يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نمذجة البلاعم المرتبطة بالورم في المختبر: دور العوامل المفرزة في ديناميكيات البيئة الدقيقة للأورام

446 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69406

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا في المختبر لتوليد خلايا شبيهة بالبلاعم المرتبطة بالورم عن طريق تعريض الخلايا الأحادية البشرية لوسائط مشرطة من خطوط خلايا الورم.

الملخص

تظهر البلاعم مرونة ملحوظة، مما يمكنها من اكتساب حالات وظيفية مميزة استجابة لمجموعة متنوعة من الإشارات البيئية. في الأورام الصلبة، غالبا ما تشكل هذه الخلايا أكثر مجموعات الخلايا المناعية وفرة داخل البيئة الدقيقة للورم، حيث يشار إليها باسم البلعم المرتبطة بالورم (TAMs). تتفاعل الخلايا التامية بشكل وثيق مع الخلايا الخبيثة، مما يعزز بنشاط تقدم الورم، وتكوين الأوعية، والتهرب المناعي. يمكن لخلايا الورم إعادة برمجة البلاعم من خلال الاتصال المباشر بالخلايا ومجموعة واسعة من العوامل المفرزة، مما يشكل استقطابها نحو الأنماط الظاهرية البدائية للأورام. لدراسة آليات استقطاب TAM هذه في المختبر، نقترح طريقة تعرض الخلايا الأحادية البشرية لعوامل قابلة للذوبان موجودة في الأوساط المحالفة لخط الخلايا الورمية. يتيح هذا البروتوكول توليد بلاعم شبيهة ب TAM تحت ظروف مضبوطة، مما يسهل تحليل التغيرات الظاهرية والوظيفية الناتجة عن الإشارات المشتقة من الأورام. يقدم نهجنا نموذجا قابلا للتكرار وذو صلة فسيولوجية للتحقيق في تفاعلات الأورام مع البلعميات، ويعمق فهمنا لإعادة برمجة البلاعمية، ويدعم البحث في استراتيجيات علاجية جديدة في مناعة السرطان والعلاج المناعي.

المقدمة

البلاعم هي خلايا مناعية فطرية متعددة الوظائف، تمكنها مرونتها المذهلة من تبني أنماط ظاهرية متنوعة استجابة للإشارات البيئية1. داخل الأورام الصلبة، غالبا ما تصبح البلاعم أكثر الخلايا المناعية وفرة وتتمايز إلى بلاعم مرتبطة بالورم (TAMs). يتم إعادة برمجة هذه الخلايا بنشاط بواسطة البيئة الدقيقة للورم لدعم نمو الورم، وتعزيز تكوين الأوعية، وتسهيل الانتشار، وقمع الاستجابات المناعية المضادة للأورم الفعالة. تدفع خلايا الورم هذا الاستقطاب من خلال تفاعلات مباشرة بين الخلايا والخلية ومجموعة معقدة من العوامل المفرزة، بما في ذلك السيتوكينات، الكيموكينات، وعوامل النمو، التي تعيد تشكيل برامج النسخ والوظيفة للبلاعم3. هذا التفاعل الديناميكي يدعم الدور المركزي لتقنيات الطب البلعمي في بيولوجيا السرطان ويبرز مرونة البلاعم كتحد وفرصة للتدخل العلاجيفي آن واحد.

الأهمية السريرية لمضادات الطب المعالج أصبحت معروفة بشكل متزايد: وفرتها في الأورام غالبا ما ترتبط بتوقعات ضعيفة ومقاومة للعلاجات4،5. وبالتالي، ظهرت TAMs6 كأهداف علاجية جذابة. الاستراتيجيات التي تهدف إلى منع تجنيدهم، أو تثبيط بقائهم، أو إعادة برمجتهم نحو الأنماط الالتهابية والقتال للأورام قيد الدراسة حاليا6. لذا فإن فهم الآليات التي تقوم بها العوامل المشتقة من الأورام باستقطاب البلاعم إلى TAMs أمر ضروري لتطوير علاجات مناعية فعالة. بينما أظهر الحصار المناعي نجاحا كبيرا في العديد من أنواع السرطان، إلا أن فعاليته لا تزال محدودة في أنواع أخرى7. الجمع بين العلاجات الموجهة للخلايا التائية، مثل الأجسام المضادة لبروتين موت الخلايا المبرمجة 1 (PD-1) أو رابطة موت الخلايا المضادة 1 (PDL-1)، مع استراتيجيات إعادة برمجة البلعم قد تعزز الاستجابة المناعية العامة المضادة للأورام.

النماذج التجريبية التقليدية لدراسة بيولوجيا الفئران الضوئية شملت نماذج سرطان فئران في الجسم الحي، والتي توفر بيئة معقدة وذات صلة فسيولوجية8. قدمت هذه النماذج رؤى أساسية حول توظيف ووظائف الذاكرة التام. ومع ذلك، فإن الفروق الكبيرة بين الأنواع في الإشارات المناعية، وبيولوجيا الأورام، وتكوين البلاعم يمكن أن تحد من الترجمة المباشرة إلى مرض بشري 9,10. علاوة على ذلك، فإن تعقيد الأنظمة في الجسم الحي يجعل من الصعب عزل ودراسة مسارات الإشارات المحددة أو الأحداث الجزيئية التي تدفع استقطاب البلاعمية.

على النقيض من ذلك، توفر النماذج المخبرية ظروفا أبسط وأكثر تحكما لتحليل هذه الآليات. النهج الأكثر استخداما يتضمن استقطاب البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية مع محفزات محددة: الإنترفيرون غاما (IFN) والبوليساكاريد الدهني البكتيري (LPS) لتوليد بلعم التهابية (M1)، أو إنترلوكين 4 (IL-4) وإنترلوكين 10 (IL-10)، أو ديكساميثازون للحصول على أنواع فرعية مختلفة من البلاعم المضادة للالتهابات (M2) 11,12,13,14. ساعدت هذه النماذج في تحديد العلامات الجزيئية وبرامج النسخ المرتبطة بحالات استقطاب البلاعم القياسية. ومع ذلك، فهي لا تستطيع تكرار البيئة المعقدة والمتعددة العوامل التي تواجهها البلاعم داخل الأورام، حيث ينتج الاستقطاب نتيجة تأثير متزامن لعدة وسطاء ذوبان وإشارات أيضية وتفاعلات خلية إلى خلاية15,16. على الرغم من أن التصنيف الكلاسيكي ل M1/M2 لا يزال مفيدا لوصف الحالات الوظيفية للبلاعمية، إلا أنه أصبح من الواضح الآن أن هناك عددا أكبر بكثير من مجموعات البلاعم مما كان يعتقد سابقا. أظهر عمل مجموعة الدكتور جينهوكس وآخرين، باستخدام مناهج النسخ الوحيدية الخلية، التنوع الواسع للمجموعات الفرعية من البلاعم الموجودة في الظروف الفسيولوجية وفي المرض17,18. هذا يبرز أن TAMs، رغم وصفها غالبا بأنها تشبه ملفات M2، إلا أنها ليست مكافئة تماما للبلاعم التي تميز فقط باستخدام السيتوكينات القانونية؛ بل تشترك في بعض السمات لكنها أيضا تظهر اختلافات مميزة وتعتمد على السياق.

لسد هذه الفجوة، نقدم بروتوكولا في المختبر يمثل الاستقطاب الشبيه بتقنية TAM عن طريق تعريض البلعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية لوسائط مشرطة جمعت من خطوط الخلايا الورمية. تلتقط هذه الطريقة تأثير إفرازات الورم، وهو مزيج غني من السيتوكينات والكيموكين وعوامل النمو التي تفرزها خلايا السرطان. وبذلك يوفر نظاما ذا صلة وسهل الوصول تجريبيا للتحقيق في إعادة البرمجة الظاهرية والنسخ للبلاعم استجابة للعوامل الذوبانية المشتقة من الأورام. على عكس الأساليب السابقة التي تعرضت فيها الخلايا الأحادية مباشرة لوسائط محالية للورم، يركز هذا البروتوكول تحديدا على إعادة برمجة البلاعميات، مما يعكس بشكل أفضل سلوك البلاعم المقيمة داخل البيئة الدقيقة للورم19,20. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن لوحة محسنة ومباشرة من علامات السطح لتقييم استقطاب البلاعم بواسطة قياس تدفق الخلية، وهو أمر سهل التنفيذ ويمكن توسيعه حسب احتياجات الباحث14,21. وأخيرا، بما أن M-CSF ثبت أنه يهيئ الخلايا الأحادية نحو نمط شبيه ب M2 10,15,22,23,24، فقد تجاهلناه عمدا لضمان أن أي استقطاب بلاعمي ملحوظ ناتج تحديدا عن التعرض لوسائط مشرطة مشتقة من خط خلايا الورم.

لهذا النهج عدة نقاط قوة: فهو يحتفظ بقابلية التكرار والبساطة لأنظمة المختبر، ويستخدم الخلايا البشرية الأولية لتحقيق أهمية أكبر في الترجمة، ويعكس الطبيعة المتعددة العوامل وغير المتجانسة لبيئة الورم بشكل أفضل من نماذج السيتوكين الأحادية 25,26,27,28 . علاوة على ذلك، يسهل دراسات مقارنة لاستجابات البلعم تجاه الأوساط المعدلة من أنواع مختلفة من الأورام أو الخلايا السرطانية المعدلة وراثيا، ويعمل كمنصة لاختبار العوامل الدوائية التي قد تغير استقطاب الحمض الفصيلا. بعيدا عن قابليتها العامة، يمكن تخصيص هذه الطريقة لنماذج الأورام المختلفة عن طريق اختيار خطوط الخلايا المناسبة أو تعديل نسبة الأوساط المشرفة. ومع ذلك، يجب على المستخدمين أن يكونوا على دراية بأن التفاوت بين المتبرعين الأصحاء وخطوط خلايا الورم قد يؤثر على قابلية التكاثر، مما يبرز أهمية التصميم الدقيق للتجارب والتوحيد القياسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم جمع عينات دم محيطية من متبرعين أصحاء بعد موافقة مستنيرة وفقا لإعلان هلسنكي. تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية في جامعة بوينس آيرس. راجع جدول المواد لتفاصيل جميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

ملاحظة: حافظ على ظروف معقمة طوال البروتوكول بأكمله، والعمل في خزانة السلامة الحيوية المستوى 2 (BSL-2)، وضمان بقاء الخلايا >90٪). للتخلص منها، يجب أولا تطهير جميع النفايات البيولوجية عن طريق نقعها في محلول هيبوكلوريت 10٪ يحتوي على 10٪ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة، ثم توضع في حاوية التخلص من المخاطر البيولوجية المناسبة.

1. زراعة خط الخلايا الورمية وتحضير الوسائط المعدلة

  1. إذابة سلالة خلايا سرطان الثدي البشري الثلاثي السلبي MDA-MB-231 (أو أي ورم مختار آخر) من تخزين النيتروجين السائل. اغمر فورا أنابيب التبريد التي تحتوي على خطوط الخلايا في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بتدوير القارورة بلطف لضمان الذوبان السريع والموحد. أزل القارورة بسرعة عندما تذوب تقريبا.
  2. نقل الخلايا المذابة إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل يحتوي على 5 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS). قم بطرد مركزي لتعليق الخلية عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: يجب إجراء عملية الذوبان بسرعة للحفاظ على بقاء الخلايا.
  3. تخلص من المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق الحبيبات الخلوية بسرعة في 1 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) الطازج والطازج الذي يحتوي على ارتفاع الجلوكوز (4.5 جرام/لتر) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 4 ملليمولار جلوتامين، و1 ملليمولار بيروفات الصوديوم. عد الخلايا في الحبيبة المعلقة، مع تنفيذ التخفيف التسلسلي ذو الخطوتين التالي:
    1. أولا جهز تخفيفا معلقا بنسبة 1:5 في وسط DMEM معقم ثم (1:2) باستخدام صبغة تريبان بلو القابلة للحياة للحصول على تخفيف نهائي بنسبة 1:10.
    2. استخدم مجهر خفيف لعد الخلايا الحية داخل مقياس الدم النويباور (أو غرفة العد). عد الخلايا الصالحة (فقط الخلايا التي تستثني الصبغة الزرقاء) وحدد متوسط عدد الخلايا الصالحة لكل مربع زاوية كبير.
    3. احسب التركيز النهائي باستخدام الصيغة التالية: الخلايا/ملليتر = (متوسط الخلايا لكل مربع) × (عامل التخفيف) × 10,000.
      ملاحظة: أعد تعليق الخلايا في حجم مرغوب من وسط DMEM الكامل للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1×105خلايا/مل.
  4. زرع الخلايا 2.5 × 10من 5 إلى 5.0 ×10 5 خلايا في قارورة زراعة T25 تحتوي على 5 مل من وسط DMEM كامل. حافظ على الزراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربونحتى يتم الوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة للحصاد.
  5. في اليوم التالي بعد البذر، تحقق من ارتباط الخلايا تحت المجهر. إذا كانت أكثر من 50٪ من الخلايا تطفو (مما يشير إلى موت الخلية)، استنشق الوسط القديم بلطف واستبدله ب 2.5 مل من الوسط الطازج المسخن مسبقا.
  6. راقب نمو الخلايا يوميا. عندما تصل الزراعة إلى حوالي 90٪ من التقاء الخلايا (حوالي 2.3 ×10 6 خلايا في قارورة T25)، عادة خلال 5 أيام، تكون الخلايا جاهزة للزراعة الفرعية (التقسيم). لتقسيم الخلايا بنسبة 1:8، اتبع الخطوات التالية:
    1. أزل الوسط المستهلك باستخدام ماصحة باستور معقمة.
    2. اشطف طبقة الخلية الأحادية مرة واحدة ب 3 مل من PBS المعقم 1x لإزالة المصل المتبقي، الذي يثبط التريبسين. استنشق وتخلص من 1x PBS.
    3. أضف إلى الخلايا 1 مل من محلول حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) بنسبة 0.25٪ من تريبسين-1 ملم، وحضن عند حرارة 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونعلى حاضنة رطبة لمدة 3 دقائق لفصل الخلايا.
      ملاحظة: الوقت الأمثل للحضانة باستخدام التربسين/EDTA يعتمد على خط الخلية المحدد وقد يحتاج إلى تعديل. افحص الخلايا تحت المجهر بعد 3 دقائق للتأكد من أنها منفصلة تماما.
    4. تحيد النشاط الإنزيمي بإضافة 3 مل من وسط DMEM الكامل. بعد ذلك مباشرة، قم بعمل الماصة بلطف صعودا وهبوطا لتفكيك الخلايا بالكامل وتعليقها.
  7. انقل 3.5 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وقم بطرد مركزه لمدة 5 دقائق عند 400 × g عند RT.
  8. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط تجميد (يجب أن يحتوي على 90٪ FBS بالإضافة إلى 10٪ ثنائي ميثيل كبريتوكسيد (DMSO). نقل وتقسيم تعليق الخلية إلى التجميد، مما يضمن تركيزا 5 × 10 أو5 خلايا لكل أنبوب للاستخدام المستقبلي.
    1. يجب تبريد التجميد تدريجيا عن طريق وضع الكريوفيالات في حاوية مستر فروستي (أو حاوية تجميد بمعدل تحكم مشابه). انقل الحاوية إلى فريزر بدرجة حرارة -80°م واترك الخلايا لتتجمد طوال الليل. يمكن الاحتفاظ بالخلايا عند -80°م لبضعة أيام، ولكن يجب بعد ذلك نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
      ملاحظة: احتفظ بسجلات مفصلة لممرات الخلايا واستخدم المقاطع المبكرة للتجارب. يوصى باستخدام خلايا تحتوي على أقل من 20 مقطعا.
  9. بمجرد أن تصل الزراعة الجديدة مرة أخرى إلى ~90٪ من التقاء الماء، يتم استنشاق وجمع الفائق في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. إذا كنت ترغب في استمرار الثقافة، استبدل المجلد المجمع بوسائط DMEM كاملة وجديدة.
    1. قم بالطرد المركزي للمادة الفائقة المجمعة عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي. احتفظ بالسوبرناتينت (الوسط الشفاف المبرم)، وتخلص من الحبيبة.
  10. قم بتقسيم الوسط المصحى إلى أجزاء 1 مل، وضع علامات على الأنابيب، وخزنها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: لمراقبة الجودة، احتفظ دائما بسجل لتاريخ جمع الوسائط المشروط وما إذا كان العليكوت قد تم إذابته مسبقا. ينصح بشدة بتجنب إذابة نفس الأليكوت أكثر من مرتين. علاوة على ذلك، استخدم المعالج خلال شهر واحد من تاريخ التجميد لضمان نشاطه الأمثل.

2. عزل الخلايا أحادية النواة في الدم الطرفية (PBMCs)

ملاحظة: يتم عزل PBMCs من 40 مل من الدم المحيطي المضاد للتخثر بنسبة 3.8٪ من سترات الصوديوم. يتم العزل باستخدام تدرج كثافة فيكول-هيباك (1077) والطرد المركزي. يجب أن يتم تنفيذ هذا البروتوكول بالكامل في ظروف معقمة في خزانة BSL2.

  1. أليكوت عينة الدم المحيطية المضادة للتخثر في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل أو 50 مل قبل خطوة الطرد المركزي القادمة.
  2. عينات دم الطرد المركزي بسرعة منخفضة، 200 × جرام لمدة 15 دقيقة في العلاج التنفسي لفصل مكونات الدم. تنتج هذه العملية البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) كطبقة علوية والجزء الخلوي (خلايا الدم الحمراء والبيضاء) في الأسفل. استخدم إعداد الطرد المركزي بالتسارع: 4 والتباطؤ: 2، عندما يكون الحد الأقصى 5.
  3. بعد الطرد المركزي، استنشق المادة الفائقة (الجزء العلوي)، وهو PRP، وانقلها إلى أنبوب معقم جديد.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر للتجارب اللاحقة، يمكن إعادة طرد البلازما الPRP المجمعة عند 600 × جرام عند RT لمدة 10 دقائق (أقصى تسارع وتباطؤ) لإزالة الصفائح الدموية، وتخزين البلازما بدون الصفائح عند -20 درجة مئوية لإجراء اختبارات أخرى.
  4. يجب تخفيف الجزء السفلي الخلوي الناتج من الطرد المركزي الأولي في الخطوة الثانية بلطف إلى حجم نهائي من 2 إلى 3 طائر باستخدام 1x PBS معقم بدرجة حرارة الغرفة. قم بالتجانس بلطف عن طريق عكس التعليق الناتج واستخدامه في الطرد المركزي بتدرج كثافة Ficoll-Hypaque.
  5. قم بتوزيع 15 مل من Ficoll-Hypaque بدرجة حرارة الغرفة في أنبوب معقم بسعة 50 مل.
  6. ضع ببطء وبعناية طبقة 30 مل من الدم المخفف فوق Ficoll-Hypaque، لضمان عدم اختلاط المرحلتين.
  7. قم بالطرد المركزي بأنبوب الطبقات المصنوع من دم فيكول لمدة 25 دقيقة عند 600 × جرام عند RT. ضبط الطرد المركزي بدون فرامل (تسارع: 1؛ التباطؤ: 0).
  8. استخدم ماصة باستور معقمة للتخلص من ما لا يقل عن 4 مل من الجزء العلوي الناتج لتجنب التسرب. ثم استخدم نفس الماصة لاستعادة الحلقة البيضاء التي تحتوي على PBMCs التي تتكون بين الجزء العلوي والجزء الشفاف Ficoll-Hypaque. تجنب جمع فيكول باستخدام خاتم PBMC.
  9. انقل حلقة PBMC من الأنبوب إلى أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 15 مل يحتوي على ما لا يقل عن 3 مل من 1x PBS.
  10. املأ أنبوب 15 مل بمزيد من PBS 1x وجهاز طرد مركزي عند 600 × جرام (أقصى تسارع وتباطؤ) لمدة 10 دقائق عند RT.
  11. أزل الفائق عن طريق العكس، ثم املأ مرة أخرى ب 1x PBS، واستخدم الطرد المركزي عند 600 × جرام (أقصى تسارع وتباطؤ) لمدة 10 دقائق عند RT.
  12. أزل المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات PBMC في 2 إلى 3 مل من PBS معقمة 1x PBS بالإضافة إلى 2٪ FBS غير منشط بالحرارة (1x PBS-2٪ FBS)، ثم رفع الحجم إلى 10 مل. عد الخلايا، وتحضير تعليق خلوي بنسبة 1:5 مخفف في بارد معقم 1x PBS ثم (1:2) في 0.4٪ تريبان بلو للحصول على تخفيف نهائي بنسبة 1:10. استخدم حجرة خلية على مجهر ضوئي كما هو موضح في الخطوة 1.3.2 للعد.
  13. قم بتدوير نظام تعليق PBMC عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 8-10 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في حجم مرغوب من البارد المعقم 1x PBS-2٪ FBS للحصول على تركيز نهائي يبلغ 108 خلايا/مل. اترك هذه الخلايا عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تجميد PBMCs المجمعة في قارورة تجميد عند 108 خلايا/مل في وسط تجميد (90٪ FBS-10٪ DMSO). خزن عند -80 درجة مئوية في حاوية Mr. Frosty طوال الليل للسماح للخلايا بالتجميد ببطء. في اليوم التالي، انقل الخلايا إلى صندوق تخزين واتركها عند -80 درجة مئوية لبضعة أيام أو انقله إلى خزان نيتروجين سائل لفترة تخزين طويلة أو استمر في البروتوكول.

3. فرز الأحادية CD14+ باستخدام الخرز المغناطيسي

ملاحظة: يتم الحصول على الخلايا الأحادية المنقاة CD14+ من PBMC باستخدام مجموعة فرز مغناطيسية بشرية ذات اختيار إيجابي CD14+11. نسبة خلايا CD14+ في PBMC تعتمد على المتبرع، لكنها يمكن تقديرها ب 10٪ (تتراوح بين 5-20٪). عدل العدد الأولي ل PBMC وحجم التفاعل النهائي بناء على العدد المطلوب من الخلايا الأحادية لتجربتك. الحد الأدنى المقترح لحجم التفاعل هو 100 ميكرولتر، حتى عند معالجة أقل من 1 ×10 7 PBMC.

  1. أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الانتقاء الإيجابي لكل 100 ميكرولتر من PBMCs، استخدم الماصة للأعلى والأسفل، واحتفظ بالبودرة لمدة 15 دقيقة.
  2. قم بتعليق الدوران لمدة 30 ثانية قبل الاستخدام. ثم أضف 10 ميكرولتر من الخرزات لكل 100 ميكرولتر من تعليق PBMC. اخلط جيدا وحضن لمدة 15 دقيقة على الثلج.
  3. أضف 1x PBS - 2٪ FBS - 1 مللي مولار EDTA إلى حجم نهائي 2.5 مل، اخلط التعليق بلطف وأدخل الأنبوب على المغناطيس وحضن لمدة 5 دقائق.
  4. قلب المغناطيس (دون إزالة الأنبوب) فوق أنبوب مستلم مهمل لمدة 2-3 ثوان، لتجنب أي حركة اهتزاز. الخلايا الموجبة ستبقى في الأنبوب.
  5. أخرج الأنبوب من المغناطيس وأضف 1x PBS - 2٪ FBS -1 mM EDTA فوق جدران الأنبوب حتى يصل حجم الأنبوب النهائي إلى 2.5 مل.
  6. أدخل الأنبوب في المغناطيس مرة أخرى وحضن لمدة 5 دقائق.
  7. قلب المغناطيس (دون إزالة الأنبوب) فوق أنبوب مستلم مهمل لمدة 2-3 ثوان، لتجنب أي حركة اهتزاز. استرجع الأنبوب من المغناطيس وأضف 3 مل من 1x PBS-2٪ FBS فوق جدران الأنبوب لاستعادة جميع الخلايا.
  8. خذ 10 ميكرولتر لعد عدد خلايا CD14+ في غرفة نيوباور باستخدام مجهر ضوئي. تخفيفه باستخدام تريبان بلو بنسبة 1:2.
    ملاحظة: احسب عدد الخلايا وفقا لهذه المعادلة: عدد خلايا CD14+ = عدد الخلايا الحية في الوسائط لكل ربع × عامل تخفيف × 10,000.
  9. ضع تعليق خلايا CD14+ في أنبوب معقم جديد بسعة 15 مل واغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 600 × جرام (أقصى تسارع وتباطؤ) لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. أعد تعليق خلايا CD14+ مع وسط RPMI 1640 مع 10٪ FBS و1٪ بنسلين-ستربتوميسين (P/S) بحجم مناسب للحصول على 2.5 ×10 6 خلايا/مل للخطوة التالية، مع الأخذ في الاعتبار عدد الخلايا الحاصلة عليها.
    ملاحظة: حافظ على وحيدات CD14+ على الجليد حتى الخطوة التالية لتجنب التصاق هذه الخلايا بجدار الأنبوب البلاستيكي.

4. تمايز البلاعم

  1. تم تنقية الألواح وحيدية CD14+ بحجم 2.5 ×10 5 خلايا معلقة في 250 ميكرولتر من وسط RPMI كامل (10٪ FBS-1٪ PS) لكل بئر في صفيحة معالجة ب48 بئرا.
    ملاحظة: يمكن أيضا القيام بذلك بنصف عدد الخلايا في صفيحة معالجة جيدا ب 96 جيدا.
  2. أضف ماء معقم إلى الآبار الفارغة المحيطة لتقليل التبخر أثناء حضانة اللواح.
  3. حضانة الخلايا لمدة 5 أيام عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة دون إزعاج، مع مراقبة يومية للشكل والتمايز وقابلية البقاء.
    ملاحظة: بينما يمكن إضافة M-CSF (25 ng/mL) للتمايز، نؤكد أن بروتوكولنا يستخدم 10٪ من FBS عالي الجودة فقط للحصول على بلاعم M0 بعد خمسة أيام من الزراعة. نوصي تحديدا بتجنب M-CSF بسبب قدرته على تهيئة الخلايا الأحادية نحو نمط شبيه ب M2 10,22.

5. تعرض البلعم للوسائط والتحليل المشروط

  1. في اليوم الخامس من التمايز، أزل بلطف 50٪ (125 ميكرولتر) من الوسط من كل بئر واستبدل بأي منهما:
    1. 125 ميكرولتر من الوسط الكامل الجديد RPMI (التحكم)،
    2. 125 ميكرولتر من الوسائط المحالفة لخط الخلايا الورمية (مثل MDA-MB-231)، أو
    3. 125 ميكرولتر من الوسط الكامل DMEM (التحكم في الوسائط المحالفة).
      ملاحظة: للتحسين الأولي مع خطوط خلايا الورم الجديدة، اختبر مجموعة من تركيزات الوسائط المشرطة (مثل 10٪، 25٪، و50٪). يقترح هذا النطاق لضمان قابلية البلعم وتغيرات التمايز في البلاعمية. اختر تركيز أعلى من الوسائط المكيفة التي تظهر قدرة عالية على وجود البلعميات.
  2. استمر في الحضانة حتى اليوم السابع.
    ملاحظة: في اليوم الخامس، يتم الحصول على بلاعم M0، ثم يومين إضافيين من الزراعة في وجود وسط مشروط كافيان لتحفيز تعبير علامات الاستقطاب السطحية. يتم تحديد علامات سطح الاستقطاب بواسطة قياس خلوي التدفق، وبالمثل، عند استخدام السيتوكينات الموحدة لتوليد بلاعم M1 أو M211,14.
  3. قيم مدى بقاء البلاعم وشكلها تحت المجهر يوميا.
    ملاحظة: راقب تمايز البلعم يوميا خلال فترة الزراعة التي تستمر 7 أيام. يستخدم التصاق الخلايا كمؤشر على وجود مزرعة صحية وقابلة للحياة. نسبة أعلى من خلايا الفوسفورم تشير إلى زيادة التمايز والاستقطاب في مجموعة معالجة الوسط المشروط (CM)، كما هو موضح في الشكل 2.

6. جمع البلاعم لتقييم علامات الاستقطاب بواسطة قياس خلوي التدفق

ملاحظة: اختياريا، لتوسيع توصيف النمط الظاهري للبلاعم المرتبطة بالورم، عزل الحمض النووي الريبي لقياس تعبير الجينات المرتبطة بالاستقطاب (مثل TGM2، IRF-4، وCXCL10) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) أو جمع المواد الفائقة للزراعة لقياس إنتاج السيتوكين القانوني (مثل TNFα، IL-6، وIL-10) بواسطة اختبار التغذية المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) كما أبلغت مجموعتنا11، 14.

  1. تخلص من المحلول عن طريق الشفط بلطف باستخدام ماصة أو رأس باستور معقمة الحجم الكلي لوسط الزراعة في كل بئر وأضف 200 ميكرولتر من محلول EDTA بارد 1x PBS-2٪ FBS-1 mM EDTA لحصاد الخلايا.
  2. حضن لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الثلج ثم أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS-2٪ FBS لتخفيف مخزن EDTA. اجمع البلعم عن طريق التوصيل بأنبوب (لا يزال على الثلج) لمدة 5 دقائق إضافية حتى تنفصل جميع الخلايا.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للحصول على عدد جيد من البلاعم الصالحة. من المهم عدم تمديد الوقت تحت عرض EDTA أكثر مما هو موصى به للحفاظ على حيوية الخلية. افحص الخلايا تحت المجهر بعد الانتهاء من الإجراء للتأكد من أنها منفصلة تماما.
  3. اجمع البلاعم على أنبوب ميكرو بحجم 1.5 مل واغسلها ب 1 مل من 1x PBS-2٪ FBS بواسطة الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 8-10 درجات مئوية.
  4. أعد تعليق حبيبات البلاعم بسعة 200 ميكرولتر من 1x PBS-5٪ FBS وانقلها إلى لوحة دقيقة دائرية ذات 96 بئر للحجب غير المحدد عند RT لمدة 15 دقيقة. قم بالطرد المركزي على الخلايا عند 400 x g لمدة 5 دقائق عند 8-10 درجات مئوية.
  5. تخلص من المادة الفائقة عن طريق قلب اللوحة بسرعة.
  6. حضر المزيج المناسب من الأجسام المضادة المترافقة مباشرة في 1x PBS - 2٪ FBS باستخدام عامل تخفيف 1:50 لكل جسم مضاد. صبغ كل عينة ب 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة وحضن لمدة 30 دقيقة في الظلام على الثلج.
    ملاحظة: تركيبة الأجسام المضادة: CD11b-PE/Cy7 (200 ميكروغرام/مل)، CD64-AlexaFluor 647 (150 ميكروغرام/مل)، CD163-PerCP/Cy5.5 (200 ميكروغرام/مل)، HLADR-PE (40 ميكروغرام/مل) وCD206-AlexaFluor 488 (400 ميكروغرام/مل). تركيز الأجسام المضادة المسبق المدرج في الجدول 1؛ يمكن العثور على أرقام الكتالوج في جدول المواد.
  7. اغسل البلاعم الملونة بإضافة 150 ميكرولتر من 1x PBS وجهاز الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 8-10 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الفائقة عن طريق قلب اللوحة بسرعة.
  9. لقياس فعالية الخلية، أضف 100 ميكرولتر من صبغة الثبات القابلة للإصلاح Zombie Violet (1:1,000 في 1x PBS) وحضن في الظلام لمدة 30 دقيقة على الثلج.
  10. اغسل الخلايا الملطخة بإضافة 100 ميكرولتر من 1x PBS وطرد مركزي عند 400 x جرام لمدة 5 دقائق عند 8-10 درجات مئوية. كرر عملية الغسيل باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS.
  11. حل المشكلة بإعادة تعليق حبيبة الخلية ب 20 ميكرولتر من بارافورمالديهايد 1٪ طازج جاهز واحتضانها لمدة 20 دقيقة على الثلج وفي الظلام.
    ملاحظة: تم استخدام 1٪ بارافورمالديهيد للتثبيت، دون نفاذية. اختياري: يمكن أيضا استخدام المكون التثبيتي التجاري (من مجموعة التثبيت والنفاذية BD) في هذه الخطوة11.
  12. غسل الخلايا بإضافة 180 ميكرولتر من 1x PBS-2٪ FBS وجهاز الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 8-10 درجات مئوية. كرر عملية الغسيل باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS-2٪ FBS.
  13. تخلص من المادة الفائقة عن طريق انقلاب الصفيحة وأعد تعليق الحبيبة في 200 ميكرولتر من 1x PBS لنقلها إلى معدات قياس التدفق الخلوي للقياس.
    ملاحظة: إذا لم يكن بالإمكان تشغيل العينات الملونة والثابتة بواسطة قياس التدفق الخلوي في نفس اليوم، خزنها عند 4 درجات مئوية وحميها من الضوء. قم بتحليل العينات في أقرب وقت ممكن في الأيام التالية.
  14. تحليل نتائج قياس التدفق الخلوي باستخدام برنامج FlowJo. تبدأ استراتيجية البوابات باستبعاد الحطام باستخدام التبعثر الأمامي والجانبي (FSC/SSC). بعد ذلك، يتم اختيار البلاعم الحية كخلايا بنفسجية زومبي CD11b⁺.
    ملاحظة: نظرا لأن التألق الذاتي في البلعم يعتمد على المانح، فمن الضروري استخدام ضوابط مشتقة من نفس المتبرع لكل تجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قمنا بتوليد خلايا شبيهة بالخلايا البلعمية المرتبطة بسرطان الثدي (TAM) ثلاثية السلبية من خلال معالجة البلعم المشتقة من الخلايا الأحادية باستخدام وسط مشروط بنسبة 50٪ من خط الخلايا MDA-MB-231. تم فرز الخلايا الأحادية من خلايا دموية وحيدة النواة الطرفية (PBMC) لستة متبرعين مستقلين وأصحاء وتم تمييزها وفقا لبروتوكولنا. استخدم تحضير CM خلايا MDA-MB-231 عند 90٪ من التقاء (الشكل 1). تمت إضافة CM إلى مزرعة البلاعم في اليوم الخامس، وتم جمع الخلايا في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر البروتوكول الموضح هنا نهجا قابلا للتكرار وعمليا لدراسة الاستقطاب الشبيه بالبلعم المرتبط بالورم من خلال تعريض البلعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية لوسائط محالفة لخط الخلايا الورمية. يلتقط هذا النظام تأثير العوامل القابلة للذوبان التي تفرزها خلايا الورم، والتي تعرف بدورها المحوري في إعادة برمجة البلاعم داخل البيئة الدقيقة للورم 7,9,10,15,19,20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

نحن نقر بالدعم المالي الذي قدمته الوكالة الوطنية لتعزيز العلوم والتكنولوجيا (ANPCyT-FONCYT) من خلال المنح PICT 2021 I-INVI-00034 (إلى DR)، وPICT 2021-I-A-00807 (إلى E.A.C.S.)، وPICT 2021-I-A-00716 (إلى A.E.E.). نشكر أيضا المجلس الوطني للبحوث العلمية والتقنية (CONICET) على منحة PIP 2022-0763 وجامعة بوينس آيرس على جائزة PIDAE 2022، الممنوحة ل A.E.E.

حصل ماجستير العلوم على زمالة ليغادو بيرويل من كلية الطب بجامعة بوينس آيرس، وهو حاصل على زمالة دكتوراه ANPCyT-FONCYT. D.R.، E.A.C.S.، وA.E.E. هم محققون مهنيون في CONICET.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أليكسا فلور 488 فأر مضاد للإنسان   نسخة CD206 من الأجسام المضادة 15-2BioLegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية.قط# 321113؛ RRID:AB_571874
فأر أليكسا فلور 647 ضد الإنسان CD64 نسخة 10.1BioLegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية.كات# 305012؛ RRID:AB_528867
BD Cytofix/Cytopermبي دي ساينسز بيوساينس، سان خوسيه، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةكات# 554714مجموعة التثبيت والنفاذية
وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM)، عالي الجلوكوزGibco  ثيرمو فيشر ساينتيفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية كات# 11965092
مجموعة اختيار إيجابية من EasySep Human CD14؛ كوكتيل EasySep Positive Select; جسيمات نانوية مغناطيسية من EasySep؛ مغناطيس إيزي سيبتقنيات الخلايا الستيمية، فانكوفر، كنداCat# 18058
جهاز قياس خلوية كانتو FACS  بيكتون ديكنسون، فرانكلين ليكس، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية.
مصل البقر الجنني، مؤهل، نيوزيلندا Gibco & trade;   ثيرمو فيشر ساينتيفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية كات# 10091148
فيكول-باك بلس سيتيفاجنرال إلكتريك للرعاية الصحية - علوم الحياة، الولايات المتحدة الأمريكيةكات# 17144003
فلوجوفلوجو ذ.م.م.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   شركة جراف باد سوفتوير إنك.RRID:SCR_002798
جهاز قياس خلوي الفضاء Partec CyFlow&nb;سيسميكس بارتك، ألمانيا
نسخة من الأجسام المضادة لجسم HLA-DR المضادة ل PE المضادة L243BioLegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية.القط# 307605; RRID:AB_314683
نسخة CD11b من الجسم المضاد للفئران من PE/Cy7 لجرذان CD11b M1/70BioLegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية.القط# 101216؛ RRID:AB_312799
فأر PerCP/Cy5.5 من الجسم المضاد المضاد CD163 المستنسخ GHI/61BioLegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية.كات# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 متوسطGibco  ثيرمو فيشر ساينتيفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية كات# 11875119
محلول بيروفات الصوديومسيغما-ألدريتش ميرك، سان لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية.قط#  S8636
تريبسين-إيدتا (0.25٪)، فينول أحمرGibco  ثيرمو فيشر ساينتيفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية كات# 25200056
مجموعة قابلية للإصلاح بنفسجي زومبيBioLegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية.كات# 423113

المراجع

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استقطاب الخلايا البلعميةالنمذجة في المختبرتمايز الخلايا الوحيدةالوسط المكيَّفالتفاعلات بين الورم والخلايا البلعميةإعادة برمجة الخلايا البلعميةمناعة السرطان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.