مقالة منهجية

صبغة البيروكسيسوم في خلايا الثدييات باستخدام مجسات خاصة بالبيروكسيسوم

DOI:

10.3791/69405

⸱

ديسمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of Southampton, 2The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, 3Biosciences, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, 4Institute of Bioengineering, Faculty of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 5Biomolecular Screening Facility, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 6Conquest

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم مجسات PeroxiSPY لاكتشاف البيروكسيسومات في خلايا الثدييات. هنا نوضح كيفية استخدام المجسات لتلوين البيروكسيسومات في الخلايا الحية والثابتة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيروكسيسومات هي عضيات منتشرة في كل مكان لها أدوار أساسية في صحة الإنسان، وتؤدي خللاتها إلى طيف من الاضطرابات الجينية. تصور البيروكسيسومات هو المفتاح لتحديد خلل البيروكسسوم؛ ومع ذلك، كان التقدم محدودا بسبب غياب المجسات الخاصة بالبيروكسيسوم. من خلال تطوير PeroxiSPY، وهي مجسات خاصة بالبيروكسيسوم تحاكي مستقلبات البيروكسيسوم الطبيعية، مكنا الكشف في الوقت الحقيقي عن ديناميكيات البيروكسيسوم وتتبعها وقياسها في الخلايا الثديية الحية. بالإضافة إلى ذلك، تكشف تطبيقات هذه التقنية على الخلايا المصابة باضطرابات البيروكسسومات عن الأنماط المرضية. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا للكشف عن البيروكسيسومات في الخلايا الثديية الحية، بالإضافة إلى اكتشاف البيروكسيسومات بعد التلوين في الخلايا الثابتة. نعرض كيفية صبغ البيروكسيسومات في الخلايا الحية باستخدام مجسات خاصة بالبيروكسيسوم، مع التركيز على تحضير الخلايا، وتوقيت العملية، وقابلية التكرار، وحل المشكلة. تمكن هذه المجسات من الكشف السريع والدقيق وغير السام للبيروكسيسوم في الخلايا الحية الحية لوجود بيروكسيسومات، مما يوفر طريقة كمية فريدة لتقييم وظيفة البيروكسسوم وخلله في الاضطرابات المرتبطة بالبيروكسيسوم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيروكسيسوم هو أكثر العضيات حقيقية النواة وفرة، حيث تتجاوز بعض الخلايا ألف بيروكسيسوم1. وظائفها ضرورية لتطور الكائن وتكيف الأيض 1,2، كما يتضح من مجموعة من اضطرابات البيروكسسوم البشري، والتي عادة ما تكون غير قابلة للشفاءفي حالات تنكسية عصبية وعصبية أيضية لدى الأطفال الصغار. حسب علمنا، كان هناك سابقا نقص في الطرق الانتقائية المتاحة لوضع علامات على البيروكسسومات في الخلايا والأنسجة الحية. تعد هذه الأدوات لا تقدر بثمن للبحث والتطبيقات التشخيصية، حيث تسمح بالقياس المباشر والكمي لعدة جوانب من تكوين ووظيفة البيروكسيسوم6. هذه المجسات متعددة الاستخدامات بما يكفي لتوفير قراءة كمية لوظيفة البيروكسسوم في الخلايا، ومن جهة أخرى، تستخدم في اختبارات الفعالية الانتقالية أو كتشخيصات لاضطرابات البيروكسسوم6. صبغ PeroxiSPY هو تقنية سريعة ومحددة وغير سامة للخلايا للكشف غير الجراحي عن البيروكسيسوم الحي في الخلايا الحيوية. هنا، نشرح كيفية صبغ البيروكسيسومات في خطوط الخلايا الثديية باستخدام مجسات بيروكسوسوم (وقد أظهرت المجسات أيضا تلوينا بيروكسيزومالي محددا في أجنة سمك الزرد، لكنها غير مناسبة لتلوين البيروكسيسومات في خلايا نباتية أرابيدوبسيس ثاليانا 6). يمكن تحقيق التلوين في أقل من 10 دقائق. يمكن بعد ذلك اكتشاف المجس لساعات أو تثبيته باستخدام بروتوكول تثبيت بارافورمالديهايد لمزيد من التلوين المناعي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تلوين الخلايا الحية

  1. تحضير زراعة الخلايا لتصوير الخلايا الحية (المدة: 24 ساعة)
    ملاحظة: اتبعت الدراسة بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية لجميع التجارب. تم الحفاظ على خطوط الخلايا في DMEM أو DMEM/F12 ل SH-SY5Y، مع إضافة 10٪ مصل البقري الجيني (FBS)، 1٪ بنسلين/ستربتومايسين، عند 37 °م و5٪ ثاني أكسيد الكربون2. بعض أنظمة التصوير حساسة لتركيب الوسائط. إذا اكتشف المجهر إشارة الفينول الأحمر في الوسط، استخدم بدائل خالية من الفينول الأحمر. بالإضافة إلى ذلك، إذا لم يكن المجهر مزودابغرفة ثاني أكسيد الكربون، استبدل الوسط بوسط يحتوي على HEPES (درجة حموضة 7.4).
    1. قبل يوم من التجربة، قسم الخلايا إلى لوحة تصوير ذات قاع زجاجي لتحقيق تلاقي بنسبة 30-70٪ في اليوم التالي.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استخدام صفائح 35 مم ذات 4 آبار.
      1. (حالة حرجة) لا تستخدم الخلايا الجائعة أو المجهدة للتقسيم من أجل التجربة. تأكد من أن خطوط الخلايا تتغير في الوسائط بانتظام (على الأقل كل يومين إلى ثلاثة أيام) ويتم تقسيمها قبل أن تصل إلى 90٪ من التقاطع. الهدف هو وجود خط خلوي صحي لضمان تلوين متجانس.
        ملاحظة: بعض الخلايا، مثل الخلايا الجذعية، ستحتاج إلى طبقة طلاء زجاجية بطبقة طبقة مناسبة، مثل ماتريجيل، الذي لا يتداخل مع التلوين.
  2. تحضير إعداد التصوير (المدة: ساعة واحدة)
    ملاحظة: يتطلب تصوير العضيات وديناميكا العضيات دقة مكانية عالية. لهذا البروتوكول، تم استخدام مجهر كونفوكال مزود بوحدة مضاعف ضوئي GaAsP، وغرفة ثاني أكسيد الكربون، ووحدة تحكم في درجة الحرارة. تم إجراء التصوير باستخدام وضع مسح ثنائي الاتجاه من الجلفانومتر مع هدف CFI Plan Apo Lambda 60x زيت NA 1.42، وتم استخدام ليزر 561 نانومتر (50 ميلي واط) لمسبار 555. استخدم ليزر 640 نانومتر أو ما يعادله لمسبار 650. تم تصور البيروكسيسومات في خطوط الخلايا البشرية. قد يختلف وقت الحضانة مع المجسات لخطوط خلايا مختلفة. يوصى بتحسين التوقيت من خلال تصور الخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد التلوين (الشكل 2A).
    1. ابدأ النظام الكونفوكلي. تأكد من أن ثاني أكسيد الكربونودرجة الحرارة (37 درجة مئوية) مستقران لمدة 20 دقيقة قبل بدء التلوين وإدخال الخلايا إلى المجهر.
      ملاحظة: (حرج) من الضروري التحقق من بقاء الخلايا سليمة طوال التجربة من خلال الفحص البصري وأن درجة الحموضة ودرجة حرارة الوسط محفوظة. يمكن تحقيق ذلك باستخدام وحدات التحكم للمعلمات وفحص تلوين الوسائط بصريا، إذا تم استخدام الفينول الأحمر. ولهذا يمكناستخدام وحدات تحكم درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون.
    2. قم بإعداد برنامج المجهر الكونفوكي. شغل البرنامج وشغل ليزر 561 نانومتر لتلوين المجس 555. قم بضبط معايير الاستحواذ وقوة الليزر. يستخدم هذا البروتوكول 1٪ من طاقة الليزر، وقوة عالية (كسب) 100، ودقة 1024 و1024 بكسل مع 3 تكبير لتصوير الخلايا.
  3. صبغة بيروكسيسوم (المدة: 1-5 دقائق)
    1. نبت مثلثا من المجس لتركيز عمل نهائي يبلغ 1 ميكرومول، مثل 0.5 مل من الوسط، والماصة 0.5 ميكرولتر من المجس.
    2. اختر البئر الذي يصبغ، والصق عليه من الخارج بقلم تحديد.
    3. من البئر المختار، قم بإخراج كل (0.5 مل) من الوسط بالماصة وتصرفه في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على المجس المنفصل من الخطوة 1.3.1.
      ملاحظة: من الضروري إزالة جميع الوسائط من البئر في هذه الخطوة لضمان التلوين المتساو.
    4. حبت الأنابيب للأعلى والأسفل ثلاث مرات لخلط الوسائط مع المجس. استنشق الخليط الكامل إلى الماصة.
      ملاحظة: يمكن استخدام الخلط عن طريق الدوامة بدلا من استخدام الماصات.
    5. صب الخليط مرة أخرى في البئر المختار قطرة قطرة، مع التأكد من أن الماصة على اتصال بجدار البئر. عند إعادة الخليط إلى البئر، ابدأ مؤقتا لمدة 10 دقائق.
    6. أغلق الغطاء، وأضف قطرة من زيت الغمر على الهدف (يستخدم هذا البروتوكول 60× زيت هدف)، ووضع اللوح على المجهر للتصوير.
      ملاحظة: ينصح بتحسين تركيز المجس لكل خط خلوي لضمان تلوين متجانس. يوصى بالاختبار عند 0.25، 0.5، 1، و2 ميكرومولار لمدة 5-20 دقيقة؛ عادة ما تصبغ التركيزات المنخفضة بخلفية منخفضة (الشكل 2A). اعتمادا على خط الخلايا وحساسية كاشف المجهر، يمكن تصوير الخلايا الملونة من خلال 5 دقائق من إضافة المجس إلى 24 ساعة بعد الإضافة. في بعض الحالات، على سبيل المثال، تصوير الخلايا الجذعية، يمكن إجراء تصور الخلايا لأكثر من 180 دقيقة بعد إضافة المجس دون تغيير في الإشارة. في أي وقت، يمكن تغيير الوسائط لإزالة المجس. هذا يؤدي إلى فقدان تدريجي للصبغة خلال حوالي 30 دقيقة لخلايا HEK293T.
  4. التصوير الكونفوكلي للبيروكسيسومات في الخلايا الحية (المدة: 10 دقائق إلى 3 ساعات)
    1. بمجرد وضع اللوح على المجهر، قم بضبط التركيز على الخلايا في البئر الملونة وابدأ التصوير.
    2. بمجرد أن تكون الخلايا في تركيز التركيز، قم بضبط الكسب (حساسية الكاشف أو الكاشف) وإعدادات طاقة الليزر باستخدام إرشادات إعداد المجهر الكونفوكال القياسية.
    3. ابحث عن مجموعة الخلايا ووضعها (تكبير). بعد التركيز على الخلايا، قم بضبط معايير الاكتساب لتناسب جودة الصورة المطلوبة.
      1. حدد معايير التصوير لالتقاط الصورة: 0.5-1٪ قوة ليزر، 100 HV (كسب) باستخدام برنامج NIS-Elements. تأكد من أن الصورة ليست مشبعة بشكل زائد (إذا كانت كذلك، غير الشدة والكسب).
      2. اختر حجم المسح. احصل على 1024 صورة بحجم 1024 بكسل، سرعة المسح (1/2-1/4)، متوسط الخط (2)، التكبير (3) المناسب للتصوير الذي يتم إجراؤه.
        ملاحظة: تتحرك البيروكسيسومات أثناء التقاط الصورة، مما قد يؤدي إلى ظهور تشوهات أثرية. يتم تحسين المعلمات الموصى بها لتقليل آثار الحركة مع ضمان جودة كافية للصور للقياس. عند إنشاء تايم لابس، تأكد من تحديد الفاصل الزمني ومدة والحلقات قبل بدء الفيديو. المجسات قابلة للتصوير الضوئي.
    4. احصل على جميع الصور مع تسميات متاحة وحفظها (هنا، يستخدم صيغة نيكون لبرنامج .nd2 NIS-Elements).

2. تلوين الخلايا الثابتة

  1. تحضير زراعة الخلايا لتصوير الخلايا الحية (المدة: 24 ساعة)
    ملاحظة: تم اتباع بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية في جميع التجارب. تم الحفاظ على خلايا Huh7 في DMEM/F12 مع مكمل 10٪ FBS، 1٪ بنسلين/ستربتومايسين، عند 37 درجة مئوية و5٪CO2.
    1. قبل يوم من التجربة، قسم الخلايا إلى صفيحة مع أغطية لتصل إلى 30-70٪ في اليوم التالي.
      ملاحظة: زرع 50,000 خلية/بئر في صفائح ب 12 بئر مع ألواح تغطية بقطر 18 مم، أو 15,000 خلية/بئر في صفائح ب 24 بئر مع ألواح غطاء بقطر 13 مم.
  2. صبغة بيروكسيسوم (المدة: 1-5 دقائق)
    1. تخفيف المجس بوسائط جديدة إلى تركيز عمل نهائي يبلغ 4 ميكرومولار في أنبوب طرد مركزي دقيق حساس للضوء فارغ، مثلا لحجم 0.5 مل من الوسط، وماصة 2 ميكرولتر من المجس (محلول مخزوني: 1 ميلي مولار).
    2. اختر البئر الذي يجب صبغه ووضع علامة عليه من الخارج بقلم تحديد العلامة.
    3. من البئر المختار، استنشق كل (0.5 مل) من الوسط واستبدله بوسط المجس من الخطوة 2.2.1. قم بإدخال وسط المجس في البئر المختار قطرة قطرة، مع التأكد من أن الماصة على اتصال بجدار البئر.
    4. عند إعادة الخليط إلى البئر، حضن الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: من هذه اللحظة، الخلايا حساسة للضوء ويجب تغطيتها بورق الألمنيوم.
  3. تثبيت ما بعد التلوين وتصوير البيروكسسومات في الخلايا الثابتة
    1. بعد التلوين، أزل الوسط بعناية واغسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    2. ضع محلول بارافورمالديهايد (PFA) بنسبة 4٪ في PBS على درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    3. قم بإزالة PFA بعناية في حاوية نفايات مخصصة لها. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
      تحذير: PFA سام ويجب التخلص منه وفقا للوائح المؤسسات.
    4. للمضي قدما في الفلورية المناعية، اتبع الخطوات أدناه
      1. أضف 0.5٪ تريتون-إكس (مخفف في PBS) لنفخ الخلايا. اترك لمدة دقيقتين ونصف.
      2. أزل ترايتون-إكس بحذر. اغسل الخلايا مرتين، لمدة 10 دقائق باستخدام PBS.
      3. قم بحل ألبومين مصل البقري بنسبة 5٪ في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      4. تابع إجراء الفلورة المناعية القياسي.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجسات PeroxiSPY مصممة لمحاكاة الركائز الطبيعية للبيروكسيسومات - الأحماض الدهنية المتفرعة والطويلة جداالسلسلة 5. لذلك، فإن التلوين سيؤدي إلى استيراد مجسات من السيتوبلازم إلى بيروكسيسومات 5,6,7 معتمدة على رابطة الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى البيروكسيسومات 5,6,7. اعتمادا على الحالة الأيضية للخلية، قد يستورد نقل ABCD المعتمد على ATP المجسات بكفاءة وسرعة، مما يؤدي إلى نسبة عالية من البيروكسيسوم إلى السيتوبلازم من شدة الفلورية (الشكل 1A). تشمل الخطوات الحاسمة لضمان نسبة عالية تجنب جوع الخلايا عن طريق استبدال وسائط الخلايا بانتظام وعدم نمو الخلايا عند التقاء عالي.

للتحقق من خصوصية تلوين البيروكسسوم، ينصح بتضمين عدة ضوابط (الشكل 1B,C). تحليل التداخل المشترك مع علامة مرجعية للبيروكسيزومال، مثل علامة استيراد البروتين - GFP-SKL (الشكل 1B,C). بالإضافة إلى ذلك، إذا كانت هناك خطوط خلاوية تفتقر إلى البيروكسيسوم، مثل PEX19 KO، فإن التلوين سيكون غائبا في تلك الخلايا (الشكل 1B)5,8.

يمكن استخدام مجسات البيروكسيسوم لقياس كثافة البيروكسسوم (الشكل 1C)5,9، ويتم تطويرها لتقييم استيراد الركيزة، وديناميكيات البيروكسيسوم، والتفاعلات. بالنسبة للتصوير الكمي، من المهم توحيد عملية التلوين، وتوقيت التقاط الصورة (مثل 10-20 دقيقة بعد التلوين)، وتحضير خط الخلية، ومعايير الاكتساب. تتطلب بعض خطوط الخلايا تحسين تركيز المجس بالإضافة إلى التوقيت لتحسين شدة الإشارة للبيروكسيسوم بالنسبة للخلفية السيتوسولية، مثل 250 نانوموتر و20 دقيقة تعمل بشكل أفضل لخلايا COS-7 (الشكل 2A). تقوم الخلايا بعملية استقلاب المجسات، مما يؤدي إلى تقليل تدريجي في تلوين البيروكسيسوم مع مرور الوقت؛ ومع ذلك، يمكن أن تتحسن نسبة البيروكسيسوم إلى السيتوبلازم خلال 24 ساعة (الشكل 2B). بالإضافة إلى ذلك، طورنا إجراء تثبيت يسمح بالتلوين المشترك مع الأجسام المضادة ورؤية البيروكسيسومات لاحقا (الشكل 2C,D).

figure-results-1
الشكل 1: تصوير الخلايا الحية للبيروكسيسومات. (أ) مخطط التلوين. (ب) المجهر الكونفوكلي لخلايا WT وPEX19 KO HEK293T تفرط في التعبير عن GFP-SKL وتلوين بمسبار بيروكسيسوم أحمر (1 ميكرومولار لمدة 10 دقائق). أشرطة السلم - 1 ميكرومتر و10 ميكرومتر. يظهر ملف الشدة التمثيلي. (ج) المجهر الكونفوكلي للأرومات الليفية البشرية التي تفرط في التعبير عن GFP-SKL وصبغت ب PeroxiSPY (1 ميكرومولار لمدة 10 دقائق). أشرطة السلم - 1 ميكرومتر و10 ميكرومتر. يظهر ملف الشدة التمثيلي. (د) المجهر الكونفوكلي لخلايا SW13 (قشرة الغدة الكظرية)، SH-SY5Y (الخلايا العصبية)، CCL-136 (الخلايا العضلية)، HaCat (خلايا الكيراتينو)، U2OS (الخلايا العظمية)، و HEK293T (الكلى الجنينية البشرية) الملونة بمسبار البيروكسيسوم الأحمر (1 ميكرومولار لمدة 10 دقائق). قضبان السلم - 2 ميكرومتر و10 ميكرومتر. تم إجراء القياس باستخدام فيجي كما هو موصوف سابقا9 ويظهر عدد البيروكسسومات لكل ميكرون مربع، متوسط ± SEM، N = 100 خلية مجمعة من 3 تكرارات بيولوجية، *** - p < 0.001، **** - p < 0.0001، اختبار كروسكال-واليس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحسين تصوير البيروكسيسوم وتلوين الخلايا الثابتة. (أ) المجهر الكونفوكلي لخلايا COS-7 (كلى الأخضر الأفريقي) الملونة بمسبار بيروكسيسوم أحمر وفقا للبروتوكول (1 ميكرومولار لمدة 10 دقائق؛ قبل التحسين) وتحت ظروف محسنة (250 نانوميل لمدة 20 دقيقة؛ بعد التحسين). شريط المقياس - 10 ميكرومتر. تم قياس متوسط كثافة البكسل للبيروكسيسوم والسيتوسول باستخدام فيجي والتعبير عنه كنسبة. N = 7 خلايا (قبل التحسين) و21 خلية (بعد التحسين). متوسط ± SEM، *** - p < 0.001، **** - p < 0.0001، اختبار شابيرو-ويلكس. (ب) المجهر الكونفوكلي لخلايا HEK293T مصبوغة بمسبار بيروكسوم أحمر (1 ميكرومولار) لمدة 15 دقيقة و24 ساعة. تظهر الكمية شدة الفلورة للبيروكسيسومات والسيتوبلازم، بالإضافة إلى نسبة البيروكسيسوم إلى السيتوبلازم، المتوسط ± SEM، N = 680 بيروكسيسوم مجمعة من 3 تكرارات بيولوجية، **** - p < 0.0001، اختبار شابيرو-ويلكس. (ج) المجهر الكونفوكلي لخلايا Huh7 الملونة بمجسات بيروكسيسوم باستخدام بروتوكول التثبيت. تم تليين البيروكسيسومات مع الجسم المضاد الأولي مضاد PEX14 (1:100 في محلول الحجب، حضانة لمدة ساعة في RT) والأجسام المضادة الثانوية (1:1000 في محلول الحجب، وفلور أليكسا 488 من الأرانب المضادة للماعز، وحضانة لمدة ساعة في RT). تعرض صور كونفوكال تمثيلية. أشرطة المقياس - 10 ميكرومتر. (D) يظهر القياس القياسي التغيرات في شدة فلورية البيروكسسوم أثناء التثبيت والنفاذية التي أجريت على HEK293T الخلايا وفقا للبروتوكول، المتوسط ± SEM، N = 100 خلية مجمعة من ثلاث تكرارات بيولوجية، **** - p < 0.0001، اختبار شابيرو-ويلكس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إجراء هذا الكشف البسيط عن البيروكسسوم في أقل من 10 دقائق في خلايا. يسمح تلوين PeroxiSPY بتصور وقياس وتتبع البيروكسيسومات في الخلايا الحية، ويتوفر باللون الأحمر (جدول المواد) ومسبار أحمربعيد 5 (جدول المواد). يوفر التلوين تصورا مشابها للبيروكسيسوم لصبغة إشارة استهداف البيروكسومات الكلاسيكية (PTS1)l10 (الشكل 1B) دون الحاجة إلى تعبير مفرط. الفلوروفورات قابلة للضوء، ويمكن استخدامها للتصوير فائق الدقة واكتساب ديناميكيات البيروكسسوم على المدى الطويل في ظروف تجريبية مختلفة 5,9,11. بالإضافة إلى ذلك، المجسات حساسة لوظائف البيروكسسوم؛ لذلك يمكن استخدامها للكشف وقياس مرض بيروكسيسوم5 لأغراض البحث والتشخيص. تعتمد صبغة البيروكسيسوم على أيض البيروكسيسوم وقدرة البيروكسيسوم على استيراد وأكسدة الأحماض الدهنية. لذلك، من المهم تحسين التركيز والتوقيت لخطوط الخلايا المستخدمة. هنا نقدم إجراء قياسي يعمل على خطوط الخلايا التي اختبرناها؛ ومع ذلك، يمكن تمديد توقيت التلوين إلى 24 ساعة دون فقدان نسبة شدة الفلورة بين البيروكسيسوم إلى السيتوبلازم (الشكل 2B).

تم اختبار المجسات في العديد من خطوط الخلايا الثديية (الشكل 1 والشكل 2) وفي خلايا وأجنة دانيو ريريو في سمك الزرد5، وأظهرت خصوصية للبيروكسيسومات وسهولة الاستخدام. لم يتم اختبار هذه المجسات في خطوط خلايا حيوانية أخرى، ويجب تحسين الظروف وتركيزات المجسات لها. لا تصبغ هذه المجسات البيروكسيسومات في خلايا نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا 5.

بعض المشكلات وحلولها الخاصة بحل المشكلات هنا تناقشها. إذا كانت نسبة البيروكسيسوم إلى السيتوبلازم منخفضة جدا (تلوين بيروكسيسوم منخفض)، تأكد من أن الخلايا مقسمة حديثا ثم قم بتقسيمها مرة أخرى للتلوين. استخدم التلوين بنسبة 30-70٪ من التلطين. تحسين تركيز المجس (التركيز العالي جدا سيؤدي إلى تجاوز قدرة البيروكسيسوم على امتصاص المجسات) والتوقيت (على سبيل المثال، انظر الشكل 2A). استخدم طبق زجاجي قاع بحجم 35 مم (التلوين في ألواح 96 بئر أصعب بسبب خلط الحجم الصغير). تأكد من إضافة المجسات إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وخلطها جيدا مع الوسط قبل إضافتها إلى الخلايا. تختلف خطوط الخلايا والظروف المختلفة تؤثر على التلوين. وأخيرا، غسل المجس سيقلل من الخلفية؛ ومع ذلك، ستفقد الإشارة تدريجيا، مما يقلل من الوقت الذي يمكن فيه إجراء التصوير بفعالية.

إذا لم تكن هناك بيروكسيسومات مرئية، تأكد من أن المسبار قد تم خلطه مع الوسائط. زيادة تركيز المجس (مثلا إلى 2 ميكرومول). إدخال علامة بيروكسيزومالية إضافية لضمان إمكانية رؤية البيروكسيسومات. إذا كان هناك اختلاف خلوي لآخر في التلوين، فمن المهم إزالة جميع الوسائط وخلطها جيدا مع العليكوت جيدا قبل إعادتها إلى الخلايا. هذا يضمن تلوين متساو. إذا كان هناك تباين، فمن الممكن أن تكون مجموعة الخلايا غير متجانسة في قدرتها على استيراد ركيزة البيروكسيسوم. يساعد تزامن الخلايا عن طريق الانقسام المنتظم في التلوين الموحد. إذا لم يتم اكتشاف أي إشارة، تحقق من أن إعدادات الليزر على المجاهر متوافقة مع معايير الإثارة/الانبعاث الخاصة بالمجس البحري. إذا كانت الخلفية خارج الخلية ساطعة جدا، قم بغسل المجسات لإزالة هذه الخلفية؛ ومع ذلك، ستفقد الإشارة تدريجيا، مما يقلل من نافذة الوقت التي يمكن خلالها إجراء التصوير بفعالية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التثبيت لتقليل الخلفية. إذا كانت الإشارة بعد التثبيت ضعيفة جدا، تحقق مما إذا كانت الإشارة قد فقدت بعد إضافة Triton-X 100. يمكن تعديل أو إزالة هذه الخطوة حسب التطبيق اللاحق. قلل من خطوات الغسيل.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمتلك LR أسهما في شركة سبيروكروم AG. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز التصوير والمجهر في كلية العلوم البيولوجية (IMC) على توفير الوصول إلى المعدات الأساسية. تم تمويل TA من قبل زمالة HFSP طويلة الأمد (LT000559/2021-L)، وجامعة ساوثهامبتون، ومنحة الابتكار البحثية الطبية في ويسكس، والجمعية الأوروبية لاستثلال اللويوديستيري (ELA). يدعم برنامج الماجستير برنامج ELISIR التابع لكلية علوم الحياة بجامعة EPFL، ومؤسسة برين تيرنر-سامويلز، ومؤسسة Bios pour la Researchche. تم تمويل CH من خلال منحة الصيف للجمعية الملكية للمجاهر. يدعم مركز أبحاث التكنولوجيا الحيوية وعلوم الأحياء زمالة اكتشاف مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BB/Z514767/1). تم دعم MSvA من خلال منحة عطلة الصيف التابعة لجمعية الكيمياء الحيوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة المضادة ل-PEX14بروتين تك10594-1-AP
المجهر الكونفوكلينيكونA1rأي مجهر كونفوكالي ذو هدف NA مرتفع، مثل 60x زيت NA1.4
DMEMبان بيوتك  P04-03590وسائط زراعة الخلايا
ألواح التصوير ذات القاع الزجاجيسيلفيسD35C4-20-1.5-N
أليكسا فلور ضد الأرنب الماعز 488 ABCAMab150081
HEK293TATCCCRL-3216 
بيروكسي SPY555سبيروكرومhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
بيروكسيس PY650سبيروكرومhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kassmann, C. M. Myelin peroxisomes - essential organelles for the maintenance of white matter in the nervous system. Biochimie. 98, 111-118 (2014).
  2. van den Bosch, H., Schutgens, R. B., Wanders, R. J., Tager, J. M. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem. 61, 157-197 (1992).
  3. Aubourg, P., Wanders, R. Peroxisomal disorders. Handb Clin Neurol. 113, 1593-1609 (2013).
  4. Honsho, M., Okumoto, K., Tamura, S., Fujiki, Y. Peroxisome biogenesis disorders. Adv Exp Med Biol. 1299, 45-54 (2020).
  5. Korotkova, D., et al. Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes. Nat Commun. 15, 4314(2024).
  6. Bezman, L., Moser, H. W. Incidence of X-linked adrenoleukodystrophy and the relative frequency of its phenotypes. Am J Med Genet. 76 (5), 415-419 (1998).
  7. Visser, W. F., van Roermund, C. W., Ijlst, L., Waterham, H. R., Wanders, R. J. Metabolite transport across the peroxisomal membrane. Biochem J. 401 (2), 365-375 (2007).
  8. Matsuzono, Y., et al. Human PEX19: cDNA cloning by functional complementation, mutation analysis in a patient with Zellweger syndrome, and potential role in peroxisomal membrane assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2116-2121 (1999).
  9. Borisyuk, A., Howman, C., Pattabiraman, S., Kaganovich, D., Amen, T. Protein Kinase C promotes peroxisome biogenesis and peroxisome-endoplasmic reticulum interaction. J Cell Biol. 224 (9), e202505040(2025).
  10. Gould, S. G., Keller, G. A., Subramani, S. Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase. J Cell Biol. 105 (6 Pt 2), 2923-2931 (1987).
  11. Lukinavicius, G., et al. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem. 5 (2), 132-139 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة