مقالة منهجية

إعداد قابل للتكرار للتصوير الثنائي الفوتوني في الجسم الحي لانقباض الأوعية اللمفاوية العنقية وتدفق اللمفاوف في الفئران

DOI:

10.3791/69482

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Department of Computer Science and Information Technology, Saratov State University, 4, Res Inst Intelligent Complex Syst, Fudan University, 5Potsdam Institute for Climate Impact Research

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح المخطوطة طريقة مبتكرة لدراسة انقباض الأوعية اللمفاوية العنقية وتدفق اللمفاوف في الفئران لاختبار الوظائف الفسيولوجية المختلفة للأوعية اللمفاوية العنقية (cLVs) والاستراتيجيات العلاجية لتعديل آليات تنظيم اللمفاوية لتصريف الدماغ وتنظيفه.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انقباض الكلماتير الدماغية هو القوة الدافعة لتدفق اللمفا، وهو آلية رئيسية وراء تطهير سموم الدماغ. هنا، نقدم طريقة مبتكرة للتصوير الثنائي الفوتوني في الجسم الحي لانقباض cLVs والمراقبة طويلة الأمد لإزالة خلايا الدم الحمراء مع تدفق اللمفاوف في cLVs في الفئران. تشمل مكونات الإعداد وسادة تسخين صغيرة مكيفة على عنق الفأرة تسمح بزيادة نافذة التصوير حتى 5 ساعات مع الحفاظ على انقباض cLV وتدفق اللمفاو؛ التحكم في الرطوبة؛ غلاف واق؛ ونظام تحديد المواقع الذي يسمح بالحفاظ على تصور بصري مستقر لعناصر cLV. تضمن الطريقة قابلية التكرار والتوافق مع أنواع أخرى من المجاهر ذات الفوتونتين ومجموعة واسعة من الأهداف، مع الحفاظ على صور عالية الجودة بعمق يصل إلى 500 ميكرومتر. يتضمن البروتوكول مراحل مفصلة من التحضير الجراحي لكلاب الجلود العصبية للحفاظ على البيئة الفسيولوجية، مما يوفر الانقباض الطبيعي للعروق العصبية المزمنة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب انقباض الأوعية اللمفاوية العنقية (cLVs) دورا رئيسيا في تصريف الدماغ وتنظيف الأنسجة اللمفاوية من المستقلبات والسموم 1,2,3. يؤدي تقليل هذه الوظيفة الرئيسية ل cLVs إلى تثبيط تطهير سموم الدماغ الذي يصاحبه العديد من أمراض الدماغ، بما في ذلك مرض الزهايمر، وإصابات الدماغ الرضحية، وسرطان الدماغ 4,5,6,7,8,9. لذلك، فإن دراسة انقباض cLV يعد نهجا مهما في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لتعديل آليات تنظيم الدماغ لتصريف وتنظير الدماغ 10,11,12.

تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة لتصوير فوتونين في الوقت الحقيقي لانقباض cLV وتدفق اللمفاوم في فئران من أعمار مختلفة. تشمل المكونات المهمة في الإعداد وسادة تسخين دقيقة، والتي عند تثبيتها على عنق الحيوان، تسمح بوقت تصوير ممتد يصل إلى 5 ساعات مع الحفاظ على نشاط انقباض الأوعية اللمفاوية المجمعة واستقرار تدفق اللمفاو.

يجدر بالذكر أنه على عكس الجهاز الدوري الدموي، المملوء بالدم الذي يتحرك بسرعة معينة (من 10 مم/ث في الشرايين إلى 13 سم/ثانية في الجيب السهمي عند البشر) عبر أنواع مختلفة من الأوعية الدموية، فإن امتلاء الأوعية اللمفاوية باللمف يعتمد على زيادة تدرج الضغط بين الأوعية اللمفاوية الفارغة وحجم السائل الخلالي الناتج أثناء الأيض13. 14، 15، 16، 17، 18، 19. في الوقت نفسه، يكون تدفق اللمفاوف في الأوعية اللمفاوية متقطعا، ويتراوح من 0 إلى 1 مم/ث20، 21، 22. أظهرت دراسات الرنين المغناطيسي الحديثة على البشر أن تدفق اللمفاوف في الأوعية اللمفاوية السحائية (MLVs) يتراوح بين 1-3 ممو23 ملم. ومع ذلك، يجب ملاحظة أنه حتى في شخص واحد، يتغير تدفق اللمفاوف في الميكروفونات الخلفية في أوقات مختلفة من اليوم وقد ينخفض إلى الصفر. لذا، فإن تدفق اللمفاوي في الأوعية اللمفاوية غير متسق لأنه يعتمد على معدل العمليات الأيضية، والتي تعتمد بدورها على درجة الحرارة24. في الواقع، تتأثر سرعة التفاعل الكيميائي الحيوي بعمق وبشكل مباشر بدرجة الحرارة، والتي قد تؤثر أيضا بشكل كبير على الانقباضات التلقائية للأوعية اللمفاوية وبالتالي تغير تصريف ونقل اللمفاوف24، 25، 26.

لذلك، فإن الحفاظ على درجة حرارة الجسم شرط مهم للحفاظ على البيئة الفسيولوجية للأوعية اللمفاوية لدعم الانقباض الطبيعي وتدفق اللمفاو. ومع ذلك، فإن استخدام ألواح التدفئة التجارية المتوفرة لا يضمن الحفاظ على درجة الحرارة اللازمة في المناطق العميقة والبصرية المتاحة من الرقبة حيث توجد ألواح cLV. وهذا مهم بشكل خاص في تصوير فوتونين لانقباض cLV وتدفق اللمفاو، حيث يتم ذلك في غرف تجريبية باردة بدرجة حرارة محيطة تبلغ 19 درجة مئوية، وهو مطلوب لهذه التقنية البصرية27.

وفي هذا الصدد، في الغالبية العظمى من الدراسات الحية المحيطة، يقتصر انقباض أوعية جمع اللمفاوات باستخدام ألواح تسخين تجارية على 3-5 دقائق (عادة ما يلاحظ التأثير الأقصى خلال ثوانقليلة: 3، 28، 29، 30، 31، 32، 33، 34، 35، 36، 37,38، وبعدها تنخفض الحشوة اللمفاوية والانقباض. هذا النهج يحد بشكل كبير من وقت مراقبة فسيولوجيا الأوعية اللمفاوية ويجعل من المستحيل تقييم التأثيرات طويلة الأمد على انقباضها وتدفق اللمفاو، مما دفعنا لتطوير وسادة تسخين صغيرة متكيفة مع عنق الفأر بهدف زيادة فترة التصوير حتى 5 ساعات مع الحفاظ على انقباض cLV وتدفق اللمفاوي الثابت.

مكون آخر من الإعداد هو الغلاف الواقي مع نظام التحكم في الرطوبة وتحديد المواقع الذي يسمح بالحفاظ على تصور مستقر لل cLVs دون غمر بالماء، ومع الحفاظ على صور عالية الدقة عند استخدام عدسات الغمر الجوي لمسافات طويلة مصححة لزجاج تغطية 0.17 مم (مثل CFI Plan Apochromat Lambda D 10x (MRD70170) وCFI Plan Apochromat Lambda D 20x (MRD70270).

تضمن الطريقة المقترحة قابلية التكرار والتوافق مع أنواع أخرى من المجاهر ذات الفوتونتين ونطاق الأهداف المختلفة المتوافق مع الغلاف مع مراعاة الخصائص البيئية، بما في ذلك التحكم في درجة الحرارة/الرطوبة ومسافة العمل من العدسة، مع الحفاظ على صور عالية الجودة بعمق يصل إلى 500 ميكرومتر ونافذة زمنية (حتى 5 ساعات) مما يسمح بتحليل طويل الأمد لانقباض المجاهر الثانوية وتدفق اللمفاوف بجودة عالية في الفئران.

من المهم أخذ الموقع التشريحي لحلقات cLVs بالقرب من تفرع الشريان السباتي، حيث تقع مستقبلات الضغط في الاعتبار. يؤدي التأثير الميكانيكي على مستقبلات الضغط إلى زعزعة ضغط الدم ومعدل ضربات القلب. يمكن أن يسبب ذلك تغيرات كبيرة في الضغط الهيدروستاتيكي، ونتيجة لذلك يسبب تعطيلا في تدفق اللمفاوف39. لذلك، تتضمن الطريقة المقترحة وصفا مفصلا للبروتوكول الجراحي للعزل اللطيف للشريان السباتي السباتي في منطقة الرقبة العميقة لتجنب التأثير الميكانيكي على انقسام الشريان السباتي القريب وتغيرات ضغط الدم، مما قد يؤدي إلى ضعف تدفق اللمفاوم في الدماغ، وبالتالي ضعف تدفق اللمفاوم في الشريان السباتي وانقباضها.

تظهر النتائج الانخفاض المرتبط بالعمر في انقباض cLV وحساسيته للتأثيرات العلاجية المحفزة للضوء في الفئران. علاوة على ذلك، ولأول مرة في المراقبة طويلة الأمد (أكثر من 5 ساعات)، نثبت بوضوح أن cLVs تعمل كأنفاق لإزالة خلايا الدم الحمراء من البطين الجانبي الأيمن، وهو مسار لمفاوي مهم لتنظيف سموم الدماغ 1,2,3. بشكل عام، تهدف طريقة التصوير الثنائي الفوتوني في الجسم الحي لانقباض cLV وتدفق اللمفاوف للدراسات ما قبل السريرية لوظائف فسيولوجية مختلفة ل cLV، بما في ذلك تنظيم تصريف الدماغ وتطهيره، وإزالة المستقلبات والسموم من الدماغ، بالإضافة إلى اختبار التقنيات العلاجية الجديدة لتعديل فسيولوجيا cLV.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لدليل العناية واستخدام الحيوانات المختبرية، التوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية، وإرشادات وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (رقم 742 بتاريخ 13.11.1984)، والتي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوية في جامعة ساراتوف الحكومية (البروتوكول رقم 7، 22.09.2022).

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. جهاز تقني لإصلاح الفأرة

  1. استخدم سكة بصرية فولاذية (SOR، الطول 270 مم، العرض 43 مم؛ الشكل 1A) كأساس للتركيب.
  2. قم بتركيب حاملي أعمدة (3PH-25) فوق منطقة SOR على مسافة 175 مم من بعضهما البعض (الشكل 1B). ضع أعمدة التثبيت (3 ميجابكسل، قطر 12 مم) داخل 3PH-25 ثم ثبتها بإحكام ببرغي M6 (الشكل 1C).
  3. ثبت طوق العمود (3PC) على كلا عمودي التثبيت (3MP؛ الشكل 1D). يكون الطوق الخلفي ضروريا لتثبيت القسطرة لاحقا مع إمداد مستمر من محلول ملحي أثناء المراقبة البصرية للوعاء اللمفاوي العنقي.
    ملاحظة: هذا ضروري لغسل منطقة الدراسة بشكل دوري لإزالة الدم المتراكم بعد العمليات الجراحية، مما قد يعقد المراقبة البصرية.
  4. ثبت مشبك العمود الثابت بزاوية قائمة (3RPC-12) على أحد أعمدة التثبيت 3MP وثبته بإحكام ببرغي M6 (الشكل 1H).
    1. أدخل عمود التثبيت (قطر 12 مم) في الفتحة الجانبية لجهاز 3RPC-12 (الشكل 2B).
      ملاحظة: عمود التثبيت ضروري لتثبيت الغطاء الواقي لاحقا لعدسة فوتونتين غير مغموسة بالماء.
    2. ثبت الحامل المطبوع على طابعة ثلاثية الأبعاد على عمود التثبيت الجانبي وثبته بإحكام باستخدام زوجين من براغي M3 (الشكل 2C).
    3. باستخدام غراء قابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية، قم بتثبيت زجاج غطاء بقطر 12 مم أسفل الغلاف الواقي المطبوع على طابعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2D,F). بعد ذلك، استخدم زوج الصامولة اللولبية M4 لتثبيت الغطاء الواقي على الحامل (الشكل 2).
  5. قم بتركيب طاولة البانتوغراف الدقيقة للحركة الرأسية 02TV004 (الشكل 1E) على قاعدة SOR باستخدام مشابك طاولة (3TC5) ومجموعات من البراغي والصواميل والغسالات M6 (الشكل 1F).
  6. ضع علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (طولها 155 مم، عرضها 110 مم) على سطح الطاولة، والتي تستخدم كخزان لتراكم محلول ملحي (الشكل 1G).

2. عنصر التسخين

  1. تجميع الأجهزة الطرفية.
    1. غط نقطة اتصال الأسلاك بعنصر التسخين 1 بطبقة رقيقة من السيليكون (الشكل 3). ثبت حساس درجة الحرارة 1 على الحصيرة وأغلقه بالسيليكون (الشكل 3B).
    2. لحام أسلاك عنصر التسخين وحساسات الحرارة إلى كابل متعدد الأسلاك، واملأ نقطة الاتصال بالسيليكون، وأغلق بتغليف الانكماش (الشكل 3).
    3. ضع عنصر التسخين 2 وحساس الحرارة 2 في أسطوانة الرغوة (الشكل 4).
  2. تجميع وحدة التحكم
    ملاحظة: رابط لتحميل الملفات لطباعة علبة https://disk.yandex.ru/d/06BURfMlQpl0Jg التحكم.
    1. اطبع علبة وحدة التحكم على طابعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 5B).
    2. قم بتثبيت الموصلات الخاصة بتوصيل كابل الطاقة وزر الطاقة على جدران الهيكل، كما هو موضح في الشكل 5C,D.
  3. قم بتركيب مزود طاقة تيار مستمر بجهد 24 فولت، ومحول تيار مستمر للتخفيض المستمر، ووحدتي MOSFET داخل الغلاف (الشكل 5A، G، H، I).
  4. لتجميع الدائرة، اتبع هذه الخطوات (الشكل 6).
    1. قم بتوصيل محول التخفيض بالمصدر وضبط الجهد على 9 فولت (الشكل 6).
    2. قم بتوصيل دبوس رقم الهيكل في Arduino UNO بموصل OUT+ على المحول وGND بموصل OUT على التوالي (الشكل 6).
    3. قم بتوصيل دبوس V+ في مزود الطاقة بدبابيس VIN+ في وحدات MOSFET، ودبوس V بدبابيس VIN على التوالي (الشكل 6).
    4. قم بتوصيل دبوس V+ في عنصر التسخين 1 ب VOUT+ على MOSFET 1 وV- على VOUT على التوالي (الشكل 6).
    5. كرر الخطوات الخاصة بعنصر التسخين 2 وMOSFET 2 (الشكل 6).
    6. قم بتوصيل دبوس GND في وحدة MOSFET 1 و2 ب GND في Arduino UNO، وPWM MOSFET 1 بموصل D11 في Arduino UNO، وPWM MOSFET 2 بموصل D10 على التوالي (الشكل 6).
    7. قم بتوصيل دبوس VIN لحساس درجة الحرارة 1 بموصل GND في Arduino UNO، وVIN+ بموصل 5 فولت في Arduino UNO، وSIG ب D3 (الشكل 6).
    8. قم بتوصيل نقطة اتصال SIG لحساس درجة الحرارة 2 إلى A1 في Arduino UNO، ووصل حساس GND بحساس GND في Arduino UNO، وأيضا توصيل مقاومة السحب بقوة 100 كيلو أوم (الشكل 6).
  5. أصلح جهاز Arduino UNO وشاشة لوحة المفاتيح في غلاف الغطاء (الشكل 7I).

3. دليل برنامج التحكم في درجة الحرارة

  1. قم بتحميل مخطط أردوينو (ملف .ino) وافتحه في بيئة تطوير أردوينو (إصدار IDE: 2.3.5-nightly-20241212).
  2. اختر منفذ COM الصحيح وقم بتنزيل البرنامج الثابت. تحتوي الواجهة على زرين. للانتقال بينهما، استخدم الزرين الأيسر والأيمن (الشكل 7B,D). مؤشر الاختيار يقع إلى يسار العمود (الشكل 7F).
  3. حقل اختيار درجة الحرارة يقع في العمود الأيسر من الشاشة (الشكل 7H). استخدم أزرار الأعلى والأسفل للتعديل (الشكل 7C).
  4. حقل START/shutdown موجود في العمود الأيمن من الشاشة (الشكل 7G). لاختيار هذا العمود، اضغط على الزر الأيمن على لوحة المفاتيح، ثم اضغط على الاختيار (الشكل 7A). عندما تكون العملية قيد التشغيل، يومض مؤشر النشاط، ويتغير التسمية على زر التشغيل إلى إيقاف.

4. تثبيت الحيوان في الجهاز التقني

ملاحظة: أجريت التجارب على ذكور فئران BALB/c (25-28 جرام، 2، 18، و24 شهرا)؛ في كل مجموعة، كان هناك 7 حيوانات.

  1. حضر مزيجا من الكيتامين والزيلازين (100 ملغ/كغ؛ 10-156 ملغ/كجم على التوالي) وحقنه عن طريق الحقن داخل الصفاق حسب وزن الفأر.
  2. ضع مرهم العين على الجفون لمنع جفاف كرات العين أثناء الجراحة. كرر هذا الإجراء إذا لزم الأمر.
  3. عندما تتوقف ردود فعل سحب الأرجل الخلفيتين وثني الذيل، ضع الفأرة على عنصر التسخين في الظهر لتوفير الوصول إلى الجزء البطني من الجسم.
  4. قم بتوصيل وحدة التحكم بمقبس كهربائي (نطاق جهد الإدخال 175-240 فولت تيار متردد، نطاق التردد 50-60 هرتز، تيار تيار متردد 1.8 أمبير/230 فولت تيار متردد). اضبط درجة حرارة التشغيل على الجهاز بين 37-38 درجة مئوية.
  5. باستخدام شريط طبي، ثبت الحيوان بحيث يكون الجسم موازيا لسطح الطاولة، ووضع الرأس بزاوية نسبية إلى المحور السهمي للجسم بحيث يكون الجانب الأيمن أو الأيسر من الرقبة على الأسطوانة (الشكل 8A).
    ملاحظة: هذا التثبيت على رأس الفأر ضروري بحيث يرفع الجانب الأيمن أو الأيسر من الرقبة (حسب الظروف التجريبية) إلى ارتفاع حوالي 5 مم باتجاه عدسة المجهر. وبالتالي، ستكون منطقة dcLN وcLV تقريبا على نفس مستوى القصبة الهوائية.
  6. لف الرباط حول القواطع العلوية وثبته في الجزء الخلفي من الجهاز للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان باستخدام شريط طبي.
  7. باستخدام آلة الحلاقة، احلق منطقة خط الشعر في منطقة الرقبة. قم بإزالة أي شعر متبق بعد الحلاقة، ثم غط الحيوان لحماية الحقل المعقم. للإجراءات الجراحية والتحكم البصري اللاحق، يتم حقن 0.5 - 1 مل من الليدوكائين/بوبيفاكين (1 ملغ/مل و0.25 ملغ/مل على التوالي) تحت الجلد في موقع الشق.
    1. للتعقيم الأولي، قم بإزالة الشحوم وتعقيم الجلد جزئيا بمسحة كحولية، ثم للعلاج بالمطهر، ضع محلول كلورهيكسيدين بنسبة 0.5٪ أو يود 2٪ على الجلد. كرر جميع خطوات التعقيم مرتين إضافيتين.
  8. باستخدام مقص مستقيم، قم بإجراء عملية وضم جلدية لجلد الرقبة مع شق طولي من الفك السفلي إلى منطقة عظمة الترقوة بطول حوالي 2 سم (الشكل 8B).
  9. إجراء شق اللفافة باستخدام مقص منحني جراحي دقيق، باستخدام ملقط منحني، يدفع الغدد اللعابية والعضلات السطحية للرقبة بعيدا عن العضلة، مما يكشف عن عضلة القصية الترقاء الرقية. تجنب إتلاف الأوعية الدموية الظاهرة لمنع النزيف. قم بترطيب منطقة الجراحة باستمرار بمحلول ملحي لمنع إصابات الأنسجة المفرطة.
  10. باستخدام المقص الجراحي المجهري، قم بإجراء شق عضلة القصية الترقاء لتوفير الوصول إلى المنطقة بين القصبة الهوائية والشريان السباتي للحيوان.
  11. مع الاستمرار في نشر العضلات واللفافة وإجراء شق العضلة واللفافة، تحديد موقع العقدة اللمفاوية العنقية العميقة والأوعية اللمفاوية الواردة والصادرة على عمق 5-7 مم (الشكل 8C).

5. تثبيت الفأرة تحت المجهر

  1. ضع الجهاز مع الحيوان الثابت على الطاولة المتحركة في المجهر وربطهما بإحكام باستخدام برغي M6. هذا ضروري لضمان تثبيت دائم على الطاولة المتحركة.
  2. قم بتوصيل وحدة التحكم بمقبس كهربائي (نطاق جهد الإدخال 175-240 فولت تيار متردد، نطاق التردد 50-60 هرتز، تيار تيار متردد 1.8 أمبير/230 فولت تيار متردد). اضبط درجة حرارة التشغيل على الجهاز على 36-37 درجة مئوية.
  3. ثبت القسطرة المملوءة بمحلول ملحي على عمود التثبيت باستخدام شريط طبي.
  4. ضع بكرة قطرها 1 سم تحت عنصر التسخين على جانب رأس الحيوان لضمان زاوية ميل 45° بالنسبة لطاولة المجهر المتحركة. هذا ضروري لوضع الوعاء اللمفاوي العنقي في وضع أفقي وتقليل الضغط التالي على القصبة الهوائية.
  5. ضع القسطرة الثابتة في منطقة الرقبة مفتوحة بعد العمليات الجراحية بحيث تكون على جانب عظام الترقوة للحيوان.
    1. شغل إمداد محلول المحلول الملحي، وانتظر حتى تمتلئ منطقة الرقبة المفتوحة بالكامل بالمحلول الملحي.
    2. خفض الغلاف الواقي فوق منطقة الرقبة المملوءة بالمحلول الملحي بحيث تكون منطقة الوعاء اللمفاوي في مركزها، ولا تضغط القصبة الهوائية للحيوان (الشكل 9A).
    3. لتركيب الغلاف الواق، ينصح باستخدام منظار متصل بمجهر ذو فوتونين. ضع الغلاف الواقي على القصبة الهوائية حتى لا يضغط عليها. تأكد من عدم تجمع فقاعات الهواء تحت الغلاف الواقي عند إنزاله. تأكد من أن الصفيحة الواقية تقع على العضلات العلوية للرقبة ولا تضغط على cLVs، مما يسمح للمحلول الملحي الساخن بالدخول إلى الوعاء ويمنع التشوه الميكانيكي للcLVs.
  6. خفض عدسة الفوتونتين غير الغمر في الماء إلى الغلاف الواقي إلى عمق يتوافق مع مسافة عمل هذه العدسة ثم إجراء تصوير بصري ثنائي فوتون للوعاء اللمفاوي العنقي (الشكل 9B).
    ملاحظة: عند إجراء الفحص الأول، من الضروري التأكد من أن الوعاء اللمفاوي له بنية كاملة على طول السفينة وأنه متحرك أثناء تنفس الفأر. وهذا يعني أنه ليس مشوها أو مضغوطا بغلاف واق.

6. مراقبة انقباض cLV بواسطة فوتونين في الجسم الحي .

ملاحظة: تم الحصول على صور الفوتونتين باستخدام مجهر متعدد الفوتونات (ليزر نابض، طول موجة إثارة 970 نانومتر). تم الحصول على الصورة بدقة 20x (f/0.75). تتكون كل صورة من 1 مجال رؤية زووم × 3.0 (212.13 × 212.13 ميكرومتر)، تتكون من 512 × 512 نقطة. تم الحصول على صور cLVs عن طريق تصوير فيديو بسرعة 30 إطارا في الثانية، ويستمر دقيقة واحدة. تم الحصول على صور الفوتونتين في قناة واحدة مع إثارة لفلورسنت LYVE-1 بحجم cLVs عند طول موجي 488 نانومتر وانبعاث عند طول موجي 525 نانومتر.

  1. تحليل قطر cLV وتقييم الانقباض الآلي
    1. قس قطر cLVs في منطقة الاهتمام (ROI) باستخدام أفلام مدتها 30 دقيقة بسرعة 30 إطارا في الثانية وتكبير 3x. باستخدام رمز بايثون مخصص، قم بقياس ملف زمن قطر cLV لنفس المقاطع المستخدمة في حساب تدفق اللمفاو.
    2. اختر يدويا نقطتين تتوافق مع الجدران المقابلة لجدران сLVs. حدد موقعها في الإطارات التالية باستخدام خوارزمية التدفق البصري لوكاس-كانادي (calcOpticalFlowPyrLK في OpenCV)، والتي توفر دقة بكسل فرعية للقياسات. احسب القطر كمسافة بين النقاط المتتبعة، محولة من بكسل إلى ميكرومتر. استخدم مرشح منتصف نافذة منزلقة لإزالة تشوهات الحركة. يجب أن يكون هناك على الأقل 20 قياسا للقطر في عائد استثمار واحد.
    3. لتحديد التردد الداخلي للنبضات، استخدم السلسلة الزمنية الملساء للقطر. اكتشف تلقائيا أقصى ودنيا للإشارة باستخدام دالة find_peaks من مكتبة SciPy، التي تحدد النقاط المحلية لإشارة الزمن بناء على عتبات السعة والمسافة الدنيا بين القمم.
    4. استبعد من التحليل انكماش cLV بسعة أقل من 3٪ من القطر المتوسط وفاصل أقل من 2 ثانية. احسب متوسط التردد على مدى 30 دقيقة كتكرار الانقباضات في الدقيقة.

7. تحليل الفوتونتين لتدفق اللمفاوف في cLVs

ملاحظة: تم تقييم تحليل تدفق اللمفاوف من خلال حركة خلايا الدم الحمراء في القطع الحلقية خلال 5 ساعات بعد إدخال الدم الذاتي إلى البطين الجانبي الأيمن عبر القسطرة المزمنة.

  1. تخدير الفأر ب 1٪ من الإيزوفلوران (انظر البروتوكول المنشور فيالعدد 40). زرع القسطرة في البطين الجانبي الأيمن وفقا للبروتوكول الموضح فيالقسم 40.
  2. جهز الفأر للتصوير الثنائي في الجسم الحي لصور cLVs وفقا للخطوات 7.1، 7.3-7.5.
  3. اجمع الدم من الوريد الذيلي عن طريق ثقب الإبرة بمقدار 10 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم مغطى مسبقا بالهيبارين لتجنب التخثر أثناء أخذ عينات الدم والحقن.
  4. حقن الدم في البطين الجانبي الأيمن (AP = −0.5 مم؛ ML= −1.06 مم; DV = 2.5 مم) باستخدام مضخة حقن دقيقة بمعدل 0.1 ميكرولتر/دقيقة.
  5. إجراء تحليل بفوتونتين لحركة خلايا الدم الحمراء في cLVs. حساب معدل تدفق اللمف باستخدام بروتوكولات منشورة في 41,22.

8. التضمين الضوئي لانقباض cLV

  1. بالنسبة لنظام PBM الخاص ب cLVs، استخدم التكنولوجيا والبروتوكولات المنشورة سابقا في40.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر استخدام الغلاف الواقي أهم المزايا للمراقبة طويلة الأمد للأوعية اللمفاوية العنقية في الجسم الحي، مثل عزل منطقة الجراحة عن البيئة الخارجية، مما يسمح بالحفاظ على غمر الوعاء اللمفاوي والأنسجة المحيطة في محلول ملحي مع توفير مستمر من المحلول الملحي عبر قسطرة متصلة بالجسم. بالإضافة إلى ذلك، وبسبب ارتباطه بشريحة المجهر والاتصال الميكانيكي الوثيق بالأنسجة المحيطة بالوعاء اللمفاوي، يضمن الغطاء الواقي الاستقرار الميكانيكي لمجال المراقبة أثناء التنفس الطبيعي والنشاط القلبي للحيوان، مما...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب دراسة فسيولوجيا الأوعية اللمفاوية استخدام طرق غير جراحية مع الحفاظ على ظروف بيئية خاصة تسمح بانقباض طبيعي وتدفق لمفاوي مستقر. تعتمد الغالبية العظمى من طرق دراسة وظائف الأوعية اللمفاوية على المراقبة البصرية لانقباضها وتقييم سرعة تدفق اللمفاوف 3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من مؤسسة العلوم الروسية (رقم 23-75-30001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طابعة 3DBambu Lab, الصينP1S
موصل 5 دبابيسConnfly electronic (Zhenqin), الصينDS1110-01
مجموعة من الأنابيب القابلة للتقلص الحراريJupiter, الصينJP7230-01
Arduino IDEArduino LLC2.3.5-nightly-20241212
فئران BALB/cفرع "Andreevka" FSBIS SCBT FMBA, روسيا3-15-16ذكر، عمره 6 أشهر
Chlorhixedin BIOPHARMACEUTICAL PLANT, روسياN/A
ملقط Dumont Stoelting, الولايات المتحدة الأمريكية52100-07 
صبغة Evans Blue Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, الولايات المتحدة الأمريكيةN/A
ملقط دقيقStoelting, الولايات المتحدة الأمريكية52102-02P
HamiltonHamilton Bonaduz AG, سويسراإبرة 29 G
عنصر تسخينالصينLFH-9415sg
إبرة الإنسولينINSUPEN, إيطاليا31G, 0.25mm*6mm
Ketamine MOSCOW ENDOCRINE PLANT, FSUE, روسياتخدير عام 
لوحة المفاتيحdiymore, الصين1602 LCD Keypad Shield
Lidocaine ORGANICA, روسياN/A مسكن
زر تشغيل مغلقالصينN/A
مقاومات الفيلم المعدنيTZT, الصينN/A
مقص Micro Dissecting Vannas SpringStoelting, الولايات المتحدة الأمريكية52130-00P
وحدة MOSFETالصينوحدة MOSFET D4184
مقبس تثبيتStanda, ليتوانيا3MP, قطر 12 ملم
سلك التثبيتAB retail, روسياHB-1
ملقط غير حادStoelting, الولايات المتحدة الأمريكية52108-83P 
بلاستيك لطابعة 3DBambu Lab, الصينA00-D0-1.75-1000-SPL.
طوق العمودStanda, ليتوانيا3PC
حامل العمودStanda, ليتوانيا3PH-25
موصل الطاقةRUICHI, الصينAC-015
مصدر الطاقةSANPU, الصينPS200-H1V24
طاولة pantograph دقيقة للحركة العمودية"Laser components", روسيا02TV004 
مشبك عمود ثابت بزاوية قائمة Standa, ليتوانيا3RPC-12
مسمار M3Standa, ليتوانياN/A
مسمار M4Standa, ليتوانياN/A
مسمار M6Standa, ليتوانياN/A
آلة الحلاقة Braun, figure-materials-1Series 3310s
كلوريد الصوديومKraspharma, روسياN/A
لحام إنتاج مساحيق المعادن, روسيالحام القصدير والرصاص 61
التدفق اللحامSolins, روسياLTI-120 22 مل مع فرشاة
محطة اللحامAOYUE, الصينN/A
محطة اللحام AOYUE, الصينN/A
القضبان البصرية الفولاذية (SOR)Standa, ليتوانياN/A
محول الجهد المنخفضRUICHI, الصينEM-825
مقص تشريح مستقيم Stoelting, الولايات المتحدة الأمريكية52132-10P 
حساس درجة الحرارةLiludin, الصينDS1820
TetracyclineJSC Tatkhimfarmpreparaty, روسيامرهم للعين 
المتحكمArduino, الصينUNO R3
ملقطStoelting, الولايات المتحدة الأمريكية52100-03 
مجهر ثنائي الفوتون Nikon, اليابانA1R MP
سلكPartner-Electro, روسياP020G-0305-C050
Xylazine "Alfasan International B.V.", هولندامرخٍ للعضلات
قسطرةScientific Commodities Inc., الولايات المتحدة الأمريكيةPE-10, 0,28 ملم ID × 0,61 ملم OD

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, D. Y., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Commun. 14 (1), 6104(2023).
  2. Kunert, C., Baish, J. W., Liao, S., Timothy, P. P., Lance, L. M. Mechanobiological oscillators control lymph flow. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 112 (35), 10938-10943 (2015).
  3. Du, T., et al. Restoration of cervical lymphatic vessel function in aging rescues cerebrospinal fluid drainage. Nat Aging. 4 (10), 1418-1431 (2024).
  4. Mesquita, D., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  5. Bolte, A. C., et al. Meningeal lymphatic dysfunction exacerbates traumatic brain injury pathogenesis. Nat Commun. 11, 4524(2020).
  6. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
  7. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  8. Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat. Commun. 11, 3159(2020).
  9. Liu, X., et al. Subdural haematomas drain into the extracranial lymphatic system through the meningeal lymphatic vessels. Acta Neuropathol Commun. 8, 16(2020).
  10. Li, D. Y., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Commun. 14, 6104(2023).
  11. Liu, S., et al. Neuro-lymphaphotonics opens new horizons of the future technologies for the therapy of brain diseases. Theranostics. 16 (2), 776-793 (2025).
  12. Lin, H., et al. Transcranial photobiomodulation for brain diseases: review of animal and human studies including mechanisms and emerging trends. Neurophotonics. 11 (1), 010601(2024).
  13. Bollmann, S., et al. Imaging of the pial arterial vasculature of the human brain in vivo using high-resolution 7T time-of-flight angiography. Elife. 11, e71186(2022).
  14. Jordan, J. E., Pelc, N. J., Enzmann, D. R. Velocity and flow quantitation in the superior sagittal sinus with ungated and cine (gated) phase-contrast MR Imaging. J Magn Reson Imaging. 4 (1), 25-28 (1994).
  15. Negrini, D., Fabbro, M. D. Subatmospheric pressure in the rabbit pleural lymphatic network. J Physiol. 520 (Pt 3), 761-769 (1999).
  16. Negrini, D., Moriondo, A., Mukenge, S. Transmural pressure during cardiogenic oscillations in rodent diaphragmatic lymphatic vessels. Lymphat Res Biol. 2 (2), 69-81 (2004).
  17. Moriondo, A., Mukenge, S., Negrini, D. Transmural pressure in rat initial subpleural lymphatics during spontaneous or mechanical ventilation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289 (1), H263-H269 (2005).
  18. Grimaldi, A., et al. Functional arrangement of rat diaphragmatic initial lymphatic network. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (2), H876-H885 (2006).
  19. Gashev, A. A., Zawieja, D. C. Hydrodynamic regulation of lymphatic transport and the impact of aging. Pathophysiology. 17 (4), 277-287 (2010).
  20. Park, J. K., et al. Association of lymphatic flow velocity with surgical outcomes in patients undergoing lymphovenous anastomosis for breast cancer-related lymphedema. Breast Cancer. 29 (5), 835-843 (2022).
  21. Fischer, M., et al. Flow velocity of single lymphatic capillaries in human skin. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 270 (1), H358-H363 (1996).
  22. Dixon, J. B., et al. Lymph flow, shear stress, and lymphocyte velocity in rat mesenteric prenodal lymphatics. Microcirculation. 13 (7), 597-610 (2006).
  23. Kim, J. H., Yoo, R. E., Choi, S. H., Park, S. H. Non-invasive flow mapping of parasagittal meningeal lymphatics using 2D interslice flow saturation MRI. Fluids Barriers CNS. 20 (1), 37(2023).
  24. Solari, E., Marcozzi, C., Negrini, D., Moriondo, A. Temperature-dependent modulation of regional lymphatic contraction frequency and flow. American Journal of Physiology-Heart and Circ Physiol. 313 (5), H879-H889 (2017).
  25. Solari, E., Marcozzi, C., Negrini, D., Moriondo, A. Lymphatic Vessels and Their Surroundings: How Local Physical Factors Affect Lymph Flow. Biology (Basel). 9 (12), 463(2020).
  26. Angeli, V., Lim, H. Y. Biomechanical control of lymphatic vessel physiology and functions. Cell Mol Immunol. 20, 1051-1062 (2023).
  27. Chong, C., et al. In vivo visualization and quantification of collecting lymphatic vessel contractility using near-infrared imaging. Sci Rep. 6, 22930(2016).
  28. Weiler, M., Kassis, T., Dixon, J. B. Sensitivity analysis of near-infrared functional lymphatic imaging. J Biomed Opt. 17 (6), 066019(2012).
  29. Semiachkina-Glushkovskaia, A., et al. NO-ergic mechanisms of age differences in photostimulation of lymphatic drainage, filtration and clearance. Biomed Opt Exp. , In press (2025).
  30. Davis, M. J., et al. Modulation of lymphatic muscle contractility by the neuropeptide substance P. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (2), H587-H597 (2008).
  31. Bell, R. D., et al. iNOS dependent and independent phases of lymph node expansion in mice with TNF-induced inflammatory-erosive arthritis. Arthritis Res Ther. 21 (1), 240(2019).
  32. Bachmann, S., Detmar, M., Proulx, S. Visualization and Measurement of Lymphatic Function In Vivo. Methods Mol Biol. 1846, 197-211 (2018).
  33. Nelson, T. S., et al. Minimally invasive method for determining the effective lymphatic pumping pressure in rats using near-infrared imaging. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (5), R281-R290 (2014).
  34. Proulx, S. T., et al. Use of a PEG-conjugated bright near-infrared dye for functional imaging of rerouting of tumor lymphatic drainage after sentinel lymph node metastasis. Biomaterials. 34 (21), 5128-5137 (2013).
  35. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat Res Biol. 5 (4), 219-231 (2007).
  36. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62 (7), 1881-1889 (2010).
  37. Schmid-Schonbein, G., Zweifach, B. Fluid pump mechanisms in initial lymphatics. News Physiol Sci. 9, 67-71 (1994).
  38. Schmid-Schonbein, G. W. Mechanisms causing initial lymphatics to expand and compress to promote lymph flow. Arch Histol Cytol. 53 (Suppl), 107-114 (1990).
  39. Hughes, G. W., Moore, J. P., Lord, R. N. Barosensory vessel mechanics and the vascular sympathetic baroreflex: Impact on blood pressure homeostasis. Exp Physiol. 108 (10), 1245-1249 (2023).
  40. Blokina, I., et al. Photobiomodulation under Electroencephalographic Controls of Sleep for Stimulation of Lymphatic Removal of Toxins from Mouse Brain. J Vis Exp. (208), e67035(2024).
  41. Dixon, J. B., Zawieja, D. C., Gashev, A. A., Cote, G. L. Measuring microlymphatic flow using fast video microscopy. J Biomed Opt. 10, 064016(2005).
  42. Terskov, A., et al. Age as a limiting factor for effectiveness of photostimulation of brain drainage and cognitive functions. Front Optoelectron. 31 (3), 6(2025).
  43. Blivet, G., Relano-Gines, A., Wachtel, M., Touchon, J. A randomized, double-blind, and sham-controlled trial of an innovative brain-gut photobiomodulation therapy: safety and patient compliance. J Alzheimers Dis. 90 (2), 811-822 (2022).
  44. Herkes, G., et al. A novel transcranial photobiomodulation device to address motor signs of Parkinson's disease: a parallel randomised feasibility study. EClinicalMedicine. 66 (1), 102338(2023).
  45. Bullock-Saxton, J., Lehn, A., Laakso, E. L. Exploring the effect of combined transcranial and intra-oral photobiomodulation therapy over a four-week period on physical and cognitive outcome measures for people with Parkinson's disease: a randomized double-blind placebo-controlled pilot study. J Alzheimers Dis. 83 (4), 1499-1512 (2021).
  46. Lee, T. L., Chan, A. S. Photobiomodulation may enhance cognitive efficiency in older adults: a functional near-infrared spectroscopy study. Front Aging Neurosci. 20 (6), 1-10 (2023).
  47. Cardoso, F. S., et al. Effects of chronic photobiomodulation with transcranial near-infrared laser on brain metabolomics of young and aged rats. Mol Neurobiol. 58 (5), 2256-2268 (2021).
  48. Hosseini, L., et al. Effect of transcranial near-infrared photobiomodulation on cognitive outcomes in D-galactose/AlCl3-induced brain aging in BALB/c mice. Lasers Med Sci. 37 (3), 1787-1798 (2022).
  49. Lutfy, R. H., Essawy, A. E., Mohammed, H. S., Shakweer, M. M., Salam, S. A. Transcranial irradiation mitigates paradoxical sleep deprivation effect in an age-dependent manner: role of BDNF and GLP-1. Neurochem Res. 49 (4), 919-934 (2024).
  50. Bohlen, H. G., Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C. Nitric oxide formation by lymphatic bulb and valves is a major regulatory component of lymphatic pumping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1897-H1906 (2011).
  51. Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. D. Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction. J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).
  52. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
  53. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة