يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

صبغة مناعة كاملة لمبايض الفئران الجنينية وحديثة الولادة

293 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69455

⸱

أبريل 28, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة لوضع العلامات المناعية الكاملة لمبايض الفئران النامية، مع تطبيقات على أنسجة صغيرة أخرى.

الملخص

يتكون الاحتياطي المبيض من البويضات المتاحة للإنثى للتكاثر، وتوجد في بصيلات أولية، كل منها يحتوي على بويضة واحدة محاطة بعدة خلايا حبيبية. تبدأ البويضات كخلايا جرثومية بدائية تتشكل خارج الغدد التناسلية وتهاجر إلى المبيض النامي أثناء تطور الجنين. بمجرد وصولهم إلى المبيض، يتحول إلى أوجونيا وينقسمون عن طريق الانقسام الخلوي، مع حركة سيتوكينيس غير مكتملة، مكونة مجموعات من الخلايا المترابطة تسمى أكياس الخلايا الجرثومية. أثناء وجودها في الأكياس، تدخل الخلايا في الانقسام المختزل وتتحول إلى بويضات. في الفأر، قبل يومين من الولادة، تبدأ الأكياس في التفكك، ويتم تعبئة كل بويضة في جريبة بدائية. تبقى بعض البويضات فقط خلال هذه العملية، والباقي يخضع لموت الخلايا المبرمجة. تنظيم تحلل الأكياس وتكوين الجريبات الأولية مفهوم جزئيا فقط، وتحديد الجزيئات المشاركة أمر حاسم لفهم هذه العملية. يمكن استخدام التلوين المناعي الكامل لمبايض الفئران النامية لتحديد موقع الجزيئات التنظيمية المحتملة وتقييم التأثيرات على تكوين الجريبات البدائية الناتجة عن الطفرات أو التغيرات الجزيئية الأخرى باستخدام علامات البويضات والخلايا الجسدية. يتم جمع المبايض من فئران جنينية أو حديثة الولادة، وتثبيتها في الفورمالديهايد، ويتم حجبها. ثم تتعرض المبايض للأجسام المضادة ضد بروتين مهم، تليها أجسام مضادة ثانوية مرتبطة بعلامة فلورية تكشف الأجسام المضادة الأولية. وأخيرا، يتم تركيب المبايض وفحصها بواسطة المجهر الكونفوكلي. يمكن لهذا الإجراء اكتشاف عدة بروتينات محل اهتمام ويمكن تطبيقه على أنسجة صغيرة أخرى، مثل خصيتي الفئران الجنينية.

المقدمة

يعد التلوين المناعي الكامل مع التصوير الكونفوكلي طريقة قوية لتحليل تعبير البروتين وشكل الخلايا في الأنسجة الصغيرة دون تقسيم1. في هذه الطريقة، يتم أولا جمع الأنسجة، وتثبيتها، وحصرها، ثم تعرضها للأجسام المضادة ضد البروتينات المعنية. يتم ربط الأجسام المضادة مباشرة بالفلوروفورات أو تليها وسم بأجسام مضادة ثانوية مرتبطة بالفلوروفورات التي تتعرف على الأجسام المضادة الأولية. ثم يحتضن النسيج بصبغة فلورية 4',6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI) لرؤية نوى الخلية. هذه الخطوة مهمة لتوفير التوجيه المكاني عند تصوير الأنسجة. وأخيرا، يتم تركيب النسيج ورؤيته بواسطة المجهر الكونفوكلي. تقنية أخرى استخدمت لدراسة شكل الأنسجة تشمل تضمين النسيج في البارافين، والتقسيم، ووضع العلامات بأصباغ مثل الهيماتوكسيلين والإيوزين أو باستخدام الأجسام المضادة. بدلا من ذلك، يمكن تحضير الأقسام المجمدة وصبغها بمناعة. للأسف، هاتان التقنيتان تتضمنان التقسيم، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات ثلاثية الأبعاد. بينما يمكن أن تساعد الأقسام التسلسلية، إلا أن التحليل ممل ويتطلب مشاهدة عدد كبير من الأقسام. لذا، فإن طريقة التثبيت الكاملة مفيدة لأنها تحافظ على البنية ثلاثية الأبعاد للأنسجة التي يمكن رؤيتها باستخدام التقسيم البصري.

تطور الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) إلى بويضات وتجميع البويضات إلى جريبات بدائية أمر ضروري لخصوبة الإناث. تتكون الخلايا الجزيئية الجزئية خارج الأجنة ويجب أن تهاجر إلى المبيض أثناء تطور الجنين. بمجرد وصول PGCs إلى المبيض، بدءا من حوالي يوم الجنين (E) 10.5 في الفأر، يتم تصنيفها كأوجونيا2. تخضع الأوجونيا للانقسام الانقسامي ولكن مع حركة سيتوكينيس غير مكتملة، مكونة عناقودا مترابطة من الخلايا تسمى أكياس الخلايا الجرثومية3. تدخل الأوجونيا في الانقسام الاختزالي بدءا من E 13.5 لتصبح بويضات وتتقدم عبر المرحلة الأولى إلى مرحلة الديبلوتين. مع تطور البويضات، تتفكك الأكياس، مما يسمح لكل بويضة بأن تحيط بطبقة من خلايا الحبيبات، مكونة بصيلات بدائية تحتوي كل منها على بويضة محبوسة بديبلوتين4. هناك فقدان كبير لعدد كبير من البويضات يتزامن مع تحلل الأكياس، ويعتقد أن هذا مهم لمراقبة الجودة أثناء تكوين الجريبات الأولية. يشكل عدد البويضات المتقطعة بالديبلوتين في الجريبات الأولية الاحتياطي المبيض من البويضات المتاحة للتكاثر، ويرتبط مباشرة بالخصوبة. إذا تم تعطيل تكوين الجريبات، فقد يؤدي ذلك إلى تقليل احتياطي المبيض، مما يحد من عمر الإناث التناسلية.

تم استخدام التلوين المناعي الكامل لتحديد وتحليل تعبير البروتينات خلال تطور البويضات الجنينية والجنينية وحديثي الولادة. تشمل الجزيئات التي تم فحصها MSY2، SYCP3، ESR1، ESR2، CYP19A1، 3βHSD، KIT، وSTAT3 5,6,7,8,9. وقد استخدمت هذه التقنية أيضا بشكل واسع لكشف كيفية تنظيم تكوين الجريبات الأولية. تم زراعة المبايض الجنينية أو حديثي الولادة وتعرضها لجزيئات أو مثبطات الإشارة. تخضع البويضات في المبايض المزروعة لتكون جريبات بدائية مشابهة لما هو موجود في الجسم الحي. تم استخدام زراعة المبيض بنجاح لفحص هرمون الستيرويد6، 10، 11، KIT8، وPI3K الذي يشير إلى12 خلال هذه المرحلة من تطور المبيض. بعد الزراعة، يستخدم تلطيخ المناعة بالكامل باستخدام الأجسام المضادة ضد هيليكاز 4 الميت (DDX4، المعروف أيضا باسم هولولوج فازا الفأر (MVH))، وهو بروتين يعبر عنه في سيتوبلازم البويضات. ثم يتم فحص المبايض بواسطة المجهر الكونفوكالي لتقييم تكوين الجريبات الأولية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات باستخدام الفئران والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة سيراكيوز (IACUC). البروتوكول التالي مخصص لوضع علامات على مبايض الفئران الوليدية في الأيام بعد الولادة من 1 إلى 5 (انظر الشكل 1 للتخطيط). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. حصاد وتثبيت المبايض

  1. قم بقتل الفئران الوليدية C57BL/6 وفقا لدليل "رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" والبروتوكولات المعتمدة من IACUC للمؤسسات الوطنية للصحة. قم بتشريح المبايض في محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS).
    ملاحظة: في هذا الإجراء، تم إعدام الفئران حديثة الولادة عن طريق قطع الرأس كما هو معتمد في بروتوكول الحيوانات الخاص ب IACUC الخاص بنا. يمكن تمييز الذكور والإناث من سلالة الفئران C57BL/6 في المواليد بوجود بقعة داكنة صغيرة بين فتحات الشرج التناسلي عند الذكور. لتشريح المبايض، اقطع أولا المعدة وانزع الأمعاء. ثم افتح البطن بشق منتصف في الذيل، ثم قم بجرحين أفقيين. حدد موقع المبايض تحت كل كلية، وعزل كل مبيض، ونظف الأنسجة الزائدة.
  2. ضع المبايض مباشرة في 600 ميكرولتر 5.3٪ بارافورمالديهايد (PFA؛ 16٪ PFA درجة EM مخففة ب 1x PBS) (ثابت) في أنبوب ميكروفوج عند درجة حرارة الغرفة (RT). حضن المبايض في التثبيت على جهاز نوتاتور (O/N) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    تحذير: البارافورمالديهايد سام. استخدمها في غطاء بخار أو منطقة جيدة التهوية. ارتد قفازات، واقيات للعين، وملابس واقية لمنع التواصل مع الجلد والعين. التخلص منها كنفايات خطرة.
  3. أزل المبايض الثابتة واغسله مرتين في 1 مل ب 0.1٪ ترايتون X-100 في 1x PBS (PTS) بسرعة، ثم مرة كل 1 مل PT على نوتاتور لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في RT. احتضن 1 مل PT + 5٪ BSA (بلوك) لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في RT على نوتاتور أو خزن على 4 °C لمدة تصل إلى أسبوعين.

2. الحضانة باستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية

  1. حضانة الجسم المضاد الأولي المخفف بمقدار 500 ميكرولتر PT + 5٪ BSA O/N عند 4 °C على نوتاتور. اغسل ثلاث مرات ب 1 مل PT + 1٪ BSA، 30 دقيقة عند RT على نوتاتور.
    ملاحظة: التخفيف يعتمد على الجسم المضاد. البيانات الممثلة المعروضة هنا موسومة ب DDX4 مخفف بنسبة 1:200. يمكن استخدام الأجسام المضادة ضد بروتينين مختلفين في نفس الوقت طالما أن الأجسام المضادة الأولية مصنوعة من نوعين مختلفين وأحد الثانوي لا يصنع في النوع الذي يتعرف عليه الآخر الثانوي (لا تستخدم مضاد الفأر للماعز أليكسا 488 ومضاد الماعز-أليكسا 568).
  2. أثناء حضانة المبايض بالأجسام المضادة الأولية، يتم حضن الأجسام المضادة الثانوية المخففة مع رشة من مسحوق الجنين في 500 ميكرولتر PT + 5٪ BSA O/N عند 4 درجات مئوية على النوتاتور (مغطى بورق الألمنيوم) لتقليل الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الثانوية. قم بعمل الطرد المركزي للأجسام المضادة الثانوية بمقدار 6000 × جرام لمدة 30 ثانية لجمع مسحوق البقايا في الأسفل. تأكد من عدم سحب هذه البقايا عند نقلها إلى أنبوب العينة.
    ملاحظة: التخفيف يعتمد على الجسم المضاد. البيانات الممثلة المعروضة هنا موسومة بأليكسا 488 المضادة للأرانب الماعز مخففة 1:200.
  3. حضانة الجسم المضاد الثانوي الفلوري الممتص مسبقا (مصنوع في الخطوة 2.2) لمدة 2–4 ساعات في RT على جهاز نوتاتور. غط بورق الألمنيوم من هذه النقطة فصاعدا. اغسل ثلاث مرات ب 1 مل PT + 1٪ BSA، لمدة 30 دقيقة على RT على جهاز Nutor.

3. وضع علامات على النوى باستخدام DAPI وتركيب المبايض على شريحة

  1. حضن في DAPI 1:1000 في PBS لمدة 90 دقيقة عند RT. اغسله مرة واحدة ب 1 مل و1x PBS.
  2. نقل المبايض إلى شريحة مجهر باستخدام طرف ميكروبايبت عريض بسعة 200 ميكرولتر. قم بإزالة الفائض من PBS باستخدام الإبرة أو الحقنة. أضف 3 قطرات من وسائط التثبيت على المبايض.
  3. ضعي غطاء غطاء بلطف فوق المبايض، لضمان انتشار وسط التثبيت إلى حواف المبيض. أغلق حواف غطاء الأظافر بطلاء الأظافر واترك طلاء الأظافر يجف، ثم خزن عند -20 درجة مئوية.

4. تحضير مسحوق الأجنة

  1. توحيد ~ E 12.5–E 14.5 أجنة الفئران في حجم أدنى من 1x PBS بارد جدا. أضف 4 مجلدات من الأسيتون البارد جدا، اخلط، وحضن الثلج لمدة 30 دقيقة.
    تحذير: الأسيتون قابل للاشتعال ويهيج العين والجلد. استخدمها في غطاء بخار أو منطقة جيدة التهوية. ارتد قفازات، واقيات للعين، وملابس واقية لمنع التواصل مع الجلد والعين. التخلص منها كنفايات خطرة.
  2. استخدم الطرد المركزي على حرارة 10,000 × جرام لمدة 10 دقائق، ثم أزل السوبرناتانت، ثم اغسل الحبيبة بالأسيتون البارد المثلج وادبر مرة أخرى.
  3. افرد الحبيبة على ورقة فلتر، وضعها في صينية بلاستيكية، واترك الخليط يجف في غطاء كيميائي. اطحنها إلى مسحوق ناعم، واتركها تجف في الهواء تماما، وخزنها عند -20 درجة مئوية.

5. تحليل تعبير البروتين باستخدام المجهر الكونفوكالي

  1. بعد وضع علامات على البروتين المعني، يمكنك تصوره بالمجهر الكونفوكلي. لفحص تعبير البروتين، نستخدم عادة 3–4 حيوانات (6–8 مبايض) ونلتقط عدة صور لكل مبيض.
    ملاحظة: الصور الموصوفة في قسم النتائج الممثلة تم الحصول عليها إما على مجهر كونفوكالي قرصي دوار أو مجهر ليزر ماسح كونفوكالي. يتم وصف المعاملات المستخدمة في قسم النتائج التمثيلية وستختلف حسب المجهر المستخدم.

6. تحليل تكوين وتطور الجريبات البدائية باستخدام المجهر الكونفوكالي

  1. بعد وضع علامة على المبايض لعلامة بويضية سيتوبلازمية مثل DDX4، لكل مبيض، قم بتخصيص منطقتين أو "نواتين" عشوائيا للتصور.
    ملاحظة: يتكون النواة من 4 أقسام بصرية رئيسية بأبعاد 212 × 212 ميكرومتر، ويفصل بينهما عمق يتراوح بين 15–20 ميكرومتر. تمتد الأقسام البصرية الأربعة على كل من القشرة والنخاع لضمان تقييم جميع مناطق المبيض. لكل مبيض، سيكون هناك نواتان مع 4 أقسام بصرية ليصبح المجموع 8 أقسام (انظر الشكل 2).
  2. بعد تصوير المقطع البصري الرئيسي للتحليل، التقط مجموعة Z من 5 صور فوق و5 صور أسفل القسم الرئيسي، كل منها بفارق 1 ميكرومتر. لكل قسم رئيسي، احسب العدد الإجمالي للبويضات في القسم
  3. ثم، لكل بويضة في القسم الرئيسي، تحدد ما إذا كانت مرتبطة ببويضة أخرى أم لا من خلال فحص القسم الرئيسي وكذلك كومة الأقسام لتحديد ما إذا كانت البويضات في المقطع الرئيسي مرتبطة بالبويضات فوق أو تحت مستوى التركيز. وأخيرا، لكل بويضة، حدد المرحلة التي هي في تطور الجريبات (بدائية، أولية، أو ثانوية).
    ملاحظة: يوصى بتحليل ما لا يقل عن 4 حيوانات (8 مبايض) للحصول على بيانات ذات دلالة إحصائية.

7. استخدام يوديد البروبيديوم كمؤشر نووي بديل

  1. بعد الخطوة 2.3، حضن لمدة 30 دقيقة في 0.1 ملغ/مل RNase A (10 ميكرولتر من 10 ملغ/مل في 1 مل من PT + 1٪ BSA). قم بإزالة RNase A وحضنه في يوديد بروبيديوم 10 ميكروغرام/مل (10 ميكرولتر من 1 ملغ/مل في 1 مل PT + 1٪ BSA) لمدة 20 دقيقة عند RT على جهاز نوتاتور. غط الأنبوب بورق الألمنيوم من هذه النقطة فصاعدا.
    تحذير: يوديد البروبيديوم سام ومسبب للطفرات. استخدمها في غطاء بخار أو منطقة جيدة التهوية. ارتد قفازات، واقيات للعين، وملابس واقية لمنع التواصل مع الجلد والعين. التخلص منها كنفايات خطرة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام توتو-3 كعلامة نووية.
  2. أزل يوديد البروبيديوم واغسل لمدة 30 دقيقة في 1 مل PT + 1٪ BSA. تخطي الخطوة 3.1 (تلوين DAPI).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تعرض النتائج النموذجية لطريقة التلوين المناعي الموضحة هنا. تم التقاط الصور في الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5، والشكل 6 على مجهر كونفوكال قرصي دوار باستخدام هدف زيت 40x، NA 1.3، مع وقت تعريض بين 100–250 مللي ثانية وقوة ليزر بين 0.01 و0.1٪. في الشكل 3، يتم تمييز مبايض الفئران حديثي الولادة بأجسام مضادة ضد DDX4، وهو بروتين يعبر عنه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا التقرير طريقة لوضع علامات فلورية على المبايض الكاملة بحثا عن البروتينات ذات الاهتمام. تم استخدام هذا الإجراء على نطاق واسع لتحديد تعبير البروتينات أثناء تكوين الجريبات الأولية وأيضا لتوصيف التغيرات في تكوين الجريبات تحت ظروف مختلفة 4,5,6,7,8,9,10,11....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم إجراء التصوير في مركز بلات للتصوير بجامعة سيراكيوز. تم الحصول على الصور في الشكل 7 من جهاز Zeiss LSM980 مع دعم Airyscan2 من قبل NIH S10 OD026946-01A1. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح R03 HD102016 وR21 HD112756 من المعاهد الوطنية للصحة (إلى البرلمان الأوروبي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فاسا مضاد للبشر (مصنوع في الماعز)R& DAF2030
مضاد DDX4/MVH (مصنوع في أرنب)أبكامab13840
مضاد ل-GCNA1/TRA98 (صنع في الفئران)أبكامAB82527
مصل البقر الألبومين (BSA)فيشرBP-1600
انزلاقات الغلاف 22 × 22 #1.5وارنر إنسترومنتس64-0721
DAPI (مسحوق)سيغما ألدريتشD-9542حضر محلول 5 ملغ/مل في dH2O
نطاق التشريح
حمار مضاد للماعز أليكسا 568إنفيتروجينA11057
أليكسا 488 مضاد للفأر الحمارإنفيتروجينA21202
أليكسا 568 ضد الأرنب الحمارإنفيتروجينA10042
أليكسا 647 المضادة للأرانب الحمارإنفيتروجينA31573
حمار مضاد للفئران أليكسا 488إنفيتروجينA21208
الإيثانول 200 إثباتفارمكو111000200
مقص دقيق - حادأدوات العلوم الدقيقة14060-09للأعمال الدقيقة لإزالة المبيض وقص الأنسجة الزائدة
الملقط (ملقط دومونت، الأسلوب 5)علم المجهر الإلكتروني72705-01 (0209-5-PO)
أليكسا 488 ضد الأرنب الماعزإنفيتروجينA11008
أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملثيرمو ساينتفيك3451PK
شرائح المجهرفيشربراند12-550-123
خلاط النوتاتينجلاب نتS0500
بارافورمالديهايد 16٪علم المجهر الإلكتروني15710
أطباق بتيري 100 × 15 ممتصنيع البيوبلاست940-10774
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X(فيشر) S271-1؛                   (سيغما) P9541-500G؛ (فيشر) BP332-500؛ (فيشر) P285-500800 مل MQ H2O                            80 جرام NaCl                                        2.0 من KCl                                                14.4 جرام Na2HPO4                  2.4 جرام KH2PO4                  اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl؛ المجلد النهائي 1 L ثم يخفف من 10X إلى 1X للاستخدام
حامل الدبوسأدوات العلوم الدقيقة26016-12لتثبيت الإبرة بشكل مستقيم منحني قليلا
أطراف فلتر الماصنةون تيب(10uL) 1121-3810؛                           (20 ميكرولتر) 1120-1810؛                   (200 ميكرولتر) 1120-8810؛         (1000 ميكرو لتر XL) 1122-1830
أطراف البيبيتون تي بي(10 ميكرولتر) 1111-3800؛                   (200 ميكرولتر) 1111-1800؛         (1250 ميكرولتر) 1112-1820
البيبيتس 0.2-2، 2-20، 20-200، 100-1000جيلسون(0.1-2 uL) F144054M؛       (2-20 ميكرو) F144056M؛     (20-200 ميكرولتر) F144058M؛       (100-1000 ميكرولتر) F144059M
يوديد بروبيديوم، 1 ملغ/مل بدرجة dH2OإنفيتروجينP3566
مسحوق RNase Aسيغما ألدريتشRG513-50mgحضر محلول بسعة 10 ملغ/مل في أسيتات الصوديوم 0.1 ملجن (درجة الحموضة 5.2). سخن إلى 100 <مرع>0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تبرد إلى RT وضبط الرقم الهيدروجيني بإضافة حجم 0.1 متر Tris-Cl 1 M (pH 7.4)
ستريت نيدلإبرة مستقيمة منحنية لقطع الأنسجة الزائدة عن المبيض
ترايتون X-100ثيرمو ساينتفيكX100-100ML
حقنة توبركولين 28G × 1/2تايكو/الرعاية الصحية كيندال مونوجكت1180128012
فيكتاشيلدمتاهات المتجهاتH-1900
مقص فاغنرأدوات العلوم الدقيقة14068-12لقطع الرأس، والجروح الأكبر
رأس ماصة عريضة السبطانة 20 وحدةلابكون1026-965-008-9

المراجع

  1. Wong, F. C. K. Whole-mount immunofluorescence staining of early mouse embryos. Methods Mol Biol. 2214, 143-155 (2021).
  2. Monk, M., McLaren, A. X-chromosome activity in foetal germ cells of the mouse. J Embryol Exp Morphol. 63, 75-84 (1981).
  3. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125, 3323-3328 (1998).
  4. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Dev Biol. 234 (2), 339-351 (2001).
  5. Burks, D. M., et al. Molecular analysis of the effects of steroid hormones on mouse meiotic prophase I progression. Reprod Biol Endocrinol. 17 (1), 105(2019).
  6. Chen, Y., Breen, K., Pepling, M. E. Estrogen regulates oocyte cyst breakdown and primordial follicle assembly via multiple pathways in the neonatal mouse ovary. J Endocrinol. 202 (3), 407-417 (2009).
  7. Dutta, S., Mark-Kappeler, C. J., Hoyer, P. B., Pepling, M. E. The steroid hormone environment during primordial follicle formation in perinatal mouse ovaries. Biol Reprod. 91 (3), 68(2014).
  8. Jones, R. L., Pepling, M. E. Kit signaling regulates primordial follicle formation in the neonatal mouse ovary. Dev Biol. 382 (1), 186-197 (2013).
  9. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. E. Expression of STAT3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  10. Chen, Y., Jefferson, W. N., Newbold, R. R., Padilla-Banks, E., Pepling, M. E. Estradiol, progesterone, and genistein inhibit oocyte nest breakdown and primordial follicle assembly. Endocrinology. 148 (8), 3580-3590 (2007).
  11. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  12. Burton, J. J. N., Luke, A. J., Pepling, M. E. Regulation of mouse primordial follicle formation by PI3K signaling. Biol Reprod. 106 (3), 515-525 (2022).
  13. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: An update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  14. Pina, R., et al. Ten approaches that improve immunostaining: advances in immunofluorescence optimization. Int J Mol Sci. 23 (3), 1426(2022).
  15. Yau, C. N., et al. Principles of deep immunohistochemistry for 3D histology. Cell Rep Methods. 3 (5), 100458(2023).
  16. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , Springer-Verlag. (2010).
  17. Ino, H. Antigen retrieval by heating for double-label fluorescent immunohistochemistry with identical species-derived antibodies. J Histochem Cytochem. 52 (9), 1209-1217 (2004).
  18. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  19. Boateng, R., et al. Whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for 3D analysis of the ovarian reserve in mouse. J Vis Exp. (175), e62972(2021).
  20. Folts, L., et al. Oocount: A machine-learning-based approach to mouse ovarian follicle counting and classification. Biol Reprod. 113 (5), 1083-1101 (2025).
  21. Rinaldi, V. D., Bloom, J. C., Schimenti, J. C. Whole-mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries. J Vis Exp. (135), e57593(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الجريبات البدائيةكيسات الخلايا الجرثوميةعلامات الخلايا البيضيةعلامات الخلايا الجسديةالمجهر البؤريمبايض أجنة الفئرانتكوين الجريبات

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.