Method Article

عزل متسلسل ممثل للكريبتات وخلايا البسكوماتور الميزنشيمية من أنسجة الأمعاء الخنزيرية

DOI:

10.3791/69429

⸱

December 19th, 2025

 , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر هذه الدراسة بروتوكولا تدريجيا للعزل التسلسلي للقبعات المعوية وخلايا البضيض الميزنشيمية المعوية (iMSCs) من نسيج الخنزير الجني. تولد الطريقة طبقات أحادية ثنائية الأبعاد من الأمعاء وiMSC مناسبة لتطوير نماذج قابلة للتكرار وذات صلة فسيولوجية لزراعة الظهارة والسترومال لدراسة التداخل الخلوي أثناء التوازن والتجدد في الأمعاء.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتفاعل ظهارة الأمعاء بشكل وثيق مع الخلايا البثوية المتوسطة المعوية الأساسية (iMSCs) لتنظيم التطور، والتوازن الداخلي، والتجدد. ومع ذلك، فإن الطرق الموحدة لعزل كل من الأجزاء الظهارية والسترومالية عن نسيج الخنزير بشكل متسلسل محدودة. يصف هذا البروتوكول عملية محسنة خطوة بخطوة لعزل الكريبتات وiMSCs من نفس المقطع الصغير من الخنازير. تستخدم الطريقة مخزن تفكك قائم على حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA/DTT) لإطلاق القفر، يليه هضم الكولاجناناز/ديسباس لمصفوفة خارج الخلية لعزل الخلايا العضلية العضلية. يقلل هذا النهج من التغيرات المكانية في الخلايا المعزولة. تم زراعة القنابل المعزولة بنجاح وشكلت طبقات أحادية معوية ثنائية الأبعاد متمدد نموذجية على صفائح مغطاة بالكولاجين الهيدروجيل. التزمت الخلايا الصلبة العضلية المستزرعة بقوارير الزراعة وأعربت عن علامات البلقاعة مثل مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα) وتجمع التمايز 81 (CD81)، كما تم تحديده بواسطة التلوين المناعي. بشكل عام، ينتج هذا البروتوكول المحسن للعزل خلايا ظهارية وخلايا سمكية من نفس مقطع الخضر الصغير، مما يوفر أساسا قابلا للتكرار للأبحاث المستقبلية التي تشمل عضويات الأمعاء وأنظمة الزراعة المشتركة للخنازير لتوضيح آليات التحكم في التفاعلات الظهارية والبتكية في الخنازير، وهو نموذج ذو صلة ترجمية لتكرار فسيولوجيا الإنسان وتقدم علوم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الظهارة المعوية هي نسيج ديناميكي يخضع لتجديد ذاتي مستمر وتمايز للحفاظ على توازن الأمعاء وتسهيل التجدد بعد إصابات الغشاء المخاطي 1,2. تنشأ خلايا الظهارة المعوية من الخلايا الجذعية المعوية (ISCs)، وتتفاعل مع عوامل البيئة الدقيقة المختلفة 3,4,5,6,7,8. تتكون الأقسام تحت الظهارية، وخاصة الصفيحة العمودية والمخاطية العضلية، من مجموعات خلايا متنوعة من سلالات مختلفة9. من بين هذه المجموعات الخلية، تنتج الخلايا البضاعة المتوسطة المعوية (iMSCs)، بما في ذلك الخلايا الليفية والأرومات الليفية العضلية، عوامل غذائية ونمو تعدل جذع وتكاثر وتمايز ISC لتنظيم التوازن الظهاري والتجدد 6,7,10,11.

لدراسة هذه التفاعلات الخلوية، طورت دراسات حديثة طرقا جديدة لفك آليات عمل محتملة تدفع التفاعل المتقاطع بين خلايا الظهارة المعوية والخلايا العضلية الداخلية. لقد طورت أنظمة الزراعة المشتركة التي تجمع بين الأعضاء والخلايا البثوية أو المناعية فهمنا للتفاعلات الخلوية بين الخلايا الظهارية تحت الظهارية أثناء التطور، والتجدد، وفحص الأدوية، ونمذجة الأمراض 12,13,14,15,16,17. ومع ذلك، استخدمت معظم دراسات الزراعة العضوية أنسجة الفئران، التي غالبا ما تفشل في محاكاة فسيولوجيا الإنسان وأنماط المرض بشكل فعال، مما يحد من أهميتها السريرية في الترجمة18.

في معظم بروتوكولات عزل أمعاء الفئران، يتم الحصول على خلايا الظهارة والسترومال من شرائح نسيج منفصلة، مما قد ينتج عينات تعكس خصائص مختلفة قليلا، مما قد يؤثر على قابلية التكاثر عبر التجارب19,20. حاليا، لا توجد بروتوكولات موحدة محسنة لعزل القنابل المعوية الخنزيرية وiMSCs من نفس عينة الأنسجة. علاوة على ذلك، أدت القيود العملية في الحصول على عينات مناسبة من الأمعاء البشرية إلى اعتماد العديد من الباحثين على أنواع خلايا غير متطابقة من أعضاء مختلفة (مثل الأمعاء البشرية مع الأرومات الليفية الجلدية) لتقييم التداخل الخلوي بين الخلايا الظهارية والميزنشيمية، مما قد يربك تفسير البيانات 21,22,23.

على الرغم من أن بروتوكول خزعة الأمعاء البشرية الذي نشر مؤخرا عزل القنابات وحصل على الأرومات الليفية من خلال نمو نسيج متبقي منهك من الظهارة، إلا أن هناك حاجة لطرق موحدة مماثلة تفتقر إلى الخنازير24. تستخدم الخنازير كنموذج حيواني مناسب للأبحاث الانتقالية بسبب تشابهها التشريحي والفسيولوجي مع البشر 2,18,25,26,27,28,29. لذلك، تقدم هذه الطريقة بروتوكول عزل متسلسل يستعيد القنابل المعوية وقطع ال iMSC من نفس مقطع الخنزير النباتي بناء على البنية الفسيولوجية والتشريحية والشكلية للأمعاء 4,30. يوفر الإجراء إطارا قابلا للتكرار لعزل كل من القبو وقطع ال iMSC مناسبا لدراسات الزراعة المشتركة في أمعاء الخنازير المستقبلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تشريح جزء بطول 5 سم من الجيجونوم القريب المستخرج من خنازير صغيرة تبلغ من العمر 21 يوما وكانت تقيم في منشأة تربية الخنازير بجامعة ماريلاند، كوليدج بارك. الإجراء (R-JUN-22-30) المستخدم للتضحية بالخنزير الصغير اتبع إرشادات سياسات رعاية واستخدام التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في الجامعة. قبل المضي قدما في خطوات العزل، يتم عرض مخطط البروتوكول في الشكل 1، وقائمة الكواشف والمعدات المستخدمة في العزل التسلسلي لقبوات الأمعاء الخنزيرية وiMSCs موجودة في جدول المواد.

1. مرحلة التحضير قبل العزل

  1. جهز 30 مل من حاجز الغسيل لكل جزء نسيج بحجم 5 سم في أنابيب مخروطية بحجم 50 مل.
  2. اضبط الحجم بناء على عدد عينات الأنسجة التي تم جمعها.
    ملاحظة: تحقق من الجدول 1 لمعرفة تركيب مخزن الغسيل. جميع خطوات تحضير الأنسجة وعزل الخلايا تتم على سطح الطاولة.

2. مرحلة تحضير الأنسجة المعوية

  1. ضع نسيج الأمعاء المستخرج في 30 مل من حاجز الغسيل في أنابيب مخروطية بحجم 50 مل.
    ملاحظة: يمكن وضع الأنسجة المستخرجة في محلول غسيل بارد لمدة ساعة قبل الاستخدام.
  2. اشطف النسيج 3× باستخدام محلول غسيل بارد باستخدام حقنة 21 جرام لإزالة المحتويات المضيئة.
  3. ضع النسيج على سطح من رغوة البوليسترين المعقمة وقم بإزالة الأنسجة المساريقية والدهنية بعناية من السيروزا.
  4. قم بتشريح الأنسجة طوليا باستخدام شفرة جراحية لفتح التجويف (الشكل 2A).
  5. انقل الأنسجة المقطعة جزئيا إلى محلول تنظيف جديد واغسل مرتين أو حتى يصبح المحلول شفافا.
  6. ضع النسيج في مخزن الغسيل في طبق بتري بحجم 100 مم وقطعه إلى قطع بحجم 10-15 مم باستخدام شفرة جراحية جديدة (الشكل 2B,C). تزيد هذه الخطوة من مساحة السطح المعرضة لحاجز الهضم.
  7. انقل النسيج المفروم إلى أنبوب مخروطي جديد بسعة 50 مل.
  8. اغسلها بلطف باستخدام محلول الغسيل ودع الأنسجة المفروم تستقر بالجاذبية لمدة تقارب 30 ثانية (الشكل 2D).
  9. استنشق السوبرناتانت بلطف، مع ترك حاجز كاف فقط لتغطية قطع الأنسجة في الأنبوب المخروطي.
  10. مرحلة الانفصال الظهاري
    1. أضف 30 مل من محلول تفكك الظهارة المسخن مسبقا (الجدول 2) وحضانه لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام خرز ثابت أو حمام ماء مهز عند حوالي 9 × جرام.
    2. اهز الأنبوب بلطف كل 15 دقيقة لزيادة إطلاق القبو من الغشاء الظلائي.
    3. دع النسيج يستقر واسحب الفائق بلطف باستخدام ماصنة مصلية، مع ترك حاجز كاف لتغطية الأنسجة المستقرة في الأنبوب المخروطي.
    4. أضف 30 مل من محلول الغسل الطازج إلى الأنسجة المستقرة واهز بقوة لإطلاق الزغب والقبور والحطام (الشكل 3A). دع بقايا الأنسجة تستقر، ثم قم بإخراج سوبرناتانت العزل الغسيل، الذي يحتوي على الأجزاء المعلقة من القاع، عبر مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي جديد بسعة 50 مل.
      1. كرر عملية إضافة محلول غسيل جديد إلى النسيج المتبقي وإزالة الغبار ثلاث مرات (3×). قم بعمل 10 ميكرولتر من مخزن الغسيل الذي يحتوي على القبوب في طبق بتري بقطر 100 مم وفحص كثافة القبو تحت مجهر ستيريو.
        ملاحظة: احتفظ بكل مخزن غسيل يحتوي على كريبتات بعد كل غسل.
    5. بعد الغسيل الثالث، يجب أن يكون مخزن الغسيل الذي يحتوي على القبو نظيفا مع أقل قدر من الحطام (الشكل 3B).
      ملاحظة: احتفظ ببقايا الأنسجة مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) في الأنبوب المخروطي لمعالجة عزل iMSC لاحقا.
    6. قم بعمل جهاز الطرد المركزي في تعليق القبو عند 150 × جرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لإزالة شظايا القبو.
    7. استنشاق وأعد تعليق حبيبات القبو في وسط الزراعة الظهارية.
    8. قم بالطرد المركزي في السراديب المعلقة مرة أخرى عند 150 × جرام لمدة دقيقتين لجمع رصاصة شظايا القبو.
    9. أضف وسط زراعة ظهارية لإعادة تعليق القبو والماصة 5× باستخدام رأس ماصة بسعة 1000 ميكرولتر.
    10. زرع حوالي 100 سراديب معلقة على صفائح 6 آبار مغطاة بالهيدروجيل من نوع 1 معدة مسبقا لزراعة وتوسيع القبو إلى طبقات أحادية الأمعوية ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد).
      ملاحظة: تحقق من تحضير الطبق المغطى بالهيدروجيل الكولاجين في الجدول 3. يجب أن يكون التركيز النهائي للكولاجين من النوع الأول 1.0 ملغ/مل. تجنب تغطية القبو الكثيفة جدا أو شظايا الحطام لمنع تلوث الخميرة أو الفطريات. يجب أن يوفر المضاد الحيوي-مضاد الفطريات (مضاد الفطريات) في مخزن الغسيل ووسط الزراعة الحماية.
    11. فحص الخلايا تحت مجهر التباين الطور المقلوب قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2.
    12. استبدل وسط الزراعة خلال 12 ساعة من البذور لإزالة الحطام العائم وتقليل التلوث البكتيري.
    13. ازرع الأمعوية باستخدام وسط زراعة ظهارية (الجدول 4) واستبدل الوسط كل يومين حتى حوالي اليوم الثامن، عندما تصل طبقات أحادية الأبعاد الموسعة إلى ≥85٪ من التقاء الزراعة الفرعية.
  11. مرحلة تفكك المصفوفة خارج الخلية
    ملاحظة: استمر في عملية العزل مع بقايا الأنسجة التي تحتوي على المصفوفة خارج الخلية في الأنبوب المخروطي (الشكل 3C و الشكل 4A).
    ملاحظة: على الرغم من أن EDTA في محلول تفكك الظهارة يمكن أن يثبط نشاط الكولاجنازي، إلا أن الخطوات الثلاث السابقة للغسل تزيل كل EDTA وDTT. لذا، لا ينبغي أن يتأثر نشاط الكولاجيناز في العملية اللاحقة.
    1. قم بتقطيع الأنسجة المتبقية مرة أخرى إلى قطع صغيرة قبل البدء في عزل الخلايا الصبغية في الصفيحة الجوية.
    2. أضف 25 مل من حاجز الهضم خارج الخلوي (الجدول 5) إلى النسيج وحضنه في حمام خرز ثابت لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية (الشكل 4B).
    3. اهتز بقوة بعد الحضانة.
      ملاحظة: الفائق الشفاف سيصبح عكرا مع تقليل شظايا الأنسجة الطافية. مدمج 10 ميكرولتر من المادة الفائقة تحت مجهر مقلوب لفحص كثافة الميكروبات الفائقة في الفائق. استمر في حضان الأنسجة في حوض الحمام لمدة 15 دقيقة إضافية إذا كانت كثافة iMSC الملحوظة منخفضة.
    4. قم بإخراج السائل الفائق بلطف (مباشرة بعد هزها القوي في الخطوة 2.2.3) عبر مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي جديد لتقليل الحطام.
    5. قم بعمل نظام الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 280 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لدفع أقراص iMSCs.
    6. استنشاق الفائق وأعد تعليق iMSCs في وسط الزراعة المتوسطة (انظر وسائط ثقافة iMSC في الجدول 6).
    7. قم بجهاز الطرد المركزي للميكروفونات المعلقة مرة أخرى عند 280 × جرام لمدة 5 دقائق لغسل مخزن التفكك.
    8. استنشاق وإعادة تعليق iMSCs في وسط الزراعة المتوسطة.
    9. قم بتغليف iMSCs في قارورة زراعة T75 بحوالي 5 × 10 إلى5 خلايا لكل قارورة.
      ملاحظة: تأكد من أن الخلايا المطلية تغطي حوالي 60٪ من مساحة سطح القارورة لأن الخلايا الميزانشيمية تتطلب كثافة بذر متوسطة إلى عالية للنمو الأمثل.
    10. استبدل وسط الزراعة خلال 12 ساعة من الطلاء لإزالة الحطام الزائد ومنع التلوث البكتيري.
    11. افحص الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية تحت مجهر تباين الطور المقلوب في اليوم الثاني بعد البذر.
      ملاحظة: غير وسيط زراعة الميزنكيميا كل يومين. يجب أن تصل جزر ال iMSC إلى حوالي 85٪ من التقاء الأشجار وتكون جاهزة للزراعة الفرعية بحلول اليوم الرابع.

3. اختبار الكيمياء المناعية

  1. زراعة حوالي 5,000 iMSC لكل بئر في صفيحة تحتوي على 96 بئرا مع وسط زراعة ميزنشيمي لمدة 2-3 أيام حتى تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء الجسم.
  2. استنشق الوسط بلطف وشطف الميكروبات المزروعة مرتين بجرعة 100 ميكرولتر من 1× PBS/بئر في درجة حرارةالغرفة 31. جميع الإشارات إلى مجموعات التلطين المناعي موفقة في جدول المواد.
  3. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهيد (PFA) لكل بئر لتثبيت الخلايا الزجاجية المزروعة واحتضنه على طاولة ثابتة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. اغسل الميكرولتر الثابت مرتين ب 100 ميكرولتر من 0.1٪ Tween-20/PBS (PBST) لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم استخدم 100 ميكرولتر من 0.5٪ Triton X-100/PBS لمدة 30 دقيقة.
  5. أضف 100 ميكرولتر من ألبومين مصل البقري بنسبة 5٪ (BSA)/PBST لكل بئر لمنع الارتباط غير النوعي على الخلايا الثابتة.
    ملاحظة: اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة قبل غسلها مرتين ب 100 ميكرولتر من PBST لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  6. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة (1:250؛ أي 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في 250 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة) إلى كل بئر وحضن الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية. الأجسام المضادة الأساسية المستخدمة هي PDGFRα و CD81.
    ملاحظة: أضف آبار التحكم السلبية بإضافة مخفف الأجسام المضادة فقط بدون الأجسام المضادة الأولية.
  7. في اليوم الثاني، اغسل الأجسام المضادة الأولية مرتين ب 100 ميكرولتر من PBST لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  8. يتم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في 1× PBS باستخدام النسب التالية: Alexa Fluor Plus 555 (1 ميكرولتر:100 ميكرولتر)، Alexa Fluor Plus 647 (1 ميكرولتر:100 ميكرولتر)، وDAPI (1 ميكرولتر:800 ميكرولتر).
  9. قم بصبغ الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية المخففة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
  10. اغسل الخلايا مرتين بمحلول 1× PBS لمدة 5 دقائق لكل واحدة.
  11. أضف 100 ميكرولتر من وسط التثبيت في كل بئر، غط اللوحة، لفها بورق الألمنيوم، وخزنها على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر حتى التصوير الفلوري.

4. عزل الحمض النووي الريبي واختبار qPCR

  1. استخلاص إجمالي mRNA من iMSCs المزروعة في قوارير T75 باستخدام تقنية فصل الحمض الجوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول والكلوروفورم.
    ملاحظة: حدد تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طياف فوتوميتر.
  2. قم بعكس نسخ mRNA الكلي إلى cDNA لاستخدامه كقالب لاختبار تفاعل بوليميراز النسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) للتحقق من مخططات التضخيم لمبرمر جين Sus scrofa المختار، GAPDH (للأمام: ATCCTGGGCTACACTGAGGAC؛ العكس: AAGTGGTCGTGGGCAATG)، كما ورد في الدراسات السابقة 2,28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء تفكك الظهارة، يقوم حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) بتخلب أيونات الكالسيوم لتعطيل التصاقات الخلايا المعتمدة على الكالسيوم، بينما يقطع الديثيوثرايتول (DTT) روابط ثنائية الكبريتيد في بروتينات المخاط لتسهيل التحلل المخاطي. لذا، فإن الاستخدام المشترك لمركب مخلب (EDTA) وعامل اختزال (DTT) يتيح إطلاق القبو بشكل فعال من الغشاء الظلائي دون تعطيل بنية المصفوفة خارج الخلية (ECM) 2,32 (الشكل 3). تم إطلاق السراديب بنجاح من طبقة ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل القنابات المعوية وقطع العضلات الصلبة من نفس شريحة الجوهرية الخنزيرية يقدم نهجا جديدا للحفاظ على الخصائص الخلوية والوظيفية الخاصة بشريحة الأنسجة. وهذا أمر حاسم لأن أنسجة الأمعاء تظهر هويات إقليمية ومكانية، كما أظهرت الدراسات السابقة على الخنازير 2,36,37,38. الدراسات العضوية السابقة في الخنازير أو أنواع أخرى، والتي اعتمدت على القبو المعزولة من جزء واحد والأرو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدر المؤلفون الدعم المالي من برنامج المنح التنافسية MAES في جامعة ماريلاند، كوليدج بارك، الولايات المتحدة الأمريكية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 مليون بتوقيت شرق الولايات المتحدةبروميغاPR-V4231
مخزن HEPES بسعة 1 Mثيرموفيشر15630080لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية
رؤوس الماصة بسعة 1000 ميكرولترألكالي ساينتيفك FT1000104027-530
10 مرات PBSإنفيتروجينAM9624لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية
1N هيدروكسيد الصوديومالترموSS266-1لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية
1x HBSSثيرموفيشر14025092
1X PBSهايكلونSH30256FS
4٪ بارافورمالديهيد (PFA)ثيرموفيشرAAJ61899AK
أنابيب مخروطية بحجم 50 ملثيرموفيشر12-565-271
6 ألواح بئرفيشربراندFB012927
محلول بيكربونات الصوديوم بنسبة 7.5٪كورنينغMT25035CIلتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية
Advance DMEM/F12 Gibco 12634-010
أليكسا فلور زائد 647إنفيتروجينA32728الأجسام المضادة الثانوية
أليكسا بلس 555 - A32732 إنفيتروجينA32732الأجسام المضادة الثانوية
رقائق الألمنيومرينولدزhttps://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
مضاد للمعارضةجيبكو15240096
B27ثيرموفيشر12587010
BSAفيشربراندBP1600-100
CD81 Proteinintech66866-1-igالجسم المضاد الأولي
مياه بدرجة زراعة الخلاياهايكلونSH30529FSلتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية
الكولاجين، النوع الأولكورنينغ356236لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية
الكولاجيناز IVجيبكو17104019
طبق كورنينج بتري 100 ممكورنينغ07-202-011
وسائط حفظ الخلايا المجمدةتقنيات الخلايا الجذعية7930
التجميد للخلايا فيشربراند1050026
مخفف الأجسام المضادة داكوداكو/أجيلينترقم القطعة: S302283-2مخفف الأجسام المضادة الأولية
وسائط تركيب فلورية داكوداكو/أجيلينترقم القطعة: S302380-2
DAPIبروموسيل/VWR10180-470تلوين الحمض النووي
ديسباسي IIروش4942078001
DMEM، ارتفاع الجلوكوزكورنينغMT10013CV
DTTسيغما646563
EGFبيبروتيك315-09
FBS (هاي)أفانتور1300-500 ساعة
غاسترينأناسپيكAS-64149
جنتاميسينMP BiomedicalsICN1676045
غلوتا ماكسثيرموفيشر35050061
هيبسثيرموفيشر15630-080
ميكروسكروب فلورسنت مقلوبنيكونإكليبس Ti2التصوير الفلوريسنت
مجهر التباين الطور المقلوبنيكونإكليبس TS100لتصوير الخلايا المزروعة 
مجموعة iScript Advanced لتخليق cDNAبيو-راد1725038مجموعة RT-PCR
iTaq يونيفرسال SYBR Green Supermixبيو-راد1725122مجموعة qPCR
وسائط LWRN الشرطيةATCCCRL-3276تم إعداد وسائل الإعلام المحلية المحلية وفقا لإجراءات ATCC
ن-أسيتيل سيستينسيرة المؤلف السياسي194603
مطياف النانو دروب 2000ثيرموفيشرND 2000
نيكوتيناميدسيغماN0636-100G
ألواح بصرية ذات 384 بئر مع باركودأنظمة حيوية تطبيقية4483285مجموعة qPCR
PDGFRαأبكامAB230457الجسم المضاد الأولي
البروستاجلاندين E2 (PGE2)كيمان كيميكال  14010
كوانتستوديو 5النظام الحيوي التطبيقيA28570جهاز qPCR
SB202190مختبرات LCS-1700
المجهر الستيريونيكون  SMZ745
قارورة T 75فيشربراندFB012937
ترايتون X100فيشربراندPI85111
واشاف تريزول إنفيتروجين15596026
20 سنة، منظف غير أيوني 100٪بيو-رادي1706531
Y27632أبيكس بيوA3008-200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr. 8 (1), 265-276 (2022).
  3. Pastula, A., Marcinkiewicz, J. Cellular interactions in the intestinal stem cell niche. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 67 (1), 19-26 (2019).
  4. Mccarthy, N., Kraiczy, J., Shivdasani, R. A. Cellular and molecular architecture of the intestinal stem cell niche. Nat Cell Biol. 22 (9), 1033-1041 (2020).
  5. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 39-53 (2021).
  6. Pasztoi, M., Ohnmacht, C. Tissue niches formed by intestinal mesenchymal stromal cells in mucosal homeostasis and immunity. Int J Mol Sci. 23 (9), 5181(2022).
  7. Kraiczy, J., et al. Graded BMP signaling within intestinal crypt architecture directs self-organization of the Wnt-secreting stem cell niche. Cell Stem Cell. 30 (4), 433-449 (2023).
  8. Niec, R. E., et al. Lymphatics act as a signaling hub to regulate intestinal stem cell activity. Cell Stem Cell. 29 (7), 1067-1082 (2022).
  9. Paerregaard, S. I., et al. The small and large intestine contain related mesenchymal subsets that derive from embryonic gli1(+) precursors. Nat Commun. 14 (1), 2307(2023).
  10. Maimets, M., et al. Mesenchymal-epithelial crosstalk shapes intestinal regionalisation via Wnt and Shh signalling. Nat Commun. 13 (1), 715(2022).
  11. Ayansola, H., Mayorga, E. J., Jin, Y. Subepithelial stromal cells: Their roles and interactions with intestinal epithelial cells during gut mucosal homeostasis and regeneration. Biomedicines. 12 (3), 668(2024).
  12. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  13. Xia, X., et al. Mesenchymal stem cells promote healing of nonsteroidal anti-inflammatory drug-related peptic ulcer through paracrine actions in pigs. Sci Transl Med. 11 (516), eaat7455(2019).
  14. Zhang, W., et al. Dietary calcium and phosphorus amounts affect development and tissue-specific stem cell characteristics in neonatal pigs. J Nutr. 150 (5), 1086-1092 (2020).
  15. Zhou, J. Y., et al. Zinc l-aspartate enhances intestinal stem cell activity to protect the integrity of the intestinal mucosa against deoxynivalenol through activation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Environ Pollut. 262, 114290(2020).
  16. Yang, S., et al. Organoids: The current status and biomedical applications. MedComm (2020). 4 (3), e274(2023).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  18. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: The future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
  19. Nieuwenhuis, T. O., et al. Patterns of unwanted biological and technical expression variation among 49 human tissues. Lab Invest. 104 (6), 102069(2024).
  20. Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: A method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells Int. 2016, 3710836(2016).
  21. Kraski, A., et al. Structured multicellular intestinal spheroids (SMIS) as a standardized model for infection biology. Gut Pathog. 16 (1), 47(2024).
  22. Darling, N. J., Mobbs, C. L., Gonzalez-Hau, A. L., Freer, M., Przyborski, S. Bioengineering novel in vitro co-culture models that represent the human intestinal mucosa with improved Caco-2 structure and barrier function. Front Bioeng Biotechnol. 8, 992(2020).
  23. Freer, M., Cooper, J., Goncalves, K., Przyborski, S. Bioengineering the human intestinal mucosa and the importance of stromal support for pharmacological evaluation in vitro. Cells. 13 (22), 1859(2024).
  24. Meran, L., Tullie, L., Eaton, S., De Coppi, P., Li, V. S. W. Bioengineering human intestinal mucosal grafts using patient-derived organoids, fibroblasts and scaffolds. Nat Protoc. 18 (1), 108-135 (2023).
  25. Burrin, D., et al. Translational advances in pediatric nutrition and gastroenterology: New insights from pig models. Annu Rev Anim Biosci. 8, 321-354 (2020).
  26. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), eabd5758(2021).
  27. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C794-C805 (2021).
  28. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
  29. Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia. J Vis Exp. (135), e57647(2018).
  30. Meran, L., Baulies, A., Li, V. S. W. Intestinal stem cell niche: The extracellular matrix and cellular components. Stem Cells Int. 2017, 7970385(2017).
  31. Mahe, M. M., et al. Establishment of gastrointestinal epithelial organoids. Curr Protoc Mouse Biol. 3 (4), 217-240 (2013).
  32. Koliaraki, V., Kollias, G. Isolation of intestinal mesenchymal cells from adult mice. Bio-Protocol. 6 (18), 1940(2016).
  33. Chang, C. W., et al. Mesenchymal stem cell seeding of porcine small intestinal submucosal extracellular matrix for cardiovascular applications. PLoS One. 11 (4), e0153412(2016).
  34. Chen, J., et al. Human intestinal organoid-derived PDGFRα+ mesenchymal stroma enables the proliferation and maintenance of Lgr4+ epithelial stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 16(2024).
  35. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33(2021).
  36. Wiarda, J. E., Becker, S. R., Sivasankaran, S. K., Loving, C. L. Regional epithelial cell diversity in the small intestine of pigs. J Anim Sci. 101, skac318(2023).
  37. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore etec-host interactions in the gut. Vet Res. 52 (1), 94(2021).
  38. Wiarda, J. E., Trachsel, J. M., Sivasankaran, S. K., Tuggle, C. K., Loving, C. L. Intestinal single-cell atlas reveals novel lymphocytes in pigs with similarities to human cells. Life Sci Alliance. 5 (10), e202201442(2022).
  39. Uniken Venema, W. T. C., et al. Gut mucosa dissociation protocols influence cell type proportions and single-cell gene expression levels. Sci Rep. 12 (1), 9897(2022).
  40. Schaaf, C. R., et al. A lgr5 reporter pig model closely resembles human intestine for improved study of stem cells in disease. FASEB J. 37 (6), e22975(2023).
  41. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals (Basel). 12 (3), 372(2022).
  42. Gomez-Martinez, I., et al. A planar culture model of human absorptive enterocytes reveals metformin increases fatty acid oxidation and export. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 409-434 (2022).
  43. Jacob, J. M., et al. Pdgfralpha-induced stromal maturation is required to restrain postnatal intestinal epithelial stemness and promote defense mechanisms. Cell Stem Cell. 29 (5), 856-868 (2022).
  44. Modina, S. C., et al. Stages of gut development as a useful tool to prevent gut alterations in piglets. Animals (Basel). 11 (5), 1412(2021).
  45. Tang, W., et al. Ileum tissue single-cell mRNA sequencing elucidates the cellular architecture of pathophysiological changes associated with weaning in piglets. BMC Biol. 20 (1), 123(2022).
  46. Dong, X., et al. Identification of optimal reference genes for gene expression normalization in human osteosarcoma cell lines under proliferative conditions. Front Genet. 13, 989990(2022).
  47. Mccarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
  48. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
  49. Zhang, M., et al. Long-term expansion of porcine intestinal organoids serves as an in vitro model for swine enteric coronavirus infection. Front Microbiol. 13, 865336(2022).
  50. Benz, P., Plenge, M., Wagner, S., Mazzuoli-Weber, G. Two-dimensional porcine intestinal organoids reflecting the physiological properties of native gut. J Vis Exp. (215), e67666(2025).
  51. Lee, B. R., Ock, S. A., Park, M. R., Lee, M. G., Byun, S. J. Establishing porcine jejunum-derived intestinal organoids to study the function of intestinal epithelium as an alternative for animal testing. J Anim Reproduction Biotechnol. 39 (1), 2-11 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Crypt IsolationMesenchymal Stromal CellsPorcine Intestinal TissueSequential IsolationEDTA DTT DissociationCollagenase DigestionEnteroid MonolayersCollagen HydrogelStromal MarkersEpithelial Stromal Interactions
Video Coming Soon

Related Articles