توفر هذه الدراسة بروتوكولا تدريجيا للعزل التسلسلي للقبعات المعوية وخلايا البضيض الميزنشيمية المعوية (iMSCs) من نسيج الخنزير الجني. تولد الطريقة طبقات أحادية ثنائية الأبعاد من الأمعاء وiMSC مناسبة لتطوير نماذج قابلة للتكرار وذات صلة فسيولوجية لزراعة الظهارة والسترومال لدراسة التداخل الخلوي أثناء التوازن والتجدد في الأمعاء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل متسلسل ممثل للكريبتات وخلايا البسكوماتور الميزنشيمية من أنسجة الأمعاء الخنزيرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتفاعل ظهارة الأمعاء بشكل وثيق مع الخلايا البثوية المتوسطة المعوية الأساسية (iMSCs) لتنظيم التطور، والتوازن الداخلي، والتجدد. ومع ذلك، فإن الطرق الموحدة لعزل كل من الأجزاء الظهارية والسترومالية عن نسيج الخنزير بشكل متسلسل محدودة. يصف هذا البروتوكول عملية محسنة خطوة بخطوة لعزل الكريبتات وiMSCs من نفس المقطع الصغير من الخنازير. تستخدم الطريقة مخزن تفكك قائم على حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA/DTT) لإطلاق القفر، يليه هضم الكولاجناناز/ديسباس لمصفوفة خارج الخلية لعزل الخلايا العضلية العضلية. يقلل هذا النهج من التغيرات المكانية في الخلايا المعزولة. تم زراعة القنابل المعزولة بنجاح وشكلت طبقات أحادية معوية ثنائية الأبعاد متمدد نموذجية على صفائح مغطاة بالكولاجين الهيدروجيل. التزمت الخلايا الصلبة العضلية المستزرعة بقوارير الزراعة وأعربت عن علامات البلقاعة مثل مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα) وتجمع التمايز 81 (CD81)، كما تم تحديده بواسطة التلوين المناعي. بشكل عام، ينتج هذا البروتوكول المحسن للعزل خلايا ظهارية وخلايا سمكية من نفس مقطع الخضر الصغير، مما يوفر أساسا قابلا للتكرار للأبحاث المستقبلية التي تشمل عضويات الأمعاء وأنظمة الزراعة المشتركة للخنازير لتوضيح آليات التحكم في التفاعلات الظهارية والبتكية في الخنازير، وهو نموذج ذو صلة ترجمية لتكرار فسيولوجيا الإنسان وتقدم علوم.
المقدمة
الظهارة المعوية هي نسيج ديناميكي يخضع لتجديد ذاتي مستمر وتمايز للحفاظ على توازن الأمعاء وتسهيل التجدد بعد إصابات الغشاء المخاطي 1,2. تنشأ خلايا الظهارة المعوية من الخلايا الجذعية المعوية (ISCs)، وتتفاعل مع عوامل البيئة الدقيقة المختلفة 3,4,5,6,7,8. تتكون الأقسام تحت الظهارية، وخاصة الصفيحة العمودية والمخاطية العضلية، من مجموعات خلايا متنوعة من سلالات مختلفة9....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تشريح جزء بطول 5 سم من الجيجونوم القريب المستخرج من خنازير صغيرة تبلغ من العمر 21 يوما وكانت تقيم في منشأة تربية الخنازير بجامعة ماريلاند، كوليدج بارك. الإجراء (R-JUN-22-30) المستخدم للتضحية بالخنزير الصغير اتبع إرشادات سياسات رعاية واستخدام التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في الجامعة. قبل المضي قدما في خطوات العزل، يتم عرض مخطط البروتوكول في الشكل 1، وقائمة الكواشف والمعدات المستخدمة في العزل التسلسلي لقبوات الأمعاء الخنزيرية وiMSCs موجودة في جدول المواد.
1. مرحلة التحضير قبل العزل
- جهز 30 مل من حاجز الغسيل لكل جزء ن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أثناء تفكك الظهارة، يقوم حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) بتخلب أيونات الكالسيوم لتعطيل التصاقات الخلايا المعتمدة على الكالسيوم، بينما يقطع الديثيوثرايتول (DTT) روابط ثنائية الكبريتيد في بروتينات المخاط لتسهيل التحلل المخاطي. لذا، فإن الاستخدام المشترك لمركب مخلب (EDTA) وعامل اختزال (DTT) يتيح إطلاق القبو بشكل فعال من الغشاء الظلائي دون تعطيل بنية المصفوفة خارج الخلية (ECM) 2,32 (الشكل 3). تم إطلاق السراديب بنجاح من طبقة ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عزل القنابات المعوية وقطع العضلات الصلبة من نفس شريحة الجوهرية الخنزيرية يقدم نهجا جديدا للحفاظ على الخصائص الخلوية والوظيفية الخاصة بشريحة الأنسجة. وهذا أمر حاسم لأن أنسجة الأمعاء تظهر هويات إقليمية ومكانية، كما أظهرت الدراسات السابقة على الخنازير 2,36,37,38. الدراسات العضوية السابقة في الخنازير أو أنواع أخرى، والتي اعتمدت على القبو المعزولة من جزء واحد والأرو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يقدر المؤلفون الدعم المالي من برنامج المنح التنافسية MAES في جامعة ماريلاند، كوليدج بارك، الولايات المتحدة الأمريكية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.5 مليون بتوقيت شرق الولايات المتحدة | بروميغا | PR-V4231 | |
| مخزن HEPES بسعة 1 M | ثيرموفيشر | 15630080 | لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية |
| رؤوس الماصة بسعة 1000 ميكرولتر | ألكالي ساينتيفك FT1000 | 104027-530 | |
| 10 مرات PBS | إنفيتروجين | AM9624 | لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية |
| 1N هيدروكسيد الصوديوم | الترمو | SS266-1 | لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية |
| 1x HBSS | ثيرموفيشر | 14025092 | |
| 1X PBS | هايكلون | SH30256FS | |
| 4٪ بارافورمالديهيد (PFA) | ثيرموفيشر | AAJ61899AK | |
| أنابيب مخروطية بحجم 50 مل | ثيرموفيشر | 12-565-271 | |
| 6 ألواح بئر | فيشربراند | FB012927 | |
| محلول بيكربونات الصوديوم بنسبة 7.5٪ | كورنينغ | MT25035CI | لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية |
| Advance DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| أليكسا فلور زائد 647 | إنفيتروجين | A32728 | الأجسام المضادة الثانوية |
| أليكسا بلس 555 - A32732 | إنفيتروجين | A32732 | الأجسام المضادة الثانوية |
| رقائق الألمنيوم | رينولدز | https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1 | |
| مضاد للمعارضة | جيبكو | 15240096 | |
| B27 | ثيرموفيشر | 12587010 | |
| BSA | فيشربراند | BP1600-100 | |
| CD81 | Proteinintech | 66866-1-ig | الجسم المضاد الأولي |
| مياه بدرجة زراعة الخلايا | هايكلون | SH30529FS | لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية |
| الكولاجين، النوع الأول | كورنينغ | 356236 | لتحضير ألواح الكولاجين الهيدروجيلية |
| الكولاجيناز IV | جيبكو | 17104019 | |
| طبق كورنينج بتري 100 مم | كورنينغ | 07-202-011 | |
| وسائط حفظ الخلايا المجمدة | تقنيات الخلايا الجذعية | 7930 | |
| التجميد للخلايا | فيشربراند | 1050026 | |
| مخفف الأجسام المضادة داكو | داكو/أجيلينت | رقم القطعة: S302283-2 | مخفف الأجسام المضادة الأولية |
| وسائط تركيب فلورية داكو | داكو/أجيلينت | رقم القطعة: S302380-2 | |
| DAPI | بروموسيل/VWR | 10180-470 | تلوين الحمض النووي |
| ديسباسي II | روش | 4942078001 | |
| DMEM، ارتفاع الجلوكوز | كورنينغ | MT10013CV | |
| DTT | سيغما | 646563 | |
| EGF | بيبروتيك | 315-09 | |
| FBS (هاي) | أفانتور | 1300-500 ساعة | |
| غاسترين | أناسپيك | AS-64149 | |
| جنتاميسين | MP Biomedicals | ICN1676045 | |
| غلوتا ماكس | ثيرموفيشر | 35050061 | |
| هيبس | ثيرموفيشر | 15630-080 | |
| ميكروسكروب فلورسنت مقلوب | نيكون | إكليبس Ti2 | التصوير الفلوريسنت |
| مجهر التباين الطور المقلوب | نيكون | إكليبس TS100 | لتصوير الخلايا المزروعة |
| مجموعة iScript Advanced لتخليق cDNA | بيو-راد | 1725038 | مجموعة RT-PCR |
| iTaq يونيفرسال SYBR Green Supermix | بيو-راد | 1725122 | مجموعة qPCR |
| وسائط LWRN الشرطية | ATCC | CRL-3276 | تم إعداد وسائل الإعلام المحلية المحلية وفقا لإجراءات ATCC |
| ن-أسيتيل سيستين | سيرة المؤلف السياسي | 194603 | |
| مطياف النانو دروب 2000 | ثيرموفيشر | ND 2000 | |
| نيكوتيناميد | سيغما | N0636-100G | |
| ألواح بصرية ذات 384 بئر مع باركود | أنظمة حيوية تطبيقية | 4483285 | مجموعة qPCR |
| PDGFRα | أبكام | AB230457 | الجسم المضاد الأولي |
| البروستاجلاندين E2 (PGE2) | كيمان كيميكال | 14010 | |
| كوانتستوديو 5 | النظام الحيوي التطبيقي | A28570 | جهاز qPCR |
| SB202190 | مختبرات LC | S-1700 | |
| المجهر الستيريو | نيكون | SMZ745 | |
| قارورة T 75 | فيشربراند | FB012937 | |
| ترايتون X100 | فيشربراند | PI85111 | |
| واشاف تريزول | إنفيتروجين | 15596026 | |
| 20 سنة، منظف غير أيوني 100٪ | بيو-رادي | 1706531 | |
| Y27632 | أبيكس بيو | A3008-200 |
المراجع
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
- Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
