مقالة منهجية

تحديد الكتلة الحيوية الميكروبية في التربة باستخدام جهاز PCR الرقمي للقطرات (ddPCR)

DOI:

10.3791/69467

⸱

أبريل 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة طريقة سريعة ل ddPCR لقياس الكتلة الحيوية الميكروبية في التربة ونسب الفطريات إلى البكتيريا. على الرغم من أن الكربون الحيوي الميكروبي المستخرج من ddPCR يظهر ارتباطا ضعيفا فقط مع تقديرات التبخير الكلوروفورمي، إلا أن الطريقة توفر نهجا جزيئيا حساسا وقابلا للتوسع لتقييم وفرة الميكروبات دون أخذ عينات إضافية من التربة أو استخدام العينة القاسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل التربة أكبر مخزون بري من الكربون العضوي، ومع ذلك فقد أكثر من 133 جيجا طن من الكربون من التربة خلال القرنين الماضيين. يعد القياس الدقيق للكتلة الحيوية الميكروبية في التربة، وخاصة الفطريات والبكتيريا، وهي المحللات الأساسية التي تدفع دورة الكربون والمغذيات، أمرا ضروريا لفهم الوظائف البيئية وصحة التربة. تقتصر الأساليب التقليدية، بما في ذلك استخراج التبخير بالكلوروفورم وتحليل PLFA، بسبب متطلبات عينة عالية وعدم يقين مرتبط بتحويل العلامات الكيميائية الحيوية إلى تقديرات للكتلة الحيوية الميكروبية. هنا، نقدم سير عمل محسن لقياس وفرة البكتيريا والفطريات في التربة باستخدام PCR رقمي للقطرات (ddPCR) المستهدف جينات 16S و18S rRNA. تتيح الطريقة القياس المطلق لنسخ الجينات الميكروبية، والتحويل إلى أعداد الخلايا باستخدام عوامل تصحيح عدد نسخ الجينات، والتقدير اللاحق لكربون الكتلة الحيوية الميكروبية. طبقنا هذا البروتوكول على تربة من خمسة أنظمة زراعية موزعة عالميا تختلف في نسيج التربة واستخدام الأراضي ومحتوى المادة العضوية. تمت مقارنة التقديرات المشتقة من ddPCR مع تقديرات التبخير التقليدية للكربون الحيوي الميكروبي بالكلوروفورم. قدم ddPCR قياسا دقيقا بدقة عالية لكمية الميكروبات وأنتج تقديرات أوسع وأكثر حساسية لنسب F:B عبر أنواع التربة مقارنة بتسلسل الجينوم الكامل. على الرغم من أن MBC المستخرج من ddPCR أظهر ارتباطا ضعيفا فقط مع قيم التبخير الكلوروفورمي، إلا أن هذه الطريقة تقدم نهجا جزيئيا فعالا لتقييم الكتلة الحيوية الميكروبية والمؤشرات البيئية مثل نسبة F:B. يوفر هذا البروتوكول استراتيجية قابلة للتكرار والتوسع لدمج مقاييس وفرة الميكروبات مع التحليلات التركيبية لتطوير تقييم صحة التربة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد التربة أكبر مخزون كربون عضوي بري، حيث تحتفظ بكمية أكبر من الكربون النباتي والكربون الجوي مجتمعين1. فقد أكثر من 133 جيجا طن من الكربون من التربة خلال ال 200 عام الماضية، والجهود المستمرة لاستعادة وصيانة مخزونات الكربون في التربة ضرورية لصحة التربةالعالمية 2. نظرا للقدرة الهائلة على تخزين الكربون في التربة، فإن تحديد المساهمين الرئيسيين لهذه المخزونات الكربونية بدقة أمر بالغ الأهمية3. تلعب الميكروبات دورا أساسيا في دورة المغذيات داخل التربة، وتمثل الكتلة الحيوية الميكروبية مكونا مهما من الكربون العضوي للتربة. الفطريات والبكتيريا هي المحللتان الرئيسيتان في بيئات التربة وهما أساسيتان في الدورات البيوجيوكيميائية لهذه النظم البيئية 4,5. في التربة التي تهيمن عليها البكتيريا، يكون تحلل المادة العضوية وتمعدن العناصر الغذائية أسرع بكثير من التربة التي تهيمن عليهاالفطريات 5. نسبة الفطريات إلى البكتيريا (F:B) تستخدم بشكل متزايد كمؤشر على صحة التربة 6,7؛ لذلك، فإن التقييم الدقيق لكل من الفطريات والبكتيريا أمر بالغ الأهمية.

غالبا ما تعتمد تقديرات الكتلة الحيوية الميكروبية في التربة على علاجات كيميائية مزعزعة، مثل تبخير الكلوروفورم8. تستهدف طرق أخرى بشكل انتقائي المجتمع الميكروبي النشط من خلال تقنيات مثل التنفس الناجم عن الركيزة أو تحليل الأحماض الدهنية الفوسفوليبيدية (PLFA)9. تم استخدام تحليل PLFA على نطاق واسع لتقييم تركيب المجتمعات الميكروبية وتقدير نسبة F:B. ومع ذلك، فإن التباين الكبير في حجم الخلايا عبر أنواع الفطريات والبكتيريا المختلفة يخلق عدم اليقين عند تحويل تركيزات PLFA إلى نسب F:B قائمة على الكتلة الحيوية أو السكان، مما يجعل هذه التقديرات غير موثوقة10. يمكن استخدام طرق أخرى، مثل قياس تدفق السيلتومترية، لزيادة إنتاجية العينة لتحديد وفرة البكتيريا في التربة؛ ومع ذلك، قد تنخفض دقتها بسبب تشابه حجم وشكل وخصائص التألق الذاتي للجزيئات غير الميكروبية11. يتطلب التبخير بالكلوروفورم كمية كبيرة نسبيا من التربة (>10 جرام) لتقدير الكتلة الحيوية الميكروبية، في حين أن حجم عينة 500 ملغ من التربة كاف للطرق المعتمدة على الحمض النووي عند إجراء الاستخلاص باستخدام مجموعات تجارية. أظهرت مقارنة سابقة بين الطرق المعتمدة على الحمض النووي والتبخير الكلوروفورم أنه رغم قدرة كلا النهجين على تقدير الكتلة الحيوية الميكروبية، فإن استخدامهما معا قدم تقييما أكثر قوة للكتلة الحيوية الميكروبيةللتربة.

تقييمات المجتمعات الميكروبية هي مقياس غير مستغل بشكل كاف لصحة التربة وله القدرة على تحويل كيفية قياسنا وفهمنا للتربة. تستخدم طرق الترميز المغناطيسي تقليديا لتحديد مجتمع الميكروبات في التربة، حيث يتم تقييم الوفرة النسبية للبكتيريا من خلال تضخيم مناطق جين 16S rRNA، بينما تستهدف الأنواع الفطرية باستخدام جين 18S rRNA أو منطقة14 (ITS) المنسوخ الداخلي. قد تعتمد طرق الترميز المغناطيسي للفطريات على مناطق مستهدفة جينومية مختلفة، مما يؤثر على تنوع ووفرة أنواع الفطريات المحددة. قد يعزز طول ITS غير المتساوي بين أنواع الفطريات التضخيم والتتابع التفضيلي، وبالتالي تقدير خاطئ لوفرتها، مما يؤدي إلى تقييم خاطئ لمجتمعات الفطريات15. تم تطوير بادئات الفطريات لاستهداف مناطق متغيرة محددة داخل جين 18S rRNA تظهر تغطية شاملة للفطريات المتنوعة والخصوصية مقارنة بحقيقيات النواة الأخرى16.

معظم البكتيريا والفطريات لديها أكثر من نسخة واحدة من الجين المستهدف، مما يؤدي إلى تقديرات متحيزة لعدد الخلايا. علاوة على ذلك، غالبا ما تحتوي الفطريات على خلايا متعددة النوى بعدد متغير من النوى لكل خلية6. هناك تباين كبير في عدد نسخ جين rRNA داخل وبين المجموعات التصنيفية، عادة أقل من 15 نسخة في بدائيات النوى، ويقدر أن يتراوح بين 28 و511 للفطريات17. بسبب هذا التغير، تعتبر التقنيات الجزيئية المستخدمة لتحليل هياكل المجتمعات الميكروبية شبه كمية، لأنها قد تشوه تقدير الوفرة النسبية للأنواع في مجتمع18. يتم تحويل أعداد النسخ الجينية المقاسة (GCN) بشكل روتيني إلى وفرة الخلايا باستخدام متوسط GCN المقدر في المجموعة التصنيفيةالمعنية 18,19,20.

استخدمت بعض الدراسات أساليب الميتاجينومية، حيث تقدم عدة مزايا مقارنة بالميتاباركود، بما في ذلك القضاء على تحيز التضخيم والقدرة على فحص المجتمع الميكروبيبأكمله بشكل شامل. بالإضافة إلى ذلك، تتيح المقارنة المتزامنة بين تركيبات الفطريات والبكتيريا، بالإضافة إلى علاقاتها ببعضها البعض22. بشكل عام، يستخدم QPCR RT عادة للكشف عن المحتوى الميكروبي ووظيفته23. يعاني qPCR من قيود عند مقارنته ب PCR القطرات الرقمية (DDPCR) في القياس المطلق بسبب حساسيته للمثبطات، حيث يتطلب معياراخارجيا 24.

ddPCR هي تقنية رائدة تعتمد على تقسيم تفاعلات التضخيم الفردية إلى قطرات منفصلة. يتم تضخيم القالب لاحقا بواسطة PCR في كل قطرة كتفاعل منفصل. يتميز ddPCR بحساسية منخفضة للمثبطات الإنزيمية، ودقة وتكرار وحساسية واستقرار أفضل في الكمية البكتيرية والفطرية مقارنة ب qPCR25. علاوة على ذلك، فهي طريقة يمكن استخدامها للقياس المطلق للبكتيريا والفطريات في التربة5. نظرا لأن ddPCR يعتمد على نفس الحمض النووي المستخرج المستخدم لتقييم تحولات تركيب الميكروبات، يمكن ربط بيانات الوفرة من ddPCR مباشرة ببيانات تركيب المجتمع26 واستخدامها لقياس الكتلة الحيوية الميكروبية في التربة.

توفر هذه الدراسة منهجية لقياس الفطريات والبكتيريا في التربة باستخدام تقنية PCR الرقمية للقطرات (ddPCR). تم تطبيق هذه الطريقة المحسنة على تربة من خمسة مواقع واستخدامات أراضي عالمية مختلفة. تم اختيار مواقع العينات لتشمل طيفا واسعا من خصائص التربة والظروف البيئية وممارسات الإدارة، مما أتاح تقييم متانة وعمومية نهجنا عبر بيئات متنوعة. مكنت هذه البيانات من تحديد نسبة F:B كمؤشر حيوي جزيئي لجودة التربة البيئية. وأخيرا، أجريت مقارنة بين تقديرات الكتلة الحيوية الميكروبية بين بيانات ddPCR الميكروبي وطرق التبخير التقليدية بالكلوروفورم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

موضح مخطط عام لهذه البروتوكولات في الشكل 1. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. أخذ عينات التربة

  1. اجمع عينات من التربة السطحية المركبة (0–20 سم) من خمسة مواقع عالمية، مع ثلاث عينات من نقاط مختارة عشوائيا ضمن منطقة 25 مترا من كل موقع.
    ملاحظة: تم جمع جميع العينات من أنظمة زراعية تمثل استخدام الأراضي الإقليمي الذي تقع فيه. تم توصيف نسيج التربة باستخدام حيود الليزر، وتم قياسه بواسطة محلل حجم جسيمات الحيود بالليزر (الجدول 1). تم نقل العينات عند درجة الحرارة المحيطة وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى إجراء تحليلات إضافية.

2. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: قم باستخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج DNA من التربة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. كانت درجة حرارة الغرفة لجميع الخطوات 20 درجة مئوية.

  1. قم بتدوير أنبوب ضرب الخرز بسعة 2 مل لفترة وجيزة لضمان استقرار الخرزات في القاع. أضف 100 ملغ من التربة و800 ميكرولتر من محلول CD1. لف دوامة لفترة وجيزة للخلط.
  2. يتم توحيد العينات بشكل كامل باستخدام جهاز التجانس في مطحنة الخرز، مع تحليل العينات لمدة 40 ثانية عند 6 متر −1.
  3. الطرد المركزي هو أنبوب ضرب للخرز لتحليل الخلايا الميكانيكية بحرارة 15,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  4. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة 2 مل.
    ملاحظة: قد يحتوي الفائق الفائق على جزيئات التربة.
  5. أضف 200 ميكرولتر من محلول CD2 ودوامة لمدة 5 ثوان.
  6. الطرد المركزي بقوة 15,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  7. انقل حتى 700 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة 2 مل، متجنبا الكريات. يجب أن تكون الحبيبة مرئية.
  8. أضف 600 ميكرولتر من محلول CD3 ودوامة لمدة 5 ثوان.
  9. قم بتحميل 650 ميكرولتر من المادة على عمود دوران وجهاز طرد مركزي بقوة 15,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  10. تخلص من التدفق عبر الخطوة وكرر الخطوة 2.9 للتأكد من مرور كل الليستات عبر عمود الدوران.
  11. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع نظيف بسعة 2 مل.
  12. أضف 500 ميكرولتر من محلول EA إلى عمود الدوران. قم بتشغيل الطرد المركزي بقوة 15,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  13. تخلص من أنبوب التدفق ووضع عمود الدوران في نفس أنبوب الجمع بسعة 2 مل.
  14. أضف 500 ميكرولتر من محلول C5 إلى عمود الدوران الكهربائي. الطرد المركزي عند 15,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  15. تخلص من التدفق السريع وضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد بسعة 2 مل.
  16. الطرد المركزي عند ضغط يصل إلى 16,000 x g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
  17. ضع عمود الدوران في أنبوب إخلاء جديد بسعة 1.5 مل.
  18. أضف 50–100 ميكرولتر من محلول C6 إلى مركز غشاء المرشح الأبيض.
  19. الطرد المركزي عند 15,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من عمود الدوران واحتفظ بالمنبوبة عند -20 درجة مئوية.

3. قياس الحمض النووي المنقى

ملاحظة: تم قياس الحمض النووي النقي باستخدام جهاز قياس فلورومتر ومجموعة اختبار واسعة النطاق (BR) مزدوجة السلسلة (dsDNA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

  1. جهز حلا يعمل باستخدام نسبة 199:1 بين المخزن المؤقت والكاشف.
  2. أضف 10 ميكرولتر من كل معيار DNA إلى 190 ميكرولتر من محلول العمل.
  3. أضف 1–20 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى إلى 180–199 ميكرولتر من محلول العمل. يجب أن يكون الحجم النهائي 200 ميكرولتر. دوامة واحتضن عينات العينات القياسية والعينات النووية على درجة حرارة البيئة لمدة دقيقتين.
  4. حلل المعايير قبل عينات الحمض النووي على جهاز الفلورومتر باستخدام التعليمات الموجودة على الشاشة.

4. اختيار المقدمات

  1. لتحليل الكائنات الدقيقة في التربة، اختر بادئات محددة بناء على المراجع ذات الصلة. للبكتيريا، تم استخدام بادئات 16S rRNA25,27، وللفطريات، بادئات 18S rRNA16.
  2. قم بالتضخيم باستخدام مزيج رئيسي قائم على الصبغة في الوقت الحقيقي (qPCR) وجهاز تدوير حراري. تم توفير تسلسلات البرايمر في الجدول 2.

5. القياس الميكروبي باستخدام ddPCR

  1. إذابة الذوب والدوامة كلها كواشف على الجليد.
  2. قم بإعداد تفاعل ddPCR كما يلي: 0.1 ميكرولتر (10 ميكرومول) للأمام و0.1 ميكرولتر (10 ميكرومتر) عكسي 16S أو 18S، 10 ميكرولتر ddPCR إيفاجرين سوبرمكس، 0.5 نانوغرام قالب DNA X μL، باستخدام ماء خال من النوكلياز (NFW) لضبط حجم التفاعل النهائي إلى 22 ميكرولتر. إنشاء تحكم سلبي بإضافة NFW بدلا من القالب لكل عمود.
  3. ضع DG8 في حامل الخرطوشة.
  4. ضع ما مجموعه 20 ميكرولتر من خليط التفاعل في آبار العينة داخل الخرطوشة.
  5. أضف 70 ميكرولتر من زيت توليد القطرات لصالح إيفاجرين إلى الخرطوشة التي تحمل علامة 'زيت'.
  6. ضع الخرطوشة في مولد القطرات وغط الخرطوشة بحشية.
  7. نقل 40 ميكرولتر من القطرات الناتجة إلى صفيحة ب 96 بئر (نصف شريطية) لتضخيم PCR.
  8. أغلق صفيحة 96 بئر باستخدام مادة ختم الألواح (درجة الحرارة، 180 °م لمدة 5 ثوان).
  9. استخدم ظروف الدراجة التالية مع غطاء مدفأ مضبوط على 105 درجة مئوية.
    ملاحظة: (أ) البكتيريا: 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 40 دورة من؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 61 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، 10 دقائق عند 98 درجة مئوية. (ب) الفطريات: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 40 دورة من؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، و5 دقائق عند 90 درجة مئوية.
  10. انقل لوحة 96 بئر إلى قارئ اللوحة.
  11. قيم تركيز النسخ لكل بئر باستخدام نسخة QuantaSoft 1.2. ضبط عتبة السعة لفصل القطرات السالبة والموجبة.
  12. حساب عدد نسخ الجينات لكل نانوغرام من الحمض النووي في التفاعل عن طريق ضرب النسخ/μL في حجم التفاعل النهائي (20 ميكرولتر) وقسمته على إجمالي الحمض النووي القالي المدخل في التفاعل كما يلي: (نسخ μL-1 × حجم التفاعل) / إجمالي إدخال الحمض النووي في التفاعل.
  13. احسب إجمالي نسخ الجين لكل نانوغرام من الحمض النووي المستخرج عن طريق ضرب نسخ الجينات لكل نانوغرام في إجمالي الحمض النووي المستخرج (ng) كما يلي: (نسخ جينية لكل ng × إجمالي الحمض النووي المستخرج).
  14. احسب نسخ الجينات لكل جرام عن طريق قسمة إجمالي نسخ الجينات لكل نانوغرام من الحمض النووي المستخرج على كمية الوزن الجاف للتربة المعالجة في الاستخلاص (g)، كما يلي:
    نسخ الجين لكل غرام = (إجمالي نسخ الجينات لكل ناغرام من الحمض النووي المستخرج / جرام الوزن الجاف للتربة (GDW) من التربة المعالجة أثناء الاستخلاص).
  15. احسب عدد الخلايا لكل gdw عن طريق تحويل نسخ الجينات باستخدام متوسط عدد نسخ الجين (GCN) وفقا للمعادلة:
    عدد الخلايا = نسخ الجين لكل غرام / متوسط نسخ الجين الخلية-1).
  16. حول أرقام الخلايا إلى كربون كتلة حيوية ميكروبية (MBC) باستخدام المعادلة التالية:
    MBC ل 16S (ملغ C، g-1 تربة) = خلايا gdw-1 × (100 fg خلية-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    MBC ل 18S (mg C، g-1 تربة) = خلايا gdw-1 × (6 fg خلية-1) × 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    يتم شرح العملية الكاملة في الشكل 2.
    ملاحظة: تم حساب متوسط نسخة جين 16S rRNA (المتوسط ± SD) ل 46 فيلا بكتيريا20 واستخدامه كعامل تصحيح للبكتيريا، بقيمة نهائية تبلغ 2.48. أما بالنسبة للفطريات، فقد تم حساب عدد نسخ الجين بعامل تصحيح 113 وفقا للوفغرين وآخرون 17. تم تقدير كربون الكتلة الحيوية الميكروبية (MBC) من أعداد الخلايا المشتقة من ddPCR، باستخدام محتوى كربون خلوي مفترض 100 fg لكل خلية بكتيرية28، و6 بيغار لكل خلية فطرية29.

6. التحليل الجزيئي للتربة من تسلسل الجينوم الكامل

  1. جهز مكتبة التسلسل وفقا لبروتوكول SQK-NBD114 من Oxford Nanopore Technologies، باستخدام مجموعة الترميز الشريطي الأصلية 24 V14 (SQK-NBD114.24) (انظر جدول المواد). تأكد من استخدام باركود واحد مقدم في المجموعة لكل عينة.
  2. تسلسل المكتبة المعدة باستخدام خلية تدفق من Oxford Nanopore Technologies R10.4.1.
  3. قم بإجراء الاستدعاء الأساسي في MinKnow أثناء تشغيل التسلسل باختيار نموذج الدقة الفائقة (SUP) واختيار تقليم الباركود "ON". نسخة دورادو: 0.7.2+9ac85c6.
  4. قم بإجراء تصنيف لقراءات تسلسل الحمض النووي باستخدام المصنف التصنيفي Kraken2 (v2.1.3)30 مقابل قاعدة بيانات NCBI غير المتكررة (nr)، الثقة 0.05.
  5. افحص ملفات تقرير Kraken2 بحثا عن تصنيفات البكتيريا والفطريات الكلية.
  6. احسب الوفرة النسبية للبكتيريا والفطريات لكل عينة.

7. تقدير كربون الكتلة الحيوية الميكروبية في التربة عن طريق التبخير بالكلوروفورم

  1. وزن عينات التربة الطازجة في أواني مزينة مسبقا وجففها في فرن عند 105 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. احسب محتوى رطوبة التربة عن طريق طرح وزن التربة الجافة من وزن التربة الطازجة وقسمة الفرق على وزن التربة الطازجة.
    محتوى الرطوبة (٪) = (( الرطوبة البيضاء– الرطوبة العريضة)/ الرطوبة الجافة) × 100
  3. استخدم محتوى الرطوبة لحساب المادة الجافة في التربة.
    المادة الجافة (٪) = 100 – محتوى الرطوبة (٪)
  4. أضف 5 جرام من التربة إلى أنبوبين منفصلين للطرد المركزي بسعة 50 مل، وهما معلمان غير معقمين ومبقيمين.
  5. أضف إجمالي 25 مل من 0.5 M K2SO4 إلى الأنبوب غير المدخن الموسوم.
  6. اهز العينات غير المبخنة في هزاز مداري لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  7. أضف 2 مل من الكلوروفورم الخالي من الإيثانول مباشرة إلى التربة في الأنابيب الموسومة بالتعقيم. أغلق الأغطية وثبتها بطبقة باراغليم، وحضن في الظلام لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بجهاز الطرد المركزي للعينة غير المبخرة لمدة 10 دقائق عند 2,500 × جرام في درجة حرارة الغرفة.
  9. قم بتفريغ المادة الفائقة من العينة غير المبخمة، وتصفي عبر مرشح سليلوز بحجم 0.45 ميكرومتر، وخزنها عند -20 درجة مئوية.
  10. أزل الأغطية من العينات المبعدة وافتحها في غطاء الأبخرة لمدة ساعتين، ثم قم باستخراج K2SO4 (تكرار الخطوات 5-9) وخزنها عند -20 درجة مئوية.
  11. قياس تركيز الكربون في المستخلص لكل من العينات 'المبخرة' و'غير المبخرة'، باستخدام محلل الكربون العضوي الكلي.
  12. حساب كربون الكتلة الحيوية الميكروبية (MBC) باستخدام المعادلة التالية: MBC = (محتوى كربون مسخن-محتوى كربون غير مبخر)/0.45. تطبيع الكربون للتربة ذات الوزن الجاف لكل غرام.

8. تقدير محتوى المادة العضوية في التربة

  1. جفف بوتقة بورسلان في فرن حمل حراري على حرارة 105 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم وزنه بعد التبريد إلى 20 درجة مئوية (WC).
  2. ضع حتى 2 جرام من التربة في البوتقة المجافة وأعد وزنه.
  3. جفف عينات التربة في البوتقة المملوءة في فرن حمل حراري على حرارة 105 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  4. ضعه في مجفف مغلق ليبرد ويزن مرة أخرى (W S).
  5. سخن فرن الكتم إلى 550 درجة مئوية، ثم ضع البوتقة التي تحتوي على التربة في الفرن لمدة 4 ساعات.
  6. أزل البوتقة مع التربة من الفرن وضعها في مجفف ليبرد.
  7. زن البوتقة بالتربة (WA).
  8. قس نسبة وزن التربة الجافة بحساب الفرق في وزن التربة الجاف قبل وبعد الحضانة عند درجة حرارة 550 درجة مئوية.
    SOMLOI = [(WS –W A)/(WS –W C)] × 100

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع عينات التربة من خمسة مواقع، وتم تحديد محتوى المادة العضوية في التربة من خلال فقدان الاشتعال. تراوحت محتويات المادة العضوية في التربة بين 3.38٪ إلى 10.34٪ عبر كل من الترب المستخدمة في الدراسة (الجدول 1). تم إجراء استخراج الحمض النووي على كل عينة تربة على ثلاث نسخ، وتراوحت إنتاجية الحمض النووي الناتجة بين 32 نانوغرام إلى 4,590 نانوغرام لكل غرام من التربة الجافة (الشكل 3A).

اختلفت تركيزات الحمض النووي بشكل ملحوظ بين التربة ذات المحتوى العضوي المختلف (ANOVA باتجاه واحد p < 0.0001، R2=0.97). التربة التي تحتوي على أقل محتوى للمادة العضوية، التربة A، لم تظهر أدنى تركيز DNA. ومع ذلك، كانت التربة E، التي تحتوي على أعلى محتوى للمادة العضوية، تحتوي على تركيز أكبر بكثير من الحمض النووي من جميع أنواع التربة الأخرى (A–D، p < 0.0001)، بينما كانت التربة B الأدنى، حيث تختلف بشكل ملحوظ عن A وD (p < 0.05). تم إجراء بروتوكول ddPCR على الحمض النووي المنقى من كل عينة من التربة باستخدام بادئات جينات 16S و18S rRNA. تم تحديد عدد نسخ الجين لكل جرام من الوزن الجاف للتربة لكل من جيني 16S (الشكل 3B) و18S rRNA (الشكل 3C) باستخدام ddPCR. عبر جميع عينات التربة، كان هناك نسخ أقل من جين 18S rRNA مقارنة بجين 16S rRNA. كشفت اختبارات توكي بعد الفحص أن التربة B تحتوي على أقل نسخ جينية 16S و18S rRNA، بمتوسط 8.8 × 107 و4.6 ×10 6 نسخ جينية لكل جرام من التربة الجافة. اختلفت E التربة بشكل ملحوظ عن جميع التربة الأخرى وأظهرت أكبر عدد من نسخ جينات 16S و18S rRNA بحجم 4.4 × 109 و2.5 × 109 جينات على التوالي لكل غرام من التربة الجافة. لم تختلف النسخ الفطرية في التربة A–D بشكل ملحوظ عن بعضها البعض، بينما اختلفت النسخ البكتيرية في التربة D بشكل كبير عن التربة B وE.

تم استخدام تسلسل الجينوم الكامل (WGS) على الحمض النووي المنقى من كل عينة من عينة التربة، وأجريت تصنيفات تصنيفية باستخدام Kraken2 مقابل قاعدة بيانات NCBI nr. تم استخدام إجمالي عدد قراءات تسلسل الحمض النووي المصنفة مقابل البكتيريا والفطريات لحساب نسبة الفطريات إلى البكتيريا (F:B) لكل تربة، ومقارنتها بنسب الفطريات-بكتيريا المحسوبة من أعداد النسخ الجينية المقدرة بواسطة ddPCR (الشكل التكميلي 1). تراوحت قيم نسبة F:B التي تم الحصول عليها باستخدام ddPCR بين 0.022 و0.66 عبر جميع عينات التربة، وكانت أعلى من تلك التي تم الحصول عليها من تسلسل الجينوم الكامل. لوحظ أعلى متوسط F:B في التربة E، ب F:B 0.56 ل ddPCR و0.038 لطرق WGS. علاوة على ذلك، كان هناك نطاق أوسع من قيم F:B المحددة في عينات التربة باستخدام ddPCR بدلا من WGS. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ وجود ارتباط إيجابي بين نسبة F:B التي تحددها طريقة ddPCR وبيانات WGS (r = 0.59، R2 = 0.35، p = 0.019)، كما هو موضح في الشكل التكميلي 1.

تم استخدام متوسط عدد نسخ الجينات للبكتيريا والفطريات لتحويل النسخ الجينية المحسوبة إلى عدد خلايا البكتيريا والفطريات في العينات الأصلية (الشكل التكميلي 2). تم دمج هذه البيانات لتقدير العدد الكلي للخلايا الميكروبية داخل التربة (الشكل 3D) واختلفت بشكل ملحوظ بين التربة (تحليل العينات الأحادية الاتجاه p < 0.0001). أظهر تحليل المقارنة الزوجية لتوكي أن أعلى محتوى ميكروبي لوحظ في التربة E، بينما تم العثور على أدنى محتوى ميكروبي في العينات المأخوذة من التربة B، مع اختلاف كبير عن A وD وE.

تم إجراء تبخير الكلوروفورم على كل عينة تربة في ثلاث نسخ لتقدير إجمالي كربون الكتلة الحيوية الميكروبية (MBC) في كل عينة (الشكل 4A). تم تحديد ما بين 3.6 و9.6 ملغ كربون لكل جرام من التربة الجافة عبر التربة المستخدمة، دون ملاحظة فروق ذات دلالة إحصائية بين كل عينة (تحليل الحمض النووي أحادي الاتجاه p = 0.266). تم استخدام متوسط محتوى الكربون للخلايا البكتيرية والفطرية لتحويل عدد الخلايا الميكروبية المقدر بواسطة ddPCR إلى إجمالي تقدير لكربون الكتلة الحيوية الميكروبية. تمت مقارنة هذه التقديرات المشتقة من ddPCR مع طريقة التبخير الكلوروفورم (الشكل 4B). لتقييم العلاقة بين MBC المقاس بواسطة التبخير الكلوروفورم وطريقة ddPCR، تم إجراء ارتباط بيرسون (n = 15). تم العثور على ارتباط إيجابي بين الطريقتين (r = 0.43، R2 = 0.18، قيمة p = 0.05). من المحتمل أن القيم الشاذة من التربة E، والتي تتميز بأعلى محتوى للمادة العضوية، ساهمت بشكل غير متناسب في هذه النتيجة ذات الدلالة الهامشية (الشكل 4B).

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على معالجة عينات التربة. يوضح الشكل الطرق الجزيئية التي تستخدم الحمض النووي للتربة لقياس الميكروبات والطرق التقليدية لقياس الكتلة الحيوية الميكروبية للكربون والمادة العضوية في التربة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: مخطط تدفق لعملية عد الخلايا من نسخ ddPCR لكل من 16S و18S، إلى التقدير النهائي للكربون الحيوي للكتلة الميكروبية، موضحا الخطوات 5.11–5.16 من البروتوكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: قياس الميكروبات للتربة. (أ) متوسط تركيز الحمض النووي المنقي من كل عينة من التربة. (ب) متوسط إجمالي عدد نسخ جينية 16S rRNA لكل جرام من الوزن الجاف للتربة باستخدام ddPCR. (ج) متوسط إجمالي عدد نسخ جينية 18S rRNA لكل جرام من الوزن الجاف للتربة باستخدام ddPCR. (د) متوسط إجمالي عدد الخلايا الميكروبية لكل جرام من الوزن الجاف عبر عينات التربة. جميع أشرطة الخطأ تعرض الخطأ القياسي للمتوسط. تم إجراء تحليل جبار أحادي الاتجاه واختبار توكي بعد الوقوع للمقارنات الزوجية، وتم عرض الفروق المعنوية باستخدام عرض الحروف المضغوطة (عتبة الدلالة = 0.05). تم ترتيب العينات من أدنى إلى أعلى نسبة OM٪. أصل التربة (OM٪) أ: هولندا (3.38)، ب: العراق (5.14)، ج: الصين (6.41)، د: المملكة المتحدة (8.19)، وشرق المملكة المتحدة (10.34). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: الكربون الحيوي الميكروبي المقاس بواسطة استخراج الكتلة الحيوية بالكلوروفورم وتقديرات الخلايا الجينية. (أ) MBC المستخرج بواسطة التبخير بالكلوروفورم - مرتبة من محتوى منخفض إلى عالي من المادة العضوية. تظهر أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. تم إجراء تحليل أنوفاعي أحادي الاتجاه واختبار لاحق من توكي للمقارنات الزوجية، وتم عرض الفروق الدلالة باستخدام عرض الحروف المضغوطة (عتبة الدلالة = 0.05). (B) مقدر MBC من وفرة الخلية (gdw -1) مشتق من رقم نسخة جين ddPCR وتم تحويله إلى كربون كتلة حيوية، مرسوم مقابل المادة العضوية الكلية لنفس العينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عينةأصل التربةالرقم الهيدروجينينسبة الرطوبةالمادة العضوية ٪الملمساستخدام الأراضي
Aتيكسل، هولندا7.1619.043.38الطمي الرمليالبستنة
Bالنجف، العراق7.588.335.14الطمي الطينيالأرز
Cجيانغشي، الصين4.118.456.41الطمي الطينيسمسم/اللفت
Dكامبريدج، المملكة المتحدة6.8121.88.19الطمي الطينيالقمح
Eإكستر، المملكة المتحدة5.4420.2710.34الطمي الطينيالمراعي

الجدول 1: الخصائص الفيزيائية الكيميائية وخصائص استخدام الأراضي لخمس عينات تربة (A–E)، لتحديد الكتلة الحيوية الميكروبية.

الهدفBPإلى الأمامالرجوع إلى الخلفالمرجع
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGGGGCAGCAG5′- ATTACCGGGGCTGCTGGGG(لو جيي وآخرون، 2024؛ أوفريوس وآخرون، 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCKCACACA(ليو وآخرون، 2012)

الجدول 2: أزواج البرايمر المختارة لاستهداف جين 16S و18S rRNA باستخدام ddPCR.

الشكل الإضافي 1: ارتباط بين نسبة F:B لجميع عينات التربة، يتم تحديده بواسطة طريقة ddPCR ونظام WGS. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: عدد الخلايا في عينات التربة المختلفة المقاسة باستخدام طريقة ddPCR التي تستهدف: (أ) البكتيريا؛ و(ب) الفطريات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد ميكروبات التربة هي العوامل الرئيسية للتحلل في النظم البيئية الأرضية وتلعب دورا أساسيا في دورة المغذيات وكتخزين للكربون في التربة. على الرغم من أهمية الميكروبات الدقيقة، فإن قياس وفرة مطلقة بدقة باستخدام طرق النسخ الجينية يمثل تحديا. ويرجع ذلك إلى عوامل عديدة، مثل العدد المتغير للجينات المستهدفة في الأنواع المختلفة. تظهر هذه الدراسة كيف يمكن قياس الكتلة الحيوية الميكروبية للتربة باستخدام ddPCR من خلال استهداف بدائيي النوى وحقيقيات النواة باستخدام مناطق ترميز جينات rRNA 16S و18S على التوالي. لوحظت أعلى نسبة F:B في التربة E، حيث كانت هذه العينة أيضا أعلى نسبة مواد عضوية. تم تسجيل ثاني أعلى نسبة F:B في العينة C، والتي تزامنت مع الحموضة العالية لهذه التربة. كان هذا متوقعا للعينات C وE، حيث يزداد نمو الفطريات مع انخفاض pH31. تم إجراء تسلسل الجينوم الكامل على نفس مستخلصات الحمض النووي المستخدمة في طرق ddPCR. تمت مقارنة نسبة F:B بين WGS و ddPCR. كانت نسبة F:B المحسوبة من بيانات WGS أقل لجميع العينات التي تم تحليلها مقارنة بنسبة F:B المحسوبة من بيانات ddPCR. ومع ذلك، كان الاتجاه العام لنسبة F:B بين العينات قابلا للمقارنة بصريا بين كل طريقة. أدى ذلك إلى زيادة نسبة F:B في عينات التربة مقارنة بتسلسل الجينوم الكامل وأظهر تباين أكبر في نسبة F:B عبر أنواع التربة المختلفة. من المرجح أن تكون نسبة F:B الأقل لوحظة من بيانات WGS ناجمة عن الفروق في حجم الجينوم بين الفطريات والبكتيريا، وقد تكون تسلسلات الفطريات ممثلة بشكل أقل من اللازم بدون إثراء32. علاوة على ذلك، رغم أن التربة A تحتوي على أقل محتوى للمادة العضوية، إلا أنها لم تعرض أقل عدد من النسخ الميكروبية وكربون الكتلة الحيوية الميكروبية، مما يبرز أن محتوى المادة العضوية ليس دائما مرتبطا مباشرة بالكتلة الحيوية الميكروبية. ومن الجدير بالذكر أن الاتجاهات التي لوحظت بين تركيز الحمض النووي الأصلي (الشكل 3A) والخلايا الميكروبية الكلية (الشكل 3D) كانت متشابهة بصريا، مما يشير إلى أن تركيز الحمض النووي يعد بديلا جيدا للكتلة الحيوية الميكروبية.

يتيح ddPCR القياس الدقيق لأعداد النسخ الجينية داخل عينات التربة، ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقدير إجمالي الخلايا الميكروبية. ومع ذلك، هناك قيود يجب أخذها في الاعتبار. يختلف عدد نسخ جينات 16S و18S rRNA بشكل كبير بين الأنواع الميكروبية23. نتيجة لذلك، يمكن أن يؤدي استخدام عامل تصحيح واحد لعدد نسخ الجين إلى المبالغة أو التقليل من تقدير وفرة الميكروبات في عينة33. يمكن معالجة هذا القيد من خلال دمج المعرفة السابقة بمجتمع الميكروبات18، واستخدام بيانات تسلسل الجينوم الكامل، وتطبيق تصحيحات مناسبة لعدد النسخ الجيني تمثل ميكروبيوتا التربة المحددة. بينما توفر الطرق الجزيئية تقديرا بدلا من عدد دقيق، إلا أنها تقدم توقعا أكثر دقة لوفرة الميكروبات. عند دمجها مع بيانات تكوين المجتمع، يسمح هذا النهج بتفسيرات تتجاوز الوفرة النسبية وحده19,34.

أظهر كربون الكتلة الحيوية الميكروبية (MBC)، المقدر باستخدام التبخير بالكلوروفورم، عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين العينات التي تم تحليلها، رغم أن درجات عالية من التباين في الكتلة الحيوية الميكروبية لوحظت بين العينات A–D. في المقابل، تم اكتشاف اختلافات ذات دلالة كبيرة في إجمالي عدد الخلايا الميكروبية المقاسة باستخدام طريقة ddPCR، مما يشير إلى أن هذا النهج الجزيئي قد يوفر دقة أكبر من التقنيات التقليدية. ومع ذلك، فإن حساب كربون الكتلة الحيوية الميكروبية من أعداد الخلايا الميكروبية له حدوده الخاصة. يمكن أن يؤثر التغير في حجم الخلية على تحويل عدد الخلايا إلى الكتلة الحيوية. وعلى غرار استخدام عامل تحويل واحد لعدد نسخ الجينات، قد يؤدي استخدام عامل تحويل واحد لمحتوى الكربون البكتيري والفطري إلى المبالغة أو التقليل من تقدير كربون الكتلة الحيوية الميكروبية.

علاوة على ذلك، قد تكون الطرق المعتمدة على DNA مشكلة خاصة مقارنة بالتربة التي تظهر فروقا كبيرة في درجة الهيمنة بين البكتيريا والفطريات. يمكن أن يتأثر كل من إنتاج الحمض النووي وGCN أيضا باختيار طريقة استخراج الحمض النووي وتصميم البرايمر35,36، مما يجعل المقارنات عبر المختبرات صعبة37. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون طرق GCN وطريقة إنتاج الحمض النووي معرضة للمبالغة بسبب ما يسمى "الحمض النووي الأرقي"، أي الحمض النووي في الكائنات الميتة أو المرتبطة بالطين14,38. على الرغم من أن طرق ddPCR أظهرت دقة وتكرارا أفضل، إلا أن بعض العيوب تشمل عملياتها المعقدة، والتكاليف العالية، واستخدام صبغة DNA غير محددة عند استخدام كيمياء إيفاجرين5. قد يؤدي ذلك إلى نتائج إيجابية خاطئة ضعيفة، مما يصعب فصل القطرات الموجبة عن القطرات السالبة، وقد يؤثر تعديل بسيط على نسبة F:B عندما تكون نسخ الجينات منخفضة14. لزيادة عدد العينات التي يمكن معالجتها باستخدام هذه الطريقة ddPCR، يمكن استخدام الأتمتة باستخدام روبوتات معالجة السوائل لاستخراج الحمض النووي وإعداد التفاعل39. بالإضافة إلى ذلك، يتيح نظام ddPCR الجديد تعدد أكبر من النقل، مما يولد قطرات ل 96 عينة في آن واحد.

من المهم ملاحظة أن جميع قياسات الكتلة الحيوية الميكروبية هي تقديرات وتشمل عوامل تحويل عامة لتحديد الأرقام37. لذلك، يجب إجراء المقارنات بين الطرق بحذر، حيث لا يعرف أيها الأكثر دقة. على الرغم من ذلك، تم استخدام طرق التبخير والاستخراج بالكلوروفورم على نطاق واسع خلال العقود القليلة الماضية، معتمدة على أبخرة الكلوروفورم لتعقيم التربة. أثار هذا العديد من المخاوف بسبب سميتها للبشر والبيئة، بالإضافة إلى فعاليتها في تحلل خلايا الميكروبات في التربة40. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي التبخير بالكلوروفورم إلى تقدير مبالغ فيه لقيمة MBC الناتج من مصادر غير حية، مثل بقايا النبات41. أخيرا، تعتمد هذه الطريقة أيضا على كميات كبيرة نسبيا من التربة مقارنة بالطرق الجزيئية الأخرى التي تتطلب كميات منخفضة جدا من التربة (<500 ملغ).

توفر هذه الدراسة دليلا على أن الطرق المعتمدة على ddPCR لقياس الكتلة الحيوية الميكروبية للتربة عبر مجموعة من التربة قوية ولا تتأثر بأنواع التربة المختلفة أو المثبطات المحتملة. يتأثر نجاح هذه الطريقة بعينة الحمض النووي الأصلية، ولذلك فإن ضمان تنقية فعالة للحمض النووي من العينات أمر بالغ الأهمية. تظهر هذه الطريقة وعدا في الكشف عن الميكروبات وقياسها في أنواع وملمس التربة المختلفة، مكملة للطرق القائمة لتقدير الكتلة الحيوية الميكروبية وتمكين تطبيقات مستقبلية قيمة في مراقبة صحة التربة وقابليتها للتوسع لمراقبة الميكروبيوم الإقليمية أو العالمية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون يعلنون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورة نينا ليندستروم-فريغينز، الدكتورة ليز كريسي، الدكتورة جوانا زاراغوزا-كاستيلز، أنجيلا إليوت، الدكتورة كيس جان فان غرونيغن، والبروفيسور إيان هارتلي. نود أيضا أن نشكر ملاك الأراضي على توفير التربة لهذه الدراسة. تم تمويل هذا البحث من قبل شركة شل للأبحاث المحدودة (CW648947-PT34767). تتوفر مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها خلال الدراسة الحالية في مستودع أرشيف قراءة التسلسل التابع ل NCBI PRJNA1305539.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بيترسايزر S3 بلس بيترسايز، الصينBT-803
الطرد المركزيعلم الحرارة SL16 
الكلوروفورم  ثيرمو ساينتيفكL14759. AU 
لوحات ddPCR 96-Wellبيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة12001925
زيت قارئ قطرات ddPCR  بيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة1863004
ديسيكاتور دافيسيل
حامل خرطوشة DG8بيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة1863051
خرطوشات DG8 لمولد قطرات QX200/QX100بيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة1864008
حشيات DG8 لمولد قطرات QX200/QX100بيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدةQ33265
مجموعة DNeasy Power Soil Pro  تشياغن، ألمانيا47017
مجموعة اختبار واسع النطاق (BR) مزدوجة السلسلة (dsDNA)إنفيتروجين، ألمانياQ33230
FastPrep-24 5G MP Biomedicals، المملكة المتحدة116005500
جريديون  تقنيات أكسفورد نانوبور، المملكة المتحدةGRD-MK1CAPX
K2SO4ميرك، المملكة المتحدة7778-80-5
خرز مغناطيسي من نوع Mag-bindأوميغا بيو-تيك، الولايات المتحدة الأمريكيةM1378-01
خلية تدفق MinIONتقنيات أكسفورد نانوبور، المملكة المتحدةFLO-MIN114
فرن مكتومالكربولايت AAF1100
مجموعة الترميز الشريطي الأصلية 24تقنيات أكسفورد نانوبور، المملكة المتحدةSQK-NBD114.24
ختم حرارة لوحة PCR، ورق الألمنيوم، قابل للثقب  بيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة1814040
مادة ختم ألواح PCR من نوع PX1بيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة1814000
فلوروميتر الكيوبتإنفيتروجين، ألمانياQ33226
نظام QX200 Droplet الرقمي PCRبيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة1864001
QX200 ddPCR EvaGreen Supermixبيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة186-4033
زيت توليد قطرات QX200 لصالح EvaGreen بيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة1864005
مولد قطرات QXDx بيو-راد، واتفورد، المملكة المتحدة12001049
SENSOQUEST LABCYCLER جينفلو، ألمانيا1120280125

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jobbágy, E. G., Jackson, R. B. The vertical distribution of soil organic carbon and its relation to climate and vegetation. Ecol Appl. 10 (2), 423-436 (2000).
  2. Sanderman, J., Hengl, T., Fiske, G. J. Soil carbon debt of 12,000 years of human land use. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9575-9580 (2017).
  3. He, Y., Li, J., Siemann, E., Li, B., Xu, Y., et al. Plant invasion increases soil microbial biomass carbon: meta-analysis and empirical tests. Glob Change Biol. 31 (3), e70109(2025).
  4. de Menezes, A. B., Richardson, A. E., Thrall, P. H. Linking fungal-bacterial co-occurrences to soil ecosystem function. Curr Opin Microbiol. 37, 135-141 (2017).
  5. Wang, D., et al. ddPCR surpasses classical qPCR technology in quantitating bacteria and fungi in the environment. Mol Ecol Resour. 22 (7), 2587-2598 (2022).
  6. Djemiel, C., et al. Biogeographical patterns of the soil fungal:bacterial ratio across France. mSphere. 8 (5), e0036523(2023).
  7. Bailey, V. L., Smith, J. L., Bolton, H. Fungal-to-bacterial ratios in soils investigated for enhanced C sequestration. Soil Biol Biochem. 34 (7), 997-1007 (2002).
  8. Vance, E. D., Brookes, P. C., Jenkinson, D. S. Microbial biomass measurements in forest soils: the use of the chloroform fumigation-incubation method in strongly acid soils. Soil Biol Biochem. 19 (6), 697-702 (1987).
  9. Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlio, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol Biochem. 25 (6), 723-730 (1993).
  10. Cao, Z., Li, D., Han, X. The fungal to bacterial ratio in soil food webs, and its measurement. Acta Ecol Sin. 31 (20), 6050-6058 (2011).
  11. Frossard, A., Hammes, F., Gessner, M. O. Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge. Front Microbiol. 7, 903(2016).
  12. Joergensen, R. G., et al. A hitchhiker’s guide: Estimates of microbial biomass and microbial gene abundance in soil. Biol Fertil Soils. 60 (4), 457-470 (2024).
  13. Fierer, N., Wood, S. A., Bueno de Mesquita, C. P. How microbes can, and cannot, be used to assess soil health. Soil Biol Biochem. 153, 108111(2021).
  14. Laine, M. B., Taipale, S. J., Tiirola, M. Comparison of methods for assessing fungi-to-bacteria ratio of soil. Biol Fertil Soils. 61 (5), 941-954 (2025).
  15. De Filippis, F., Laiola, M., Blaiotta, G., Ercolini, D. Different amplicon targets for sequencing-based studies of fungal diversity. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00905-e00917 (2017).
  16. Liu, C. M., et al. FungiQuant: A broad-coverage fungal quantitative real-time PCR assay. BMC Microbiol. 12, 255(2012).
  17. Lofgren, L. A., et al. Genome-based estimates of fungal rDNA copy number variation across phylogenetic scales and ecological lifestyles. Mol Ecol. 28 (4), 721-730 (2019).
  18. Angly, F. E., et al. W. CopyRighter: A rapid tool for improving the accuracy of microbial community profiles through lineage-specific gene copy number correction. Microbiome. 2 (1), 11(2014).
  19. Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002743(2012).
  20. Pan, P., Gu, Y., Sun, D. L., Wu, Q. L., Zhou, N. Y. Microbial diversity biased estimation caused by intragenomic heterogeneity and interspecific conservation of 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol. 89 (5), e0210822(2023).
  21. Chacón-Vargas, K., Torres, J., Giles-Gómez, M., Escalante, A., Gibbons, J. G. Genomic profiling of bacterial and fungal communities and their predictive functionality during pulque fermentation by whole-genome shotgun sequencing. Sci Rep. 10 (1), 15115(2020).
  22. Bahram, M., et al. Metagenomic assessment of the global diversity and distribution of bacteria and fungi. Environ Microbiol. 23 (1), 316-326 (2021).
  23. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology: Application of Q-PCR in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Le Geay, M., Mayers, K., Küttim, M., Lauga, B., Jassey, V. E. J. Development of a digital droplet PCR approach for the quantification of soil micro-organisms involved in atmospheric CO2 fixation. Environ Microbiol. 26 (6), e16666(2024).
  26. Hansen, P. M., Semenova-Nelsen, T. A., Platt, W. J., Sikes, B. A. Recurrent fires do not affect the abundance of soil fungi in a frequently burned pine savanna. Fungal Ecol. 42, 100852(2019).
  27. Ovreås, L., Forney, L., Daae, F. L., Torsvik, V. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3367-3373 (1997).
  28. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (12), 6578-6583 (1998).
  29. Cheng, J. Y. W., Chan, C. K., Lee, C. T., Lau, A. P. S. Carbon content of common airborne fungal species and fungal contribution to aerosol organic carbon in a subtropical city. Atmos Environ. 43 (17), 2781-2787 (2009).
  30. Wood, D. E., Lu, J., Langmead, B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 20 (1), 257(2019).
  31. Rousk, J., Brookes, P. C., Bååth, E. Contrasting soil pH effects on fungal and bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization. Appl Environ Microbiol. 75 (6), 1589-1596 (2009).
  32. Xie, Z., Canalda-Baltrons, A., d’Enfert, C., Manichanh, C. Shotgun metagenomics reveals interkingdom association between intestinal bacteria and fungi involving competition for nutrients. Microbiome. 11 (1), 275(2023).
  33. Větrovský, T., Baldrian, P. The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses. PLoS One. 8 (2), e57923(2013).
  34. Doyle, B., et al. Absolute quantification of prokaryotes in the microbiome by 16S rRNA qPCR or ddPCR. Nat Protoc. 20, 3471-3476 (2025).
  35. Frostegård, A., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl Environ Microbiol. 65 (12), 5409-5420 (1999).
  36. Lee, E., Lim, H. J., Son, A. Discrepancies in qPCR-based gene quantification and their dependencies on soil properties, inhibitor presence, and DNA extraction kit types. RSC Adv. 15 (25), 19656-19664 (2025).
  37. Buell, Z. W., et al. Interrelationships among methods of estimating microbial biomass across multiple soil orders and biomes. Soil Biol Biochem. 208, 109844(2025).
  38. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nat Microbiol. 2 (3), 16242(2016).
  39. Child, H. T., et al. Automated environmental metagenomics using Oxford nanopore sequencing. BMC Genomics. 26 (1), 835(2025).
  40. Paliaga, S., Laudicina, V. A., Muscarella, S. M., Said-Pullicino, D., Badalucco, L. Comparison of different methods for estimating microbial biomass in biochar-amended soils. Soil Biol Biochem. 203, 109733(2025).
  41. Setia, R., Verma, S. L., Marschner, P. Measuring microbial biomass carbon by direct extraction: comparison with chloroform fumigation-extraction. Eur J Soil Biol. 53, 103-106 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ddPCR 16S rRNA 18S rRNA

مقالات ذات صلة