز. في اليوم التالي، حضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. (انظر جدول المواد لتخفيف الأجسام المضادة).
    ملاحظة: بالنسبة لتلوين F-actin بالفالويدين أو غشاء البلازما باستخدام CellMask (انظر جدول المواد)، تجاوز الخطوة 3.4.
  5. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام قرص PBS مرة واحدة (5 دقائق لكل منها). قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية، مثل الفالويدين أو CellMask (انظر جدول المواد)، في حاجز العزل (1٪ BSA في 1x PBS) وحضن الخلايا ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام قرص PBS مرة واحدة (5 دقائق لكل منها). حضن الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام هوشت (انظر جدول المواد) مخفف في 1x PBS لتلوين النوى.
  7. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع 1x PBS (5 دقائق لكل منها) واترك الخلايا ب 1x PBS. تخزين عند 4 درجات مئوية.
  8. تخيل شرائح μ الشرائح المحجرة (انظر جدول المواد) باستخدام مجهر كونفوكالي ليزر أو مجهر فلوري.
    ملاحظة: يمكن التقاط صور عامة باستخدام هدف 20x على مجهر فلوري لتقييم كفاءة العدوى وتوزيعها بشكل عام. تم الحصول على صور ذات دقة أعلى باستخدام مجهر كونفوكلي مزود بهدف غمر ماء 40x لرؤية البكتيريا الفردية المرتبطة أو المستوعبة داخل الخلايا الظهارية. تم إثارة الفلوروفورات باستخدام خطوط ليزر عند 405، 499، 590، و653 نانومتر، حسب نوع الفلوروفورات المستخدمة. تم اكتشاف الانبعاث مع تعيين نوافذ الانبعاث على 415 إلى 516 نانومتر ل Hoechst، و509 إلى 573 نانومتر ل GFP أو Alexa 488، و600 إلى 651 نانومتر ل mcherry أو Alexa 594، و663 إلى 720 نانومتر لأليكسا 647. تم الحصول على مكدسات Z بحجم خطوة 0.5 ميكرومتر وتغطي كامل سمك طبقة الظهارة. تم التقاط الصور بدقة 1024 في 1024 بكسل، مع تردد مسح 400 هرتز ومتوسط إطارات مضبوط على 4، مما يوفر جودة صورة جيدة. تم الحفاظ على ثبات قوة الليزر وكسب الكاشف عبر جميع الظروف داخل نفس التجربة. يجب تحسين وتعديل جميع معايير التصوير بما في ذلك قوة الليزر، وكسب الكاشف، وسرعة المسح، والمتوسط حسب الحاجة حسب المجهر الكونفوكلي المستخدم.

4. العدوى البكتيرية بالإشريكية القولونية الممرضة للبول (UPEC)

ملاحظة: تأكد من استخدام نموذج قائم على العضوية يتم صيانته لمدة 7 أيام بدون بريموسين (انظر جدول المواد) للخطوات التالية.

تم استخدام سلالة الإشريكية القولونية الممرضة UTI89، التي تعبر بشكل أساسي عن بروتين mCherry من البلازميد pFPV-mCherry (مقاوم للأمبيسيلين)، في هذه الدراسة.

تحذير: عند التعامل مع مسببات الأمراض المعدية (مستوى السلامة البيولوجية 2)، ارتد قفازات وحماية مناسبة للعين والوجه. دائما ارتد معطف مختبر بأزرار كاملة. نفذ جميع الإجراءات ضمن خزانة سلامة بيولوجية معتمدة. قم بتطهير أسطح العمل واغسل اليدين جيدا بعد التعامل مع المواد البيولوجية. جمع نفايات BSL-2 في حاويات مخصصة للخطر البيولوجي المناسبة للتعقيم الجسدي. قم بتطهير المواد النفايات قبل التخلص منها باستخدام التعقيم أو أي طريقة مناسبة أخرى لإزالة التلوث.

  1. قبل ثلاثة أيام من تجربة العدوى، قم بإزالة سلالة UPEC على صفيحة أجار LB مدعمة بالمضاد الحيوي المقابل (تم استخدام أمبيسيلين 100 ميكروغرام·مل-1 في هذا البروتوكول) وحضن السلسلة لمدة 16-24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    تحذير: بعض المضادات الحيوية قد تسبب ردود فعل تحسسية أو تهيج عند ملامستها وتساهم في مقاومة الميكروبات إذا تم التخلص منها بشكل غير صحيح. دائما جهز وأضف المضادات الحيوية داخل خزانة السلامة البيولوجية مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات وحماية للعين). التخلص من المحاليل التي تحتوي على المضادات الحيوية كنفايات كيميائية من خلال منشأة معتمدة للتخلص من النفايات.
  2. قبل يومين من تجربة العدوى، تم تلقيح 3 مل من مرق LB مع المضاد الحيوي المقابل (أمبيسيلين 100 ميكروغرام·مل-1) باستخدام مستعمرة UPEC واحدة من صفيحة الأجار (الخطوة 4.1). حضانة ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  3. قبل يوم من تجربة العدوى، قم بعمل دوامة في مزرعة البكتيريا من الخطوة 4.2 وقس جرعة الجرعةالزائدة 600. احسب حجم هذه الزراعة المطلوب لتطعيم 3 مل من مرق LB مع إضافة الأمبيسيلين (100 ميكروغرام·مل-1) إلى OD600 في البداية 0.05 باستخدام الصيغة التالية: الحجم (μL) = (0.05 * 3,000 μL) / OD600 مقاس. أضف الحجم المحسوب للزراعة من الخطوة 4.2. إلى مرق LB الطازج وحضن بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يجب أن يكون OD600 لثقافة النوم الليلي من الخطوة 4.2 بين 1.7 و2.2.
  4. في يوم العدوى، قم بتدوير مزرعة البكتيريا من الخطوة 4.3 وقس جرعة الأكسجين600. احصد600 جرعة من الجرعة الزائدة 1، ثم استخدم الطرد المركزي بحرارة 12,000 x جرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. أزل السوبرناتانت.
  5. أعد تعليقها في 1 مل من وسط زراعة العضوية الخالي من البريموسين بدون DHT. اخفف إلى MOI 100.
    ملاحظة: يعتبر أن كل بئر في صفيحة تحتوي على 48 بئرا يحتوي على حوالي 150,000 خلية في اليوم السابع. تم الحصول على هذا التقدير من خلال عد الخلايا في فترة قبل العدوى عبر عدة تجارب. لضبط ال MOI بدقة، ينصح بزراعة بئر إضافي لعد الخلايا قبل العدوى. لتحديد حجم التعليق البكتيري المطلوب (الخطوة 4.4)، اضرب عدد الخلايا في البئر في MOI للحصول على إجمالي عدد البكتيريا المطلوبة لكل بئر، ثم اقسم هذا العدد على تركيز البكتيريا (8 × 10⁵ بكتيريا/ميكرولتر) للحصول على الحجم بμL.
  6. استبدال وسط الزراعة في النموذج القائم على العضوية بوسط زراعة يحتوي على بكتيريا. اضبط الحجم حسب سطح الزراعة: استخدم 200 ميكرولتر لكل بئر لألواح 48 بئر و300 ميكرولتر لكل بئر للشرائح μ. حضن لمدة ساعة واحدة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  7. بعد فترة الحضانة، يتم استنشاق الوسط المحتوي على البكتيريا من النموذج القائم على العضوية العضوية. اغسل البئر ثلاث مرات باستخدام adDMEM/F12+/+ لإزالة البكتيريا خارج الخلية.
  8. أضف وسط زراعة يحتوي على 50 ميكروغرام·مل-1 جنتاميسين لقتل البكتيريا خارج الخلية. حضنها لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: قد يحتاج تركيز الجنتاميسين إلى تعديل حسب السلالة البكتيرية المستخدمة. إذا استخدمت تركيزا أعلى من 50 ميكروغرام·مل-1، ينصح بفحص سمية الخلايا الخلوية.
  9. أزل الوسط واستبدل بوسط جديد مع 10 ميكروغرام·مل-1 جنتاميسين لبقية فترة العدوى.
    معالجة الخلايا المصابة لتلوين الفلورة بعد القسم 3، أو للقياس بالقياس الخلوي التدفقي بعد القسم 5.

5. قياس العدوى بواسطة قياس خلوي التدفق

  1. استنشق وسط الزراعة واغسل الخلايا ثلاث مرات ب 1x PBS. استخدم 100 ميكرولتر من إنزيم TrypLE Express لفصل الخلايا. حضن لمدة 5-10 دقائق حتى تنفصل جميع الخلايا.
    ملاحظة: بئر من صفيحة بها 48 بئر يكفي حسب الحالة.
  2. اجمع تعليق الخلية وانقله إلى بئر من صفيحة بسعة 96 بئر (قاع مخروطي). أضف 100 ميكرولتر من مخزن مقياس التدفق الخلوي (1x PBS، 10٪ FBS، 5 mM EDTA) في الأعلى لتعطيل إنزيم TrypLE Express.
  3. قم بالطرد المركزي على لوحة 96 بئر عند 450 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 150 ميكرولتر من مخزن قياس تدفق السيلتومتر.
  4. احصل على الخلايا المصابة وقم بقياسها باستخدام جهاز قياس تدفق الخلايا (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام ليزر إثارة بقطر 488 نانومتر ومرشح انبعاث 615/20 نانومتر للكشف عن الخلايا الموجبة لكلير الكرز. تم جمع البيانات بمعدل تدفق مرتفع (66 ميكرولتر·دقيقة⁻¹)، حيث جمعت ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة وتشمل فقط الأحداث ذات قيم ارتفاع التشتت الأمامي التي تزيد عن 80,000. تم تحديد الخلايا المصابة بناء على تألق mCherry مقارنة بمجموعة تحكم غير مصابة (ساذجة)، بعد استبعاد الحطام والتوبلت. يمكن تضمين علامة قابلية للحياة (مثل يوديد البروبيديوم أو بقع حية/ميتة أخرى) في استراتيجية البوابة لتقييم صلاحية الخلايا. قد يكون هذا مفيدا بشكل خاص عند العمل الأول مع النموذج لضمان عدم تأثير تفكك الخلايا سلبا على الخلايا.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول توليد نموذج عضوي لظهارة البروستاتا في الفأر يعيد تلخيص نوع الخلية والتعبير النسخي لقسم الظهارة في النسيج الأصلي. يتم إنشاء هذا النموذج باستخدام عضويات الخلايا الجذعية ثلاثية الأبعاد للبالغين الناتجة عن نسيج البروستاتا للفأر البالغ. يتم الحفاظ على هذه الثقافات العضوية في الثقافة وتمر أسبوعيا. بالنسبة للنموذج القائم على الأورجينويد، تبدأ الخطوة الأولى في سير العمل (الشكل 1A) باستخدام أورغانويدات ثلاثية الأبعاد عمرها 7 أيام. هذه الفترة الزمنية ضرورية للوصول إلى الحجم والكثافة الخلوية المناسبة للتلقيح اللاحق على سطح ثنائي الأبعاد. بعد المرور، تم زرع شظايا صغيرة من الأعضاء (الشكل 1B، اليوم 0) في ECM وتركت للنمو. مع مرور الوقت، تنمو هذه الهياكل إلى هياكل كروية كبيرة ذات تجويف داخلي محدد بحلول اليوم السابع (الشكل 1B). بعد تفكيك الأعضاء التي عمرها 7 أيام إلى خلايا منفردة، تم زرع الخلايا على صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة (الشكل 1C، اليوم 0) باستخدام نفس وسط الزراعة المستخدم في الزراعة العضوية ثلاثية الأبعاد (1nM DHT) لتشكيل طبقة أحادية. بحلول اليوم الأول، بدأت الخلايا الملتصقة بالتكاثر. خلال الأيام التالية، توسعت الطبقة الأحادية ووصلت إلى التقاءها بين اليوم الثالث واليوم الخامس، كما لوحظ بواسطة مجهر الحقل اللامع (الشكل 1C). لتوصيف التغيرات الشكلية مع مرور الوقت ومراقبة الوقت الذي يصل فيه النموذج القائم على العضوية إلى التقاء البعض، قمنا بصبغ غشاء البلازما ب CellMask وأجرينا تصوير فلوري في عدة نقاط زمنية (الشكل 1D).

نظرا لأن إشارات مستقبلات الأندروجين (AR) هي منظم رئيسي لتمايز الخلايا في البروستاتا، وأن تعديل تركيز التستوستيرون (أو DHT) في وسط الزراعة العضوية ثبت أنه يوجه تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا قاعدية أو ضوئية32، قمنا بتعديل مستويات DHT في وسط الزراعة لتعزيز إثراء الخلايا المضيئة (DHT 10 نانومتر) أو الخلايا القاعدية (بدون DHT)، التحكم؛ الطريقة1، الشكل 2A). كما هو موضح في الشكل 2 (B-F)، لم تلاحظ أي فروق كبيرة في نمو أو تقارب الخلايا. كما هو متوقع، في الحالة الضابطة (وسط زراعة عضوي بدون DHT)، عبرت معظم الخلايا عن سيتوكيراتين 5 (KRT5)، وهو علامة لخلايا البروستاتا الجذعية القاعدية (الشكل 2B,E). على النقيض من ذلك، عبرت عدد قليل فقط عن مستويات منخفضة من CD24a، وهو مؤشر لخلايا البروستاتا اللومعية المتمايزة (الشكل 2B,F).

أدى تناول مكملات ب 1 نانوملر DHT، كما وصفناسابقا 32، إلى تكوين مجموعة مختلطة تحتوي على خلايا قاعدية وخلايا ضوئية. ومع ذلك، ظل تعبير CD24a منخفضا، مما يشير إلى تمايز غير كامل إلى خلايا ضوئية (الشكل 2C,F 32). زيادة DHT إلى 10 نانومالايت عززت التمايز الكامل للخلايا اللومية مع الحفاظ على بعض الخلايا القاعدية بعد 7 أيام من الزراعة (الشكل 2D-F). يمكن أيضا تقييم تمايز النماذج المعتمدة على العضوية باستخدام مجهر الحقل المضيء. على الرغم من أن الفروق بين الشروط ليست واضحة جدا عندما تكون الخلايا متناثرة (اليوم 0 - 5، الشكل 1C، الشكل 1A)، تصبح شكل الخلايا ومظهرها مميزا وملحوظا بين ظروف الزراعة الثلاثة بواسطة مجهر الحقل المضيء في اليوم السابع (الشكل 1C، الشكل التكميلي 1A,B). في غياب DHT، بدت الخلايا أكثر تسطحا وغير منتظمة في الشكل، بينما في DHT بحجم 10 نانوملر، كانت الخلايا محشوة بإحكام بترتيب متعدد الأضلاع، يشبه شكل الحصى (الشكل التكميلي 1B).

ومن الجدير بالذكر أن الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد خضعت أيضا لتغيرات شكلية عند زراعتها بتركيزات مختلفة من DHT. على وجه التحديد، لوحظ زيادة واضحة تعتمد على الجرعة في حجم العضويات، حيث تشكلت أكبر العضويات في وجود 10 نانوميل DHT (الشكل 1B، الشكل الإضافي 2A,B). تشير هذه النتائج إلى أن مسار AR حاسم ليس فقط لتمايز الخلايا بل أيضا لتعديل ديناميكيات نمو عضويات البروستاتا في الفأر.

لتقييم سلامة الظهارة واستقطاب النماذج، أجرينا قياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) في النموذج القائم على العضوية الذي نما بدون DHT أو 10 نانوملر. ارتفعت قيم TEER مع مرور الوقت في كلا الحالتين لكنها كانت أعلى بكثير في وجود 10 نانوملار DHT (الشكل 3A)، مما يشير إلى تعزيز وظيفة الحاجز الظهاري. وقد دعمت هذه النتائج تلوين فالودين لخيوط الأكتين، والتي عادة ما تنظم في حلقة قمية عند وصلات الخلية والخلايا في خلايا ظهارة البروستاتا اللومية. في حالة DHT بحجم 10 نانومتر، بدا أن حلقة الأكتين أكثر تحديدا مقارنة بحالة التحكم، متوافقة مع زيادة قطبية الخلايا وتنظيم الظهارة (الشكل 3B). بالإضافة إلى ذلك، أظهر التلوين المناعي للزونولا أوكلودينس 1 (ZO-1) زيادة في الوصلات الضيقة في حالة DHT بحجم 10 نانومتر (الشكل 3C)، مما يدعم تعزيز سلامة الحاجز الظهاري وتمايز النمط الظاهري الضوئي. تكشف الإسقاطات المتعامدة أن الأعضاء المزروعة ب 10 نانومالتر DHT تظهر قطبية ظهارية محددة جيدا (الشكل التكميلي 3A). تقع خلايا KRT5⁺ القاعدية في الأسفل، وتوزع خلايا CD24a⁺ اللومعية على طول الطبقة الظهارية، مما يظهر شدة صبغ أقوى نحو الجانب القمي. تشبه هذه البنية تلك التي لوحظت في نسيج البروستاتا الخاص بالفئران (الشكل الإضافي 3B). ومن الجدير بالذكر أن بيانات أطلس البروتين البشري تظهر أن هذه العلامات لها توطين مماثل في نسيج البروستاتا البشري، حيث توجد خلايا KRT5⁺ القاعدية تحت طبقة ضوئية CD24a⁺ (الشكل الإضافي 3C)33. على النقيض من ذلك، الخلايا المزروعة تحت السيطرة أو حالات 1 نانومتر DHT لا تظهر فصلا مكانيا واضحا بين المؤشرات القاعدية واللمائية، وكان ارتفاع الخلية أقل بكثير من حالة 10 نانومتر (الشكل التكميلي 3A). يشير ذلك إلى أن مكملات DHT بمقدار 10 نانوميل تعزز التمايز والاستقطاب الظهاري في النموذج ثنائي الأبعاد بطريقة تشبه ظهارة البروستاتا الأصلية. نظرا لأن النموذج القائم على العضوية المزروع ب 10 نانومالتر DHT يشبه إلى حد كبير ظهارة البروستاتا الأصلية للفأر (الشكل 2D، الشكل الإضافي 3A,B)، فإنه يعد منصة ذات صلة للتحقيق في تفاعلات المضيف مع الممرض. لإثبات قابلية تطبيق النموذج، استخدمنا العدوى بفيروس UPEC، وبشكل خاص سلالة UTI89، وهي واحدة من أكثر السلالات استخداما في مجال الجهاز البولي التناسلي، كمثال. كما هو موضح في الشكل 4A، تم زراعة البكتيريا في مرق LB لمدة 24 ساعة (كما هو موضح في الطريقة 4) وحضنت مع الخلايا لمدة ساعة واحدة. ثم تم قتل البكتيريا خارج الخلية باستخدام الجنتاميسين لقياس الغزو والتكاثر داخل الخلية. عند إصابة النموذج العضوي، التزمت UPEC بالخلايا الطهارية بأعداد كبيرة (0 hpi؛ الشكل 4B، اللوحة اليسرى؛ الشكل 4C). ثم، وبعد علاج الجنتاميسين (1 hpi)، انخفض عدد الخلايا الموجبة لUPEC بشكل ملحوظ، بسبب موت البكتيريا خارج الخلية (الشكل 4B، اللوحة الوسطى؛ الشكل 4C). عند 24 hpi، بقي عدد الخلايا المصابة دون تغيير (الشكل 4C)، ومع ذلك، أظهر تصوير المجهر الكونفوكي أن البكتيريا داخل الخلية استمرت في التكاثر، مكونة هياكل شبيهة بالمجتمعات، مشابهة لتلك الموصوفة سابقا في ظهارة المثانة (الشكل 4B، اللوحة اليمنى). تم تحديد الخلايا المصابة بواسطة فلورة mCherry باستخدام ضوابط غير مصابة (ساذجة) كمرجع، بعد استبعاد الحطام والدوبلات (الشكل التكميلي 4).

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل والتطور الشكلية لعضويات البروستاتا والنماذج القائمة على العضوية العضوية مع مرور الوقت. (أ) التمثيل التخطيطي لسير العمل التجريبي (الطريقة 1). (B) صور برايتفيلد تظهر التطور الموفولوجي لعضويات البروستاتا مع إضافة 1 نانوماليت DHT، تم التقاطها في الأيام 0 و1 و3 و5 و7 (من اليسار إلى اليمين). شريط المقياس: 200 ميكرومتر (n = 3). (ج) صور برايت فيلد للنموذج القائم على الأورجانويدات مدعومة ب 1 نانومتر DHT، تم التقاطها في الأيام 0 و1 و3 و5 و7 (من اليسار إلى اليمين). شريط المقياس: 200 ميكرومتر (n = 3). (د) صور مجهرية ممثلة للنموذج القائم على العضويات المدعومة ب 1 نانوملر DHT ومصبوغة ب CellMask (أحمر)، في الأيام 1 و3 و5 و7 (من اليسار إلى اليمين). تم تلوين النوى باستخدام Hoechst 33342 (الأزرق). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (n = 3) يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: يعدل DHT تمايز السلالة في النموذج القائم على الأورجينويد. (أ) تمثيل تخطيطي للشروط المختلفة المستخدمة في التفاضل. (B-D) صور المجهر المناعي الفلورية التمثيلية للنموذج القائم على العضويات الذي نما لمدة 7 أيام في غياب (B) (Ctrl) أو وجود (C) 1 نانوميل أو (D) 10 نانومال. تم التقاط الصور في الأيام 1 و3 و5 و7 (من اليسار إلى اليمين). تم صبغ النماذج القائمة على العضوية لتحديد CD24a (علامة خلايا ضوئية، خضراء) وKRT5 (علامة الخلية القاعدية، أرجواني). تم تلوين النوى باستخدام Hoechst 33342 (الأزرق). شريط المقياس: 50 ميكرومتر (n = 4). (E,F) قياس صورة خلايا (E) KRT5+ و(F) CD24a+ في النموذج القائم على العضوية التي نمت بدون DHT (Ctrl)، 1nM أو 10nM. تعرض البيانات كنسبة مئوية من الخلايا الموجبة لكل مجال رؤية. اختبار إحصائي: تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه مع اختبار ما بعد الهجوم لتوكي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: النموذج القائم على العضوية الذي تم تمييزه مع DHT بمقدار 10 نانوميل يظهر استقطابا أعلى للخلايا مقارنة بالضابطة. (أ) تحليل TEER للنموذج القائم على الأعضاء الذي نما لمدة 7 أيام في غياب (Ctrl؛ وردي) ووجود DHT (10 نانومتر؛ أخضر). تمثل أشرطة الخطأ SD (n = 3). اختبار إحصائي: تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه مع اختبار ما بعد الهجوم لتوكي. (B,C) صور مجهر فلورية مناعية تمثيلية للنموذج القائم على العضوية التي نمت لمدة 7 أيام بدون (Ctrl؛ الأعلى) أو ب 10 نانومول DHT (في الأسفل) ومصبوغة ل (B) F-actin (أحمر) و (C) ZO-1 (أحمر). تم تلوين النوى باستخدام Hoechst 33342 (الأزرق). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (n = 3) يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل ديناميكيات العدوى في النموذج القائم على العضويات. (أ) التمثيل التخطيطي لبروتوكول العدوى (القسم 4). (ب) صور مجهرية ممثلة للفلورة المناعية تظهر النموذج القائم على الأعضاء المصاب عند 0 و1 و24 ساعة بعد العدوى (hpi؛ من اليسار إلى اليمين). يتم تصور UPEC باللون الأحمر. تم تلوين النوى باستخدام Hoechst 33342 (الأزرق). شريط المقياس: 50 ميكرومتر (n = 3). (ج) تحليل تدفق الخلايا الخلوية الإيجابية لUPEC (الخلايا المصابة موجبة mChery) عند 0 و1 و24 نقطة انطلاق في نقطة انطلاق الحصان. تظهر استراتيجية البوابات في الشكل التكميلي 4. أشرطة الخطأ تمثل SEM (n = 3). اختبار إحصائي: تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه مع اختبار ما بعد الهجوم لتوكي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: التطور الموركولوجي للنموذج القائم على العضوية مع مرور الوقت. (أ، ب) صور الحقل المضيء لنموذج قائم على الأعضاء في غياب (A) (Ctrl) و(B) وجود 10 نانومال DHT، تم التقاطها في الأيام 0 و1 و3 و5 و7 (من اليسار إلى اليمين). شريط المقياس: 200 ميكرومتر. (n = 3) يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: تركيز DHT يؤثر على نمو العضوية ثلاثية الأبعاد في البروستاتا. (أ) صور برايت فيلد لنموذج قائم على العضوية في غياب (Ctrl؛ الأعلى) ووجود 10 نانوماليت DHT (الأسفل)، تم تصويرها في الأيام 0، 1، 3، 5، و7 (من اليسار إلى اليمين). شريط المقياس: 200 ميكرومتر (n = 3). (ب) قياس حجم العضوية ثلاثية الأبعاد في اليوم السابع المزروعة تحت ثلاث ظروف مختلفة: عدم وجود DHT (Ctrl؛ وردي)، 1 نانومالي DHT (بنفسجي)، و10 نانومالي DHT (أخضر). اختبار إحصائي: تحليل أنوي أحادي الاتجاه مع اختبار ما بعد الهوك لتوكي (n = 3). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: توصيف شكل عضويات البروستاتا وقطبية الظهارة. (أ) إسقاطات متعامدة لأكوام Z كونفوكال توضح تنظيم الظهارة وقطبية من العمود إلى القاعدي تحت تركيزات DHT المختلفة (Ctrl، 1 نانومال، و10 نانومال. DHT). تم صبغ الخلايا القاعدية ل KRT5 (أرجواني) والخلايا اللومعية ل CD24a (الأخضر). شريط الميزة: 50 ميكرومتر. (B) تلوين فلوري مناعي لنسيج البروستاتا المدمج في OCT يظهر علامات ظهارية قاعدية (KRT5، أرجواني) ومضيئة (CD24a، خضراء). يتم صبغ النوى بصبغة DAPI (زرقاء). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. لفترة وجيزة، تم تثبيت أجزاء نسيج الفأر بنسبة 4٪ من PFA، وتم تجفيفها طوال الليل بنسبة 30٪ سكروز، وتم تثبيت32٪ في OCT. ثم تم ترطيب الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق وصبغها المناعي بعد القسم 3. (ج) تحليل الكيمياء المناعية لتعبير بروتيني CD24a وKRT5 في أنسجة البروستاتا البشرية (تم استخراج اللوحة C من قاعدة بيانات أطلس البروتين البشري (الإصدار 25.0؛ أطلس البروتين البشري proteinatlas.org)، أولين، م. وآخرون (2015)33، https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 4: استراتيجية تحديد الخلايا المصابة بقياس تدفق الخلايا الخلوية لتحديد الخلايا المصابة. تم تحديد الخلايا أولا بناء على ارتفاع التشتت الجانبي (SSC-H) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) لاستبعاد الحطام، تلاها ببواب على SSC-H مقابل منطقة التشتت الجانبي (SSC-A) لاختيار الخلايا الفردية. ثم تم تحديد الخلايا المصابة (المصابة) الموجبة mCherry باستخدام العد مقابل تألق PE-تكساس Red-H (المخطط التكراري). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تؤثر مجموعة من الأمراض على البروستاتا، بما في ذلك فرط التنسج الحميد للبروستاتا، والتهاب البروستاتا، وسرطان البروستاتا. هذه الأمراض منتشرة بشكل كبير وتؤثر بشكل كبير على جودة حياة المرضى2. على الرغم من تأثيرها الكبير على الرعاية الصحية، لا يزال فهمنا لهذه الأمراض، وخاصة الآليات الأساسية واستجابات المضيف في الحالات غير السرطانية، محدودا. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى نقص النماذج التجريبية ذات الصلة الفسيولوجية. من ناحية، لا تلتقط خطوط الخلايا الخالدة تعقيد أو حالة التمايز لظهارة البروستاتا الطبيعية. من ناحية أخرى، تثير نماذج الحيوانات، وخاصة القوارض، مخاوف أخلاقية وليست فعالة من حيث التكلفة. نهج بديل هو استخدام الخلايا الأولية البشرية أو إزالة الأنسجة المشتقة من المرضى. ومع ذلك، فإن توفر نسيج البروستاتا الطازج المحدود يحد من انتشارها على نطاق واسع. تسلط هذه القيود الضوء على الحاجة إلى أنظمة أخرى في المختبر ذات صلة فسيولوجيا، وسهلة الاستخدام، وقابلة للإدارة تجريبيا. في هذا السياق، غيرت تقنية الخلايا الجذعية العضوية للبالغين نمذجة الأمراض. تمتلك هذه الثقافات ثلاثية الأبعاد القدرة على التنظيم الذاتي، مما يحافظ على هوية الظهارة وتنوع الخلايا الظهارية 23,34,35,36,37,38. بينما مكنت بنيتها ثلاثية الأبعاد من التطبيقات في أبحاث السرطان، واختبار الأدوية، والطب التجديدي 23,34,35,36,37,38,39,40,41، إلا أن هيكلها المغلق، مع سطح القمة مواجها للداخل، يشكل تحديات عملية للوصول التجريبي، خاصة في المختبر نماذج العدوى. تعالج الأعضاء ذات الخروج من القطع هذا القيد من خلال عكس قطبية الظهارة، مكشوفة السطح القمي لدراسات عدوى مباشرة27،28. ومع ذلك، قد تكون فعاليتها كنموذج للعدوى محدودة بسبب التفاوت في حجمها، والتعرض غير المتكافئ لمسببات الأمراض، وهشاشة العدوى طويلة الأمد.

هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج قائم على العضوية لبروستاتا الفأر يعيد تلخيص تركيب الخلايا الظهارية والملف النسخي لظهارة الفأر الأصلية، مع توفير وصول سهل إلى سطح القمة. تم تحسينها في عملناالسابق رقم 32، ويسمح هذا النموذج بالتحكم الدقيق في المتغيرات التجريبية الرئيسية، بما في ذلك كثافة البذر، والتعرض الموحد للمحفزات، ونسب البكتيريا إلى الخلايا المحددة، ومعلمات التصوير عالية الإنتاجية التي يصعب توحيدها في الأنظمة العضوية ثلاثية الأبعاد التقليدية.

تماشيا مع مبدأ 3Rs (استبدال، تقليل، تنقية) للتجارب الحيوانية42، فإن الأعضاء المستخدمة كمصدر للخلايا الأولية لهذا النموذج مشتقة من فئران برية ساذجة تم التضحية بها لأغراض غير مرتبطة مثل التربية. يتم الحصول على البروستاتا من خلال التبرعات من مرافق الحيوانات القريبة، مما يقلل الحاجة للتضحية بحيوانات إضافية خصيصا لهذا البروتوكول.

يعد التمايز القوي والموثوق بين العضويات والنماذج القائمة على العضوية أمرا بالغ الأهمية لتكرار التركيب الخلوي والخصائص الوظيفية للأنسجة الأصلية بأمانة لضمان أهميتها كنماذج مختبرية. يتأثر تمايز الخلايا داخل الأعضاء بشكل كبير بالتركيب المحدد لوسط الزراعة، بما في ذلك التركيز الدقيق لعوامل النمو والعوامل الدوائية (أي مثبطات الأدوية). يمكن التلاعب بهذه العوامل التمايز المباشر نحو سلالات خلايا محددة، كما يظهر في أنظمة عضوية مختلفة. على سبيل المثال، في الأعضاء المعوية، يؤدي إزالة الشبكة البيضاء إلى تعزيز تمايز الخلايا المعوية، والذي يمكن تعزيزه أكثر بواسطة الإنترفيرون غاما (تمت مراجعته في38). يمكن تحقيق التمايز إلى خلايا الكأس عن طريق إزالة مثبط p38 والنيكوتيناميد أو عن طريق تثبيط نوتش عبر DAPT/DBZ (تمت مراجعته في38). كما ثبت أن IGF-1 وFGF-2 يدعمان التوسع طويل الأمد لزراعة الخلايا الإفرازيةالغنية بالخلايا 43. علاوة على ذلك، يعزز IL-22 تمايز خلايا بانيث، وتنشأ الخلايا المعوية الصماء من خلال تثبيط المسارات بما في ذلك نوتش وBMP38. وبالمثل، تظهر الأعضاء المعدية وطبقات الأحادية القائمة على الأعضاء تمايز تجاه خلايا الحفرة عند سحب WNT من وسط الزراعة، بينما يوجه النيكوتيناميد إلى الوسط الخلايا إلى نمط ظاهري للغدة (الرقبة وخلايا الرأس) 31,44,45.

في البروستاتا، يلعب مستقبل الأندروجين (AR) دورا حيويا في الحفاظ على توازن الأنسجة 46,47,48,49. يتم تحويل التستوستيرون، الذي تنتجه خلايا لايديج في الخصيتين، إلى DHT في خلايا ظهارة البروستاتا بواسطة إنزيم 5α-reductase. ينشط DHT الحمض الريدروني، الذي يتحول إلى النواة، وينتقل إلى النواة، ويرتبط بعناصر استجابة الأندروجين لتنظيم الجينات المشاركة في تمايز الخلايا والتوازنالداخلي 50. أظهرت دراسات سابقة أن مكملات 1 نانوميل في عضويات البروستاتا ثلاثية الأبعاد في الفأر كافية لتحقيق تمايز الخلايا إلى خلايا ضوئية51. وأظهر آخرون أيضا أن مكملات فيتامين د (وتحديدا 1,25-ديهيدروكسي فيتامين د) عززت نمو عضويات البروستاتا البشرية وتسريع التمايز من خلال تثبيط النشاط القياسي للبروستاتا وتقليل عضو عائلة WNT DKK352. ومع ذلك، في هذه الدراسات، تم استخدام العضويات ثلاثية الأبعاد فقط. أظهر عملنا السابق32 وآخرون53 أن مكملات DHT بجرعة 10 نانومتر في الأعضاء ثلاثية الأبعاد ليست كافية لتحقيق التمايز الكامل. على النقيض من ذلك، فإن استخدام النموذج ثنائي الأبعاد الموصوف هنا، وهو زرع الخلايا في 2D ب 10 نانوماليت DHT، يكفي لتمييز النموذج إلى حالة مشابهة للنسيج الأصلي32. لفهم هذا الفرق بين النماذج ثلاثية الأبعاد وثنائية الأبعاد، سيكون هناك حاجة لمزيد من العمل، لكن يمكن تفسيره باختلاف الإشارات الميكانيكية-الفيزيائية بين الأنظمة أو بوجود عوامل نمو تحتوي على ECM في النموذج ثلاثي الأبعاد.

يمكن العثور على ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا الظهارية في نسيج البروستاتا البالغ: الخلايا اللومية، والقاعدية، والخلايا العصبية الصماء. من بين هذه النماذج فقط، توجد خلايا لومينية وقاعدية فقط في جميع النماذج العضوية المنشورة حتى الآن. غياب الخلايا النادرة في الغدد الصماء العصبية يشير إلى أن بروتوكولات العضوية الحالية قد لا تكون محسنة بالكامل. بين الخلايا اللومية والقاعدية، تم وصف مجموعة الخلايا الوسيطة في البروستاتا بأنها حالة انتقالية تعبر عن كل من العلامات اللومية (أي CD24a) والقاعدية (أي SCA-1)18,51. غالبا ما توجد هذه المجموعة الفرعية في منطقة البروستاتا حول الإحلال، ولهذا السبب يشار إليها غالبا باسم الخلايا المضيئة حول الإحليل54. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن ذلك في بعض أنظمة العضوية ثلاثية الأبعاد تحت ظروف تمايز أو إشارات محددة 53,55، إلا أننا لا نلاحظ فصلا واضحا بين الخلايا الضوئية والمتوسطة في نظامنا32. أحد التفسيرات المحتملة هو أنه أثناء توليد الأعضاء ثلاثية الأبعاد، لا نميز بين مناطق البروستاتا المختلفة، ولتجنب التلوث بخلايا الإحليل، نقوم بإزالة الأنسجة المجاورة مباشرة لاتصال البروستاتا الإحليلية. لذلك، فإن الزراعة العضوية المشتقة من المناطق القريبة أو المجاورة للإحليل من المرجح أن تكون أكثر قدرة على توليد خلايا وسيطة.

تعتبر سلامة الحاجز علامة مميزة للظهارة الناضجة والمميزة، حيث توفر حاجزا واقيا ضد وصول السموم والميكروبات إلى الأنسجة الأساسية. تلعب الوصلات المحكمة (الغنية ببروتينات ZO-156) دورا حيويا في تنظيم نفاذية الخلايا الجانبية والحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري57. مع تمايز الخلايا الظهارية، فإن نضج هذه الوصلات بين الخلايا يقوي الحاجز58. لذا، فإن تقييم سلامة الحاجز هو قراءة مهمة لنموذج الظهارة في المختبر . في هذا البروتوكول، نعرض ثلاث طرق مكملة لتقييم سلامة الحاجز: قياس TEER، وتلوين المناعة ZO-1، وتلوين F-actin. بينما تقيم الطرق الثلاث بفعالية سلامة الحواجز، إلا أنها تختلف بشكل كبير في المعدات والموارد المطلوبة. توفر قياسات TEER قيمة كمية يمكن تتبعها عبر الزمن، مما يوفر رؤية ديناميكية لدالة الحاجز؛ ومع ذلك، تتطلب هذه التقنية أجهزة وبرمجيات متخصصة قد لا تكون متوفرة في كل مختبر. على النقيض من ذلك، التلوين بالأجسام المضادة المضادة ZO-1 أو الفالويدين أكثر قابلية للإدارة من حيث الوقت والتكلفة (مثلا، يمكن تلوين الفالويدين في حوالي 3 ساعات - القسم 3).

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام عضويات البروستاتا ثلاثية الأبعاد من الفأر لإنشاء نموذج ثنائي الأبعاد يمكن الوصول إليه من الناحية القمة. وقد أوضحت عدة مراجعات مزايا وعيوب العضويات والأنظمة القائمة على العضوية في دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض 23,36,59. في دراسات العدوى، من الضروري النظر في الموقع الطبيعي للتفاعل بين مسببات الأمراض والظهارة المضيفة. في البروستاتا، تكون الخلايا اللومينية عادة نقطة الاتصال الأولى، ولذلك فإن الوصول إلى السطح القمي ضروري لنمذجة ديناميكيات العدوى بدقة. في عضويات البروستاتا ثلاثية الأبعاد التقليدية، يواجه السطح القمي تجويف العضوية ولا يمكن الوصول إليه مباشرة. في هذه المناطق، يمكن تحقيق التعرض للمسبب الممرض من خلال الحقن الدقيق، وهو منخفض الإنتاج وصعب تقنيا، أو عن طريق تعطيل الأعضاء العضوية، مما يضر بقطبية الظهارة ويؤدي إلى تفاعل غير فسيولوجي23. على النقيض من ذلك، يوفر النموذج ثنائي الأبعاد المتاح للقمة المعروض في هذا البروتوكول وصولا مباشرا إلى السطح الضوئي. يتيح ذلك التعرض المسيطر عليه وذو الصلة الفسيولوجية بمسببات الأمراض، وتنظيم دقيق لمؤشر الصناعة، والتوافق مع منصات التصوير عالية الإنتاجية والدقة أو أنظمة الخلايا الحية. هنا، نعرض استخدام هذا النموذج كنظام عدوى في المختبر باستخدام السلالة المرجعية UPEC UPEC UTI89، وهي مرجع واسع الاستخدام تمثل النوع البكتيري الرئيسي المسؤول عن التهاب البروستاتاالبكتيري 9. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة لدراسة مسببات أمراض البروستاتا الأخرى مثل المكمكة المعوية الجنوية أو Pseudomonas aeruginosa، مما يجعله منصة متعددة الاستخدامات لبيولوجيا العدوى في البروستاتا.

يعد تفكك العضويات ثلاثية الأبعاد خطوة حاسمة لنجاح تأسيس نموذج القائم على العضويات. الفشل في تفكيك الأعضاء ثلاثية الأبعاد بالكامل، مما يؤدي إلى شظايا كبيرة، يمكن أن يؤثر على التصاق الخلايا بسطح الزراعة، بينما يقلل التعرض المطول لمادة التفكك لأكثر من 30 دقيقة من قدرة الإصابة على الجسم. علاوة على ذلك، فإن الحفاظ على فترة مرور ثابتة تقارب سبعة أيام قبل الانفصال والبذر أمر ضروري، حيث تؤثر الحالة الفسيولوجية للعضويات بشكل كبير على قدرتها على الالتصاق والتمايز. متغير حاسم آخر يؤثر على نجاح تطوير نموذج القائم على عضويات البروستاتا هو كثافة البذر. تم تحسين تركيز البذر المستخدم هنا للتمايز على مدى 7 أيام. زيادة أو تقليل هذا التركيز من المرجح أن يؤدي إلى أوقات تمايز مختلفة. علاوة على ذلك، فإن إعادة تعليق الخلايا غير الكافية قبل الطلاء يمكن أن تؤدي إلى توزيع غير متساو للخلايا عبر الآبار، مما يؤدي إلى كثافات خلاوية متغيرة تؤثر بدورها على كل من التكاثر والتمايز. بالإضافة إلى ذلك، كما هو الحال في نماذج العضويات الأخرى، يمكن لدفعات مختلفة من ECM أو عوامل النمو أن تؤثر على النمو والقدرة على التمايز. لذلك، من المهم التحقق من أن النموذج القائم على العضوية يحتفظ بنمط ظاهري ثابت بعد أي تغيير في عدد دفعات أو دفعات عامل النمو.

بمجرد تأسيس النموذج القائم على العضويات، يجب أيضا تحسين معايير العدوى بعناية. غالبا ما تكون MOI مختلفة مطلوبة لتحقيق مستويات عدوى قوية وقابلة للتكرار حسب السلالة البكتيرية والقراءة المختارة. بالنسبة لسلالة UPEC UPEC UTI89 (المستخدمة هنا وفي32) ولعدة عزلات من التهاب البروستاتا32، كان MOI 100 كافيا للحصول على عدد موثوق من الخلايا المصابة عبر نقاط الالتصاق والغزو والتكاثر. ومع ذلك، إذا كان يجب تمديد حضانة الخلايا التي تحتوي على البكتيريا لأكثر من ساعة، يجب استخدام مؤشر MOI أقل لمنع النمو الزائد لفيروس UPEC خارج الخلية في الوسط والسمية اللاحقة للخلايا. في هذا البروتوكول، تم تقييم العدوى باستخدام طريقتين: 1) قياس تدفق الخلايا لقياس نسبة الخلايا المصابة، و2) المجهر الكونفوكالي لتقييم موقع البكتيريا. ومع ذلك، يمكن استخدام عدة طرق أخرى أيضا، مثل اختبارات وحدة تشكيل المستعمرات لقياس البكتيريا32، أو التلوين المناعي للكشف عن علامات المضيف أو البكتيريا32، أو التحليلات الترانسكريبتومية لتحديد استجابات المضيف.

بينما يوفر نموذج القائم على عضويات البروستاتا نظاما فسيولوجيا ذا صلة، يجب أخذ عدة قيود في الاعتبار عند تطبيقه على أبحاث العدوى. أحد القيود الرئيسية لهذا النموذج هو غياب الخلايا المناعية المقيمة أو الطرفية، مما يحد من قدرته على التقاط استجابة المضيف بالكامل للعدوى (مثل تجنيد الخلايا المناعية أو التطهير المناعي). تشمل المكونات الأساسية الأخرى المفقودة من النموذج الأوعية الدموية، والستروما، والأعصاب، وكلها قد تؤثر على تفاعلات المضيف مع الممرض. إدخال أنواع إضافية من الخلايا، مثل الخلايا الليفية البتكية، وخلايا المناعة، والخلايا البطانية، سيساعد في إعادة خلق بيئة نسيج أكثر اكتمالا. يمكن لأنظمة الزراعة المشتركة المتقدمة أو منصات الأعضاء الميكروفلويدية على شريحة أن تدعم تفاعلات خلوية معقدة وتمكن من دراسات ديناميكية للعدوى. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام الأعضاء المشتقة من نماذج حيوانية، يجب أخذ الفروق الخاصة بالنوع في الاعتبار، خاصة عند دراسة مسببات الأمراض الخاصة بالبشر. على الرغم من أن عملناالسابق 32 أظهر أن نتائج نموذج الفأر القائم على عضويات البروستاتا يمكن أن تتكاثر في الأنسجة البشرية، إلا أن التنوع بين الأنواع في تنظيم الجينات، أو تعبير المستقبلات، أو الاستجابات الهرمونية قد لا يزال يحد من الصلة المباشرة للنموذج بفسيولوجيا الإنسان. إن دمج الأعضاء المشتقة من الإنسان، عندما يكون ممكنا، سيعزز القيمة الترجمية من خلال تمكين دراسة تفاعلات واستجابات مسببات الأمراض الخاصة بالبشر. بينما يمكن لهذه الإضافات أن تعزز النماذج القائمة على العضوية كأدوات قوية لدراسة بيولوجيا البروستاتا، ومسببات العدوى، والتطور العلاجي، فإن النموذج الظلائي البحت الذي نقدمه يقدم نظاما مبسطا ومجزأا. يتيح ذلك دراسة مركزة في تفاعلات المضيف والممرض الخاصة بالظهارة دون تدخل من مكونات الأنسجة الأخرى.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل من قبل BMFTR (FiRe-UPec, 01KI2107 to C.A.)، والمؤسسة الألمانية للأبحاث (DFG GRK 2157؛ نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد لدراسة العدوى الميكروبية بواسطة مسببات الأمراض البشرية، المشروع 11 إلى C.A.). نشكر ناتالي بوركارد ونيكولا شليغل (مستشفى جامعة فورتسبورغ) على دعمهم بمعدات ECIS1600R. تم إنشاء المخططات باستخدام BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
48 لوحة بئرسارستيدت83.3923شكل القاع: مسطح
5α-أندروستان-17&بيتا;-أول-3-ون ديهيدروتستوستيرونسيغما-ألدرتشA8380تم تصنيفه ك DHT. محلول المخزون 10μ M بإيثانول 100٪
شريحة PET ب 8 آبار مع 40 قطبا كهربائيا لكل بئر الفيزياء الحيوية التطبيقية8W10E+الشرائح المستخدمة في قياسات TEER
96 لوحة بئرسارستيدت82.1583شكل القاع: مخروطي
أدفانس دولبيكو s معدل من إيجل متوسط/F12 ثيرمو فيشر العلمي12634028تم تصنيفه adDMEM/F12+/+ عند تعزيزه بجرعة 10 ملمول L&minus؛ 1 HEPES و1x GlutaMAX
أمبيسيلينروثK029.2 مخزون التركيز 100 ملغ/مل
الأجسام المضادة المضادة ل CD24aبروتين تك10600-1-APالجسم المضاد الأساسي؛ التخفيف 1:100 في 1x PBS 1٪ BSA
مضاد السيتوكيراتين 5 أليكسا فلور 647 الجسم المضاد  Abcam ab193895الجسم المضاد الأساسي؛ التخفيف 1:100 في 1x PBS 1٪ BSA
مضاد للأرنب IgG أليكسا فلور 488  الأجسام المضادةإنفيتروجينA21441الأجسام المضادة الثانوية؛ التخفيف 1:500 في 1x PBS 1٪ BSA
الأجسام المضادة متعددة النسيات المضادة ZO-1بروتين تك21773-1-APالجسم المضاد الأساسي؛ التخفيف 1:750 في 1x PBS 1٪ BSA
B27، 50xثيرمو فيشر العلمي12587010
ألبومين بافنز سيرومالبومين (BSA) فراكتيون V، نيوزيلندا-أوريجنروث8076.3مكون من مخزن الحجب المستخدم عند 1٪ في 1x PBS
آبار ذات حجرة وميكرو - شريحة 8إيبيدي80806تعديل السطح: ibiTreat
أنبوب مخروطي (15 مل)سيغما ألدريتشT1943القاع المسطح أفضل للحبيبات الصغيرة.
ثنائي الصوديوم إيثيلين ديامين تيترا-أسيتات 2H2O (EDTA)روث  8043.2صنع منزلي: 93.0 جرام في 400 مل من H2O، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0، فقط حجم H2O يصل إلى 500 مل؛ 0.5 مليون بتوقيت شرق الولايات المتحدة؛ مكون مخزن جهاز قياس التدفق الخلوي
محلول الملح المتوازن من دولبيكو (DPBS)جيبكو14190-144PBS
مجهر إيكو الدوار صدى
ECIS  Z-Theta -  نظام تحليل الخلايا المعتمد على المقاومةالفيزياء الحيوية التطبيقيةECIS  Z-Thetaيشمل النظام: محطة بئر 16 و/أو 96؛ وحدة التحكم الخارجية؛ حاسوب محمول؛ برمجيات التحكم والاكتساب والعرض في ECIS؛ وحدة المجال المرتفع للهجرة الآلية للخلايا والتثقيف الكهربائي  
مصل البقر الجنيني (FBS) سوبيريورسيغما ألدريتشS0615مكون من مخزن مقياس التدفق الخلوي؛ مكون وسط الزراعة لخط خلية 293T; مكون وسط الزراعة HEK293T خط الخلية
فلاش فالويدين ريد 594الأسطورة الحيوية424203تخفيف 1:250 في 1x PBS 1٪ BSA
مخزن مقياس تدفق الخلايا1x PBS، 10٪ FBS، 5 mM EDTA
جنتاميسين سيغما ألدريتشG1272
غلوتا ماكس ثيرمو فيشر العلمي35050-038ديببتيد L-ألانيل-إل-جلوتامين، مكون من adDMEM/F12+/+ 
مقياس كثافة الخلايا Harvard Biochrom Ultrospec 10فيشر ساينتيفك10704417
صبغة HCS CellMask الأحمر العميقتقنيات الحياةH32721التخفيف بنسبة 1:1,000 في 1x PBS 1٪ BSA
HEK293T خط الخلية تم تحويله بواسطة متجه تعبير Noggin-Fc للفأرخط الخلية من البروفيسور الدكتور كليفرزكان يستخدم لإنتاج نوجين؛ وسط الزراعة: 500 مل DMEM، عالي الجلوكوز، جلوتا ماكس، بيروفات (Gibco Life Technologies، 31966)+ 50 مل FBS؛ فارين وآخرون. أمراض الجهاز الهضمي 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES ثيرمو فيشر العلمي15630056مكون adDMEM/F12+/+ 
هوشست 33342 تقنيات الحياةH3570التخفيف بنسبة 1:5,000 في 1x PBS
عامل نمو البشرة البشرية (EGF) بيبروتيكAF-100-15مخزون تركيز 500 وميكرو؛ g/mL
حلقات التطعيمسارستيدت86.1567.010
أنابيب التطعيمسارستيدت62.515.006
مجهر لايكا ستيلاريس 5 الكونفوكاللايكا
مرق لوريا بيرتاني (مرق LB)روث  X968.1
ماتريجيلكورنينغ356231المصفوفة خارج الخلية (ECM)
N-أستيل سيستين  سيغما-ألدرتشA9165-25Gمخزن التركيز 500 ملليمولار
نوجين سي إم
NovoCyte Quanteon أجيلينتمقياس التدفق الخلوي
بارافورمالديهايد (PFA)سيغما ألدريتشP6148استخدم بنسبة 4٪ في 1x PBS، 4٪ سكروز
بريموسينإنفيفوجينأنت-بي إم-1
Q-VETTES شبه ميكروراتيو لاب2712120
روكي (Y-27632)أبمولM1817مثبط RhoA/ROCK؛ مخزن التركيز 10 ملليمولار
R-سبودين1 سم
R-Spondin1 يعبر عن خط خلية 293Tسيغما ألدريتشSCC111يستخدم لإنتاج R-spo1 CM؛ وسط الزراعة: 500 مل DMEM، عالي الجلوكوز، جلوتا ماكس، بيروفات (جيبكو لايف تكنولوجيز، 31966)+ 60 مل FBS 
TGF β i (A-83-01)توكريس2939مثبط ALK4/5/7؛ مخزون تركيز 5 ململم 
ترايتون X-100 سيغما ألدريتشT9284تم استخدام 0.5٪ مخفف في PBS 1x
إنزيم TrypLE Express  جيبكو12605028عامل تفكك الخلايا الإنزيمي لهضم عضويات البروستاتا ثلاثية الأبعاد للفئران
الممرضات Escherichia coli سلالة المسالك البولية UTI89سلالة WT من البروفيسور الدكتور دوبرينتتم تحويله باستخدام pFPV-mCherry (addgene #20956)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Samanta, L., Parida, R., Dias, T. R., Agarwal, A. The enigmatic seminal plasma: A proteomics insight from ejaculation to fertilization. Reprod Biol Endocrinol. 16 (1), 1-11 (2018).
  2. Ma, C., Su, H., Li, H. Global Research Trends on Prostate Diseases and Erectile Dysfunction: A Bibliometric and Visualized Study. Front Oncol. 10, 627891(2021).
  3. Roehrborn, C. G. Benign prostatic hyperplasia: an overview. RIU. 7 (Suppl 9), S3-S14 (2005).
  4. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Arch Intern Med. 164 (11), 1231-1236 (2004).
  5. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  6. Krieger, J. N., Nyberg, L., Nickel, J. C. NIH consensus definition and classification of prostatitis [5]. JAMA. 282 (3), 236-237 (1999).
  7. Khan, F. U., et al. Comprehensive overview of prostatitis. Biomed Pharmacother. 94, 1064-1076 (2017).
  8. Lipsky, B. A., Byren, I., Hoey, C. T. Treatment of bacterial prostatitis. Clin Infect Dis. 50 (12), 1641-1652 (2010).
  9. Krieger, J. N., Thumbikat, P. Bacterial Prostatitis: Bacterial Virulence, Clinical Outcomes, and New Directions. Microbiol Spectr. 4 (1), (2016).
  10. Mizokami, A., Gotoh, A., Yamada, H., Keller, E. T., Matsumoto, T. Tumor necrosis factor-alpha represses androgen sensitivity in the LNCaP prostate cancer cell line. J Urol. 164 (3 Pt 1), 800-805 (2000).
  11. Lin, H. P., et al. Difference in protein expression profile and chemotherapy drugs response of different progression stages of LNCaP sublines and other human prostate cancer cells. PLoS ONE. 8 (12), e82625(2013).
  12. Conte, M. P., et al. The adherent/invasive escherichia coli strain lf82 invades and persists in human prostate cell line rwpe-1, activating a strong inflammatory response. IAI. 84 (11), 3105-3113 (2016).
  13. Pennanen, P., et al. The effects of metformin and simvastatin on the growth of LNCaP and RWPE-1 prostate epithelial cell lines. Eur J Pharmacol. 788, 160-167 (2016).
  14. Abate-Shen, C., Shen, M. M. Mouse models of prostate carcinogenesis. Trends Genet. 18 (5), S1-S5 (2002).
  15. Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. IAI. 79 (2), 628-635 (2011).
  16. Irshad, S., Abate-Shen, C. Modeling prostate cancer in mice: Something old, something new, something premalignant, something metastatic. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 109-122 (2013).
  17. Lupo, F., Rousseau, M., Canton, T., Ingersoll, M. A. The Immune System Fails to Mount a Protective Response to Gram-Positive or Gram-Negative Bacterial Prostatitis. J Immunol. 205 (10), 2763-2777 (2020).
  18. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocr Relat Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. McClurg, U. L., et al. Human ex vivo prostate tissue model system identifies ING3 as an oncoprotein. Br J of Cancer. 118 (5), 713-726 (2018).
  21. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesisin a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Sci. 345 (6194), 1247125(2014).
  22. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  23. Aguilar, C., Alves da Silva, M., Saraiva, M., Neyazi, M., Olsson, I. A. S., Bartfeld, S. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Exp and Mol Med. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  24. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  25. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  26. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Prot. 11 (2), 347-358 (2016).
  27. Co, J. Y., et al. et al Controlling Epithelial Polarity: A Human Enteroid Model for Host-Pathogen Interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520.e4 (2019).
  28. Stroulios, G., et al. Apical-out airway organoids as a platform for studying viral infections and screening for antiviral drugs. Sci Rep. 12 (1), 7673(2022).
  29. Mayorgas, A., et al. A Novel Strategy to Study the Invasive Capability of Adherent-Invasive Escherichia coli by Using Human Primary Organoid-Derived Epithelial Monolayers. Front Immunol. 12, 646906(2021).
  30. Tindle, C., et al. Adult stem cell-derived complete lung organoid models emulate lung disease in COVID-19. eLife. 10, e66417(2021).
  31. Aguilar, C., et al. Helicobacter pylori shows tropism to gastric differentiated pit cells dependent on urea chemotaxis. Nat Commun. 13 (1), 5878(2022).
  32. Guedes, M., et al. Uropathogenic Escherichia coli invade luminal prostate cells via FimH-PPAP receptor binding. Nat Microbiol. , 1-16 (2026).
  33. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  34. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 20 (5), 279-293 (2020).
  35. Bose, S., Clevers, H., Shen, X. Promises and challenges of organoid-guided precision medicine. Med. 2 (9), 1011-1026 (2021).
  36. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  37. van der Vaart, J., Clevers, H. Airway organoids as models of human disease. J Intern Med. 289 (5), 604-613 (2021).
  38. Paužuolis, M., Samperio Ventayol, P., Neyazi, M., Bartfeld, S. Organoids as a tool to study the impact of heterogeneity in gastrointestinal epithelium on host-pathogen interactions. Clin Exp Immunol. 218 (1), 16-27 (2024).
  39. Kondo, J., Inoue, M. Application of cancer organoid model for drug screening and personalized therapy. Cells. 8 (5), 470(2019).
  40. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on Three Dimensional Organoid Studies for Stem Cell Therapy in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  41. Peng, Z., Lv, X., Sun, H., Zhao, L., Huang, S. 3D tumor cultures for drug resistance and screening development in clinical applications. Mol Cancer. 24 (1), 93(2025).
  42. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. J Exp Biol. 220 (17), 3007-3016 (2017).
  43. Fujii, M., et al. Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793.e6 (2018).
  44. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136.e6 (2015).
  45. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  46. Tan, M. E., Li, J., Xu, H. E., Melcher, K., Yong, E. Androgen receptor: structure, role in prostate cancer and drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 36 (1), 3-23 (2015).
  47. Zhou, Y., Bolton, E. C., Jones, J. O. Androgens and androgen receptor signaling in prostate tumorigenesis. J Mol Endocrinol. 54 (1), R15-R29 (2015).
  48. Xie, Q., Liu, Y., Cai, T., Horton, C., Stefanson, J., Wang, Z. A. Dissecting cell-type-specific roles of androgen receptor in prostate homeostasis and regeneration through lineage tracing. Nat Commun. 8 (1), 14284(2017).
  49. Vickman, R. E., et al. The role of the androgen receptor in prostate development and benign prostatic hyperplasia: A review. Asian J Urol. 7 (3), 191-202 (2020).
  50. Likos, E., Bhattarai, A., Weyman, C. M., Shukla, G. C. The androgen receptor messenger RNA: what do we know. RNA Biol. 19 (1), 819-828 (2022).
  51. Karthaus, W. R., et al. Regenerative potential of prostate luminal cells revealed by single-cell analysis. Science. 368 (6490), 497-505 (2020).
  52. McCray, T., et al. Vitamin D sufficiency enhances differentiation of patient-derived prostate epithelial organoids. iScience. 24 (1), 101974(2021).
  53. De Felice, D., et al. Rarγ-Foxa1 signaling promotes luminal identity in prostate progenitors and is disrupted in prostate cancer. EMBO Rep. 2024 (2), 443-469 (2024).
  54. Crowley, L., et al. A single-cell atlas of the mouse and human prostate reveals heterogeneity and conservation of epithelial progenitors. eLife. 9, 1-24 (2020).
  55. Cambuli, F., et al. Intra-epithelial non-canonical Activin A signaling safeguards prostate progenitor quiescence. EMBO Rep. 23 (5), e54049(2022).
  56. Kuo, W. T., Odenwald, M. A., Turner, J. R., Zuo, L. Tight junction proteins occludin and ZO-1 as regulators of epithelial proliferation and survival. Ann N Y Acad Sci. 1514 (1), 21-33 (2022).
  57. Yazici, D., et al. The epithelial barrier: The gateway to allergic, autoimmune, and metabolic diseases and chronic neuropsychiatric conditions. Semin. Immunol. 70, 101846(2023).
  58. Zeyneloglu, C., et al. The epithelial barrier theory proposes a comprehensive explanation for the origins of allergic and other chronic noncommunicable diseases. FEBS Lett. 599 (22), 3208-3243 (2025).
  59. Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoid Models for Infectious Disease. Annu Rev Med. 73 (1), 167-182 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prostate Organoid ModelHost Pathogen InteractionsMouse Prostate OrganoidsEpithelial DifferentiationUropathogenic Escherichia ColiImmunofluorescence MicroscopyTwo Dimensional CultureCell AttachmentGentamycin Protection AssayConfocal Microscopy

Related Articles