يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج زراعة وريدية لحديثي الولادة لتقييم الأنشطة المناعية المبكرة ضد الخلايا السرطانية

245 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69478

⸱

يونيو 26, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Michael Cuccione Childhood Cancer Research Program, BC Children's Hospital Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of British Columbia

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول حقن الوريد الصدغي لتوصيل خلايا سرطان الأطفال عن طريق الوريد إلى الفئران حديثة الولادة، مما يمكن من نمذجة دقيقة وقابلة للتكرار لاستجابات المناعة المبكرة ضد السرطان. تمكن الطريقة من تقييم تأثير التدخلات، مثل تعديل المناعة أو العلاج، عند تطبيقها خلال فترة حديثي الولادة.

الملخص

أكثر من نصف جميع سرطانات الأطفال تبدأ في الرحم، مع استمرار التقدم نحو المرض الظاهر خلال فترة حديثي الولادة. بينما تقدم العلاجات المناعية الآن خيارات علاجية جديدة للعديد من الأطفال المصابين بالسرطان، لا يزال مدى تأثير المناعة المبكرة على تقدم السرطان واستجابة العلاج غير مفهومة بشكل كامل. سيتطلب سد هذا الفجوة تقييم التدخلات العلاجية خلال فترة الولادة، حيث تختلف الاستجابات المناعية بشكل جوهري عن تلك في مرحلة الطفولة والبلوغ المتأخرة.

هنا، نصف نموذج زراعة الزراعة لحديثي الولادة يتكامل مع التصوير الحيوي المتوهج في الجسم الحي لدراسة تأثير تعديل المناعة في مرحلة الحياة المبكرة على سرطانات الأطفال.

حقق حقن الأوردة الصدغية لخلايا موسومة باللوسيفيراز مشتقة من اثنين في سرطانات البداية بالرحم زرع أورام قابل للتكرار في متلقي تركيبي بعمر يوم إلى يومين، دون وفيات مرتبطة بالإجراءات ونجاح إجرائي مرتفع كما أكدته التصوير الحيوي المضيء. باستخدام تعديل المناعة المدفوع بالعدوى كمتغير تجريبي، نظهر بعد ذلك أن العدوى داخل الصفاق بفيروس الحصان الضخم للفأر بعد خمسة أيام من الزرع تؤدي إلى انخفاض ملحوظ في عبء سرطان الدم اللمفاوي الحاد (ALL)، ولكن ليس في الورم العصبي (NB). تمكن هذه المنصة من دراسة الفروق الخاصة بالسرطان في الاستجابة لتعديل المناعة في الحياة المبكرة وتؤكد أهمية سياق الورم عند نمذجة التفاعلات المناعية والسرطانية في الحياة المبكرة.

توفر هذه المنهجية مجتمعة منصة متعددة الاستخدامات وقابلة للتكرار للغاية لفحص آليات المناعة لدى حديثي الولادة ذات الصلة بمراقبة المناعة السرطانية، وتعديل المناعة المدفوع بالعدوى، والتدخل العلاجي. بعيدا عن ALL وNB، يمكن تكييف هذا النهج مع أورام خبيثة إضافية للأطفال واستراتيجيات تعديل المناعة، مما يدعم الدراسات الميكانيكية والتقييم قبل السريري لتدخلات السرطان في الحياة المبكرة.

المقدمة

لقد حسنت التطورات الحديثة في العلاج المناعي نتائج معينة لبعض مرضى السرطان، ومع ذلك فإن تطبيقها الأمثل لدى الأطفال الصغار يتطلب فهما عميقا لكيفية تحديد الجهاز المناعي المتطور للخلايا السرطانية والقضاء عليها. بينما ينشأ حوالي 50٪ من سرطانات الأطفال في الرحم، بما في ذلك سرطان الدم اللمفاوي الحاد لخلايا B (B-ALL) وNB، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الأحداث بعد الولادة تؤثر بشكل حاسم على تطور المرض والنتيجة السريرية 1,2.

تختلف استجابات المناعة لحديثي الولادة كمية ونوعية عن تلك لدى البالغين3. في غياب المناعة التكيفية المتطورة بالكامل، تعتمد حماية المواليد بشكل كبير على الأجسام المضادة للأم والخلايا المناعية الفطرية. ومع ذلك، فإن هذه المؤثرات الفطرية أقل كفاءة وظيفيا من نظيراتها البالغة بسبب ضعف استجابة الخلايا الذاتية وتنشيط مسارات مثبطة للمناعة بشكل متزايد، مما يجعل الأطفال المولودين عرضة بشكل خاص للعدوى 4,5,6. ومع ذلك، لا يزال تأثير هذه الخصائص على قدرة الجهاز المناعي غير الناضج على تنفيذ استجابات فعالة مضادة للسرطان غير مفهوم جيدا.

يتطلب نمذجة المناعة المضادة للسرطان في الحياة المبكرة توصيل الخلايا السرطانية ومعدلات المناعة أو مسببات الأمراض بدقة وقابلة للتكرار خلال فترة ما بعد الولادة القصيرة، عندما تكون وظيفة المناعة محدودة. حقن الوريد الصدغي هو طريقة توصيل وريدية لحديثي الولادة تلبي هذه المتطلبات بشكل أفضل، وتوفر نجاحا إجرائيا عاليا، ومعدل وفيات منخفض، وأقل توتر في التعامل، وتوافقا مع التدخلات المتسلسلة مثل تحدي العدوى أو الإعطاء العلاجي 7,8,9,10.

في هذه الدراسة، قمنا بالبناء على تقنيات الولادة الوريدية التي تم التحقق منها سابقا ومرونة التصوير الحيوي في الجسم الحي، وتعديلنا على تقنيات التوليد الوريدي الحيوي لوصف نموذج زرع لدراسة تأثير العدوى في الحياة المبكرة على تقدم خلايا السرطان لدى الأطفال. يتيح هذا النهج توصيل خلايا B-ALL أو NB الموسومة باللوسيفيراز عن طريق الوريد إلى الجراء الذين تبلغ أعمارهم يوما إلى يومين، تليها تعديل المناعة من خلال إعطاء فيروس ضخم الخلايا في الفأر (mCMV) عبر الصفاق (i.p.) في اليوم السابع بعد الولادة (P7). تم تقييم تقدم السرطان بعد 10 أيام من العدوى (P17).

على الرغم من أن الوصول إلى الوريد الصدغي محدود بفترة محدودة بعد الولادة (P0–P3)، إلا أن هذه المنهجية تعزز قابلية التكرار والسيطرة التجريبية، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات لدراسة تأثير آليات المناعة في الحياة المبكرة على المراقبة المناعية للسرطان، والتفاعلات بين العدوى والسرطان، والاستجابة للعلاج المناعي. بالإضافة إلى ذلك، يدعم هذا النهج التتبع الفعال للخلايا المزروعة، مما يمكن من إنشاء نماذج مرضية قابلة للتكرار للتحقيقات الميكانيكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات (الشكل 1) وفقا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوانات وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات بجامعة كولومبيا البريطانية (البروتوكول A23-0169).

1. توليد خلايا اللوكيميا الموسومة باللوسيفيراز

  1. عزل خلايا اللوكيميا من فئران Eμ-Ret المصاحبة لللوكيميا
    1. تخدير الفئران في غرفة تحفيز بسعة 1 لتر تحتوي على 5٪ إيزوفلوران و1 لتر·دقيقة 1 أكسجين حتى يتم الوصول إلى مستوى جراحي عميق (فقدان منعكس الاستقامة والتنفس البطيء والمنتظم).
    2. بمجرد تأكيد التخدير العميق، يتم التوقف عن الإيزوفلوران وإعطاء ثاني أكسيد الكربون (CO₂) بمعدل تدفق مرتفع (3–4 أضعاف معدل الإزاحة التدريجي القياسي؛ مثل 6-8 لتر·دقيقة لغرفة بسعة 10 لتر) دون نقل الحيوان بين الغرف. حافظ على التعرض لثاني أكسيد الكربون لمدة لا تقل عن 5 دقائق بعد توقف التنفس لضمان الوفاة.
    3. قم بتفريغ وإزالة الغازات المهدرة قبل فتح الحجرة.
    4. تأكيد الوفاة بسبب غياب نبض القلب والتنفس، ثم قم بخلع عنق الرحم كإجراء فيزيائي ثانوي وفقا للعلاجات المؤسسية.
    5. انقل الجثة إلى خزانة أمان حيوي، وأعد تأكيد الوفاة، وسجل الجنس ووزن الجسم، ورش الخارج بنسبة 70٪ إيثانول.
    6. قم بعمل شق بطني في منتصف الخط، واعكس الجلد وجدار الصفاق، وقم باستئصال الطحال إلى 5 مل من PBS معقمة.
    7. قم بتشريح عظم الساق والفخذ من كلا الساقين، وإزالة الأنسجة الزائدة، واستئصال الطحال في ظروف معقمة. انقل الطحال فورا إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) معقم بارد بحجم 5 مل للحفاظ على بقاء الخلايا.
    8. معالجة الطحال.
      1. قم بتجانس نسيج الطحال في 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) بحجم 1× (استخدم 2 مل للطحال > 200 ملغ). حضن لمدة 2–3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      2. إزالة التبريد بإضافة 10 مل PBS + 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS) (مخزن FACS)، والترشيح عبر مصفاة بحجم 40 ميكرومتر، وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      3. أعد تعليق حبيبات الطحال في مخزن FACS بسعة 5 مل.
    9. معالجة نخاع العظم.
      1. قم بإزالة كلا الجسمين من الإبيفيزيز وغسل كل عظمة بمحلول FACS بسعة 1 مل باستخدام حقنة بسعة 1 مل مزودة بإبرة قياس 29 في أنبوب بسعة 15 مل.
      2. قم بطرد مركزي في تعليق الخلية، وتخلص من المادة الفائقة وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من مخزن تحليل 1× RBC، واحتضن الخلايا لمدة دقيقتين عند RT، ثم إزالة التهدئة بإضافة 10 مل من FACS، والترشيح عبر مصفاة بحجم 40 ميكرومتر، والطرد المركزي عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      3. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة BM في مخزن FACS بسعة 1 مل عن طريق التوصيل بالماصات صعودا وهبوطا.
      4. استخدم دوامة بلطف وقم بتصفية من خلال مصفاة بحجم 40 ميكرومتر إذا لزم الأمر.
      5. أعد تعليق 0.5 × 10^6 خلايا لوكيميا في وسط زراعة الخلايا بسعة 200 ميكرولتر (مثل وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو) مع 20٪ FBS وإنترلوكين-7 (IL-7؛ 250 pg·m-1).
        نقطة التوقف: حافظ على تعليق الخلايا على الثلج لمدة تصل إلى ساعتين قبل الصبغ.
  2. نقل الفيروس اللينتي لخلايا اللوكيميا:
    1. خلايا البثمر المشتقة من نخاع عظم الفئران عند 1 × 10^5 خلايا في كل بئر في صفيحة ب 24 بئرا قبل 24 ساعة من النقل للسماح بالالتصاق وتحقيق التقاء بنسبة 70–80٪.
    2. خلايا لوكيميا الصفائح (0.5 × 10^6 خلايا في حجم نهائي 200 ميكرولتر) في صفيحة غير نسيجية معالجة ب 24 بئر.
    3. أضف ناقل فيروسات عدسة ذاتي التعطيل (SIN) يشفر مراسلا مزدوجا يتكون من لوسيفيراز خنفساء النقر الأحمر (CBR) وبروتين فلوري أخضر معزز (eGFP)، مدفوع بمحفز يوبيكويتين مكون، مع تعدد العدوى (MOI): 10–20، عيار الفيروس: ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (وحدات تحويل لكل مليلتر) في حجم النقل النهائي 200 ميكرولتر مع بولي برين (8 ميكروغرام·مل-1؛ سيغما، H9268-5G).
      تحذير: بوليبرين سام للخلايا عند تركيزات عالية. لا تتجاوز 8 ميكروغرام·مل-1. التعامل مع لينتيفيروس تحت احتواء مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2).
    4. أغلق اللوح بطبقة بارافيلم وجهاز طرد مركزي عند 1200 × جرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. بعد التقطيع الدماغي، تم نقل الخلايا البيضاء المحولة إلى طبقة وزراعة في الستروما لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO₂ في DMEM + 20٪ FBS + IL-7 (250 pg·m-1) لدعم بقاء الخلية والتعبير عن التقرير.
      ملاحظة: يمكن إضافة المضادات الحيوية بعد 24 ساعة إذا لزم الأمر، ولكن يجب تجنبها أثناء نقل الفيروس.
    6. بعد 24 ساعة، اجمع خلايا اللوكيميا غير الملتصقة واغسل مرتين بمحلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS)، 350 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية، لإزالة الفيروس المتبقي والبوليبرين.
    7. أعد تعليق الخلايا في PBS المعقمة عند 1 × 10^7 خلايا·مل-1 للزراعة.
      نقطة التوقف: بعد الغسل، يمكن الحفاظ على الخلايا تحت نفس حالة الزراعة حتى 48 ساعة قبل الزراعة إذا لزم الأمر.
  3. الزرع في فئران NSG البالغة (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)
    1. استخدم فئران NSG التي تبلغ من العمر 4–6 أسابيع كمستقبل.
    2. سخن الفأر لمدة 5 دقائق باستخدام وسادة تدفئة أو مصباح حراري لتوسيع الأوردة الذيلية.
    3. تقييد الفأرة باستخدام مقيد أكريليك.
    4. حقن 1 × 10^6 خلية في PBS معقمة بسعة 100 ميكرولتر عبر وريد الذيل الجانبي باستخدام حقنة إنسولين 29 مقياس القياس. لا حاجة للتخدير (إلا إذا كانت هناك إرشادات مؤسسية مطلوبة)
    5. طبق ضغطا لطيفا على موقع الحقن لمنع النزيف.
      تحذير: تجنب التمدد الدوائي. الحقن الوريدي الناجح لا يؤدي إلى تورم ظاهر.
    6. راقب الفئران مرتين أسبوعيا لتطور المرض.
  4. فرز خلايا GFP+ اللوكيمية
    1. عند ظهور المرض، قم بجمع نبيض الدماغ أو الطحال من فئران NSG المصابة باللوكيميا.
    2. جهز نظام تعليق أحادي الخلية كما هو موضح أعلاه.
    3. صبغة الخلايا بصبغة الصلاحية (7-AAD).
    4. استخدم فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لفرز خلايا GFP+ اللوكيمية.
    5. للفرز، استخدم فرز الخلايا عالي السرعة واتبع استراتيجية البوابات مثل التشتت الأمامي (FSC) مقابل التشتت الجانبي (SSC) → استبعاد الحطام، FSC-A مقابل FSC-H → تحديد الخلايا المفردة، سلبي صبغة البقاء → بعض الخلايا الحية، بوابة GFP+ → عزل خلايا اللوكيميا الإيجابية للتقرير.
    6. اجمع الخلايا المفرتبة في أنابيب تحتوي على DMEM + 20٪ FBS. نقاء ما بعد الفرز المستهدف: ≥ 95٪ خلايا GFP+.
      نقطة التوقف: يمكن الاحتفاظ بالخلايا المفترسة على التجميد حتى ساعتين قبل الحفظ بالتجميد.
  5. الحفظ بالتبريد للخلايا المصنفة
    1. أعد تعليق الخلايا المفترزة عند 5 × 10^6 خلايا/مل في وسط تجميد يحتوي على 90٪ FBS و10٪ ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO).
    2. أليكوت 1 مل لكل مبرد وضع القوارير في حاوية تجميد تعتمد على الإيزوبروبانول وتخزينها عند −80 درجة مئوية طوال الليل (12–18 ساعة).
    3. نقل القوارير إلى النيتروجين السائل (LN₂) للتخزين طويل الأمد.
      تحذير: DMSO سام ويمتص بسهولة عبر الجلد. تعامل مع القفازات واستخدم بسرعة.
      نقطة التوقف: قد تخزن الخلايا لفترة طويلة في النيتروجين السائل حتى تستخدم في تجارب زراعة حديثي الولادة.

2. توليد خلايا NB الموسومة باللوسيفيراز

ملاحظة: الفئران المعدلة وراثيا من TH-MYCN تطور أورام غير وراثية تلقائية وتم الحفاظ عليها وفقا لبروتوكولات رعاية الحيوانات المؤسسية المعتمدة. ناقل الفيروسات اللينتي المستخدم هو نفسه كما هو موصوف في القسم 1.2.

  1. حصاد الأورام وتفكك الأنسجة
    1. قتل الفئران الحاملة للأورم TH-MYCN وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات المعتمدة.
    2. احصاد أورام الNB تحت الجلد أو البطن في ظروف معقمة.
    3. وزن نسيج الورم وقطعه إلى قطع بحجم ~1–2 مم باستخدام مقص معقم.
    4. نقل النسيج إلى حوالي 5 مل من محلول الهضم لكل نسيج ورمي بوزن 0.5 جرام في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل، يتكون من DMEM، ديوكسي ريبونوكلياز I (DNase I؛ 50–100 U·mL-1)، ومزيج إنزيمات قائم على الكولاجيناز (تركيز نهائي 10 ميكروغرام·مل-1 ).
    5. حضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز بسرعة 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
      تحذير: قد تسبب مواد هضم إنزيمية تهيجا في الجلد والعين. ارتد قفازات وحماية للعين.
    6. بعد الهضم، قم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل لزيادة تفكيك الأنسجة. تعليق الفلتر عبر مصفاة خلية بحجم 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد.
    7. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20–22 درجة مئوية).
    8. تخلص من السوبرناتينت وأعد تعليق الحبوب في DMEM مع إضافة 10٪ FBS.
    9. إجراء تحليل RBC باستخدام مخزن تحليل RBS كما هو موضح سابقا في القسم 1.1.
    10. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق الحبيبات في 10 مل DMEM عالي الجلوكوز مع 10٪ FBS و50 ميكرومولار 2-ميركابتوإيثانول.
      تحذير: 2-ميركابتوإيثانول سام ومتطاير. قم بالتعامل مع غطاء بخار كيميائي.
      نقطة التوقف: يمكن إبقاء الخلايا على الثلج لمدة تصل إلى ساعة واحدة قبل التحويل.
  2. تحويل اللينتيفيروس
    1. الحبيبات 2 × 10^6 خلايا NB عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الفائقة تماما.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية مباشرة في ناقل فيروسي عدسي مركز بسعة 14 ميكرولتر (نفس الناقل الموصوف في القسم 1.2؛ عيار الفيروس ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1، تقريبا MOI: 10–20).
    3. احتضن خلية الفيروس لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة (٪ CO₂).
    4. أضف 200 ميكرولتر DMEM عالي الجلوكوز + 10٪ FBS واستمر في الحضانة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂.
      تحذير: يجب التعامل مع ناقلات اللينتيفيروس تحت ظروف BSL 2.
    5. غسل الخلايا المحولة أربع مرات باستخدام DMEM عالي الجلوكوز لإزالة الفيروس المتبقي.
    6. عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق التريباني.
      مهم: حافظ على تحضير المصفوفة على التجميد دائما لمنع التجلي المبكر.
  3. الزرع تحت الجلد في فئران NSG
    1. أعد تعليق الخلايا عند 5 × 10^6 خلايا لكل 100 ميكرولتر في تحضير لمصفوفة الغشاء البارد القاعدي (مصفوفة خارج الخلية المخفضة بعامل النمو).
    2. تخدير فئران NSG التي تبلغ من العمر 6–8 أسابيع (انظر القسم 1.1) باستخدام الإيزوفلوران المستنشق (2–3٪ في الأكسجين).
    3. خلية تحميل ومصفوفة إلى حقنة مبردة مسبقا بسعة 1 مل مزودة بإبرة قياس 27.
    4. حقن 5 × 10^6 خلايا في حجم إجمالي 100 ميكرولتر تحت الجلد في منطقة الجانب.
    5. راقب الفئران حتى التعافي الكامل من التخدير.
      ملاحظة: حقنها مباشرة بعد الخلط مع المصفوفة لمنع التصلب داخل المحقنة.
    6. اسمح للأورام بالنمو حتى قطر ~1 سم.
  4. فرز الخلايا
    1. حصاد الأورام وتوليد تعليق خلية واحدة كما هو موضح في الأقسام 2.1–2.2.
    2. إثراء الخلايا الموسومة باللوسيفيراز بواسطة FACS بناء على تعبير GFP، وفقا لاستراتيجية البوابة الموضحة في القسم 1.4.
    3. قم بجولتين متتاليتين من الفرز لتحقيق نقاء إيجابي بنسبة 95٪ من ≥ GFP.
  5. الحفظ بالتجميد
    1. فرز الخلايا بCryopreserve كما هو موضح في القسم 1.5.
      نقطة توقف: يمكن تخزين الخلايا لفترة طويلة في النيتروجين السائل لتجارب الزرع المستقبلية.

3. جهز تعليق الخلية لحقن الأوردة الصدغية

  1. قم بإذابة الخلايا البيضاء الموسومة باللوسيفيراز أو خلايا NB المحجوزة بالتجميد بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يبقى بلورة جليدية صغيرة.
  2. قم بتعقيم الجزء الخارجي من القارورة فورا بنسبة 70٪ إيثانول، ثم انقل محتوياتها إلى 9 مل من وسط DMEM مسبق التسخين + 10٪ FBS في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
  3. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، استنشاق السوبرناتانت، وإعادة تعليق الحبيبة في PBS معقمة وباردة جدا.
  4. حدد الجدوى باستخدام استبعاد التربان الأزرق ومقياس الدم الخلوي (أو عداد الخلايا الآلي). استخدم فقط أنظمة التعليق ذات صلاحية ≥ 80٪.
  5. مرر تعليق الخلية عبر مصفاة خلوية بحجم 40 ميكرومتر لإزالة التكتلات.
    تحذير: تجمعات الخلايا تزيد من فشل الحقن وإصابة الأنسجة.
  6. اضبط التركيز لتحضير 20 ميكرولتر لكل مولود يحتوي على 1 × 10^4 خلية لوكيميا (لزراعة اللوكيم)، أو 5 × 10^4 خلايا NB (لزراعة اللوكيم).
  7. حافظ على تعليق الخلية على الثلج وامزج بلطف فورا قبل تحميل الحقنة للحفاظ على التجانس.
    نقطة توقف: احتفظ بالخلايا على الثلاجة لمدة تصل إلى ساعتين قبل الحقن إذا بقيت صلاحيتها ≥ 80٪.

4. حقن الوريد الصدغي (جراء P1–P2)

ملاحظة: يمكن إجراء حقن الأوردة الصدغية لحديثي الولادة بدون تخدير. ومع ذلك، يستخدم التثبيت القصير بانخفاض حرارة الحرارة عادة لتقليل الحركة وتحسين دقة الحقن. استخدام التثبيت المنخفض الحراري غير مسموح به من قبل بعض لجان رعاية الحيوانات المؤسسية - يجب على الباحثين استشارة اللجنة المؤسسية المختصة قبل إجراء هذا الإجراء. إذا تمت الموافقة عليها من قبل مؤسستك، فإن الخطوات التالية فعالة لتثبيت الحرارة.

  1. حضر وعاء صغيرا مبطنا بمنديل معقم وقم بتبريده مسبقا بوضعه على الثلج.
  2. جراء المكان (اليوم الأول والثاني بعد الولادة؛ P1–P2) على المنديل داخل الحاوية لتثبيت الحرارة المنخفض لمدة 2–3 دقائق حتى تقل الحركة التلقائية بشكل ملحوظ.
    مهم: لا تسمح للجراء بملامسة الثلج مباشرة (استخدم الحاوية وحاجز المناديل في جميع الأوقات).
  3. تحميل 60 ميكرولتر من نظام تعليق الخلية في حقنة زجاجية بسعة 100 ميكرولتر وربط إبرة قياس 30. أخرج التعليق مرة أخرى إلى داخل الأنبوب لملء الحجم الميت للحقنة والإبرة. بمجرد تجهيز الحجم الميت، استنشق 20 ميكرولتر من تعليق الخلية للحقن، لضمان عدم وجود فقاعات هواء. استخدم فئران BALB/c وTH-MYCN كمستفيدين لخلايا اللوكيميا والخلايا الناروليكية على التوالي.
  4. جهز مرحلة مضاءة بوضع مصدر ضوء بارد تحت منصة زجاجية من البلاستيك.
  5. ارتد نظارات مكبرة (أو استخدم مجهر مجسم) لرؤية موقع الحقن.
  6. ضع منديلا معقما مع فتحة مركزية على المسرح ووضع الجرو بحيث يكون الوريد الصدغي مرئيا.
  7. ضع قطعة صغيرة من طين النمذجة (عجينة اللعب) بجانب رأس الجرو للمساعدة في تثبيت الإبرة أثناء الحقن.
  8. أدخل الإبرة بحافة إلى الوريد الصدغي المرئي وحقن تعليق الخلية ببطء، مع ملاحظة الحشو الوعائي لتأكيد نجاح الولادة الوريدية.
  9. بعد الحقن، اضغط بلطف على موقع الحقن باستخدام مكشوفة قطنية معقمة. ضع الجرو على سطح تعافي دافئ (حوالي 37 درجة مئوية، مثل وسادة التدفئة على درجة منخفضة مع حاجز منشفة) حتى تعود الحركة الطبيعية واللون الوردي.
  10. راقب الجرو لمدة 5–10 دقائق بعد التعافي، ثم أعده إلى الأم.
    تحذير: تجنب ارتفاع درجة الحرارة أثناء التعافي. استخدم طبقة حاجز وراقب باستمرار.
  11. اشطف الحقنة فورا ب PBS، ثم بمحلول تنظيف الحقنة، وأنه ب 70٪ إيثانول.

5. تحضير الفيروسات والعدوى

  1. إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بفيروس الميغالو الخلوي في الفأر (mCMV) تحت احتواء BSL-2 وفقا لموافقات السلامة البيولوجية المؤسسية ورعاية الحيوانات.
  2. التعامل مع مخزونات الفيروسات في خزانة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية المعتمدة وإجراء حالات العدوى الحيوانية في مناطق إجراءات BSL-2 المحددة.
  3. إجراء تحضير الفيروس والتعامل معه في خزانة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية المعتمدة، وإجراء حالات العدوى الحيوانية في مناطق إجراءات محددة ل BSL-2.
  4. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر أو رداء الاستخدام، وقفازات، وحماية للعين. عامل جميع المواد التي تحتوي على فيروس (الحقن، الفراش، الأقفاص، والأسطح) على أنها قد تكون معدية.
  5. قلل من استخدام الإبر الحادة وتخلص منها فورا في حاويات المواد الحاملة البيولوجية المعتمدة. قم بتطهير أسطح العمل والمعدات بعد الاستخدام. التخلص من جميع النفايات الصلبة والسائلة كنفايات بيولوجية خطرة وفقا للإجراءات المؤسسية.
  6. إصابة الفئران عند P7 (بعد 5–6 أيام من زراعة خلايا اللوكيميا).
  7. قم بإذابة الفيروس على الثلج، ثم اخلط بلطف عن طريق الانقلاب، واحتفظ به على الثلج أثناء التحضير. تجنب تكرار دورات التجميد-الذوبان (استخدم الليكوات للاستخدام الواحد).
  8. جهز mCMV عند 2 × 10^5 وحدة تشكيل لويحات (PFU)/mL في PBS وحقن الجراءات داخل الصفاق (i.p.) ب 1 × 10^4 PFU في 50 ميكرولتر PBS باستخدام إبرة 30 مقياس قياس. حقنها في الربع السفلي الأيمن من البطن بزاوية ضحلة لتجنب الأعضاء البطنية.
    تحذير: mCMV معد (BSL-2). استخدم احتواء وإزالة التلوث المناسبين.
  9. سجل تحديد هوية الحيوان، العمر، المجموعة التجريبية، جرعة الفيروس، حجمها، وتفاصيل الحقن.

6. تصوير التلألؤ الحيوي (BLI)

ملاحظة: قم بإجراء اختبار BLI عند P7 (بعد 5–6 أيام من حقن الخلايا وقبل العدوى) وعند P17 (بعد 10 أيام من العدوى) كما هو موضح أدناه.

  1. ذاب D-لوسيفيرين في PBS عند 10 ميكروغرام·μL-1. يتم تعقيم الفلتر باستخدام فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر، مع التعقيم الكهربائي، وتخزينه عند −20 درجة مئوية محمي من الضوء.
    تحذير: د-لوسيفيرين حساس للضوء. قلل من التعرض للضوء أثناء التحضير والاستخدام.
  2. حقن D-luciferin i.p. عند 50 ميكرولتر لكل جرعة باستخدام إبرة قياس 30.
  3. تخدير الجراء باستخدام الإيزوفلوران (الحث 3–4٪، الصيانة 1.5–2٪) في الأكسجين (0.8–1.0 لتر·دقيقة-1). الحفاظ على درجة حرارة الجسم في مرحلة التصوير الساخن (حوالي 37 درجة مئوية).
    تحذير: الإيزوفلوران مخدر متطاير. استخدم جهاز تبخير ونظام جمع معتمد.
  4. ضع الجراء المخدرة في نظام تصوير حيوانات صغيرة (تفاصيل الجهاز في جدول المواد).
  5. التقاط صور مضيئة حيوية وصور أشعة إكس باستخدام إعدادات تعريض متسقة بعد 10 دقائق من حقن D-لوسيفيرين (إعدادات BLI: زمن التعريض 120 ثانية لصور P7 و30 ثانية ل P17، وضع B4 لصور P7 وB4 لصور P17، مجال الرؤية (FOV) 25، توقف التردد 1.2، ارتفاع الجسم 1.5 وإعدادات الأشعة السينية: دقة عالية، طاقة عالية).
    نقطة التوقف: تخزين ملفات الصور مباشرة بعد التصوير؛ يمكن إجراء التحليل لاحقا.
  6. تحليل الصور باستخدام برامج تصوير BLI المناسبة من خلال تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) التي تغطي كامل جسم كل فأر وقياس الضوء المنبعث كفوتونات·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1.
  7. قيم العائد على الاستثمار الكمية للتصدير للتحليل الإحصائي في المراحل النهائية.

7. جمع خلايا اللوكيميا من فئران مزروعة

  1. حصاد خلايا اللوكيميا وتوليد تعليقات خلية واحدة كما هو موضح في القسم 1.1.

8. تلوين واكتساب التدفق الخلوي

  1. عد الخلايا وأنظمة الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليقها عند 1 × 10^7 خلايا·مل-1 في مخزن FACS.
  2. نقل 100 ميكرولتر (1 × 10^6 خلايا) إلى أنابيب قياس خلوية تدفق البوليسترين.
  3. أضف الأجسام المضادة التي تمنع مستقبلات Fc (مضاد CD16/32؛ 1 ميكرولتر لكل أنبوب) وحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. تحضير خليط الأجسام المضادة الرئيسي في مخزن FACS وإضافة إلى كل أنبوب CD19-FITC، BP1-PE، B220-APC، وعلامات سلبية النسب (TER119-PerCP، CD3-PerCP، CD11b-PerCP)، 1 ميكرولتر من كل جسم مضاد لكل خلية 1 × 10^6 في 100 ميكرولتر FACS buffer.
  5. حضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  6. غسل باستخدام مخزن FACS بسعة 5 مل، وجهاز طرد مركزي، وإعادة تعليقها في 200 ميكرولتر من FACS يحتوي على 7-AAD (3 ميكرولتر) وخرز العد (6 ميكرولتر؛ 6000 خرزة).
  7. تحضير ضوابط تعويضية ملونة واحدة باستخدام خرز أو خلايا التقاط الأجسام المضادة والحصول على ضوابط جنبا إلى جنب مع عينات تجريبية.
  8. احصل على عينات على مقياس تدفق باستخدام إعدادات كاشف FITC/PE/APC/PERCP القياسية ومعدل تدفق متوسط. اجمع الفعاليات حتى يتم الحصول على 1000 خرزة.
  9. تصدير ملفات FCS وتحليلها باستخدام برنامج تحليل التدفق الخلوي (المدرج في جدول المواد) باستخدام استراتيجية البوابات المحددة (الشكل 2D).
  10. حساب الأعداد المطلقة للخلايا لكل طحال أو نخاع عظم باستخدام عد الخرزات عن طريق ضرب عدد الأحداث المستهدفة المكتسبة عند 1000 خرزة بعامل تدرج 6 (6000 خرزة مضافة)، وتطبيع التكوين الخلوي الكلي للعضو بناء على نسبة الخلايا الملونة (1 × 10^6 خلايا).

9. رسم الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي

ملاحظة: إنشاء الرسوم البيانية وإجراء تحليلات إحصائية لبيانات BLI وقياس التدفق الخلوي باستخدام حزمة برامج إحصائية (مذكورة في جدول المواد).

  1. قدم البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
    ملاحظة: لم يتم استبعاد أي حيوان من هذه الدراسة.
  2. بالنسبة ل BLI، قارن مجموعات PBS وmCMV بشكل منفصل عند P7 وP17 باستخدام اختبارات مان–ويتني غير المزدوجة، مع تطبيق تصحيح هولم–شيداك لضبط مقارنات متعددة عبر نقاط زمنية.
  3. تحليل نتائج قياس التدفق الخلوي باستخدام اختبار مان–ويتني غير المزدوج ذي الذيلين.
  4. عرف الدلالة الإحصائية ك p < 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتيح حقن الأوردة الصدغية عملية زرع فعالة لسرطان الدم وخلايا الورم العصبي في حديثي الولادة
لنمذجة تأثير العدوى في الحياة المبكرة على تقدم السرطان لدى الأطفال، تم توصيل خلايا B-ALL الموسومة باللوسيفيراز المستمدة من فئران Eμ-Ret البالغة المصابة باللوكيميا أو خلايا NB المستخرجة من فئران Th-Mycn الميت عن طريق الوريد عبر الوريد الصدغي إلى جراء تركيبية عمرها يوم إلى يومين. تم تأكيد نجاح الزرع بعد خمسة أيام من الزراعة باستخدام تقنية BLI والتصوير بالأشعة السينية لكل من اللوكيم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

فهم كيف يؤثر تطور المناعة في مرحلة مبكرة على تقدم السرطان أمر ضروري لتصميم استراتيجيات تعديل مناعة مناسبة للعمر. في هذه الدراسة، نصف منصة زراعة حديثي الولادة قابلة للتكرار تتيح التحكم الزمني الدقيق في زرع الخلايا السرطانية وتعديل المناعة خلال فترة حرجة من عدم نضج المناعة بعد الولادة. من خلال الجمع بين التوصيل الوريدي عبر الأوردة الصدغية مع BLI، يسمح هذا النموذج بفحص منهجي لكيفية تأثير العدوى المبكرة على تقدم سرطان الأطفال عبر سياقات مرضية مختلفة.

باستخدام هذا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل بمنح تشغيلية من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة إلى G.S.D.R. (MOP-126122). حصل أ. ف. على منحة ما بعد الدكتوراه من برنامج مايكل كوشيوني لأبحاث سرطان الطفولة (MC3RP).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100µL, Microliter Syringe, Luer Tip Hamilton  80601 -
30 G Needle  BD  305106 -
7-AAD Biolegend 420404 - 
Ami-X imaging system Spectral Instruments Imaging - - 
anti-mouse B220- APC Biolegend 103212  -
anti-mouse CD19-FITC Biolegend 152404  -
anti-mouse CD3ε- PerCPBiolegend  100326 - 
anti-mouse Ly-51-PEBiolegend  108308 Also called BP1 
anti-mouse TER119- PerCP  Biolegend 116226 - 
anti-mouse/human CD11b- PerCP Biolegend 101230 - 
Aura software Spectral Instruments Imaging - version 4.0.8
BD Accuri C6  BD- - 
BD Fortessa X-20  BD- - 
Cleaning solution Hamilton 18310  -
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen by Thermo Fisher Scientific 2770930 6 µL contains 6000 beads 
D-Luciferin GoldBioeLUCK-1G- 
DMEMGibco11965092-
DNase ISigma1.13E+10-
Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged FALCON 352340 - 
FBSGibcoA5256701- 
FlowJo software BD- v10.8
GeltrexTMThermo Fisher Scientific A1413202- 
GraphPad Prism software Dotmatics- v10.4.1
LE.5209 Cold light source Euromex -- 
Liberase™ TM Research GradeSigma5.4E+09-
NSG miceJackson Labrotary5557NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ
PolybreneSigmaH9268-5G-
Purified anti-mouse CD16/32 AntibodyBiolegend 101301- 
RBC Lysis Buffer (10X)Biolegend 420301- 

المراجع

  1. Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
  2. Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
  3. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  4. Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
  5. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  6. Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
  7. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous Injections in Neonatal Mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
  8. Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread Gene Delivery and Structure-Specific Patterns of Expression in the Brain after Intraventricular Injections of Neonatal Mice with an Adeno-Associated Virus Vector. J Virol. 75 (24), 12382-12392 (2001).
  9. Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
  10. Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
  11. Farrokhi, A., et al. Early-life infection depletes preleukemic cells in model of hyperdiploid B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 144 (8), 809-821 (2024).
  12. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
  13. Pavathuparambil, A. M. N., et al. Facial vein injection of human cells in severe combined immunodeficiency (SCID) neonatal mice. MethodsX. 5, 1281-1286 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

علم المناعة والعدوىالعدد 232العدد 232قيمة فارغةالعددسرطان الأطفالابيضاض الدمالورم الأرومي العصبيابيضاض الدم اللمفاوي الحاد من النوع بالعدوىحقن حديثي الولادةحقن الوريد الصدغي
نموذج زراعة وريدية لحديثي الولادة لتقييم الأنشطة المناعية المبكرة ضد الخلايا السرطانية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.