مقالة منهجية

العزل الموحد وتحضير الخلايا البمثيرة المتوسطة النسيمية المشتقة من نخاع العظم في الفئران لتعزيز التعديل المناعي

DOI:

10.3791/69397

⸱

ديسمبر 5, 2025

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Laboratory, ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health, Indian Council of Medical Research (ICMR), 2Department of Medicine and Carbone Cancer Center, University of Wisconsin in Madison

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نعرض بروتوكولا لعزل خلايا البترومال المتوسطة النخوة المشتقة من نخاع عظم الفئران إلى جانب طريقة تحضير السيتوكينات لتعزيز تأثير BMSCs المثبط للمناعة على الخلايا المناعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمتلك خلايا البكر الميزنشيمي (MSCs) وظائف قوية في التجدد وتعديل المناعة. تجعل هذه الخصائص من MSCs أدوية خلوية قوية لعلاج اضطرابات المناعة المتعددة. يعد نخاع العظم المصدر الرئيسي والأكثر استخداما لمراكز MSCs. تعد الدراسات الميكانيكية قبل السريرية باستخدام نماذج الفأر ضرورية لاكتساب المعرفة بأفضل استراتيجيات توصيل الأدوية لأجهزة BMSC في التجارب السريرية البشرية. لذا، فإن توحيد عملية تصنيع مراكز MSC في الفأر أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج علاجية أفضل. الهدف المركزي لهذا البروتوكول هو إظهار كيف يعزز التمهيد بالإنترفيرون-غاما (IFN-γ) الخصائص الذاتية المثبطة للمناعة في BMSCs. نحن نصف توليد الوسائط المشرفة (CM) من الخلايا البلعمية غير المعالجة أو المرخصة مسبقا ب IFN-γ ونقيم نشاطها البيولوجي باستخدام البلعم الصفاقية الأولية. من خلال ELISA والتحليل الخلوي المتدفق (تدفق الخلايا الخلوية)، يوضح البروتوكول كيف أن الإفرازات المستمدة من BMSC - خاصة عند تعهيد IFN-γ - تدفع استقطاب البلاعم المضاد للالتهابات الذي يتميز بزيادة إنتاج IL-10 وعلامات السطح المرتبطة ب M2. بشكل عام، يضع هذا البروتوكول إطارا موحدا لإنتاج مراكز BMSC للفئران المتسقة وظيفيا ولتقييم قوتها المناعية. من خلال تقليل التنوع التقني وتوفير وضوح بصري وإجرائي، يدعم تحسين قابلية التكرار في أبحاث MSC قبل السريرية ويسهل استراتيجيات نشر MSC المحسنة للدراسات الترجمية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع الخلايا البثوية المتوسطة النخاع المشتقة من نخاع العظم (BMSCs) بتطبيقات واسعة في الدراسات ما قبل السريرية والسريرية. تجعل مناعتها المنخفضة، سهولة الوصول إليها، وقدرتها على التمايز متعدد السلالات مرشحات واعدة للاستخدام في البيئات السريرية كأدوية خلوية 1,2,3. تم استغلال خصائصها المثبطة للمناعة والتجدد بشكل واسع في الدراسات السريرية لعلاج اضطرابات التهابية مثل مرض الطعم ضد المضيف (GVHD)4، تعفن الدم5، ومرض الأمعاء الالتهابي (IBD)6. يتكون المجوز البترومي لنخاع العظم من مجموعة خلايا سترومالية غير متجانسة. ومع ذلك، تتوافق جميع الخلايا العضلية العضلية الصلبة للمعايير التي حددتها الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT)، والتي تشمل: الالتصاق التلطيني، التعبير عن مستقبلات السطح — CD73، CD90، وCD105 في البشر، وCD29، CD44، وCD90 في الفئران — دون التعبير عن علامات مكونة للدم أو البطانة - مثل CD11b، CD14، CD19، CD34، CD45، CD79a، HLA-DR، والقدرة على التسبب بالأديبوجيل. التمايز الغضروطي أو التمايز العظمي7.

تظل BMSCs فعالة من خلال إطلاق عوامل باراكرين تعرف مجتمعة باسم السيكروت، والتي تشمل السيتوكينات، الكيموكينات، عوامل النمو، الحويصلات خارج الخلية، والعديد من الجزيئات الذائبة والمعتمدة على التلامس 8,9. يقوم إفراز الخلايا الصبغية البحوية بتعديل المكوك الجوية من خلال التفاعل مع عناصر من الجهاز المناعي الفطري بطريقة ثنائية الاتجاه10. يمكن للعوامل التي تطلق أثناء تفاعلات MSC-البلاعم أن تحول البلاعم نحو نمط ظاهري مضاد للالتهاب أو مضاد للالتهاب11,12. وعلى العكس، تنظم الحالة الوظيفية للخلايا العضلية الصلبة الصلبة أيضا بواسطة الخلايا المناعية المحلية - وخاصة البلاعم - من خلال آليات التغذية الراجعة11. هذا التداخل بين MSC والبلعم ضروري لوظيفة مثبطة المناعة في الخلايا العضلية العضلية. تقلل الخلايا العضلية المنقولة بالتبني، التهاب الأنسجة فقط عندما تكون البلاعم موجودة، كما لوحظ في نماذج الفئران لالتهاب القولون. في المقابل، تفاعل الخلايا الصلبة الصلبة مع الخلايا اللمفاوية B أو T في غياب البلاعم غير كاف لإحداث تأثيراتها العلاجية13.

تم إكمال المرحلة الثالثة الأولى من التجربة السريرية باستخدام منشطات BMSC التألوجينية بواسطة شركة Osiris Therapeutics في الولايات المتحدة لعلاج GVHD المقاوم للستيرويدات (NCT00366145)1. منذ ذلك الحين، أجريت العديد من الدراسات ما قبل السريرية والسريرية، رغم أن نجاح التجارب السريرية لم يلق التوقعات بناء على النتائج قبل السريرية. لتحسين معدل نجاح التجارب السريرية القائمة على MSC، يعد تحسين استراتيجيات نشر الأدوية أمرا ضروريا. فهم مسار التوصيل الأمثل، وجرعة الخلية العلاجية، والحالة الفسيولوجية للخلايا عند نقطة الرعاية أمر بالغ الأهمية. على سبيل المثال، في نموذج فأر التهاب القولون في الجسم الحي ، أظهرت الدراسات أن الخلايا العضلية المحجوزة بالتجميد أو التوصيل الوريدي هي طرق غير مثالية للإعطاء14.

تمت دراسة طرق مختلفة، مثل الترخيص المسبق للسيتوكينات، التعديل الوراثي، أو التكييف المسبق لنقص الأكسجين، لتحسين استمرارية الخلايا الصلبة في الجسم الحي وفائدتها العلاجية15. في نموذج نقص التروية في الطرف الخلفي للفوار، حسن التكييف المسبق لنقص الأكسجين (2٪ O2) القدرة على التكاثر والهجرة للخلايا الصلبة من خلال زيادة التعبير عن بروتين الصدمة الحرارية، وهو بروتين منظم بالجلوكوز 78 كيلو دالتر (GRP78). يعزز ترخيص IL-1β (Interleukin-1 beta) من قدرة الخلايا العضلية الصلبة على استخدام العدلات، والخلايا الأحادية، والخلايا اللمفاوية، والخلايا الحمضية17. بعد الولادة في الجسم الحي، تتعرض الخلايا الصلبة الصلبة للخلايا المنشطة من T وNK مشتقة من IFNγ، مما يعزز إنتاج إنزيم الإندوليامين 2,3-ديأوكسيناز (IDO) بواسطةMSCs 18. يعد IDO مكنا أساسيا في إفراز الخلايا المجهولة العظمى، مما يقلل من معدل تكاثر الخلايا التائية. ومن المثير للاهتمام أن قدرة الخلايا الصلبة الصلبة على المناعة تقل عندما يتم استزراعها مع خلايا اللمفايا التائية المشتقة من IFNγ/-19. حددت الدراسات أن الترخيص المسبق ل IFN-γ يقلل من معدل الموت المبرمج الذي يبوساه الخلايا التائية في الخلايا الجذرية المحجوزة بالتجميد13,20. يحسن التمهيد IFNγ النتائج العلاجية لاختبارات BMSCs13. تشير كل هذه الأدلة مجتمعة إلى الدور الحتمي ل IFNγ في إنتاج الخلايا الصلبة القوية التي تثبط المناعة الأقوى والأكثر قوة.

لتحديد أكثر طرق توصيل مراكز التخزين الجزئي فعالية، تم استخدام نماذج على نطاق واسع لسهولة الوصول الأخلاقي لها. لتقليل التباين في النتائج قبل السريرية، من الضروري وضع طريقة محسنة لعملية تصنيع الخلايا الصبغية تضمن إنتاجية عالية، وحيوية الخلايا، والاتساقمع مرور الوقت. يعد عبور MSCs متغيرا مهما يمكن أن يولد نتائج علاجية مختلفة. أثناء الزراعة المختبرية ، يمكن للمرور أن ينظم توصيف وقوة الخلايا الجذرية الصلبة الصلبة، وبعد عدد معين من المراتيح، تصبح الخلايا متقدمة في السن22. لذا، في أي دراسة سريرية أو ما قبل سريرية، من الضروري أن تكون متسقا في استخدام رقم مقطع MSC. وبالمثل، فإن الاتساق مع بروتوكول معين لعزل مراكز MSC هو عامل رئيسي لتحقيق قابلية التكرار في نتائج استخدام MSCs. من بين العديد من الأساليب، تعد فرز الخلايا المعتمد على الأجسام المضادة23، وطريقة الانتقاء السلبية24، والهضم الإنزيمي25 من الطرق الشائعة لعزل الخلايا الصبغية. ومع ذلك، تعتمد قابلية تطبيق هذه الطرق على المصدر، حيث يقلل الاستخدام غير الصحيح من الإنتاجية والفعالية وقدرة التمايز على الثلاثية.

هنا، نقدم بروتوكولا موحدا لعزل وتوصيف BMSCs، مع التركيز على عدد الممرات المفضل، وتقنية الحفظ بالتبريد، وجمع وسائط الحالة المشتقة من BMSC. كما نوفر بروتوكولا لتحضير الخلايا البلعمية العضلية بوساطة IFN γ ونعرض أخيرا دراسة مقارنة لكيفية استجابة البلعم الصفاقية بشكل مختلف للبلعم البريتونية للبلعم المرخصة مسبقا أو طبيعية أو IFN-γ.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة بموافقة واتباع إرشادات لجنة أخلاقيات التابعة للمعهد الوطني للأبحاث في صحة الإنجاب والطفل (مشروع IAEC رقم 09/23) ولجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ويسكونسن-ماديسون. تم استخدام الفئران الإناث C57Bl/6J التي تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع، تم تربيتها وإيواؤها في ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) محددة، في هذه الدراسة.

ملاحظة: اتبعنا بروتوكولات السلامة البيولوجية التي حددتها لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBSC) أثناء العمل على الدراسات في الجسم الحي أو في المختبر . باختصار، في دراسة، حافظنا على التعامل اللطيف لتقليل التوتر وخطر الإصابة. استخدمنا معدات الحماية الشخصية المناسبة مثل نظارات الأمان، وقفازات، معطف مختبر، كمامة، وقبعة بوفانت قابلة للتخلص منها. بالنسبة للمواد الكيميائية الخطرة البيولوجية مثل DMSO، استخدمنا خزانة سلامة حيوية للتعامل مع المواد الكيميائية. استخدمنا حاوية النفايات المحددة للتخلص من المواد الميكانية أو الأشياء الحادة.

1. عزل خلايا العضلات المتوسطة النخاع العظمي في الفئران

ملاحظة: بعد جمع الطرف الخلفي، يجب تنفيذ بقية الخطوات باستخدام غطاء تدفق مزرعة الأنسجة، وتقنيات معقمةمعقمة 26.

  1. قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم، ثم شطفه جيدا بنسبة 70٪ إيثانول. باستخدام ملقط العيون، قم بتعديل جلد البطن بين مفصلي الورك للفأر بلطف وقطع الجلد بعناية بالمقص.
  2. افصل الجلد بسحب لطيف نحو القدم. اقطع عند مفاصل الورك والكاحل لتحرير كلا الأطراف الخلفية.
  3. انقل الأطراف الخلفية بسرعة إلى DMEM بارد جدا مع مكمل 1x بنسلين/ستربتوميسين و2٪ FBS لتجنب تلف الأنسجة حتى عملية التشريح الإضافية.
  4. خذ كل طرف خلفي في طبق بتري يحتوي على الوسط البارد جدا. قم بتقشير العضلات والأنسجة الضامة من عظم الفخذ والساق بحذر عن طريق كشط الحجاب الدهوي بلطف من العظم. انقل العظم المنظف إلى طبق بتري جديد يحتوي على وسط بارد كالثلج.
  5. افصل عظم الفخذ والظنبوب، ثم عمل جرح في نهايات عظم الساق وفخذ الفخذ أسفل تجويف النخاع مباشرة. احم تجويف النخاع إلى أقصى حد أثناء إجراء تشريح عظم الفخذ والظنبوب.
  6. خذ حقنة معقمة بسعة 1 مل مع إبرة 21 جيلون واسحب الوسط من لوحة بتر. باستخدام الملقط المعقم، امسك عظم الفخذ المقطوع وأدخل الإبرة برفق في تجويف النخاع العظمي. قم بتنظيف تجويف نخاع العظم للحصول على نخاع العظم. كرر هذه الخطوة حتى يصبح العظم أبيض. اغسل عظم الساق بنفس الطريقة.
  7. استخدم الماصة بلطف داخل وخارج لتوزيع تجمعات الخلايا في طبق بتري. باستخدام شبكة فلتر بحجم 70 مم، قم بترشيح تعليق الخلية لإزالة أي جزيئات عظمية. اجمع جهاز الترشيح وقم بطرد مركزه على حرارة 230 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات مع الوسط الكامل (DMEM، 10٪ FBS، 5٪ L-جلوتامين، البنسلين، والستريبتومايسين). قس إنتاجية وقابلية البقاء للخلايا باستخدام استبعاد تريبان الأزرق والاعتماد على جهاز قياس الدم الخلوي.
  9. زرع الخلايا في قارورة بحجم 75 سم2 معالجة بزراعة الأنسجة بكثافة خلاوية تبلغ 5000 خلية/سم2 في وسط DMEM كامل13. قم بإزالة الخلايا المكونة للدم غير الملتصقة بعد 48 ساعة من الزراعة عن طريق تغيير الوسط. استبدل الوسائط بوسائط جديدة كل 3-4 أيام بالتناوب
    ملاحظة: استخدم قارورة زراعة الخلايا بدلا من طبق لتجنب التلوث. لا تخرج القارورة من الحاضنة بشكل متكرر لفحص الخلايا، لأنها تعيق نمو الخلايا.
  10. لفصل الخلايا الملتصقة، اغسل الخلايا مرة واحدة ب PBS، أضف 0.25٪ تريبسين-EDTA، وأبق الخلايا في التربسين لمدة 5 دقائق. يساعد ذلك على فصل الخلايا عن البئر.
  11. أضف الوسائط الكاملة، أعد تعليقها، وجهاز الطرد المركزي بحرارة 230 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت. أضف وسائط DMEM كاملة إلى الحبيبة، ثم أعد تعليقها، وأعد زرع الخلايا بكثافة 5000 خلية/سممربع.
  12. انقل الخلايا أسبوعيا عن طريق تغيير الوسط كل 3-4 أيام. بعد الفقرة الثالثة، قم بفحص زراعة الخلايا المثلثية بواسطة تحليل تدفق الخلايا كما هو موضح في الخطوة 6. استخدم خلايا الممر 3-5 لأي تجربة.
    ملاحظة: للحفاظ على الخلايا بالتجميد للاستخدام التجريبي المستقبلي، قم بالطرد المركزي للخلايا عند الحجم المطلوب، وإعادة تعليق الخلايا في وسط تجميد، وتخزين 1 ×10 6 خلايا في 1 مل من وسط تجميد في كل مبرد عند -80 درجة مئوية خلال الليل، ثم نقل الخلايا إلى النيتروجين للاستخدام طويل الأمد.
    تركيب وسائط التجميد: 70٪ DMEM، 20٪ FBS، 10٪ DMSO.

2. تحضير وسط مكيف من الخلايا المزرعة

  1. زرع الخلايا بكثافة 5000 خلية/سم 2 في 6 صفيحات آبار. العلوم الزراعية حتى تصل نسبة التقاء بنسبة 80٪.
  2. اجمع الوسط المكيف من لوحة زراعة الخلايا وجهاز الطرد المركزي بدرجة حرارة 230 x جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بالفلتر، واستخدم للعلاج.

3. تحضير وسط مشروط من IFNγ من الخلايا العضلية العضلية المزروعة

  1. زرع الخلايا في صفائح ذات 6 آبار بكثافة 5000 خلية/سم2. عالج الخلايا ب 25 نانوغرام/مل IFNγ لمدة 48 ساعة. قم بإجراء دراسة تعتمد على الجرعة للحصول على التأثير الأمثل ل IFNγ على الخلايا الصلبة. لهذه التجربة، اختر نطاقا من تركيزات IFNγ، 5، 10، 25، 50، 100 نانوغرام/مل، لترخيص مسبق MSCs. كانت تركيزات 5 و10 نانوغرام/مل أقل فعالية بشكل ملحوظ في استقطاب البلاعمية، وتم تحديد تركيز 25 نانوغرام/مل كتركيز مثالي (الشكل التكميلي 1).
  2. بعد تفريغ الوسط الذي يحتوي على IFN-γ، اغسل البئر مرتين باستخدام PBS لضمان إزالة IFN-γ بالكامل. أي متبقي من IFN-γ قد يتداخل مع نتيجة الدراسة.
  3. احتضن الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى في وسط DMEM العادي عند 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، اجمع الوسائط المكيفة التالية للخطوة الثانية.

4. عزل وزراعة البلعم المشتقة من التجويف الصفاقي

  1. حقن 5 مل من PBS البارد جدا (مع 3٪ FBS) في تجويف الصفاق للفئران، تليها تدليك لطيف للبطن.
  2. استرجع محلول PBS باستخدام حقنة معقمة. اجمعها في أنبوب بسعة 10 مل. قم بجهاز الطرد المركزي للمحلول بقوة 300 × g لمدة 5 دقائق.
  3. أزل السوبرناتانت. قم بإذابة الحبيبات في وسائط RPMI كاملة (RPMI، 10٪ FBS، 1x بنسلين وستربتوميسين). قم بتغطية الخلايا بحجم 5000 خلية/سممربع.
  4. قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة بعد 24 ساعة وزراعة الخلايا حتى الالتقاء البعض. استخدم الخلايا لمزيد من الإجراءات التجريبية حسب الحاجة.

5. اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيمات

  1. للكشف عن IL-10 المشتق من البلاعم المعالجة بواسطة BMSCs-CM، اتبع الخطوات أدناه.
    1. عالج البلعم ب BMSCs-CM لمدة 24 ساعة وجمع المادة الفائقة في اليوم التالي.
    2. قس كمية IL-10 باستخدام مجموعة ELISA الخاصة ب IL-10 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. للكشف عن CCL2 المشتق من BMSCs أو معالجات IFNγ، استخدم مجموعة CCL2 ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

6. تحليل قياس التدفق الخلوي للكربون العضلية العضلية والنماذج الظاهرية للبلاعم

  1. زرع الخلايا في صفيحة بستة آبار واجعلها تلتقي ببعضها. اغسل مرة واحدة باستخدام PBS (1 مل) ثم التريبسينز. أضف التربسين بنسبة 0.25٪ وحضن التربسين لمدة 5 دقائق لرفع الخلايا تماما عن الطبق.
  2. أضف وسائط لتعطيل نشاط التربسين. اجمع الخلايا في أنبوب بوليستيرين بسعة 10 مل. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية للبلاعم و230 x جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لأجهزة BMSC.
  3. أزل المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من محلول الصبغة (PBS بارد جدا مع 2٪ FBS و0.05٪ أزيد). قم بتدوير 230 × g لمدة 7 دقائق. قم بالتفريغ وقطع الحبيبة. أضف 1 مل من صبغة Ghost red 780 للحياة و50 مل من FACS، ثم أعد تعليقها، ثم وضعها في أنبوب التدفق. ضع صبغة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  4. بعد 30 دقيقة، اغسل الخلايا بمحلول البقع بمقدار 1 مل. قم بالتفريغ وقطع الحبيبة. أضف الحجم المطلوب من الأجسام المضادة أو التحكم في الأنواع النظيرية. احتضن لمدة 30 دقيقة أخرى في الظلام. اغسل الخلايا باستخدام محلول البقعة، ثم أفرغ، ثم أعد تعليقها في 400 مل من محلول الصبغة. أنبوب العينة جاهز للاقتناء.
  5. لتحضير التحكم في التلوين الأحياء والميت، بعد التربسين والطرد المركزي، قم بإذابة الحبيبة في 2 مل من حاجز الصبغة. أخرج 1 مل من أنبوب طرد مركزي دقيق آخر وأضف 10 مل من DMSO لقتل الخلايا. دوامة واحتضن لمدة 10 دقائق. الآن اخلط هذا مع 1 مل آخر من محلول الخلايا في أنبوب تدفق.
  6. أضف 1 مل من محلول التلوين وادفقها على 230 x جرام لمدة 7 دقائق. قم بالتفريغ وقطع الحبيبة. أضف 1 مل من صبغة Ghost red 780 للحياة و50 مل من FACS، ثم أعد تعليقها، ثم وضعها في أنبوب التدفق. ضع صبغة في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة، اغسل الخلايا بمحلول البقع بمقدار 1 مل. قم بالتفريغ وقطع الحبيبة. أعد تعليقها في 400 مل من حاجز البقع. العينة الملطخة بالأحياء جاهزة للاقتناء.
    ملاحظة: بالنسبة لتلوين البلاعم في الفئران، يجب إضافة خطوة تلوين إضافية قبل بروتوكول التلوين القياسي. لتجنب عدم دقة بيانات التدفق، يعد حجب مستقبل FC خطوة حاسمة، تمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة بمستقبلات Fc في الخلايا. لحجب مستقبل Fc، أضف 1 مل من مادة منع Fc (الجسم المضاد المنقى لمضاد الفأر CD16/CD32) إلى تعليق الخلية وحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتنفيذ خطوات تلوين الأجسام المضادة المتبقية دون غسل مادة منع ال FC.
  7. لتحليل بيانات التدفق، يجب في البداية اختيار الخلايا المفردة بناء على معلمات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي. هذه الخطوة ضرورية لإزالة الحطام وتجمعات الخلايا. ثم يتم تقييد الخلايا المفردة بناء على التلوين الأحياء والميت. قم بإجراء المزيد من التحليل بناء على مجموعة الخلايا الحية (الشكل التكميلي 2).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف المخطط التجريبي العام في الشكل 1. تم جمع نخاع عظم الفأر من كل من عظم الفخذ والساق، وتم بذوره، وتمريره، وقياس خلوي التدفق المميز (الشكل 1A). تم جمع وسائط الحالة (BMSCs-CM) مع أو بدون ترخيص IFNγ، وتم تخزين بعض قوارير BMSCs-CM عند -80 درجة مئوية للاحتياجات التجريبية المستقبلية (الشكل 1B).

تم عد الخلايا المشتقة من نخاع العظم بواسطة جهاز قياس الدم (الشكل 2A) وزرع الخلايا بكثافة 5000 خلية/سم2 في وسط DMEM كامل. بعد 48 ساعة، تم تغيير الوسط الأول، ثم تغير الوسط كل 3/4 أيام حتى التقاء كامل. قمنا بتمرير الخلايا عندما وصلت إلى 80٪ من التقاء (الشكل 2B). في الفقرة 4، قمنا بتوصيف الخلايا بناء على تعبير العلامة الخاصة ب MSC. كانت الخلايا إيجابية ل CD44، CD29، وCD90، وسلبية ل CD45، CD11b، وCD34 (الشكل 2C). يمكن لحاملات BMSC أن تتفاوت إلى سلالات أديبوجينية، وعظمية، وغضروفية14، 27، 28، 29. وهذا يحافظ على إرشادات الهوية للجمعية الدولية للعلاج الخلوي.

لفهم التأثير المثبط للمناعة ل MSCs-CM، عالجنا البلاعم المشتقة من التجويف الصفاقي (PMφ) وعالجناها ب BMSCs-CM (الشكل 3A). قمنا بإجراء تحليل تدفق الخلايا الخلوية للبلاعم المعالجة ب BMSCs مع CM (الشكل 3B,C). تم صبغ البلعم المقيمة في التجويف الصفاقي المتكيفة مع الثقافة بواسطة علامات سطحية خاصة ب M1 وM2. منعنا ارتباط الأجسام المضادة غير النوعية عن طريق حضانة البلاعم باستخدام مادة مضادة للفئران المنقاء CD32/CD16 (كتلة Fc للفئران قبل إضافة الأجسام المضادة للصبغ)، قبل التلوين الفعلي للعلامات الخلوية. تمت دراسة تعبير العلامات الخاصة ب M1، CD86 وiNOS، وعلامات M2 الخاصة ب CD206 وCD163. تم تجميع الخلايا أولا بناء على العلامة المكونة للدم CD45.2 (ل C57BL6). IL-10 هو السيتوكين المميز لنمط M2. تم قياس IL-10 الذي تم إطلاقه بواسطة بلاعم معالجة بواسطة MSCs-CM بواسطة دراسة ELISA (الشكل 3D). نظرا لأن LPS/IFNg يحفز استقطاب M130، فقد كان هذا العلاج بمثابة تحكم سلبي.

يعد CCL2 أحد السيتوكينات المميزة التي تم تحديدها في إفرازات الخلايا الصلبة الصلبية، والذي يحفز استقطاب البلاعم13. تم اكتشاف CCL2 الذي أطلقته MSCs بواسطة ELISA (الشكل 3E). لتأكيد دور CCL2 في استقطاب البلاعمية، قمنا بمعالجة البلعم مسبقا بمثبط CCR2 تليها معالجة MSC-CM (الشكل 3F)، وتم اكتشاف استقطاب البلاعم مرة أخرى بواسطة دراسة ELISA IL-10 (الشكل 3F).

تظهر نتائجنا بوضوح أن إفرازات الخلايا الجوجية الصلبة يمكن أن تحفز استقطاب البلاعم المضادة للالتهابات، كما يتضح من زيادة إنتاج IL-10 في البلعم المشتقة من الأمعاء بعد العلاج بوسط مشروط (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1: مخطط تدفق الدراسة. (A) تم قتل فئران C57BL/6 رحيما. تم إزالة النخاع من عظم الفخذ والظنبوب، وتم طرد مركزه، وزراعته لمدة أسبوع مع تغيير الوسائط كل 3 أيام. تم تمرير الخلايا العضلية الصلبة الصلبة وعند المقطع الرابع تميزت بقياس تدفق الخلايا ودراسة تكوين الدهون. (ب) تم زرع ممرات MSC في الممر الرابع في صفائح ذات 6 آبار، في مجموعة مع إضافة IFNγ بتركيز 25 نانوغرام/مل، وفي مجموعة أخرى تم إبقاؤها دون معالجة. بعد 48 ساعة، استبدلها بوسائط DMEM كاملة وطازجة عادية. بعد 24 ساعة، اجمع الوسائط من اللوحة، والطرد المركزي، والفلتر. خزن الوسائط الحالة في -80 درجة مئوية للاستخدام المستقبلي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: التوصيف الظاهري. (أ) تم عد الخلايا المشتقة من نخاع العظم بواسطة مقياس الدم الخلوي قبل البذر. (ب) تركت الخلايا تنمو حتى تلتقي بنسبة 80٪ قبل كل مقطع. (ج) تم تمييز خلايا الممر 4 بتحليل القياس الخلوي التدفق باستخدام علامات محددة ل MSC للفأر. يمثل شريط المقياس 100 م. تم تعديل الشكل 2C منرقم 14. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: تحليل فرازات BM-MSC. (أ) مخطط التجارب. (B) تحليل سيتومتري مخطط التدفق الأمامي التمثيلي ل PMφ المعالج ب MSC-CM. تم تحديد الخلايا المشتقة من الصفاق بناء على المؤشرات المسببة للدم CD45.2. تم صبغ المجموعة المختارة أيضا بواسطة علامات محددة ل M1 مثل CD86 أو iNOS، وعلامات M2 المحددة CD206 أو CD163، بالإضافة إلى التلوين المزدوج ل CD11b في كل حالة. (ج) تم قياس نسبة الخلايا M1 أو M2. كانت مجموعة الخلايا التي عولجت ب LPS/IFNγ بمثابة اختبار سلبي. (د) تم إجراء ELISA لقياس كمية IL-10 الذي يطلقه PMφ المعالج ب MSC-CM. تم إجراء ELISA لقياس (E) CCL2 الذي يطلقه MSC-CM، و(F) IL-10 الذي يطلقه PMφ. كما هو موضح في الشكل، تم إجراء مجموعة واحدة من التجارب بحضور مضاد CCR2. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SEM. بيانات تمثل 3 تجارب مستقلة مع 3 عينات MSC لكل مجموعة. تم استخدام اختبار t للطالب لإجراء تحليل إحصائي لجميع التجارب. ∗p < 0.05، ∗∗p < 0.01، ∗∗∗p < 0.001، ∗∗∗∗p < 0.0001. تم تعديل الشكل 3B-F من13. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: كانت وحدات BMSC مرخصة مسبقا ب 0، 5، 10، 25، 50، 100 نانوغرام/مل IFNg. تمت معالجة البلاعم ب MSCs-CM المرخصة مسبقا من IFNγ. تم إجراء ELISA لقياس كمية IL-10 الذي يطلقه PMφ المعالج ب MSC-CM. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SEM. بيانات تمثل 3 تجارب مستقلة مع 3 عينات MSC لكل مجموعة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: (A-C) تم اختيار الخلايا المفردة بناء على معلمات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي. (د) تم تغليف الخلايا المفردة بناء على التلوين الأحياء والميت. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد عزل الخلايا البترومية المتوسطة النخاع العظمي المشتقة من نخاع عظم الفأر تقنية حاسمة لفهم الخصائص الذاتية المثبطة للمناعة والتجدد لخلايا الخلايا الصبغية في نماذج الحية . على الرغم من أن الطريقة تبدو بسيطة وسهلة المتابعة، إلا أنه يجب تنفيذ عدة خطوات بدقة لمنع التلوث البكتيري وضمان إنتاج الخلايا الأمثل. يجب تنفيذ كل خطوة من خطوات العملية بشكل معقم في بيئة نظيفة للغاية.

لتجنب انخفاض إنتاجية الخلايا، اختر فئرا في الفئة العمرية من 6 إلى 8 أسابيع. عند قطع نهايات عظم الفخذ والظنبوب، يجب حماية تجويف النخاع قدر الإمكان، ويجب أن تكون عملية الغسل ثابتة ولكن لطيفة لضمان استخلاص النخاع بالكامل. يجب حضن الخلايا المعزولة تحت تركيز مناسب من CO₂ وفي ظروف رطبة. أثناء تغييرات الوسط، من الضروري غسل الخلايا بلطف باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) قبل استبدال الوسط للقضاء على الخلايا الملوثة بالملوث. لتجنب تلوث الخلايا المكونة للدم، يجب ألا يتجاوز التريبسين عند إعادة الانتقال 5 دقائق. في المرحلة المبكرة، يجب ألا يكون تغيير الوسائط سريعا جدا، لأن التغيير المتكرر في الوسائط قد يسبب تلوثا بكتيريا.

في كل مقطع، من الضروري حفظ الخلايا بالتجميد في دفعات متعددة للحفاظ على الاتساق والتوافر. بالنسبة لتمهيد IFN-γ، يجب إجراء تجربة تعتمد على الجرعة لتحديد أكثر شروط الترخيص فعالية للوسط المكيف بالميكروفون. في تجاربنا، اختبرنا مجموعة من تركيزات IFNγ، أي 5، 10، 25، 50، 100 نانوغرام/مل، لترخيص مسبقا لمراكز MSCs. ثم تم تحديد تركيز 25 نانوغرام/مل كتركيز مثالي.

للحفاظ على سلامة البيانات، يجب استخدام الخلايا من رقم مقطع محدد بشكل متسق في جميع الاختبارات التجريبية. لتوصيف الخلايا الخلوية المتدفق لمراكز MSC، يجب استخدام الخلايا من الممر 3 أو أعلى لضمان الكشف الموثوق عن تعبير مستقبلات السطح. التمييز بين الخلايا الحية والميتة أثناء صبغ التدفق الخلوي أمر ضروري، لأنه يقلل من احتمالية حدوث نتائج سلبية كاذبة.

تمثل النتائج آلية رئيسية من خلالها تخفف التهاب الأمعاء أثناء التهاب القولون. يعزز تمهيد IFN-γ تأثير الوسائط المكيفة على استقطاب البلعميات. CCL2 المنبعث من BMSCs هو كيموكين حيوي يعمل على البلعم لتحفيز استقطاب M2. أظهرت نتائجنا السابقة أن الكيموكينات CCL2 وCXCL12 تتفاعل بشكل تعاوني على البلعم لتعزيز استقطابها. هذا الحدث ضروري لنشر الإشارات المضادة للالتهابات من خلال التعديل اللاحق لأنماط الخلايا التائية والخلايا البائية13.

في دراستنا، اتبعنا تحديدا بروتوكولا بسيطا لعزل BMSCs، بناء على خاصية الالتصاق البلاستيكي في MSCs. يمكن استخدام الفرز الخلوي التدفق أو الفرز المناعي المغناطيسي لعزل BMSCs بناء على علامات سطحية محددة ل MSC. ومع ذلك، في كلتا الطريقتين، هناك احتمال فقدان الكثير من الخلايا أثناء تحضير العينة. نظرا لأن نخاع عظم الفأر يحتوي على عدد قليل جدا من الخلايا الصلبة الصلبة (يقدر بحوالي 0.001٪ إلى 0.08٪ من خلايا نخاع العظم)، فضلنا طريقة العزل القياسية القائمة على خصائص الملاصق البلاستيكية. ومع ذلك، لهذه الطريقة بعض العيوب. الخطر الرئيسي هو تلوث الخلايا المكونة للدم، والذي قد يقلل من القدرة العلاجية لخلايا MSC. لذا، فإن تحديد رقم ممر معين أمر بالغ الأهمية، حيث يعبر عدد كبير من الخلايا عن مستقبلات سطحية خاصة بMSC.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمويل من التحالف المبكر لعلاج DBT/ويلكوم ترست الهند لزمالة مهنية مبكرة ل J.G. تحمل المخطوطة رقم NIRRCH ID: REV/1502/02-2023 من صندوق مختبر DM. وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى، ومنحت R01DK109508 لج. جاليبو. وقد دعمت هذه الدراسة أيضا منحة دعم مركز كاربون للسرطان بجامعة ويسكونسن رقم P30 CA014520.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غطاء زراعة الخلايا مع تدفق عمودي صفحي، مزود بأشعة فوق بنفسجية  
مقص جراحي معقم
25/75-سم<سب>2 قارورة 
محاقن 5/10 مل مع إبر 27 جيلون
أطباق ثقافة 6-آبار  
أكوتازكورنينغ#AT104
ناقلة أني-ماوس F4/80 APCالأسطورة الحيوية#123116
القرص المضاد للفأرة 11b PEبي دي فارمينجن#557397
ناقلة مضادة للفأر CD 45.2 APCبي دي فارمينجن#558702
مضاد للفأر CD163 Percp eFluor710العلوم الحيوية الإلكترونية#46-1631-80
مضاد الفأر CD206 PEالأسطورة الحيوية#141706
جهاز مكافحة الفأر CD86 FITCبي دي فارمينجن#553691
مضاد الفأر iNOS PE-Cy7العلوم الحيوية الإلكترونية#25-5920-80
مجموعة CCL2 ELISAإنفيتروجين#554722
خصم CCR2 (RS 102895)سيغما#R1903
الطرد المركزي 
DPBSكورنينغ#21-031-CV
متوسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM)كورنينغ# 10-013-CV
مصل الأبقار الجنينيسيغما#F8067
شبكة الفلتر (70 مم) 
صبغة Ghost Red 780 القابلة للحياةعلم الأحياء في تونبو#13-0865-T100
مجموعة IL-10 إليساإنفيتروجين#88-7105-88
إل-جلوتامينكورنينغ#25-005-CI
المجهر مع معدات تباين الطور
مورين IFN وغاما؛R& أنظمة D#485-MI-100
البنسلين-ستربتوميسينكورنينغ#30-002-CI
قرص CD16/CD32 مضاد للفأربي دي فارمينجن#553142
RPMImediumكورنينغ#10-040-CV
الملقط الجراحي المعقم (مستقيم ومنحني)
الحاضنة التي تتحكم بها درجة الحرارة وتركيب الغاز
تريبسنكورنينغ#25052-cl
حمام مائي مع تحكم في درجة الحرارة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22, 824-833 (2018).
  2. Fan, X. L., Zhang, Y., Li, X., Fu, Q. L. Mechanisms underlying the protective effects of mesenchymal stem cell-based therapy. Cell Mol Life Sci. 77, 2771-2794 (2020).
  3. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regen Med. 4, 22(2019).
  4. Kadri, N., Amu, S., Iacobaeus, E., Boberg, E., Le Blanc, K. Current perspectives on mesenchymal stromal cell therapy for graft versus host disease. Cell Mol Immunol. 20, 613-625 (2023).
  5. Premer, C., Hare, J. M., Yuan, S. Y., Wilson, J. W. Mesenchymal stem/stromal cells as a therapeutic for sepsis: a review on where do we stand. Stem Cell Res Ther. 16, 245(2025).
  6. Eiro, N., Fraile, M., Gonzalez-Jubete, A., Gonzalez, L. O., Vizoso, F. J. Mesenchymal (Stem) Stromal Cells Based as New Therapeutic Alternative in Inflammatory Bowel Disease: Basic Mechanisms, Experimental and Clinical Evidence, and Challenges. Int J Mol Sci. 23 (16), 8905(2022).
  7. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  8. Gonzalez-Gonzalez, A., Garcia-Sanchez, D., Dotta, M., Rodriguez-Rey, J. C., Perez-Campo, F. M. Mesenchymal stem cells secretome: The cornerstone of cell-free regenerative medicine. World J Stem Cells. 12, 1529-1552 (2020).
  9. Trigo, C. M., Rodrigues, J. S., Camoes, S. P., Sola, S., Miranda, J. P. Mesenchymal stem cell secretome for regenerative medicine: Where do we stand. J Adv Res. 70, 103-124 (2025).
  10. Giri, J., Modi, D. Endometrial and placental stem cells in successful and pathological pregnancies. J Assist Reprod Genet. 40, 1509-1522 (2023).
  11. Lu, D., Xu, Y., Liu, Q., Zhang, Q. Mesenchymal Stem Cell-Macrophage Crosstalk and Maintenance of Inflammatory Microenvironment Homeostasis. Front Cell Dev Biol. 9, 681171(2021).
  12. Galipeau, J. Macrophages at the nexus of mesenchymal stromal cell potency: The emerging role of chemokine cooperativity. Stem Cells. 39, 1145-1154 (2021).
  13. Giri, J., Das, R., Nylen, E., Chinnadurai, R., Galipeau, J. CCL2 and CXCL12 Derived from Mesenchymal Stromal Cells Cooperatively Polarize IL-10+ Tissue Macrophages to Mitigate Gut Injury. Cell Rep. 30, 1923-1934.e4 (2020).
  14. Giri, J., Galipeau, J. Mesenchymal stromal cell therapeutic potency is dependent upon viability, route of delivery, and immune match. Blood Adv. 4, 1987-1997 (2020).
  15. Kahrizi, M. S., et al. Recent advances in pre-conditioned mesenchymal stem/stromal cell (MSCs) therapy in organ failure: a comprehensive review of preclinical studies. Stem Cell Res Ther. 14, 155(2023).
  16. Lee, J. H., Yoon, Y. M., Lee, S. H. Hypoxic Preconditioning Promotes the Bioactivities of Mesenchymal Stem Cells via the HIF-1alpha-GRP78-Akt Axis. Int J Mol Sci. 18 (6), 1320(2017).
  17. Carrero, R., et al. IL1beta induces mesenchymal stem cells migration and leucocyte chemotaxis through NF-kappaB. Stem Cell Rev Rep. 8, 905-916 (2012).
  18. English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunol Lett. 110, 91-100 (2007).
  19. Sheng, H., et al. A critical role of IFNgamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Res. 18, 846-857 (2008).
  20. Chinnadurai, R., et al. Cryopreserved Mesenchymal Stromal Cells Are Susceptible to T-Cell Mediated Apoptosis Which Is Partly Rescued by IFNgamma Licensing. Stem Cells. 34, 2429-2442 (2016).
  21. Fernandez-Santos, M. E., et al. Optimization of Mesenchymal Stromal Cell (MSC) Manufacturing Processes for a Better Therapeutic Outcome. Front Immunol. 13, 918565(2022).
  22. Mastrolia, I., et al. Challenges in Clinical Development of Mesenchymal Stromal/Stem Cells: Concise Review. Stem Cells Transl Med. 8, 1135-1148 (2019).
  23. Van Vlasselaer, P., Falla, N., Snoeck, H., Mathieu, E. Characterization and purification of osteogenic cells from murine bone marrow by two-color cell sorting using anti-Sca-1 monoclonal antibody and wheat germ agglutinin. Blood. 84, 753-763 (1994).
  24. Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89, 1235-1249 (2003).
  25. Siclari, V. A., et al. Mesenchymal progenitors residing close to the bone surface are functionally distinct from those in the central bone marrow. Bone. 53, 575-586 (2013).
  26. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3, 26-33 (2015).
  27. Rafei, M., Birman, E., Forner, K., Galipeau, J. Allogeneic mesenchymal stem cells for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Mol Ther. 17, 1799-1803 (2009).
  28. Krakenes, T., et al. The neuroprotective potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and human exfoliated deciduous teeth in a murine model of demyelination. PLoS One. 18, e0293908(2023).
  29. Kannan, S., Gokul Krishna, S., Gupta, P. K., Kolkundkar, U. K. Advantages of pooling of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells from different donors versus single-donor MSCs. Sci Rep. 14, 12654(2024).
  30. Muller, E., et al. Toll-Like Receptor Ligands and Interferon-gamma Synergize for Induction of Antitumor M1 Macrophages. Front Immunol. 8, 1383(2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

M2

مقالات ذات صلة