مقالة منهجية

تصوير الكالسيوم القائم على التألق في زراعات ظهارية مجرى الهواء الأولي باستخدام تقسيم الخلايا الآلي

DOI:

10.3791/69470

⸱

مايو 22, 2026

 ,  , 
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم تصوير الخلايا الحية لإشارات الكالسيوم بشكل مكثف لدراسة تحريك الكالسيوم في خطوط الخلايا المستقرة المزروعة في طبقات أحادية. يصف هذا البروتوكول تصوير الفلورة للخلايا الحية لإشارات الكالسيوم باستخدام أصباغ الخلايا الحية على الأنسجة المعقدة الأولية، كما يستخدم برامج التعلم الآلي لقياس شدة التألق لآلاف الخلايا الفردية في آن واحد، مما يبسط التحليلات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد إشارات الكالسيوم ضرورية في العديد من العمليات البيولوجية، مما يعزز الحاجة إلى تطوير طرق لدراسة تدفق الكالسيوم في الأنسجة الأولية. دراسة إشارات الكالسيوم بدقة خلية واحدة في المزارع الظهارية الأولية المعقدة تمثل تحديا ولذلك لا تزال غير مدروسة بشكل كاف. تقدم هذه الدراسة طرقا معدلة لمراقبة إشارات الكالسيوم الحية في مزارع مجرى الهواء الظهارية الأولية وأساليب جديدة للتحليلات القائمة على التعلم الآلي. باستخدام زراعات ظهارية أولية مشتقة من المريض عند واجهة الهواء-السائل، محملة بصبغة مؤشر فلورسنت خارجي، تم قياس تحريك الكالسيوم بدقة خلية واحدة باستخدام مجهر فوق فلوري. طورنا برنامجا جديدا يستخدم تقسيم الخلايا المعتمد على التعلم الآلي لتحديد شدة الفلورة لخلايا مختلفة عبر الزمن. بشكل عام، يتيح نظام التصوير المعدلة والبرمجيات نهجا سريعا وغير متحيز لتحليل الخلايا المفردة داخل الزراعة الظهارية الأولية. البروتوكول خطوة بخطوة المعروض هنا سيمكن من دراسة الكالسيوم في الخلايا الفردية وأنواع الخلايا التي تشكل الثقافات الظهارية الأولية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التغيرات في تعبئة الكالسيوم داخل الخلايا تفرض مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك التغيرات في التعبير الجيني وتعديل الاستجابات المناعية الفطرية 1,2. يمكن تغيير مستويات الكالسيوم داخل الخلايا من خلال إفراز مخزون الكالسيوم داخل الخلية، مثل الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا 1,2,3. يمكن لتدفق الكالسيوم خارج الخلية إلى الفضاء داخل الخلية أيضا أن يغير الكالسيوم السيتوزولي من خلال النقل السلبي والنشط2. يتم اختبار تصوير الخلايا الحية لتحريك الكالسيوم بشكل رئيسي بواسطة أصباغ داخل الخلايا أو أصباغ مشفرة وراثيا، GCaMP (متعدد/بروتين منشط بالكالسيوم الأخضر)4. شائعة في الأدبيات هي أصباغ AM (الأسيتوكسي ميثيل) المترافقة، التي تتيح للصبغة اختراق غشاء البلازما 5,6,7,8. عند دخول الخلية، يتم شق الجزء الآم بواسطة إستراز داخلي داخلي داخلي، ويكتسب الصبغة شحنة سالبة تحاصره في الفضاء السيتوسولي9. وبسبب هذه الشحنة المكتسبة، يمكن ضخ الصبغة بواسطة قنوات الأنيون العضوية المقيمة في غشاء البلازما. لذلك، يضاف البروبينيسيد، وهو مثبط لناقلات تدفق الأنيون العضوي، لمنع تدفق الخلوي للصبغة والحفاظ على الإشارة السيتوصولية المثلى10,11. تستخدم الدراسات عادة صبغة Fura-2 AM، وهي صبغة نسبية، وFluo-4AM، صبغة مكثفة القياس، لاختبار إشارات الكالسيوم على خطوط الخلايا المستقرة المزروعة في طبقة أحادية. تستخدم هذه الدراسة بروتوكولا مكيفا للتصوير فوق الفلوري للثقافات متعددة الطبقات التي تنمو عند واجهة الهواء والسائل باستخدام صبغة الكالسيوم المكثفة حديثا، Cal-520 AM، والتي تتمتع بحساسية محسنة مقارنة بفلو-4 AM. لذا، فهو مناسب لرؤية الإشارات الدقيقة بدقة خلية واحدة من المزارع الطهارية الأولية المعقدة. الأدبيات الحالية غنية بتصوير الكالسيوم الحي للاستجابات الجماعية من خطوط الخلايا المستقرة. ومع ذلك، أصبح من المعروف الآن أن الأنسجة في الجسم الحي تشكل مشهدا خلويا متنوعا يدعم أدوارا مختلفة لأنواع الخلايا في الحفاظ على توازن الأنسجة 12,13,14,15. على الرغم من هذه المعرفة الشائعة، لا تزال الآليات التي تنسق بها أنواع الخلايا المختلفة إشارات الكالسيوم وتنظم توازن أيونات الكالسيوم مجهولة. لذلك، ستمكن الطرق المعروضة هنا من الكشف عن إشارات الكالسيوم في خلية واحدة وتعزز معدل التحليل في أنسجة مجرى الهواء الأولية.

نحن نستفيد من نماذج زراعة الظهارة الأولية المنشورة سابقا والتي تم التحقق منها بدقة لظهارة أنف الإنسان كأداة لتصوير الخلايا الحية والكالسيوم السيتوسولي في نموذج أكثر صلة بيولوجيا 16,17,18. باختصار، تعزل خلايا الظهارة من فرش أنف المريض وتزرع على غشاء شبه نفاذي في بئر عرضي، يتم تعليقه داخل بئر الزراعة للحفاظ على واجهة الهواء والسائل (ALI). تم اختبار هذه الواجهة، مع وسائط متخصصة، بدقة باستخدام تقنيات التعامد لوجود أنواع خلايا مختلفة 16,17,18. علاوة على ذلك، أثبت أن الطرق الحالية قابلة للترجمة إلى ثقافات الشعب الهوائية الأولية التي يتم زراعتها بطريقة مشابهة لثقافات الأنف الأوليةلدينا 19.

تقدم هذه المقالة طريقة متكيفة لقياس وتحليل إشارات الكالسيوم الحية بدقة خلية واحدة في هذه الزراعة الظهارية الأولية في مجرى التنفس. يصعب تصور هذه الثقافات متعددة الطبقات باستخدام المجهر؛ ومع ذلك، فإن الإعداد الحالي يمكننا من التركيز بشكل موثوق على الطبقات الفردية داخل الثقافات متعددة الطبقات، مما يتيح لنا اكتشاف تحريك الكالسيوم من هذه الطبقات المحددة. لهذا النظام عدة مزايا، حيث لا يتطلب نظام تروية، وهو نظام غالبا ما يكون مكلفا وصعب التكيف إلا إذا تم استخدام مجاهر متخصصة. تم استخدام المجهر فوق التألق، الذي يوفر دقة زمنية محسنة مقارنة بالتصوير الكونفوكلي. استخدام الصمامات الثنائية الباعثة للضوء (LEDs) يقلل من السمية الضوئية مقارنة بالأنظمة الكونفوكية المعتمدة على الليزر. تستخدم الأصباغ الخارجية المكثفة في البروتوكول المعروض هنا لأنها تتيح تغييرات سريعة ونسبية في الكالسيوم عبر كامل مجموعة الخلايا وتتوافق مع معظم إعدادات المجهر الفلوري. وهذا مفيد مقارنة بالأصباغ النسبية الشائعة التي تتطلب إثارة فوق بنفسجية عميقة غير متوفرة في العديد من المجاهر. علاوة على ذلك، يتطلب GCaMP النقل أو التحويل، مما يعزز التقنية لتصوير الكالسيوم الأكثر استهدافا في أنواع الخلايا المحددة. نظرا لانخفاض كفاءة النقل والانتقال في الزراعة الظهارية الأولية، فإن هذه التقنية غير مناسبة لمراقبة كامل مجموعة الخلايا.

بالإضافة إلى ذلك، طورت هذه الدراسة برامج متخصصة ومبتكرة تعتمد على التعلم الآلي تسمح بتقسيم الخلايا الأحادية بناء على التلوين النووي الحي. بعد ذلك يصبح البرنامج قادرا على تسجيل قيم شدة الفلورة لكل خلية على مدى الزمن. تم استخدام خط خلية ظهارية مستقر (Calu-3) في البداية لتحسين الطريقة. ثم ترجمت هذه الطرق لدراسة تعبئة الكالسيوم في الخلايا الواحدة في المزارع الظهارية الأولية. تم تحسين متغيرات مثل تركيز صبغة الكالسيوم والبروبينيسيد، وتوقيت خطوات الحضانة، بالإضافة إلى إعداد التصوير. هنا، يتم تسجيل إشارات الكالسيوم بمعدل إطارات 0.2 إطار في الثانية، وهو مناسب لمراقبة إشارات الكالسيوم. يمكن زيادة معدل الإطارات لقياس الانتقالات السريعة للكالسيوم20. ثم تم تطبيق المتغيرات المثلى وتحسينها بشكل أكبر في الزراعة الأنفية الأولية الأكثر تعقيدا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. صيانة وزراعة خلايا Calu-3

  1. حافظ على خلايا Calu-3 في قوارير T-25 في وسط زراعة EMEM مع 20٪ FBS و1٪ بنسلين/ستربتوميسين. قم بتسخين الوسائط مسبقا وتغييرها في أيام متناوبة (5 مل/قارورة).
  2. عندما تكون الخلايا متلاقية بنسبة 70٪ داخل القارورة، استنشق الوسط داخل القارورة.
  3. اغسل القارورة بمحلول ملحي مخبأ بفوسفات سعة 5 مل (PBS).
  4. أضف 1 مل من تريبل مباشرة إلى الخلايا لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تأكد من أن جميع الخلايا قد انفصلت عن قاع القارورة وأنها منفصلة إلى تعليق خلية واحدة.
  5. قم بتحييد التفاعل باستخدام 4 مل من وسط الزراعة الطازج (الخطوة 1.1)، ثم اخلط الخلايا جيدا باستخدام ماصة مصلية لضمان التساو في البذر.
  6. قم بتغليف الخلايا على صفيحة بسعة 96 بئر عند التقاء بنسبة 90٪-100٪ (حوالي 40,000 خلية لكل بئر).
    1. لزراعة الآبار، أضف 200 ميكرولتر/بئر من تعليق الخلية المختلطة جيدا.
    2. دع الخلايا تلتصق بصفيحة 96 بئر طوال الليل.
  7. غير الوسائط يوميا (200 ميكرولتر/بئر) حتى تكون جاهزا للتجارب.
  8. اترك 2-5 أيام بعد التقاء الآبار لبدء التجارب قبل إجراء التجارب للسماح بالتمييز.

2. بروتوكول تحميل خلايا Calu-3 باستخدام Cal 520 AM أو Fluo-4 AM

تحذير: يتم إذابة فلو-4 صباحا وكال-520 صباحا في DMSO، ويعتبر ذلك خطيرا. بروبينيسيد مدرج كخطر حاد. يرجى ارتداء القفازات ومعطف المختبر عند التعامل مع المواد الكيميائية لتجنب ملامسة الجلد. تخلص من جميع المواد الكيميائية في صناديق النفايات الكيميائية المخصصة.

  1. في يوم التجربة، أزل الوسائط من الآبار عن طريق التوصيل بالماصات وغسل الخلايا مرتين (200 ميكرولتر/بئر) في محلول كالسيوم مسبق التسخين (140 ملليمولار NaCl، 5 ملليمولار KCl، 1 ملليمولار MgCl2 2 ملليمولار CaCl2، و10 ملليمولار هيبيز، معدلة إلى pH 7.38 (NaOH) 291 مليوم أوسم)، لإزالة الخلايا الميتة.
  2. احتضن الخلايا ب 200 ميكرولتر/بئر من مزيج من 3 ميكرومولار Cal-520 AM، وبروبينيسيد 2.5 ملليمول، وصبغة نووية هوشت 1:5000 في مخزن الكالسيوم (الخطوة 2.1) لمدة ساعة واحدة في حاضنة مضبوطة على 37°C و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    1. لتجارب فلو-4 AM، حضن الخلايا بكمية 200 ميكرولتر/بئر من مزيج من 3 ميكرومولار فلو-4 AM، 2.5 ملليمولار بروبينيسيد، و1:5000 هوشت في مخزن الكالسيوم (الخطوة 2.1) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظة: احتفظ بأنابيب الصبغة في الظلام بتغطيتها بورق الألمنيوم.
  3. خلال فترة الحضانة، حضر ثابسيغارجين في محلول الكالسيوم (الخطوة 2.1). ضبط تركيزات المخزون الوسيطة لضمان تركيزات نهائية مناسبة داخل البئر.
    ملاحظة: هنا، يضاف 50 ميكرولتر من الدواء إلى 100 ميكرولتر من محلول الكالسيوم الحالي. لذلك، تم تجهيز مخزون متوسط 3x بسعة 6 ميكرومتر.
  4. بعد ساعة واحدة، استنشق الصبغة عن طريق التلوين وغسل الصبغة خارج الخلايا باستخدام محلول الكالسيوم (الخطوة 2.1) مرتين (200 ميكرولتر/بئر).
  5. بعد الغسولات، أضف 100 ميكرولتر/بئر من بروبينيسيد 2.5 ملليمول مخفف في محلول الكالسيوم (الخطوة 2.1) للحفاظ على الصبغة في الفضاء السيتوبلازمي.
  6. لف اللوحة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء. الخلايا الآن جاهزة للتصوير.

3. إعداد المجهر لسلسلة الخلايا المستقرة Calu-3

  1. باستخدام مجهر الفلورة فوق الفلورية المزود بهدف سوبرفلور، ومصدر ضوء ثابت في الحالة الصلبة، وكاميرا فلورية CMOS (حجم بكسل 6.5 ميكرومتر). يتم ضبط شدة الإضاءة عند 500 ميلي واط.
  2. ضع لوحة الخلايا على المسرح باستخدام محول الألواح ذو 96 بئر. باستخدام برايتفيلد، ركز على طبقة الخلية بتكبير منخفض لإيجاد الطبقة الأحادية من الخلايا (استخدم هدف الهواء 5-10x).
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية، لكنها مفيدة للحصول على تركيز أولي على طبقة الخلية بكفاءة.
  3. بمجرد تحديد طبقة الخلية، استخدم برايتفيلد وانتقل إلى تكبير أعلى (هدف هوائي بمقدار 20x) وأعد التركيز على طبقة الخلية.
    ملاحظة: تأكد من التركيز المناسب على طبقة الأحادية باستخدام برايتفيلد؛ يجب أن تكون حدود الخلايا واضحة.
  4. حدد إشارة صبغة الكالسيوم باستخدام GFP (LED 475 نانومتر). تأكد من أن طاقة LED تنخفض بين 5٪-10٪ لتجنب التبييض الضوئي، وأن وقت التعريض مناسب لرؤية الإشارة الخضراء الأساسية دون تشبع زائد للإشارة، عادة بين 300-500 مللي ثانية.
    ملاحظة: لضمان قابلية التكرار وحتى تحميل الصبغة، قم بتحليل طبقة الخلية بشكل نوعي؛ معظم الخلايا يجب أن تظهر نفس السطوع. ركز على مجالات الرؤية ذات الخلايا الميتة المحدودة، والتي ستتألق بكثافة قبل إضافة أي منبه. يمكن قياس شدة الفلورة الأساسية النسبية باستخدام فيجي (الخطوة 7.9). يجب أن يكون التغير الأساسي بين الخلايا قريبا من 10٪-15٪ إذا تم تحميل الصبغة بشكل متساو (الخطوة 7.9).
  5. تحديد صبغة هوشت النووية باستخدام LED DAPI (405 نانومتر). يجب أن تكون طاقة LED بين 2٪-5٪ مع وقت تعريض بين 50-100 مللي ثانية.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا في بؤرة التركيز، يجب أن تظهر النوى بخطوط حادة. تأكد من أن الإشارة النووية لا تصل إلى التشبع، حيث يمكن للنوى أن تتداخل مع القناة الخضراء.

4. الحصول على فيديو الكالسيوم الحي

  1. ابدأ فيديو مباشر بفاصل إطار واحد كل 5 ثوان (0.2 إطار في الثانية) لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: التقط كل قناة فلورية (DAPI 405 نانومتر وGFP 475 نانومتر) في كل إطار.
  2. بمجرد بدء الفيديو، اسمح بقراءة أساسية لمدة 5 دقائق قبل إضافة المنشطات.
  3. باستخدام ماصة P200، أضف 50 ميكرولتر من التابسيغارجين عند مخزون متوسط 3x إلى البئر الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من بروبينيسيد 2.5 ملليمول في مخزن الكالسيوم (الخطوة 2.1). أعد تعليق الدواء بلطف مرة أو مرتين داخل البئر لضمان توزيع الدواء بشكل متساو. تابع القراءة لمدة 5 دقائق بعد إضافة ثابسيغارجين.
    ملاحظة: خطوة إضافة الدواء أمر حاسم؛ يجب ألا يلامس طرف الماصة اللوح لتغيير مستوى التركيز. بدلا من ذلك، قم بتعويم طرف الماصة بحيث لا يلامس سوى المخزن داخل البئر. إذا تم خلط الأدوية بقوة زائدة، يمكن للخلايا أن تنفصل عن الصفيحة وتتداخل مع الإشارة.
    ملاحظة: تأكد من ملاحظة الإطار الذي يضاف فيه الدواء للتحليل اللاحق.
  4. احفظ الفيديو واللقطة التي التقطت قبل التجربة. تابع إلى تحليل البيانات.

5. بروتوكول تحميل خلايا مجرى الهواء الأولية ب Cal 520 AM أو Fluo-4 AM

  1. في يوم التجربة، أزل الوسط الجانبي من البئر العابر وغسل الجانبين القمي والجانبي للإدخال مرتين باستخدام 750 ميكرولتر الجانبي الجانبي و300 ميكرولتر من الحافة القذرية من مخزن الكالسيوم (الخطوة 2.1).
  2. حضن الخلايا ب 600 ميكرولتر الجانبي القاعدي و200 ميكرولتر قميع من أصباغ Cal-520 AM أو Fluo-4 AM لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2. جهز الصبغة بنفس الطريقة التي تحضرها خلايا Calu-3، ل-Cal-520 AM، 3 ميكرومولار Cal-520 AM، بروبينيسيد 2.5 ملليمول، و1:5000 هوشست في محلول الكالسيوم (الخطوة 2.1). بالنسبة لفلو-4 AM، 3 ميكرومولار فلو-4 AM، 2.5 ملليمولار بروبينيسيد، و1:5000 هوشت في نفس مخزن الكالسيوم.
  3. خلال فترة الحضانة، حضر التابسيغارجين في مخزون متوسط 3× لتركيز نهائي 2 ميكرومولار (6 ميكرومولار وسيط المخزون).
  4. بعد ذلك، استنشق الصبغة وغسل الخلايا مرتين بمحلول 300 ميكرولتر قمي و750 ميكرولتر يحتوي على الكالسيوم (الخطوة 2.1).
  5. بعد الغسولات، أضف 100 ميكرولتر قمي و500 ميكرولتر من البازولتر الجانبي من بروبينيسيد 2.5 ملليمول في عازل الكالسيوم (الخطوة 2.1).
  6. للحفاظ على ناقل الحركة جيدا داخل اللوحة، لف اللوحة بورق الألمنيوم. الخلايا الآن جاهزة للتصوير.

6. إعداد المجهر للإدخال الأنفي الأولي

  1. احصل على طبق بترى ذو قاع زجاجي مناسب للتصوير، الملقط، والشريط اللاصق الرقيق. تأكد من نظافة طبق البتري عن طريق مسحه بسرعة بنسبة 70٪ إيثانول وتركه ليجف تماما.
  2. ضع طبق بتري ذو القاع الزجاجي داخل المحول الدائري الصغير لمجهر الفلورية.
  3. باستخدام الملقط، ضع الإدخال بعناية في وسط الطبق ذو القاع الزجاجي.
    ملاحظة: كن حذرا من انسكاب الحاجز المؤقت الموضوع في الحجرة القمية للإدخال.
  4. لضمان عدم تحرك الإدخال أثناء إضافة الدواء، استخدم شريط لاصق لتثبيت الجزء العلوي من البلاستيك الخاص بالإدخال على جانبي الطبق ذو القاع الزجاجي.
  5. ضع المحول مع الإدخال المثبت على مرحلة المجهر وابدأ بالتركيز على الخلايا باستخدام هدف الحقل الساطع بزاوية 10 أضعاف الهواء.
  6. حدد إشارة صبغة الكالسيوم باستخدام GFP (LED 475 نانومتر). تأكد من أن طاقة LED تنخفض بين 5٪-10٪ لتجنب التبييض الضوئي، وأن وقت التعريض مناسب لرؤية الإشارة الخضراء الأساسية دون تشبعها، عادة بين 300-500 مللي ثانية.
    ملاحظة: يرجى مراجعة الملاحظة تحت الخطوة 3.4 لضمان تحميل صبغة الكالسيوم بشكل صحيح.
  7. تحديد صبغة هوشت النووية باستخدام LED DAPI (405 نانومتر). يجب أن تكون طاقة LED بين 2٪-5٪ مع وقت تعريض بين 50-100 مللي ثانية.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا في بؤرة التركيز، يجب أن تظهر النوى بخطوط واضحة ومحددة. ركز على الطبقة القمية الأكثر قمية من الخلايا. قم بضبط محور z للمجهر لتحديد أعلى مستوى بؤري حيث تبقى الخلايا في تركيز حاد. تأكد من أن النوى لا تصل إلى تشبع الإشارة، لأن الإشارة النووية قد تتداخل مع القناة الخضراء.
  8. للحصول على فيديو الكالسيوم الحي، اتبع الخطوات 5.1-5.4. أثناء خطوة إضافة الدواء، أضفه في مركز الإدخال وأعد تعليقه ببطء باستخدام ماصة P200.
    ملاحظة: تأكد من ملاحظة الإطار الذي يضاف فيه الدواء للتحليل اللاحق.

7. التحليل باستخدام برنامج فيجي

  1. افتح تطبيق فيجي واختر الملف \ فتح، ثم رفع ملف الفيديو، وفي نافذة المنبثقة الناتجة، احتفظ بجميع الإعدادات الافتراضية.
  2. إذا رغبت، تحت الصورة \ الضبط \ السطوع/التباين، قم بتعديل سطوع وتباين قنوات الفلورة المنفصلة للحصول على أفضل رؤية للخلايا.
  3. لتسهيل تتبع الخلايا، قم بدمج قنوات الصبغة النووية أو الحقل الساطع باستخدام Image \ Colour \ Merge Channels واختر الملفات المناسبة لكل قناة على حدة في النافذة المنبثقة.
  4. لتتبع خلايا محددة بناء على حدود الخلايا والتصبغ النووي، استخدم Analyze \ Tools \ ROI Manager وحدد كل من عرض كل وتسميات في النافذة المنبثقة الناتجة.
  5. تتبع الخلايا بعناية باستخدام أداة الاختيار الحر واضغط t لإضافة خلية.
    ملاحظة: تأكد من تتبع الخلايا في جميع الزوايا الأربع ومركز الفيديو.
  6. بعد تتبع جميع الخلايا بدقة، داخل التبويب المفتوح مع جميع العائد على الاستثمار، اضغط على More \ Multi Measure، واضغط OK على النافذة المنبثقة الناتجة.
  7. انسخ الورقة كاملة في نافذة المنبثقة الناتجة بعنوان النتائج إلى ملف إكسل.
    ملاحظة: الورقة الناتجة ستحتوي على 6 عناوين فرعية (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) لكل عائد على الاستثمار مع قيمة رقمية بعد كل منها، والتي تتوافق مع الخلية التي تم تتبعها. القيمة المهمة للتحليل اللاحق ستكون متوسط كل عائد استثمار.
  8. لمراقبة التفاوت بين شدة الفلورة، احسب متوسط الفلورة خلال خط الأساس لكل خلية، واحسب نسبة التباين. عادة ما يكون هناك تباين بين 20٪ إلى 30٪.
    figure-protocol-1
  9. تطبيع جميع القراءات عن طريق قسمة قيم الشدة المتوسطة على القراءة الأولى لخط الأساس لكل خلية تم تتبعها.
  10. أنشئ عمودا إضافيا للزمن بالثواني، حيث تزداد الإطارات الأولى للإطار 0 والنقاط الزمنية التالية بمقدار 5، وهو ما يعادل فترة 0.2 إطار في الثانية.
  11. انسخ البيانات إلى برنامج تحليل ورسم بياني وأنشئ منحنى تغير في الفلورة مقارنة بالأساس مع مرور الوقت.
    ملاحظة: لإنشاء مخططات عظمى لخلية واحدة، استخدم دالة =MAX() في إكسل لإيجاد الإطار الذي يتم عنده الوصول إلى أقصى شدة فلورية لكل خلية ورسم باستخدام منشور GraphPad.

8. التحليل باستخدام مجموعة الكالسيوم

  1. باستخدام فيجي، افتح ملف الفيديو واتبع الخطوات 8.1 و8.2.
  2. بمجرد تحسين القنوات النووية والخضراء للمشاهدة، قم بنسخ إطار واحد من الفيديو بالنقر على Image \ Duplicate. في النافذة المنبثقة الناتجة، قم بإلغاء تحديد مكدس التكرار الفائق. داخل نفس النافذة المنبثقة، تحت القنوات، النوع 1. احفظه كملف صورة PNG.
  3. كرر الخطوة 9.2 وتحت القنوات، النوع 2.
    ادمج الصورتين باتباع الخطوة 8.3. رفع الصورة إلى واجهة المستخدم الرسومية (Cell-Pose GUI) لإنشاء قناع خلوي.
  4. قم بتحميل الصورة إلى واجهة المستخدم الرسومية لوضعية الخلية، وتقسيم الصورة باستخدام الصبغة النووية (القناة 1) والصبغات السيتوبلازمية (القناة 2) باختيار نموذج Cyto3.
  5. احفظ الصورة كملف PNG، ثم افتح ملف PNG في فيجي وحولها إلى ملف TIFF.
    ملاحظة: واجهة المستخدم الرسومية في وضعية الخلية تنتج ملف PNG بالأبيض والأسود.
  6. افتح كل من ملف القناع وملف الفيديو في مجموعة الكالسيوم عن طريق السحب والإفلات، ثم انقر على تحليل البيانات لإنشاء مخطط قابل للتحميل، بالإضافة إلى ملف .csv قابل للتنزيل يحتوي على قيم شدة مطبعة وخام لجميع الخلايا التي يعدها البرنامج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقياس حركة الكالسيوم في الخلايا الحية، يتم حضن خلايا Calu-3 أو الثقافات الأنفية الأولية المتمايزة بصبغة داخل الخلية. يقاس التغير النسبي في الإشارة المعتمدة على الكالسيوم كزيادة في تحريك الكالسيوم إما من مخزون الكالسيوم داخل الخلية أو من الفضاء خارج الخلية إلى السيتوسول. تمثل زيادة مستمرة في الكالسيوم في السيتوسول بزيادة في التألق بعد إضافة تابسيغارجين، وهو مثبط غير قابل للعكس المميز لبروتين SERCA (ساركو/إنزيم الكالسيوم ATPase المقيم في ER)،21. هنا، يظهر أن اختبار ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمت هذه المقالة طرقا لتحليل إشارات الكالسيوم أحادية الخلية في الزراعة الأنفية والقصبات الهوائية الأولية الحية بالإضافة إلى خط خلايا ظهاري مستقر. كل من مراسلي الكالسيوم Cal-520 AM و Fluo-4 AM هما مؤشرات كالسيوم مفيدة في كلا النظامين. Cal-520 AM أكثر حساسية لأنه يمتلك إنتاجية كمية أعلى تبلغ 0.75 مقارنة ب Fluo-4 AM البالغ 0.16 وأقرب قليلا للكالسيوم (Kd ل Cal-520 AM هو 320 نانوميل و Fluo-4 AM هو 345 نانومال). علاوة على ذلك، يقال إن Cal-520 AM قد تحسن في احتباس الخلايا مقارنة ب Fluo-4 AM

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالمساعدة في زراعة الأنسجة الأنفية الأولية بواسطة تاريني غوناواردينا. وكذلك وو شو من جامعة آيوا لزراعته وشحن الثقافات الأولية بسخاء. وكذلك غابرييل لانغفيلد وديان ليو للمساعدة في التحليل وتصميم محولات التصوير. نود أيضا أن نشكر منشأة التصوير في مستشفى الأطفال المرضى. كما نعترف بتمويل من منظمة التليف الكيسي في كندا ومؤسسة التليف الكيسي الأمريكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوحة 24 بئرا  Thermofisher 142475
إدخالات بئر ترانسويل ب 24 بئر  كورنينغ CLS3470-48EA
الميكرولوفائد المعالجة ب TC المعالجة ب 96 بئر من البوليسترين الأسود الشفاف والقاع المسطحكورنينغ 3603
كال-520 AMAAT Bioquest 21130تم الاقتباس وتخزينه عند -20 درجة؛ C، تم حله في DMSO
برنامج مجموعة الكالسيوميمكن طلب الرمز من خلال التواصل مع مجموعة مختبرنا
EMEM، 1xsWisent 320-005-CLمخزن عند 4&00; C 
مصل البقر الجنيني  Wisent 080-450تم الاقتباس وتخزينه عند -20 درجة؛ C
فلو-4 AM AAT Bioquest 20550تم الاقتباس وتخزينه عند -20 درجة؛ C، تم حله في DMSO
هيبسبيوشوبHEP001.5مخزنة في درجة حرارة الغرفة
هوشست Thermofisher H3570مخزن عند 4&00; C 
خط خلايا سرطان القولون والمستقيم الظهاري البشري &nb;ATCCHTB-55
كلوريد المغنيسيوم  سيغما & nbsp;7786-30-3مخزنة في درجة حرارة الغرفة
ميكرو ديش 35 مم، قاع زجاجي منخفضإيبيدي 80137مخزنة بدرجة حرارة الغرفة  
محلول البنسلين-ستريبتوميسينWisent 450-200-ELمخزن عند 4&00; C
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Wisent 3111-010-CLمخزنة بدرجة حرارة الغرفة  
كلوريد البوتاسيوم  سيغما & nbsp;7447-40-7مخزنة بدرجة حرارة الغرفة  
Probenecid ثيرموفيشرP36400تم الاقتباس وتخزينه عند -20 درجة؛ C، قابل للذوبان في الماء وnbsp;
كلوريد الصوديوم بيوشوب  SOD004مخزنة بدرجة حرارة الغرفة  
ثابسيغارجين ثيرموفيشرT7458تم الاقتباس وتخزينه عند -20 درجة؛ C تم حلها في DMSO 
إنزيم TripLE Express (1X)، فينول أحمر ثيرموفيشر12605010مخزن عند 4&00; C

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).
  2. Jairaman, A., Prakriya, M. Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).
  3. Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium. Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).
  4. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), e1796(2008).
  5. Ren, C., et al. Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis. Phytomedicine. 135, 156088(2024).
  6. Dwivedi, R., et al. The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells. Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).
  7. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, e1067(2009).
  8. Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2. Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).
  9. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  10. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions. J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).
  11. Liao, J., et al. A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux. BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).
  12. Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. Physiological and immunological barriers in the lung. Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).
  13. Quach, H., et al. Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity. Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).
  14. Deprez, M., et al. A single-cell atlas of the human healthy airways. Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).
  15. Prescott, R. A., et al. A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution. Respir Res. 24 (1), 213(2023).
  16. Gunawardena, T. N. A., et al. Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis. Cells. 12 (8), 1174(2023).
  17. Laselva, O., et al. Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action. J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).
  18. Terrance, M., et al. Primary human nasal epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).
  19. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).
  20. Perniss, A., et al. A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium. Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).
  21. Sehgal, P., et al. Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response. J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).
  22. Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/cal-520-am (2025).
  23. Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552 (2025).
  24. Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model. Cells. 8 (10), 1292(2019).
  25. Becker, M. E., et al. Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread. Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).
  26. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة