مقالة منهجية

تقنية استنشاق دقيقة بسيطة لعزل الخلايا الجسدية من السائل المنوي المحفوظ للخيول بالتبريد كمانحين نوويين للاستنساخ

DOI:

10.3791/69404

⸱

ديسمبر 19, 2025

 ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول تقنية استنشاق دقيق بسيطة لعزل الخلايا الجسدية الحية (SCs) من السائل المنوي المحفوظ للخيول بالتجميد. على عكس الطرق التقليدية، تتجنب هذه التقنية الزراعة المخبرية الطويلة وتتغلب على تلوث المنوية، مما يتيح الاستخدام الفوري في استنساخ الخلايا الجسدية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السائل المنوي هو سائل معقد، بالإضافة إلى المنوية، يحتوي على مجموعات خلايا أخرى، بما في ذلك الخلايا المناعية، والخلايا الجرثومية الذكرية غير الناضجة، والخلايا الظهارية، والأرومات الليفية. تشترك هذه الخلايا في حالة ثنائية الصيغة الصبغية، مما يجعلها مرشحة مناسبة كمانحين نوويين لاستنساخ نقل الخلايا الجسدية (SCNT). تم إثبات أن توليد الأجنة والنسل الصالح باستخدام هذه الخلايا. تشمل الطرق الفعالة لعزلها عن السائل المنوي تقنيات الطرد المركزي والتدرج الأسموزي؛ ومع ذلك، فإن فترات الزراعة الممهيدة في المختبر ضرورية لتأسيس الزراعة الأولية من هذه الخلايا المعزولة. علاوة على ذلك، احتوت العينات التي تم الحصول عليها على كمية عالية من المنوية، مما يعيق تأسيس وصيانة المزارع المختبرية . حتى الآن، لم يتم تأسيس الزراعة الأولية بنجاح إلا من عينات السائل المنوي الطازجة، بينما فشلت محاولات استخدام السائل المنوي المحفوظ بالتجميد باستمرار. هذا القيد يحد بشكل كبير من إمكانية توليد نسخ مستنسخة من عينات السائل المنوي المحجوزة بالتبريد. تقترح الدراسة الحالية منهجية بسيطة تعتمد على الشفط الدقيق لعزل الخلايا الجسدية عن السائل المنوي المحفوظ بالتجميد في الخيول. تسمح هذه الطريقة بالاسترجاع السريع لعدد كاف من الخلايا للاستخدام الفوري في عمليات استنساخ SCNT.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد استنساخ نقل الخلايا الجسدية أداة لا تقدر بثمن لإنقاذ وتكاثر الأفراد ذوي الاهتمام الحيواني والعلمي. تم استخدام العديد من خطوط الخلايا كممانحين نوويين، بما في ذلك الخلايا المستمدة من الجلد والعضلات والحبيبات الحبيبية والخلايا اللمباوية وخلايا البول 1,2,3,4. ومن المثير للاهتمام أن السائل المنوي ظهر كبديل جديد لجمع الخلايا الجسدية (SCs) لاستخدامها كمتبرعين نوويين في الاستنساخ5،6. هذا الاكتشاف مهم بشكل خاص لإنقاذ الأفراد الذين تم حفظ السائل المنوي فقط لهم. ومع ذلك، لم ينجح إنشاء الثقافات الأولية من الكائنات المنوية المعزولة من السائل المنوي المجمد، وحتى اليوم لا يزال العقبة الرئيسية أمام الحصول على المستنسخة من هذا المصدر 7,8,9. من المحتمل أن تنشأ هذه الخلايا من الظهارة الغددية وبطانة الأنبوب، ومن إفرازات السائل المنوي، والأهم من ذلك - من تلوث السائل المنوي بالبول، حيث يعد الأخير مصدرا معروفا للخلايا الجسدية ذات التكاثر العاليوغير المتمايز.

تم تطبيق طرق مختلفة لعزل الخلايا السوبرالية عن السائل المنوي، بما في ذلك الطرد المركزي5، والتدرجات الأسموزية7، 8، 10، وقياس خلية التدفق11. ومع ذلك، فإن الخلايا الجسدية، التي بمجرد عزلها بهذه الطرق، لا تزال تحتاج إلى ظروف محسنة للتعلق والنمو والتكاثر8. تجعل المتطلبات الخاصة لهذه الخلايا الزراعة في المختبرات أكثر تعقيدا، حيث تتطلب فترات حضانة طويلة لإنشاء زراعة الخلايا الأولية9. علاوة على ذلك، فإن التركيز العالي للحيوانات المنوية الموجودة في العينات يتداخل مع بدء وصيانة هذه الثقافات5.

على عكس الأساليب المذكورة سابقا، تقدم هذه التقنية الدقيقة عدة مزايا واضحة. يسمح باختيار الخلايا الدماغية بناء على الحجم والشكل12 ويسمح باستعادة النوى من الخلايا الحية وغير القابلة للحياة، وهي استراتيجية تم إثباتها بنجاح مع الأنسجة المجمدة بدون واقيات بالتبريد13 والخلايا التناسلية المجففةبالتجميد 14، 15، 16. من المهم أن SCs يمكن استخدامها مباشرة بعد ذوبان السائل المنوي، مما يقلل من خطر الأخطاء الصمغية المرتبطة عادة بالزراعة الممتدة للخلايا الجسدية الأولية المستخدمة في استنساخ17,18. تركز التقنية تحديدا على السائل المنوي المحجوز بالتجميد، مما يسمح بجمع عدد كاف من السائل المنوي لاستخدامه فورا في SCNT12.

لقد تقدم تصنيع الماصات الدقيقة وتطوير تقنيات الشفط الدقيق بشكل كبير في العقود الأخيرة. يتيح استخدام هذه الأدوات التلاعب الدقيق بالأمشاج والأجنة وبنياتها الخلوية، مما يخلق إمكانيات جديدة في مجال التكنولوجيا الحيوية التناسلية (https://www.jove.com). تمكن تقنيات التلاعب الدقيق بتقييم الخصائص الميكانيكية الخلوية وتوفر رؤى قيمةحول حالتها الفسيولوجية، ومع ذلك لا يزال هذا المجال غير مستكشف نسبيا.

حتى الآن، لم تكشف أي أبحاث تقنية فعالة لعزل السائل المنوي عن السائل المنوي باستخدام أي نوع من إجراءات التلاعب الدقيق (micromanipulation). نظرا لمحدودية طرق العزل التقليدية، تقترح هذه الدراسة بروتوكولا عمليا قائما على الشفط الدقيق لعزل السائل المنوي الصغير من السائل المنوي المحفوظ بالتجميد في الخيول، مما يمكن من استخدامها الفوري في إجراءات الاستنساخ الجسدي بعد الجمع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على عينات السائل المنوي المحفوظة بالتبريد، المحفوظة لأكثر من 19 عاما في النيتروجين السائل، من موزعين تجاريين مصرح لهم من قبل السلطات البيطرية المختصة في المكسيك، وفقا للمعيار الرسمي المكسيكي NOM-027-ZOO-1995، الذي ينظم العملية الصحية الحيوانية للسائل المنوي من المنزلية. تم تعطيل جميع عينات السائل المنوي، سواء كانت مستخدمة أو غير مناسبة للتحليل، والتخلص منها وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية واللوائح المعمول بها، بما في ذلك NOM-087-ECOL-SSA1-2002 لإدارة النفايات البيولوجية المعدية في المكسيك. تم تحييد حمض الهيدروفلوريك المتبقي (HF) بأمان تحت غطاء الأبخرة عن طريق نقله تدريجيا إلى حاوية بلاستيكية وإضافة أجزاء صغيرة من CaCO3 أو Ca(OH)2 تدريجيا حتى توقف الفوار، مكينا CaF2 غير القابل للذوبان. تم تأكيد أن درجة الحموضة للتعليق المعادل بين 6 و8 قبل أن تتم إدارتها كنفايات كيميائية غير عضوية وفقا للوائح المحلية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تصنيع إبر الماصير لعزل الخلايا الجسدية

  1. اختر الشعيرات الدموية الزجاجية البوروسيليكاتية (1.0 مم O.D. × 0.78 مم I.D. × 100 مم).
  2. استخدم جهاز سحب الماصات الدقيقة لإنتاج شعيرات شعرية ذات رؤوس دقيقة. اضبط نقطة القطع لتغيير قطر الرأس.
  3. أدخل الشعيرات الدموية في السحب وقم بإغلاقه بإحكام.
  4. أزل الماصة الصغيرة بحذر بعد السحب وضعها أفقيا على الميكروفورج.
  5. قم بمحاذاة السخان والمايكربايبت ضمن مجال رؤية المجهر.
  6. حدد نقطة القطع باستخدام مؤشر العدسة (الشكل 1A,B).
  7. اجعل طرف الميكروبايبت ملامسة مع خرزة الزجاج (على خيط السخان).
  8. زد الحرارة تدريجيا حتى يذوب الطرف في الخرزة.
    1. أطفئ المدفأة.
    2. دع الطرف يلتصق بالخرزة وينفصل.
      ملاحظة: ليس من الضروري ثني الميكروبايبت؛ يمكن استخدامه في شكله المستقيم. ومع ذلك، إذا فضل العامل ذلك، يمكن تشكيل زاوية (الشكل 1C).
  9. لا تنعم الطرف، لأن هذه الخطوة غير ضرورية للإجراء.
  10. نظف رؤوس الماصة عن طريق غمر كل طرف لمدة ~10 ثوان بشكل متسلسل في:
    1. حمض الهيدروفلوريك 20٪ (HF).
      تحذير: حمض الهيدروفلوريك سام للغاية ومسبب للتآكل. استخدم معدات الحماية الشخصية التي أشار إليها المورد. ركز على استخدام حماية العينين والوجه، وقفازات، ومعطف مختبر، ودائما ارتد غطاء أبخرة.
    2. ماء مقطر مزدوج معقم.
    3. إيثانول مطلق.
      ملاحظة: لتسهيل غسل أطراف الماصة، حضر المحاليل المذكورة أعلاه في أنابيب كورنينج معقمة بسعة 15 مل.
  11. جفف الميكروبايبتات في فرن عند 50 درجة مئوية.
  12. خزن الميكروبايبتات في حاوية معقمة.

2. إعداد الميكروستريشن

  1. تأكد من أن نظام الشفط الدقيق يعمل بشكل صحيح، مع وجود عصا التحكم الدقيقة في منتصف لوحة التحكم.
  2. بالنسبة للأنظمة التي تستخدم الزيت، تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل النظام، لأنها قد تؤثر على دقة الحركة.
  3. أدخل مايكربيبت شفط الخلايا الجسدية في جهاز التحكم الثابت على جانب اليد المسيطرة للمشغل السائد.
    ملاحظة: استبدل الميكروبايبت بأخرى جديدة إذا انسدت الطرف أثناء جمع الخلايا الجسدية.

3. إذابة وتخفيف السائل المنوي المحفوظ بالتجميد لدى الخيول

  1. أزل المصاصات من النيتروجين السائل، واعرض الهواء لمدة 10 ثوان، ثم أذاب على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
  2. تخفيف السائل المنوي الأول: خذ عينة من السائل المنوي المذاب (250 ميكرولتر) وخففها ب 1.0 مل من وسط DMEM/F12 مع 10٪ مصل بقري جنيني، 0.1 ملغ/مل ألبومين مصل البقر، 12.5 ميكرومولار β-ميركابتوإيثانول، و1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات.
    1. حضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. تخفيف السائل المنوي الثاني: خذ 25 ميكرولتر من التخفيف الأول، وقم بتخفيفه بمقدار 975 ميكرولتر من 1x DPBS مع مكمل ب 0.1 ملغ/ملليتر بولي (كحول الفينيل) (PVA) أو بولي فينيل بيروليدون (PVP) ووضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل، وامزجه بلطف.
    1. حافظ على هذا الخليط عند 37 درجة مئوية طوال عملية جمع الخلايا.

4. تحضير الأطباق لمجموعة SCs

  1. اجمع القطع باستخدام غطائين من أطباق زراعة قطرها 35 مم.
  2. جهز الغطاء الأول كما يلي (الغطاء #1، الشكل 2A).
    1. خذ 100 ميكرولتر من التخفيف الثاني للسائل المنوي ووضعه في مركز الغطاء (انظر الشكل 2A).
    2. قم بعمل قطرة دقيقة ثانية (10 ميكرولتر) من 1x DPBS مع 0.1 ملغ/مل PVA أو PVP فوق القطرة الأولى (انظر الشكل 2A).
    3. غط كلا الميكرودروب بالكامل بزيت البرافين لمنع التبخر والحفاظ على ثبات درجة الحرارة أثناء شفط الميكرودروب.
  3. جهز الغطاء الثاني لإزالة الحطام الخلوي المنوية المصاحبة (الغطاء #2، الشكل 2B).
    1. ضع ثلاث قطرات بحجم 30-50 ميكرولتر من 1x DPBS مع مكمل ب 0.1 ملغ/مل PVA أو PVP في وسط الغطاء؛ لا تغطيها بزيت معدني.
      ملاحظة: حضر هذا الطبق فقط بعد اختيار جميع الخلايا الجسدية لمنع التغيرات في الخصائص الفيزيائية والكيميائية لمحلول DPBS الناتج عن التعرض للهواء.
  4. قم بتنفيذ جميع خطوات الشفط الدقيق تحت مجهر مقلوب في درجة حرارة الغرفة. تجنب التغيرات المفاجئة في درجة الحرارة.

5. إجراء الشفط الدقيق لعزل السائل المنوي من السائل المنوي المحجوز بالتجميد

  1. ضع الغطاء الأول (الغطاء #1، الشكل 2A) على مرحلة المجهر، جاهزا لجمع القطع الصغيرة.
  2. اختر ميكروبايبت بالقطر المناسب لجمع القطع الكهربائية وربطها بنظام الشفط الميكانيكي.
  3. أدخل الميكروبايبت بحذر في الميكرودروب ومحاذاة مع أسفل غطاء الطبق. بمجرد أن تحصل الماصة على وسط زراعة مستنشق، ابدأ في التقاط القطع المنفصلة للكائنات الصغيرة.
  4. في أسفل الطبق، يجب أن تكون أشكال الخلايا المختلفة مرئية (الشكل 3).
  5. ضع طرف الماصي بجانب كل SC واستنشقه تحت ضغط سلبي. تستنشق خلايا شاملة وممدودة بغض النظر عن حجمها. يختلف حجم الشفط بين عمليات التقاط الSC.
  6. بعد التقاط 10 خلايا، يتم إيداعها في الميكرودروب الموجود في الأعلى (10 ميكرولتر) (الشكل 2A). كرر هذه الخطوة حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من SCs لتجربة الاستنساخ.
  7. احتفظ بجميع الخلايا الجسدية المحتجزة داخل هذا الميكرودروب طوال عملية الجمع.
  8. بمجرد الحصول على العدد المطلوب من القطع العصبية للاستنساخ، قم بإجراء عملية غسل بسيطة باستخدام قطرات دقيقة لإزالة المنوية المصاحبة، والحطام الخلوي، والملوثات الميكروبية.
  9. خذ الغطاء الثاني وقم بغسل متتابع من ثلاث خطوات لطبقات SC (الغطاء #2، الشكل 2B):
    1. اجمع الخلايا الجسدية باستخدام ميكروبايبيت ووضعها بعناية على سطح القطرة الأولى. دعهم يستقرون لمدة 3-5 دقائق (الشكل 2B؛ النقطة #1).
    2. كرر الخطوة 5.9.1، ووضعها في القطرة الثانية (الشكل 2B؛ النقطة #2).
    3. كرر الخطوة 5.9.1، ووضع الخلايا الجسدية في القطرة الثالثة (الشكل 2B؛ السقوط #3).
  10. كخطوة أخيرة، يتم إيداع الخلايا الجسدية المعزولة في قطرة دقيقة نهائية معدة للاستخدام لاحقا في عمليات نقل النوى للخلايا الجسدية (الشكل 4D).
    ملاحظة: استنشق القطع العصبية بأصغر حجم متوسط ممكن خلال كل عملية التقاط لتقليل المنوية والحطام والملوثات الميكروبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الجدول 1 أن تقنية الشفط الدقيق تسترجع الخلايا الجسدية بكفاءة من السائل المنوي المحفوظ بالتجميد، مع معدلات التقاط تتراوح بين 317.7 ± 9.60 إلى 424.7 ± 33.65 خلية/ساعة عبر ثلاثة خيول. حقق حصان #03 أعلى إنتاجية، مما يدل على فعالية الطريقة حتى مع العينات المخزنة طويلة الأمد. تشير البيانات إلى أن هذه التقنية تعزل الخلايا الجسدية من السائل المنوي بشكل مستمر وفعال، وتوفر معدلات الالتقاط المتوسطة والانحرافات المعيارية مقاييس كمية للكفاءة والاتساق، مما يدعم تطبيقها في نقل النو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد جعل التلاعب الدقيق بالخلايا والأمشاج من الممكن تبسيط تقنيات التكاثر المساعدة المعقدة. من أمثلة هذه الأمثلة الاستنساخ الجسدي بواسطة الاستنساخ اليدوي21، والفقس بمساعدة22، وحقن المنوية داخل السيتوبلازم (ICSI)23، والحقن الدقيق للنواة في الزيجوت24، من بين آخرين.

تطوير طرق فعالة لعزل الخلايا الجسدية عن السائل المنوي هو أداة لا تقدر بثمن لتقنيات تكاثر الحديثة. ومع ذلك،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنهم لا يملكون تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون مختبر إدارة التكاثر، قسم الإنتاج الزراعي والحيواني، جامعة متروبوليتانا-زوشيميلكو (UAM-X)، على دعمهم التقني واللوجستي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2 بيتا ميركابتوإيثانولسيغماM7522زراعة الخلايا الجسدية
1x DPBSجيبكومرجع-21600010التلاعب بالخلايا الجسدية
الإيثانول المطلقهايسيلإل كريسول 50181-1L73لتصنيع الماصات
مضاد حيوي-مضاد للميكوتيك 100xالغلاف الصناعي SA. Mé xicoزراعة الخلايا الجسدية
الشعيرات الدموية البوروسيليكاتية (1.0 مم O.D. &0; 0.78 مم I.D. ومرة; 100 مم الطول)جهاز هارفارد، الولايات المتحدة الأمريكيةEC1-30-0035لتصنيع الماصات
BSAسيغماA3311زراعة الخلايا الجسدية
DMEM/F12 متوسطجيبكومرجع-12500-062زراعة الخلايا الجسدية
عينة من السائل المنوي المحجوز بالتبريد في الخيولتم الحصول على عينات السائل المنوي المحفوظة بالتجميد من موزع تجاري وتم حفظها لأكثر من 19 عاما في النيتروجين السائل. تم الحصول على جميع عينات السائل المنوي المجمدة من الموزعين التجاريين المصرح لهم من قبل السلطات البيطرية المختصة في المكسيك، وفقا للمعيار الرسمي المكسيكي NOM-027-ZOO-1995، العملية الصحية الحيوانية للسائل المنوي من المنزلية.
مؤشر العدسةأداة لتصنيع الماصاتالمعدات المطلوبة
مصل الأبقار الجنينيجيبكومرجع-26140-079زراعة الخلايا الجسدية
حمض الهيدروفلوريكسيغما-ألدريتش339261لتصنيع الماصات
المجهر البصري المقلوبإكليبس، TE 200نيكونالتلاعب الدقيق بالخلايا الجسدية
مختبر   الفرن الجافأداة لتصنيع الماصاتالمعدات المطلوبة
الميكروفورجأداة لتصنيع الماصاتالمعدات المطلوبة
مجموعة الميكرو مانبوليتور للمجهر المقلوبالتلاعب الدقيق بالخلاياالمعدات المطلوبة
جهاز سحب الميكروبايبتP-97، آلة ساترأداة لتصنيع الماصاتاستخدم الإعدادات التالية وmdash; الجدارة: 720؛ السحب: 30؛ السرعة: 50؛ الوقت: 220; الضغط
زيت المعادنسيغماM8410التلاعب بالخلايا الجسدية
Nunclon  أطباق زراعة الخلية، DIAM. & Times; H 35 مم ومرة؛ 10 ممنونكلوننونك 153066
PVAسيغماP8136زراعة الخلايا الجسدية
PVPسيغماP5288زراعة الخلايا الجسدية
محلول تريبان الأزرق 0.4٪جيبكوالمرجع - 15250061صبغة الخلايا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions. Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).
  2. Galli, C., Duchi, R., Moor, R. M., Lazzari, G. Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning. 1 (3), 161-170 (1999).
  3. Olsson, P. O., Yeonwoo, J., Park, K., Yoo, Y. M., Hwang, W. S. Live births from urine derived cells. PLoS One. 18 (1), e0278607(2023).
  4. Vignon, X., et al. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. C R Acad Sci III. 321 (9), 735-745 (1998).
  5. Nel-Themaat, L., et al. Isolation, culture and characterisation of somatic cells derived from semen and milk of endangered sheep and eland antelope. Reprod Fertil Dev. 19 (4), 576-584 (2007).
  6. Kjelland, M. E., Liu, J., Hyatt, D., Kraemer, D. Collection, isolation, and culture of somatic cells from avian semen. Avian Biol Res. 6 (4), 255-260 (2013).
  7. Nel-Themaat, L., et al. Cloned embryos from semen. Part 1: in vitro proliferation of epithelial cells on embryonic fibroblasts after isolation from semen by gradient centrifugation. Cloning Stem Cells. 10 (1), 143-160 (2008).
  8. Liu, J., et al. Evaluation of culture systems for attachment and proliferation of epithelial cells cultured from ovine semen. Anim Reprod Sci. 115 (1-4), 49-57 (2009).
  9. Liu, J., et al. Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen. Theriogenology. 74 (9), 1629-1635 (2010).
  10. Saini, M., et al. Isolation and culture of epithelial cells from stored buffalo semen and their use for the production of cloned embryos. Reprod Fertil Dev. 31 (10), 1581-1588 (2019).
  11. Brom-de-Luna, J. G., Canesin, H. S., Wright, G., Hinrichs, K. Culture of somatic cells isolated from frozen-thawed equine semen using fluorescence-assisted cell sorting. Anim Reprod Sci. 190, 10-17 (2018).
  12. Ramos, B., Rodríguez, A. A., Rosales, A. M., Montiel, A. J., Hernández, J. E. Identification of somatic cell populations in cryopreserved equine semen as a source of donor nuclei for somatic cloning: preliminary results. Reprod Fertil Dev. 37 (1), (2025).
  13. Moulavi, F., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer in Asiatic cheetah using nuclei derived from post-mortem frozen tissue in absence of cryo-protectant and in vitro matured domestic cat oocytes. Theriogenology. 90, 197-203 (2017).
  14. Wakayama, S., Ito, D., Ooga, M., Wakayama, T. Production of mouse offspring from zygotes fertilized with freeze-dried spermatids. Sci Rep. 12 (1), 18430(2022).
  15. Wakayama, S., Ito, D., Hayashi, E., Ishiuchi, T., Wakayama, T. Healthy cloned offspring derived from freeze-dried somatic cells. Nat Commun. 13 (1), 3666(2022).
  16. Loi, P., Fulka, J., Hildebrand, T., Ptak, G. Genome of non-living cells: Trash or recycle. Reproduction. 142 (4), 497-503 (2011).
  17. Wakayama, S., Wakayama, T., Wells, D. N. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-10 (2023).
  18. Lanza, R., et al. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science. 288, 665-669 (2000).
  19. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophys J. 116 (4), 587-594 (2019).
  20. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J Biomech. 33 (1), 15-22 (2000).
  21. Vajta, G., et al. Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulators and carbon dioxide incubators using the handmade cloning (HMC) and the submarine incubation system (SIS). Theriogenology. 62 (8), 1465-1472 (2004).
  22. Alteri, A., et al. Revisiting embryo assisted hatching approaches: A systematic review of the current protocols. J Assist Reprod Genet. 35 (3), 367-391 (2018).
  23. Briski, O., Salamone, D. F. Past, present and future of ICSI in livestock species. Anim Reprod Sci. 246, 106925(2022).
  24. Wall, R. J. Pronuclear microinjection. Cloning Stem Cells. 3 (4), 209-220 (2001).
  25. Selokar, N. L., et al. Hope for restoration of dead valuable bulls through cloning using donor somatic cells isolated from cryopreserved semen. PLoS One. 9 (3), e90755(2014).
  26. Selokar, N. L., et al. Buffalo (Bubalus bubalis) SCNT embryos produced from somatic cells isolated from frozen-thawed semen: Effect of trichostatin A on the in vitro and in vivo developmental potential, quality and epigenetic status. Zygote. 24 (4), 549-553 (2016).
  27. Guevorkian, K., Maître, J. L. Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods Cell Biol. 139, 187-201 (2017).
  28. Duah, E. K., et al. Production of hand-made cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos from nonviable somatic cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 52 (10), 983-988 (2016).
  29. Loi, P., et al. Nuclei of nonviable ovine somatic cells develop into lambs after nuclear transplantation. Biol Reprod. 67 (1), 126-132 (2002).
  30. Fahrudin, M., Otoi, T., Suzuki, T. Developmental competence of bovine embryos reconstructed by the transfer of somatic cells derived from frozen tissues. J Vet Med Sci. 63 (10), 1151-1154 (2001).
  31. Podico, G., et al. Single-layer colloid centrifugation as a method to process urine-contaminated stallion semen after freezing-thawing. J Equine Vet Sci. 87, 102910(2020).
  32. Zhang, Y. T., et al. Evaluation of porcine urine-derived cells as nuclei donor for somatic cell nuclear transfer. J Vet Sci. 23 (2), e40(2022).
  33. Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 23808(2016).
  34. Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: a guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).
  35. Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
  36. Graber, M., Lane, B., Lamia, R., Pastoriza-Munoz, E. Bubble cells: Renal tubular cells in the urinary sediment with characteristics of viability. J Am Soc Nephrol. 1 (7), 999-1004 (1991).
  37. Rahmanian, N., Bozorgmehr, M., Torabi, M., Akbari, A., Zarnani, A. H. Cell separation: Potentials and pitfalls. Prep Biochem Biotechnol. 47 (1), 38-51 (2017).
  38. Håård, M. Use of frozen stallion semen in Europe. Acta Vet Scand Suppl. 88, 123-127 (1992).
  39. Klug, E., Treu, H., Hillmann, H., Heinze, H. Results of insemination of mares with fresh and frozen stallion semen. J Reprod Fertil Suppl. 23, 107-110 (1975).
  40. Pukazhenthi, B., Comizzoli, P., Travis, A. J., Wildt, D. E. Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species. Reprod Fertil Dev. 18 (1-2), 77-90 (2006).
  41. Swanson, W. F., Magarey, G. M., Herrick, J. R. Sperm cryopreservation in endangered felids: developing linkage of in situ-ex situ populations. Soc Reprod Fertil Suppl. 65, 417-432 (2007).
  42. Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: Advancements and problems. Cell Reprogram. 15 (5), 374-384 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Microaspiration TechniqueSomatic Cell IsolationCryopreserved Equine SemenNuclear Donor CellsSomatic Cell Nuclear TransferEquine CloningCell Morphology SelectionMicropipette AspirationSequential Cell WashingDiploid Cell Recovery

مقالات ذات صلة