Method Article

طريقة الميكروبيدات المغناطيسية السريعة للتنقية الفعالة للعدلات منخفضة الكثافة

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تزداد العدلات منخفضة الكثافة (LDN) بشكل كبير في العديد من الأمراض. عادة ما يتم عزل LDN من خلال فرز الخلايا. نقدم طريقة عملية للحصول على LDN نقي وقابل للحياة. بعد الطرد المركزي المتدرج للكثافة للدم المحيطي ، يتم تحضين الخلايا بميكروبيدات مغناطيسية ، ثم يتم فصل LDN من خلال أعمدة مغناطيسية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر العدلات ، وهي كريات بيضاء مهمة ذات مناعة فطرية ، تقليديا مجموعة خلايا متجانسة. ومع ذلك ، فقد أظهرت الأدلة الحديثة أن العدلات موجودة في العديد من المجموعات السكانية الفرعية. واحدة من هذه المجموعات السكانية هي العدلات منخفضة الكثافة (LDN). تم العثور على LDN بأعداد صغيرة في دم الأفراد الأصحاء ، لكن أعدادهم تزداد بشكل كبير في أمراض مثل الذئبة الحمامية الجهازية واضطرابات المناعة الذاتية والسرطان والالتهابات. في هذه الحالات ، قد يشارك LDN في التسبب في المرض. الطريقة الوحيدة لعزل LDN هي من خلال الطرد المركزي بكثافة التدرج للدم المحيطي. ومع ذلك ، بعد الطرد المركزي ، يتم تنقية LDN مع الخلايا أحادية النواة. وبالتالي ، فإن دراسة هذه المجموعة السكانية الفرعية للعدلات تمثل تحديا. لا توجد منهجية قياسية لفصل LDN عن الخلايا أحادية النواة. عادة ، يتم فصل LDN عن طريق فرز الخلايا في مقياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة أوقات فرز طويلة (ساعات) للحصول على خلايا نقية كافية لمزيد من الدراسات الوظيفية. هذا يؤثر بشكل خطير على بقاء الخلايا ووظيفتها. هنا ، نقترح طريقة عملية للحصول على أعداد كبيرة من LDN النقي والقابل للحياة في وقت قصير. بعد الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، يتم تحضين جزء الخلية أحادية النواة بميكروبيدات مغناطيسية مضادة ل CD66b ، ثم يتم فصل LDN من خلال أعمدة مغناطيسية في < 30 دقيقة. يتم تمييز LDN المنقى (خلايا CD66b + ) بأجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد CD10 و CD11b و CD14 و CD15 و CD16b و CD33 و CD62L و CD66b و CD98 ، ويتم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للتأكيد. تعمل LDN المنقى بشكل كامل كما يتضح من قدرتها على إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتشكيل مصائد العدلات خارج الخلية. ينتج عن طريقة التنقية الجديدة هذه LDN بنقاوة عالية (أكثر من 90٪) وقابلية للحياة (أكثر من 96٪) في فترة زمنية قصيرة. يمكن توسيع نطاق هذه الطريقة بسهولة للحصول على أعداد كبيرة من LDN النقي لتقييم وظائف LDN في الأمراض المختلفة من خلال التحليل الكيميائي الحيوي أو التحليل الكيميائي الآخر.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العدلات ، الكريات البيض السائدة في دم الإنسان1 ، هي المشاركين الرئيسيين في جهاز المناعة الفطري. يصلون بأعداد كبيرة إلى الأنسجة المصابة بالالتهاب أو العدوى2. هناك ، تنشط العدلات العديد من وظائف المستجيب ، مثل البلعمة3،4 ، والتحلل5،6 ، وتشكيل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs)7. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك العدلات أيضا في الاستجابة المناعية التكيفية8. تعتبر النظرة الكلاسيكية للعدلات خلايا متجانسة تنتج في نخاع العظام باستجابات محددة مسبقا9،10. ومع ذلك ، تكشف الدراسات الحديثة أن العدلات هي خلايا غير متجانسة ذات حالات نمطية ووظيفية متعددة في كل من الحالات الصحية والمرضية11،12،13،14،15.

من بين العديد من المجموعات السكانية الفرعية للعدلات ، جذبت العدلات منخفضة الكثافة (LDN) اهتماما كبيرا بسبب خصائصها الجوهرية ولأنها تزداد أعدادها في العديد من الأمراض16،17،18. تم العثور على LDN في دم مرضى الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) في عام 198619. تم اكتشافها بعد عملية فصل الكريات البيض في تدرج كثافة20،21. بعد الطرد المركزي للدم أو البلازما الغنية بالكريات البيض على وسط كثافة (على سبيل المثال ، Ficoll-Paque) ، تشكل الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية (المعروفة باسم خلايا الدم أحادية النواة المحيطية [PBMC]) شريطا في الجزء العلوي (منخفض الكثافة) من الأنبوب. العدلات الرواسب في الجزء السفلي من الأنبوب. من بين PBMC ، تم العثور أيضا على عدد قليل من العدلات. هذه هي LDN (الشكل 1). توجد أعداد صغيرة من LDN في دم الأفراد الأصحاء22. ومع ذلك ، تزداد أعداد LDN بشكل ملحوظ في حالات تثبيط المناعة المتعددة والالتهابات المزمنة ، بما في ذلك مرض الذئبة الحمراء23،24 ، الإنتان25 ، الصدفية26 ، الربو27 ، التهاب المفاصل اليفعي مجهول السبب28 ، التهاب الأوعية الدموية المرتبط بالأجسام السيتوبلازمية المضادة للعدلات (ANCA)29 ، عدوى فيروس نقص المناعة البشرية30 ، الملاريا31 والسل32. على الرغم من زيادة أعداد LDN في جميع الأمراض المذكورة ، فقد تمت دراسة LDN في الغالب في سياق مرض الذئبة الحمراء17. يبدو أن LDN من دم مرضى مرض الذئبة الحمراء لديه قدرة أكبر على تكوين NETs33 ، وإفراز كميات كبيرة من الوسطاء المشجعين للالتهابات34 ، وتنشيط الخلايا التائية24. ومع ذلك ، في حالات أخرى ، مثل السرطان ، تم الإبلاغ عن أن LDN يتكون من عدلات ناضجة وغير ناضجة35 ، مع خصائص قمعية للخلايا التائية36،37،38. وبالمثل ، في مرضى COVID-19 ، تم الإبلاغ أيضا عن LDN لقمع تكاثر الخلايا التائية39 ، ولكن على عكس مرض الذئبة الحمراء ، يبدو أن LDN ينتج عددا أقل من NETs39. لذلك ، لا يزال أصل LDN وتكوينه وخصائصه الوظيفية مثيرا للجدل.

نظرا لوجود LDN مع PBMC ، فإن دراستها معقدة من الناحية الفنية. لاستكشاف خصائص LDN بشكل كامل في الأمراض المختلفة ، من الضروري تنقيتها. من الإجراءات الشائعة لفصل LDN فرز الخلايا الفلورية22،40،41،42،43،44،45. ومع ذلك ، يتطلب فرز الخلايا وقتا طويلا لفصل الخلايا. قد يؤدي هذا إلى فقدان الخلايا أو انخفاض التعافي إذا لم يكن وقت الفرز كافيا. بالإضافة إلى ذلك ، تتعرض الخلايا لضغط مفرط ، مما يتسبب في نتائج متغيرة أثناء دراسة وظيفة هذه الخلايا. يزيد وقت الفرز الطويل أيضا من تكلفة الإجراءات التجريبية ويتطلب موظفين متخصصين.

هنا ، نقدم طريقة سريعة وفعالة للحصول على أعداد كبيرة من LDN البشري النقي والقابل للحياة في وقت قصير جدا. بعد الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، يتم فصل LDN عن طريق فرز الخلايا المغناطيسية (MACS ؛ الشكل 1). الميزة الرئيسية لطريقة التنقية هذه هي أن LDN مفصولة بنقاوة عالية (أكثر من 90٪) وقابلية للحياة (أكثر من 96٪). أيضا ، LDN المنقى يعمل بشكل كامل كما يتضح من قدرته على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وإطلاق NETs. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول بسهولة في أي مختبر مهتم ببيولوجيا العدلات لفصل LDN بسرعة عن دم الأشخاص المصابين بأمراض متعددة من أجل مزيد من دراسة هذه الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتبع جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات علم الأحياء البشري في معهد التحقيقات الحيوية - الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM). قدم جميع المشاركين موافقة مستنيرة.

1. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) والعدلات من دم الإنسان

  1. احصل على حوالي 10 مل من الدم من متطوع بالغ سليم عن طريق بزل الوريد. أضف 10 وحدة / مل من الهيبارين كمضاد للتخثر.
    تنبيه: تخلص من الإبرة في حاوية التخلص من إبرة الخطر البيولوجي. يجب وضع المحاقن والمواد الأخرى الملامسة للدم في كيس وتعقيمها قبل التخلص منها.
  2. في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل ، أضف 2 مل من 6٪ ديكستران T500 في PBS. ثم أضف 10 مل من الدم عن طريق تصريفه أسفل جانب الأنبوب. اقلب الأنبوب عدة مرات لخلط الدم والديكستران.
  3. دع الأنبوب يرتاح لمدة 45 دقيقة ، بينما تتساقط كريات الدم الحمراء. تظهر البلازما الغنية بالكريات البيض فوق طبقة كريات الدم الحمراء.
  4. في أنبوب طرد مركزي آخر سعة 15 مل ، أضف 5 مل من وسط تدرج الكثافة. قم بماصة البلازما بعناية ، دون لمس كريات الدم الحمراء ، وضعها فوق الوسط. يجب تشكيل مرحلتين منفصلتين.
  5. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 516 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تشكل الخلايا أحادية النواة (PBMC) نطاقا بين البلازما والطبقات المتوسطة. تشكل العدلات حبيبات في الأسفل (الشكل 1).
  6. عزل PBMC
    1. تخلص عن البلازما الموجودة أعلى PBMC عن طريق الشفط دون لمس الخلايا. اجمع الخلايا من الشريط بين البلازما والوسط. تأكد من شفط أقل قدر ممكن من المتوسط.
    2. ضع الخلايا في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل. أضف 20 مل من PBS. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. استنشق المادة الطافية بعناية وكشط الأنبوب لفصل الخلايا. أضف 10 مل من PBS البارد لإعادة تعليق الخلايا. عد PBMC باستخدام غرفة Neubauer.
      ملاحظة: لا تستخدم ماصة لإعادة تعليق الخلايا، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الخلايا.
  7. عزل العدلات
    1. قم بإزالة وسط تدرج الكثافة. افصل الخلايا عن طريق كشط الأنبوب وأضف 10 مل من PBS البارد.
    2. ضع الخلايا في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق المادة الطافية وافصل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.6.3.
  8. للتخلص من كريات الدم الحمراء المتبقية ، أضف 10 مل من محلول منخفض التوتر البارد (0.2٪ كلوريد الصوديوم ، 1٪ BSA ، 20 ملي هيبس ، درجة الحموضة = 7.4) ، واخلطها برفق لمدة دقيقة واحدة بالضبط.
  9. أضف بسرعة 10 مل من محلول مفرط التوتر البارد (1.6٪ كلوريد الصوديوم ، 1٪ BSA ، 20 ملي HEPES ، درجة الحموضة = 7.4) لجعل المحلول متساوي التوتر.
  10. عد العدلات باستخدام غرفة نيوباور (نقاء > 95٪). بيل الخلايا عن طريق الطرد المركزي كما في الخطوة 1.6.2. وأعد تعليقها في برنامج تلفزيوني بارد. حافظ على الأنبوب على الجليد.
    ملاحظة: يذكر أن عمر النصف للعدلات في المختبر هو 8 - 12 ساعة46،47،48. في تجربتنا مع هذا البروتوكول ، تحافظ العدلات على وظائفها لمدة 6 إلى 8 ساعات تقريبا.

2. تنقية العدلات منخفضة الكثافة (LDN)

  1. جهاز طرد مركزي PBMC عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل البارد (1٪ BSA في PBS).
  2. أضف 35 ميكرولتر من الميكروبيدات المغناطيسية CD66b. احتضن الخليط في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. تخلط برفق كل 10 دقائق لمنع تراكم الخلايا.
  3. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل البارد. ضع الخلايا في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بالتدوير عند 400 × جم لمدة 3 دقائق.
  4. قم بإزالة المادة الطافية ، وافصل حبيبات الخلية عن طريق كشط الأنبوب ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل.
  5. ضع عمود فصل مغناطيسي على مغناطيس. أضف 0.5 مل من مخزن الغسيل إلى العمود واتركه يمر عبر العمود.
  6. نقل الخلايا (1 مل) إلى العمود. دع المخزن المؤقت يمر عبر العمود قطرة قطرة.
  7. أضف 0.5 مل من مخزن الغسيل المؤقت إلى العمود واتركه يمر. أضف 0.5 مل أخرى من مخزن الغسيل المؤقت إلى العمود.
  8. قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 1 مل من مخزن الغسيل إلى العمود.
  9. أدخل المكبس أعلى العمود واضغط برفق لإزالة الخلايا. قم بإزالة المكبس وضع العمود فوق أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
  10. أضف 1 مل أخرى من مخزن الغسيل. أدخل المكبس أعلى العمود واضغط برفق لإزالة الخلايا.
  11. ضع كلا الأنبوبين في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بتدويرهما عند 800 × جم لمدة 3 دقائق. أخيرا ، أعد تعليق الخلايا (LDN) من كلا الأنبوبين إلى 1 مل من PBS البارد. استمر على الجليد.
    ملاحظة: يحتوي أول 2 مل من التدفق على بقية PBMC. يمكن استخدام هذه الخلايا في دراسات أخرى.

3. قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان

  1. أعد تعليق الخلايا المنقاة عند 1 × 106 خلايا / مل في المخزن المؤقت لوضع العلامات (1٪ FBS في PBS). أضف 250 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  2. أضف الأجسام المضادة المقابلة ضد جزيئات غشاء العدلات (للحصول على التفاصيل ، انظر جدول المواد). احتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وحمايتها من الضوء.
  3. أضف 1 مل من PBS. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بتدويرها على 800 × جم لمدة 3 دقائق.
  4. استنشاق المادة الطافية ، وكسر حبيبات الخلية عن طريق النقر على الأنبوب ، وأعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من 1٪ بارافورمالديهايد.
  5. حافظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء ، حتى يتم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي، والتقاط 10,000 حدث لكل عينة. قم بإجراء فرز الخلايا كما هو موضح سابقا22.
    تنبيه: بارافورمالديهايد مهيج للجلد والجهاز التنفسي. تأكد من عدم استنشاق الأبخرة.

4. الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)

  1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، أضف 2.5 × 105 خلايا. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بالتدوير عند 800 × جم لمدة 3 دقائق.
  2. استنشق المادة الطافية ، وكشط الأنبوب لفصل الخلايا ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 15 ميكرومتر ثنائي هيدرودرودامين 123 في برنامج تلفزيوني.
  3. احتضان الخلايا المحمية من الضوء عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف 1 مل من PBS.
  4. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بالتدوير عند 800 × جم لمدة 3 دقائق. استنشق المادة الطافية ، وكشط الأنبوب لفصل الخلايا ، وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من 50 نانومتر phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) في PBS.
  5. احتضان الخلايا المحمية من الضوء عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. أضف 1 مل من PBS.
  6. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بتدويرها على 800 × جم لمدة 3 دقائق. استنشاق المادة الطافية ، وكشط الأنبوب لفصل الخلايا ، وأعد تعليقها في 0.5 مل من 1٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
  7. حافظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى يتم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي، والتقاط 10,000 حدث لكل عينة.

5. تصور مصائد العدلات خارج الخلية (NETs)

  1. ضع الأغطية في آبار من صفيحة 12 بئرا وقم بتغطيتها ب 10 ميكروغرام / مل بولي إل ليسين. احتضن الطبق طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف.
  2. قم بإزالة poly-L-Lysine ، واغسل الأغطية باستخدام PBS ، واحتضان اللوحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف. اغسل الأغطية باستخدام PBS مرتين أخريين.
  3. قم بإزالة PBS واترك الأغطية تجف عن طريق وضع اللوحة داخل غطاء التدفق الرقائقي لمدة 2 ساعة.
  4. أعد تعليق LDN عند 1 × 106 خلايا / مل في وسط RPMI-1640 مع 5٪ FBS. خذ 350 ميكرولتر (3.5 × 105 خلايا) من تعليق الخلية وضعها في بئر من اللوحة المكونة من 12 بئرا تحتوي على الأغطية.
  5. احتفظ بالطبق لمدة 30 دقيقة في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية. أضف 3.5 ميكرولتر من 5 ميكرومتر PMA المخفف في PBS إلى كل بئر (التركيز النهائي ل PMA هو 50 نانومتر).
  6. احتفظ باللوحة لمدة 4 ساعات في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية. أضف 350 ميكرولتر من 8٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني ، واحتفظ باللوحة طوال الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5 ٪ عند 37 درجة مئوية.
  7. ضع طبقة شفافة فوق حامل أنبوب الاختبار كما هو موضح سابقا49 ، بحيث تتشكل الآبار على فتحات الأنبوب.
  8. املأ كل بئر بالحلول المختلفة لغسل أو تلطيخ الأغطية، مما يشكل قطرة كبيرة. قم بإزالة الأغطية وضعها رأسا على عقب على قطرة ماء لمدة 5 دقائق. بنفس الطريقة ، اغسل الأغطيةثلاث مرات أخرى بالماء.
  9. ضع الأغطية رأسا على عقب على قطرة من المخزن المؤقت للحجب (5٪ BSA في PBS) واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. انقل الأغطية إلى قطرة من الجسم المضاد الأساسي المقابل (على سبيل المثال ، مضاد الإيلاستاز أو مضاد السيترولين) في المخزن المؤقت للحظر واحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. أغطية الغسيل تنزلق 2x في 0.01٪ Tween-20 في PBS. انقل الأغطية إلى قطرة من الجسم المضاد الثانوي المقابل في المخزن المؤقت الحجب الذي يحتوي على 150 نانومتر DAPI ، واحتضنه لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء.
  12. أغطية الغسيل تنزلق 2x في 0.01٪ Tween-20 في PBS. ضع قطرة من وسط التثبيت المضاد للبهتان على شريحة زجاجية وضع الأغطية رأسا على عقب.
  13. أغطية الختم تنزلق حول المحيط بطلاء الأظافر. قم بتخزين الشرائح المثبتة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء. تصور NETs باستخدام مجهر مضان.

6. الكشف عن مصائد العدلات خارج الخلية (NETs)

  1. أعد تعليق الخلايا عند 5 × 105 خلايا / مل في 500 نانومتر Sytox Green ، مخففة في وسط RPMI-1640 مع 5٪ FBS.
  2. خذ 100 ميكرولتر (5 × 104 خلايا) من معلق الخلية وضعها في بئر من صفيحة زراعة الأنسجة ذات 96 بئرا.
  3. احتفظ بالطبق لمدة 20 دقيقة في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية. أضف إلى كل بئر 20 ميكرولتر من 300 نانومتر PMA مخفف في وسط RPMI-1640 (التركيز النهائي ل PMA هو 50 نانومتر).
  4. انقل اللوحة إلى قارئ ميكروبلاط مسخن مسبقا. احتضان اللوحة عند 35 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، مع أخذ قياسات التألق من أسفل اللوحة كل 5 دقائق (باستخدام مرشحات الإثارة 485 نانومتر و 528 نانومتر).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل العدلات منخفضة الكثافة (LDN) في الأفراد الأصحاء حوالي 5٪ من PBMC (الشكل 2 أ). عادة ما يوفر البروتوكول الموصوف هنا LDN نقيا (> 90٪). يتم أيضا استرداد الخلايا بكفاءة (تنتج حوالي 98٪) مع قابلية عالية للحياة (> 95٪. الشكل 2 ب). للمقارنة ، تم تنقية LDN أيضا عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت كما هو موضح سابقا22. باختصار ، تم تصنيف PBMC بجسم مضاد ل CD16b وتم فرزها في فارز الخلايا المنشط بالفلورسنت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بشكل عام ، كان يعتقد أن العدلات خلايا متجانسة. ومع ذلك ، فقد أظهرت الأدلة الحديثة أن العدلات يمكن أن توجد كخلايا ذات حالات تنشيط مختلفة و / أو أنماط ظاهرية متعددة. وبالتالي ، قد توجد مجموعات سكانية فرعية مختلفة من العدلات13،14،15. اكتسبت مجموعة فرعية واحدة من العدلات ، وهي العدلات منخفضة الكثافة (LDN) ، اهتماما كبيرا بسبب خصائصها الجوهرية الخاصة وأيضا لأنها تزداد في أمراض متعددة

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يذكر المؤلفون أن هذه الدراسة أجريت دون أي روابط تجارية أو مالية يمكن اعتبارها تضاربا محتملا في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون سيزار دياز جودينيز (معهد التحقيقات الحيوية في UNAM) على مساعدته في الفحص المجهري الفلوري لتصور الشبكيات. تم دعم هذا البحث من خلال منحة PAPIIT IN205523 من Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), المكسيك, وبمنحة CF-2023-I-610 من Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), المكسيك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  الأجسام المضادة متعددة النسيات لأرانب مضاد للسيترولينAbCamab100932تخفيف 1/50
لوحة زراعة الأنسجة ذات 96 بئرCostar; شركة كورنينغ.3596
أليكسا فلور 488 الجسم المضاد للفأر CD11b IgG1 ضد الإنسانبيو ليجند3013170.25 & mu; g/mL
أليكسا فلور 647 الجسم المضاد للفأر CD66b IgMبيو ليجند3051090.05 μ g/mL
الجسم المضاد للماعز مضاد للفئران IgG (H+L)، أليكسا فلور 488إنفيتروجين - ثيرمو فيشر ساينتيفيكA-11001تخفيف 1/50
الجسم المضاد IgG1 وحيد النسيلة من فأر مضاد للعدلاتسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-5554910 وميكرو؛ g/mL
أجسام مضادة للحمار مضادة لمضاد IgG (H+L) من الأرانب، أليكسا فلور 555إنفيتروجين - ثيرمو فيشر ساينتيفيكA-31572تخفيف 1/50
الجسم المضاد للفأر CD62L مضاد للبشر من نوع APC IgG1بيو ليجند3048090.03 μ g/mL
الجسم المضاد للفأر CD14 المضاد للبشر من نوع APC/Cyanine7 IgG1بيو ليجند3671070.25 & mu; g/mL
مقياس تدفق Attune NxT  شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك، إنك.(أشعة ليزر زرقاء/حمراء)
ألبومين مصل البقر (BSA) الجزء VMP Biomedicals810025
الجسم المضاد للفأر CD33 IgG1 من Brilliant Violet 510 المضاد للإنسانبيو ليجند3666090.30 & mu; g/mL
DAPIكالبيوكيم/EMD ميليبور268298
ديكسترن T500فارماكوزموس إي/سي5.51005E+11
ديهيدرورودامين-123Anaspec, Inc.AS-85711
فرز الخلايا في FACSبيكتون ديكنسون  نموذج FACSAria
مصل البقر الجنيني (FBS)جيبكو16000-044
فيكول-باكميرك كي جيGE 17-1440-03
الجسم المضاد IgG1 لفأر CD98 المضاد للبشر من FITCبيو ليجند3156030.30 & mu; g/mL
فلوجو سوفتويربيكتون ديكنسونالإصدار 10، 2019
المجهر المقلوب بالفلورةأوليمبوسالطراز IX-70
هيبارينإنهيبار - مزرعة بيسا36601495000 واجهة مستخدم/مل
هيبسسيغما ألدريتشH7006
ميكروبيدات كيميرزم MACSprep CD66bميلتيني بيوتيك130-111-552
مغناطيسميلتيني بيوتيك130-042-102
عمود الفصل المغناطيسيميلتيني بيوتيك130-042-201
الطرد المركزي الدقيقإبندورفالطراز 5415C
قارئ الميكروبليتبيوتيك إنسترومنتسنموذج سينرجي HT
بارافورمالديهايدسيغما ألدريتش158127
الجسم المضاد IgG1 لفئران CD10 المضاد للبشر من PEبيو ليجند3122030.05 μ g/mL
الجسم المضاد للفأر CD16b ب PE ضد الإنسان IgG2aبي دي فارمينجن550868تخفيف 1/40
الجسم المضاد للفأر CD15 المضاد للبشر من نوع PE/Cyanine5 IgG1بيو ليجند3230130.25 & mu; g/mL
فوربول 12-ميريستيت 13-أسيتات (PMA)سيغما ألدريتشP8139
بولي-إل-ليسينسيغما ألدريتشP2658
الطرد المركزي المبردإبندورفالطراز 5702R
وسط زراعة الأنسجة RPMI-1640جيبكو23400-021
سايتوكس جرينشركة موليكوليكال بروبز، إنك.S-7020
العمر البالغ 20 عاما؛سيغما ألدريتشP2287
فيكتاشيلدمختبرات فيكتورH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
  2. Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  3. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A fundamental process in immunity. Biomed Res Int. 2017, 9042851(2017).
  4. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  5. Faurschou, M., Borregaard, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 5 (14), 1317-1327 (2003).
  6. Lacy, P., Eitzen, G. Control of granule exocytosis in neutrophils. Front Biosci. 13, 5559-5570 (2008).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Leukoc Biol. 108 (1), 377-396 (2020).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Lawrence, S. M., Corriden, R., Nizet, V. The ontogeny of a neutrophil: Mechanisms of granulopoiesis and homeostasis. Microbiol Mol Biol. Rev. 82 (1), e00057-e00117 (2018).
  11. Aroca-Crevillén, A., Vicanolo, T., Ovadia, S., Hidalgo, A. Neutrophils in physiology and pathology. Annu Rev Pathol. 19, 227-259 (2024).
  12. Hellebrekers, P., Vrisekoop, N., Koenderman, L. Neutrophil phenotypes in health and disease. Eur J Clin Invest. 48 (Suppl 2), e12943(2018).
  13. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nat Rev Immunol. 19 (4), 255-265 (2019).
  14. Qu, J., Jin, J., Zhang, M., Ng, L. G. Neutrophil diversity and plasticity: Implications for organ transplantation. Cell Mol Immunol. 20 (9), 993-1001 (2023).
  15. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Front Physiol. 9, 113(2018).
  16. Silvestre-Roig, C., Fridlender, Z. G., Glogauer, M., Scapini, P. Neutrophil diversity in health and disease. Trends Immunol. 40 (7), 565-583 (2019).
  17. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  18. Ning, X., Wang, W. M., Jin, H. Z. Low-density granulocytes in immune-mediated inflammatory diseases. J Immunol. 2022, 1622160(2022).
  19. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheum. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  20. Böyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  21. García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J Vis Exp. (74), e50410(2013).
  22. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  23. Midgley, A., Beresford, M. W. Increased expression of low-density granulocytes in juvenile-onset systemic lupus erythematosus patients correlates with disease activity. Lupus. 25 (4), 407-411 (2016).
  24. Rahman, S., et al. Low-density granulocytes activate T cells and demonstrate a non-suppressive role in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 78 (7), 957-966 (2019).
  25. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low-density subpopulations and CD10 (calla) negative neutrophils in severely infected patients. Surg Today. 22, 322-327 (1992).
  26. Lin, A. M., et al. Mast cells and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in psoriasis. J Immunol. 187 (1), 490-500 (2011).
  27. Fu, J., Tobin, M. C., Thomas, L. L. Neutrophil-like low-density granulocytes are elevated in patients with moderate to severe persistent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 113 (6), 635-640 (2014).
  28. Ramanathan, K., et al. Neutrophil activation signature in juvenile idiopathic arthritis indicates the presence of low-density granulocytes. Rheumatology (Oxford). 57 (3), 488-498 (2018).
  29. Grayson, P. C., et al. Neutrophil-related gene expression and low-density granulocytes associated with disease activity and response to treatment in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis. Arthritis Rheumatol. 67 (7), 1922-1932 (2015).
  30. Cloke, T., Munder, M., Taylor, G., Müller, I., Kropf, P. Characterization of a novel population of low-density granulocytes associated with disease severity in HIV-1 infection. PLoS One. 7, e48939(2012).
  31. Rocha, B. C., et al. Type I interferon transcriptional signature in neutrophils and low-density granulocytes is associated with tissue damage in malaria. Cell Rep. 13 (12), 2829-2841 (2015).
  32. Deng, Y., et al. Low-density granulocytes are elevated in mycobacterial infection and associated with the severity of tuberculosis. PLoS One. 11 (4), e0153567(2016).
  33. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
  34. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  35. Sagiv, J. Y., et al. Phenotypic diversity and plasticity in circulating neutrophil subpopulations in cancer. Cell Rep. 10 (4), 562-573 (2015).
  36. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The multifaceted roles neutrophils play in the tumor microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (December), 125-158 (2015).
  37. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  38. Vanhaver, C., et al. Immunosuppressive low-density neutrophils in the blood of cancer patients display a mature phenotype. Life Sci Alliance. 7 (1), e202302332(2023).
  39. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).
  40. Cabrera, L. E., et al. Characterization of low-density granulocytes in COVID-19. PLoS Pathog. 17 (7), e1009721(2021).
  41. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils and neutrophil extracellular traps (nets) are new inflammatory players in heart failure. Can J Cardiol. 40 (9), 1524-1535 (2024).
  42. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils contribute to subclinical inflammation in patients with type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1674(2024).
  43. Jones, B. E., et al. Anca autoantigen gene expression highlights neutrophil heterogeneity, where expression in normal-density neutrophils correlates with anca-induced activation. Kidney Int. 98 (3), 744-757 (2020).
  44. Li, Y., et al. The proportion, origin, and pro-inflammation roles of low-density neutrophils in SFTS disease. BMC Infect. Dis. 19 (1), 109(2019).
  45. Martin, K. R., et al. Cd98 defines a metabolically flexible, proinflammatory subset of low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Clin Transl Med. 13 (1), e1150(2023).
  46. Murphy, M. P., Caraher, E. Mcl-1 is vital for neutrophil survival. Immunol Res. 62 (2), 225-233 (2015).
  47. Nauseef, W. M. Neutrophils, from cradle to grave and beyond. Immunol Rev. 273 (1), 5-10 (2016).
  48. Pérez-Figueroa, E., Álvarez-Carrasco, P., Ortega, E., Maldonado-Bernal, C. Neutrophils: Many ways to die. Front Immunol. 12, 631821(2021).
  49. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  50. Emmendörffer, A., Hecht, M., Lohmann-Matthes, M. L., Roesler, J. A fast and easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorhodamine 123. J Immunol Methods. 131 (2), 269-227 (1990).
  51. Pioch, J., Blomgran, R. Optimized flow cytometry protocol for dihydrorhodamine 123-based detection of reactive oxygen species in leukocyte subpopulations in whole blood. J Immunol Methods. 507, 113308(2022).
  52. Liu, X., et al. Pad4 takes charge during neutrophil activation: Impact of pad4 mediated net formation on immune-mediated disease. J Thromb Haemost. 19 (7), 1607-1617 (2021).
  53. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  54. Alemán, O. R., Mora, N., Cortes-Vieyra, R., Uribe-Querol, E., Rosales, C. Transforming growth factor-β-activated kinase 1 is required for human fcγriiib-induced neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 7, 277(2016).
  55. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent net release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  56. Sanchez Gonzalez, A., Bardoel, B. W., Harbort, C. J., Zychlinsky, A. Neutrophil methods and protocols. , Humana Press - Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  57. Mishalian, I., Granot, Z., Fridlender, Z. G. The diversity of circulating neutrophils in cancer. Immunobiology. 222 (1), 82-88 (2017).
  58. Wright, H. L., Makki, F. A., Moots, R. J., Edwards, S. W. Low-density granulocytes: Functionally distinct, immature neutrophils in rheumatoid arthritis with altered properties and defective TNF signalling. J Leukoc Biol. 101 (2), 599-611 (2017).
  59. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of mdsc: Assays, problems and potential solutions. Cancer Immunol Immunother. 68 (4), 631-644 (2019).
  60. Kimberly, R. P., Ahlstrom, J. W., Click, M. E., Edberg, J. C. The glycosyl phosphatidylinositol-linked FCγRIII PMN mediates transmembrane signaling events distinct from FCγRII. J Exp Med. 171 (4), 1239-1255 (1990).
  61. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Fc receptors: Cell activators of antibody functions. Adv Biosci Biotech. 4, 21-33 (2013).
  62. Unkeless, J. C., Shen, Z., Lin, C. W., Debeus, E. Function of human fcγriia and fcγriiib. Semin Immunol. 7 (1), 37-44 (1995).
  63. Ghaemdoust, F., Keshavarz-Fathi, M., Rezaei, N. Natural killer cells and cancer therapy, what we know and where we are going. Immunotherapy. 11 (14), 1231-1251 (2019).
  64. Lanier, L. L., Le, A. M., Civin, C. I., Loken, M. R., Phillips, J. H. The relationship of CD16 (leu-11) and leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 136 (12), 4480-4486 (1986).
  65. Huizinga, T. W., et al. The pi-linked receptor fcriii is released on stimulation of neutrophils. Nature. 333 (6174), 667-669 (1988).
  66. Jongstra-Bilen, J., Harrison, R., Grinstein, S. Fcγ-receptors induce mac-1 (cd11b/cd18) mobilization and accumulation in the phagocytic cup for optimal phagocytosis. J Biol Chem. 278 (46), 45720-45729 (2003).
  67. Tak, T., et al. Human CD62Ldim neutrophils identified as a separate subset by proteome profiling and in vivo pulse-chase labeling. Blood. 129 (26), 3476-3485 (2017).
  68. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Exp Cell Res. 342 (2), 200-209 (2016).
  69. Schröder, A. K., Uciechowski, P., Fleischer, D., Rink, L. Crosslinking of CD66 b on peripheral blood neutrophils mediates the release of interleukin-8 from intracellular storage. Hum Immunol. 67 (9), 676-682 (2006).
  70. Skubitz, K. M., Campbell, K. D., Skubitz, A. P. Cd66a, cd66b, cd66c, and cd66d each independently stimulate neutrophils. J Leukoc Biol. 60 (1), 106-117 (1996).
  71. Basic principle of magnetic cell separation. , Miltenyi Biotec. https://www.miltenyibiotec.com/UN-en/products/macs-cell-separation/basic-principle-of-magnetic-cell-separation.html?query=:relevance:allCategoriesOR:10000089 (2025).
  72. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci. Rep. 12 (1), 3667(2022).
  73. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  74. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J Clin Invest. 126 (5), 1612-1620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Low Density NeutrophilsMagnetic MicrobeadsNeutrophil PurificationDensity GradientPeripheral BloodFlow CytometryMononuclear CellsReactive Oxygen SpeciesNeutrophil Extracellular TrapsCD66b Marker

Related Articles