مقالة منهجية

النهج متعدد الوسائط لتقييم تجديد العظام وأداء السقالات

331 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69483

⸱

فبراير 13, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

في هذه المقالة

ملخص

نقترح بروتوكولا لتقييم تجديد العظام على مستويات هرمية مختلفة. يتيح هذا النهج متعدد الوسائط التحليل الهيكلي عبر مقاييس طول مختلفة، مما يعالج التحديات في تحضير العينة بفعالية. كما يوفر سير عمل موثوق لتقييم فعالية المواد الحيوية في تعزيز تجديد العظام.

الملخص

يعتمد النجاح السريري للزرعة بشكل كبير على قدرتها على تعزيز إصلاح العظام وتسهيل اندماج العظام. على الرغم من إحراز تقدم كبير في تصميم السقالات الجديدة، لم يتم التحقيق بشكل كاف في تقييم نجاح الزرعات على مقاييس طول العظام المختلفة. العظم هو نسيج منظم هرميا، ذو بنية معقدة تتراوح من تنظيم ألياف الكولاجين وتمعدنها على مقياسي النانومتر والميكرومتر إلى الترتيب الكبير للعظام المضغوطة واللاصقة. هذا التنظيم الهرمي ضروري لضمان وظيفة العظام والأداء الميكانيكي. في هذا السياق، يعد تقييم شامل لتأثيرات المواد الحيوية على إصلاح العظام على مقاييس أطوال متعددة أمرا ضروريا لتقييم فعالية وسلامة المواد المزروعة. ومع ذلك، يشكل إعداد عينات للتحليلات متعددة الوسائط المتكاملة تحديا تقنيا. في هذا العمل، نقدم بروتوكولا مصمما لتقييم تجديد العظام عبر مستويات هرمية مختلفة وتحليل الواجهة بين العظم الجديد والسقالة المزروعة. يوفر هذا النهج طريقة قوية لتقييم فعالية السقالات في تحفيز إصلاح العظام. يعد الجمع بين تقنيات التصوير ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد مختارة أمرا بالغ الأهمية لتقييم صحيح للأنسجة المعدنية المعقدة التي تتكون أثناء عملية شفاء العظم

المقدمة

العظم هو نسيج معقد ومنظم هرميا 1,2. فهم تنظيمها البنيوي ضروري لمعالجة الأسئلة الأساسية المتعلقة بكيفية مساهمة الخلايا في بنية الأنسجة وكيف تؤثر التغيرات الهيكلية على الوظيفة الميكانيكية3. في هذا السياق، يظل إعادة تشكيل العظام بعد الإصابة موضوعا مركزيا للبحث. شفاء الكسور هو عملية معقدة متعددة المراحل، تبدأ باستجابة التهابية أولية، تليها تكوين الأوعية الدموية وتمايز الخلايا السلفية إلى الخلايا الغضروفية والأرومات العظمية 4,5. لقد نوقش الكثير حول دور المواد الحيوية في تحفيز التكامل العظمي، خاصة حول التوافق الحيوي وقدرتها على منع التغليف الليفي.

طريقة شائعة لتقييم التكامل العظمي المحفز بالمواد الحيوية هي المجهر البصري، الذي يتيح التحليلات النسيجية الكمية والنوعية على حد سواء. لقد ثبت أن هذا النهج طريقة موثوقة وفعالة لتقييم نجاح زراعة العظام7،8. ومع ذلك، لا يمكن استكشاف عدة قضايا تتعلق بتنظيم العظام الهرمي باستخدام نهج تصوير واحد3، وخاصة النهج النسيجي، الذي يحد جزئيا على الأقل بسبب قيود التكبير في الطريقة.

لقد أثبتت التطورات في التصوير ثلاثي الأبعاد أنها ضرورية لفهم التنظيم الهرمي للعظام. تقنيات مثل التصوير المقطعي المحوسوب المجهري (ميكروCT؛ إما إما إشعاع سينكروترون أو مصادر أشعة إكس التقليدية في المختبر) 9,10,11، والمجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الشعاع (FIB-SEM) المرتبط بالتصوير المقطعي بتقنية القطع والرؤية 12,13,14 والتصوير المقطعي الإلكتروني الناقل 15,16 قدمت رؤى جديدة حول بنية العظام على مقاييس متعددة.

استنادا إلى مناهج تصوير ثلاثي الأبعاد مختلفة، تم اقتراح نموذج لتنظيم هيكلي العظام، والذي حدد في البداية تسعة مستويات مميزة من تنظيم هيكل العظام1. تم تعديل هذا النظام وتوسيعه مؤخرا ليشمل حوالي 12 مستوى هرميا، ليكون مرجعا قيما لاستكشاف العلاقة بين البنية والوظيفة في نسيج العظم 2,17. ومن المهم أن هذا النموذج الهرمي المقترح يوفر أساسا لتقييم نجاح إصلاح العظام بعد الإصابة. يعد تقييم ما إذا كان نسيج العظم المعاد تجديده يعيد إنتاج البنية الهرمية الأصلية معيارا رئيسيا في تقييم جودة شفاء العظام، خاصة عند استخدام المواد الحيوية داخل الموقع التالف.

على الرغم من مناقشة استخدام تقنيات تصوير متعددة لدراسة تنظيم العظام 6,7,18,19,20، لم يتم استكشاف الكثير فيما يتعلق بسير عمل يدمج أساليب تصوير مختلفة لتقييم تنظيم معادن العظام عبر مقاييس مكانية متعددة. كما ذكر، العظم هو نسيج مركب معقد، يتكون من طور عضوي (خلايا، كولاجين، وجزيئات كبيرة) ومصفوفة معدنية. من منظور تحضير العينة، يطرح هذا التعقيد تحديات تقنية تتعلق بنفاذ المذيب عبر العينة، وتقسيم العينة الصلبة، ودمج استراتيجيات تصوير مختلفة على نفس العينة.

الابتكار الرئيسي في هذا العمل هو إنشاء سير عمل تصوير قابل للتكرار، مترابط، ومتعدد المقاييس باستخدام تقنيات تصوير ثلاثية الأبعاد وتقنيات تكميلية. كما هو موضح في الشكل 1A، تم تصميم سير العمل بحيث يمكن فحص نفس العينة بشكل متسلسل باستخدام طرق تصوير مختلفة. نظرا لأن بعض هذه التقنيات مدمرة أو تتطلب تقسيما، يتبع سير العمل ترتيبا يبدأ بطرق غير مدمرة ويتقدم إلى طرق تتضمن القطع أو إزالة المواد.

هذا السير في تحضير وتحليل العينات قابل للتطبيق بشكل واسع على العينات الصلبة أو المعادنة، بما في ذلك العظام القشرية والترابيكولارية، والسقالات قبل الزرع، وتقييم واجهة العظام/المواد الحيوية بعد الزرع. من خلال دمج أنماط التصوير التي تغطي مجالات رؤية مختلفة ونطاقات دقة مختلفة (الشكل 1B)، يمكن سير العمل تحليل العينات من مقياس السنتيمتر وصولا إلى مقياسي الميكرومتر والنانومتر. بينما تم تحسين التسلسل لدعم التحليل الترابطي لعينة واحدة، يمكن تطبيق كل تقنية بشكل مستقل وفقا للهدف التجريبي. يتيح هذا النهج تقييما تفصيليا لتكامل العظم في المواد الحيوية وتقييم نمو العظام المتجدد في منطقة الشفاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

النتائج المقدمة في هذا البروتوكول تم الحصول عليها من إجراء تجريبي أجري في دراسة سابقة21. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للإرشادات الأخلاقية للجنة الأخلاقية لاستخدام ورعاية الحيوانات التجريبية في جامعة فلومينينسي الفيدرالية في البرازيل (CEUA/UFF: 779). باختصار، تم توزيع 20 ذكرا من جرذ ويستار يزنون بين 300 و400 جرام عشوائيا إلى مجموعتين: زرع الشام، وزرع الميكروسفير cHA. جميع الحيوانات خضعت لعملية جراحية تم فيها تكوين عيب بحجم 2 مم في الحجاب الساقي. خدمت مجموعة شام كضابط تحكم في الجلطات لتقييم تجديد العظام في عيب غير حرج، بينما تلقت المجموعة التجريبية كرات دقيقة CHA37 مزروعة في موقع العيب. بعد 7 و21 يوما، تم القتل الرحيم للحيوانات بجرعة زائدة من التخدير العام، وتم جمع كتل عظم الظنبوب من كل مجموعة ونقطة زمنية (7 و21 يوما). تم تقييم جودة العظم ومدى العظم المتكون حديثا باستخدام المجهر البصري والتصوير المقطعي المقطعي الدقيق.

1. تثبيت العينة وتضمين التشفير

  1. بعد القتل الرحيم مباشرة، قم بإزالة عظم الساق الذي يحتوي على المادة الحيوية المزروعة ونقلها إلى قارورة تحتوي على محلول تثبيت كارنوفسكي (2.5٪ جلوتارالديهايد، 4٪ فورمالديهايد في محلول كاكوديلات 0.1 متر). احتفظ بالعينة عند -4 درجة مئوية لمدة يوم واحد على الأقل.
    ملاحظة: حضر وتعامل مع المثبت تحت غطاء بخار لمنع التعرض للمواد المتطايرة. يجب تنفيذ جميع التعاملات الكيميائية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، ويجب تنفيذ تدابير السلامة الفنية الإضافية عند الحاجة.
  2. انقل العينة من المثبت إلى قارورة تحتوي على مخزن كاكوديلات بقطر 0.1 مل. حافظ على العينة تحت دوران لطيف، مع تغيير المخزن مرتين بفواصل زمنية كل 10 دقائق. في هذه المرحلة، قم بقص حواف العينة باستخدام منشار صغير لتسهيل تسرب الراتنج. عند قطع العينة، حافظ عليها رطبة في مخزن كاكوديلات 0.1 متر لمنعها من الجفاف.
    ملاحظة: دائما احتفظ بالعينة في حجم مخزن مؤقت لا يقل عن ضعف حجم العينة. يجب اتباع هذا الإجراء لجميع المحاليل والراتنج المستخدم في هذا البروتوكول. عند التعامل مع المكونات الكيميائية المذكورة أعلاه، اعمل داخل غطاء بخار وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة. اجمع المحلول الثابت وقم بعمل النفايات المخازلة في حاويات متوافقة كيميائيا ومعنونة بوضوح مع أغطية مناسبة بشكل صحيح. اتباع إجراءات التشغيل القياسية المؤسسية (SOPs) للتخزين الآمن والتخلص من النفايات الكيميائية الخطرة.
  3. ابدأ عملية الجفاف باستخدام تركيزات متزايدة من الأسيتون (10٪، 30٪، 50٪، 70٪، 90٪ و100٪). حافظ على العينة تحت التدوير لمدة 30 دقيقة عند كل تركيز. كرر خطوة الأسيتون اللامائي 100٪ ثلاث مرات.
    ملاحظة: عند التعامل مع الأسيتون، اعمل داخل غطاء بخار وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة. بعد استخدامه، اجمع أي مذيب متبقي في حاويات نفايات متوافقة كيميائيا مع أغطية مناسبة بشكل واضح. اتبع الإجراءات القياسية المؤسسية للتخزين الآمن والتخلص من النفايات الكيميائية الخطرة.
  4. قم بالتغلغل بالراتنج الجانبي عن طريق نقل العينة عبر سلسلة من نسب الأسيتون إلى الراتنج المتدرجة: 2:1، 1:1، 1:2، وفي النهاية راتنج نقي. يجب أن تستمر كل خطوة لمدة 12 ساعة وأن تجرى تحت الدوران في درجة حرارة الغرفة. بعد تسريب الأسيتون إلى الراتنج المعالج، غير الراتنج النقي مرتين. وأخيرا، نقل العينة إلى قالب يحتوي على راتنج نقي وبلمرة العينة عند درجة حرارة 70 °م لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: تم تجهيز الراتنج وفقا لورقة البيانات لتحقيق صلابة متوسطة. عند التعامل مع راتنج التنبيه، اعمل داخل غطاء بخار وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة. بعد الاستخدام، اجمع أي بقايا في حاويات نفايات متوافقة كيميائيا ومعلمة بوضوح مع أغطية مناسبة بشكل صحيح. اتبع الإجراءات القياسية المؤسسية للتخزين الآمن والتخلص من النفايات الكيميائية الخطرة.

2. تصوير العينات باستخدام التصوير المقطعي بالأشعة السينية المحوسبة (microCT)

ملاحظة: يستخدم الميكروسي سي لتقييم وضعية الزرعات وتجدد العظام. كما يساعد في تحديد المناطق المحتملة ذات الاهتمام لمزيد من التحليل. يجب تنفيذ هذه الخطوة مع تضمين العينة في الراتنج.

  1. استخدم حامل عينة مقدمة من الشركة المصنعة كأساس، لضمان وضع العينة بأمان لمنع الحركة أثناء المسح. استخدم مواد منخفضة الكثافة للدعم، مثل البوليسترين، الشاش، أو أنابيب الطرد المركزي الدقيق.
  2. تصور باستخدام معايير المسح المثلى التالية: جهد/تيار الأنبوب = 60 كيلوفولت/133 مللي أمبير؛ الخطوة الزاوية = 0.33°؛ متوسط الإطارات = 5؛ حجم الفوكسل = 5 ميكرومتر؛ وضع الدوران = 180°. بالنسبة للعينات التي تحتوي على زرعات معدنية، استخدم دورانا بزاوية 360 درجة وفلتر ألمنيوم بحجم 0.5 مم.
    ملاحظة: أثناء تجديد العظام، يكون سمك العظم المنسوج الشبيه بالترابيكول عادة ضمن حدود الدقة في تصوير الميكرو سي التقليدي. لقياس المعاملات الشكلية التقليدية لعظم الترابيكولار بدقة، مثل سمك الترابيكولار، والفصل، والعدد، ينصح باستخدام أصغر حجم فوكسل (5 ميكرومتر كما هو محدد). إذا تجاوز نطاق الاهتمام (ROI) مجال الرؤية (FOV) عند هذه الدقة الاسمية، استخدم أولا ميزة المسح المتعدد لبلاطات العائد على الاستثمار. فكر في زيادة حجم الفوكسل فقط كحل أخير إذا لم يكن بالإمكان التقاط العائد على الاستثمار عبر المسح المتعدد.
  3. بعد المسح، تتكون بيانات الاستحواذ الخام من سلسلة من ملفات الصور المرقمة. قم بإعادة البناء باستخدام البرنامج الذي يوفره المصنع، مع التركيز على تقليل العيوب في منطقة الاهتمام بالعينة.
    ملاحظة: من الشائع مواجهة تشوهات صور على طول حدود الصور، خاصة في المناطق التي لن يتم تحليلها. يمكن قص المجلد النهائي باستخدام برنامج الشركة المصنعة لإزالة هذه المناطق.
  4. حلل الحجم المعاد بناؤه باستخدام خيارات برامج التصور ثلاثي الأبعاد المختلفة، مثل Avizo وVGStudio Max وCTVox وDragonfly22. تطبيق فلاتر الصور الرقمية لإزالة الشوائب الأثرية. في هذه الحالة، استخدم طريقة إزالة الضوضاء بالوسائل غير المحلية لهذا الغرض19.
    ملاحظة: يجب الحفاظ على قيم تنعيم مرشحات إزالة الضوضاء غير المحلية من منظور إزالة الضوضاء في أدنى مستوى ممكن، حتى لا تعيق تفاصيل الواجهة المهمة.

3. تحضير العينات للمجهر البصري

  1. اختر اتجاه تقسيم العينة وفقا للهدف التجريبي. يمكن تقسيم عظم الساق إما عرضيا أو طوليا على طول المحور الطولي للعظم. استخدم التقسيم العرضي لإنتاج مقاطع تسلسلية تغطي كامل حجم العيوب. التقسيم الطولي مناسب لتقييم تجدد العظم على طول اتجاه المحور الطويل. ومع ذلك، يوفر هذا النهج جزءا واحدا فقط من العيب.
    1. استخدم قرص منشار ماسي منخفض السرعة لتقسيم العينة إلى شرائح بحجم 1 مم، وفقا للاستراتيجية التجريبية.
      ملاحظة: ينصح باستخدام قرص ماسي بسماكة من 0.006 إلى 0.012 بوصة. تسمح الشفرات الأرق بقطع دقيق للغاية، مع فقدان بسيط للمادة بسبب سمك الشفرة.
    2. املأ خزان السائل حتى يغطي مستوى السائل الحافة السفلية للشفرة.
      ملاحظة: الماء المقطر مناسب لعينات العظام. ومع ذلك، إذا كان من المتوقع حدوث تسخين زائد، مثل العينات التي تحتوي على زرعات معدنية، استخدم الزيت الذي توفره الشركة المصنعة للمعدات لملء الخزان.
    3. ثبت العينة على حامل العينة وربطها بذراع الأداة. تأكد من أن العينة مستقرة وأفقية على سطح القرص. استخدم مقابض تحديد الموقع لضبط منطقة قطع العينة على القرص.
    4. ابدأ بقطع العينة باستخدام إعدادات سرعة أعلى (210 - 250 دورة في الدقيقة) وطبق ضغطا منخفضا حتى يتكون انبعاج في العينة. ثم خفض السرعة (إلى 93 - 124 دورة في الدقيقة) لإكمال التقسيم بسلاسة ومنع الاهتزاز الزائد.
    5. أوقف المنشار فورا بعد اكتمال القطع. قم بضبط النظام بشكل صحيح لضمان توقف القطع بمجرد فصل العينة عن كتلتها الأصلية.
  2. افحص العينة باستخدام المجهر المجسم. ابدأ بتكبير منخفض (مثلا 5x-10x) لفحص العينة بالكامل، ثم زد التكبير (مثلا 20x-40x) لاختيار المنطقة المطلوبة وفقا للسؤال العلمي. قد يختلف نطاق التكبير الدقيق حسب الجهاز المستخدم. في هذا العمل، تم اختيار المناطق التي تظهر كثافة أعلى من الواجهات بين العظم الجديد والمادة الحيوية لمزيد من التحليل.
  3. تركيب العينات للتخفيف
    1. ثبت العينة على دعامة لتسهيل التعامل الصحيح أثناء التلميع. إذا كانت العينة مخصصة فقط لتحليل المجهر البصري، قم بتثبيتها مباشرة على غطاء بلاستيكي باستخدام الغراء الفائق على الجانب المصقول سابقا.
      ملاحظة: ينصح باستخدام شرائح بلاستيكية بسبب تحسن التصاقها. يمكن أيضا استخدام شرائح زجاجية (بعد غسل مكثف بصابون محايد). ومع ذلك، تزيد شرائح الزجاج من خطر انفصال العينات أثناء التلميع.
    2. للعينات التي سيتم تحليلها بشكل إضافي باستخدام نهج ارتباطي، قم بتركيبها على تجميع أنابيب من جزأين من الألمنيوم. في هذا البروتوكول، تم تطوير تجميع أنابيب ألمنيوم منزلي الصنع، يتكون من أسطوانة صلبة داخلية بقطر 2.5 سم وأسطوانة خارجية مجوفة توفر الدعم الميكانيكي أثناء التلميع. العينة متصلة بالأسطوانة الصلبة الداخلية.
    3. ضع الأسطوانة الداخلية من الألمنيوم على صفيحة ساخنة وسخنها إلى درجة حرارة مناسبة لإذابة الشمع (عادة حوالي 60-70 درجة مئوية، حسب نوع الشمع المستخدم).
      ملاحظة: شمع العسل مناسب أيضا. عند التعامل مع الشمع المثبت، اعمل داخل غطاء بخار وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة. بعد الاستخدام، اجمع البقايا في حاويات نفايات متوافقة كيميائيا ومعنونة بوضوح مع أغطية مناسبة بشكل صحيح. اتبع الإجراءات القياسية المؤسسية للتخزين الآمن والتخلص من النفايات الكيميائية الخطرة.
    4. ضع كمية صغيرة من الشمع على سطح الأسطوانة ودعها تذوب تماما.
    5. بعد الذوبان، ضع العينة مع السطح المعني على السطح المغطى بالشمع واضغط عليها بلطف لضمان التلامس الكامل.
      ملاحظة: يجب أن يكون السطح المعني مواجها لسطح الأسطوانة بحيث يتم التخفيف على الجانب المقابل. تجنب استخدام الشمع الزائد، لأن ذلك قد يؤدي إلى تركيب غير متساو ويؤثر على جودة التلميع.
    6. أزل الأسطوانة من صفيحة التسخين ودع الشمع يتصلب عند درجة حرارة الغرفة.
  4. مراقبة سمك العينة أثناء التلميع
    1. لمراقبة سمك العينة أثناء عملية التلميع، استخدم مجهر الانعكاس بتكبير منخفض إلى متوسط (مثل 10x-20x). يظهر مخطط يوضح معايرة المجهر وقياس سمك العينة في الشكل 2.
    2. معايرة محور Z المجهر باستخدام غطاء قياسي، والذي عادة ما يكون سمكه حوالي 150 ميكرومتر. ضع علامة على جانب واحد من الغطاء بعلامة دائمة حمراء، ومنطقة مجاورة على الجانب المقابل بعلامة زرقاء. ثبت غطاء الغطاء على شريحة زجاجية.
    3. باستخدام مقبض التركيز الدقيق ومقياس الميكرومتر، ركز أولا على السطح السفلي للغطاء ثم على السطح العلوي.
    4. سجل قيمة الإزاحة Z. تتوافق هذه القيمة مع سمك الانزلاق الغطاء (حوالي 150 ميكرومتر) وتعمل كمرجع.
    5. أثناء تلميع العينة، استخدم هذه المعايرة على محور Z بشكل دوري لتقدير سمك العينة دون إزالتها من أسطوانة الألمنيوم.
      ملاحظة: تسمح هذه التقنية بتقدير السماكة بسرعة وغير مدمرة أثناء التلميع. بدلا من ذلك، يمكن إزالة العينة من الحامل وقياسها باستخدام كاليبر رقمي أو ميكرومتر.
  5. التخفيف والتلميع
    1. ابدأ التلميع الخشن والمتوسط باستخدام ورق صنفرة بأحجام حبيبات 1200، 2500، و4100. الهدف من هذه الخطوة هو تقليل سمك العينة إلى حوالي 0.15 مم مع إزالة الشوائب السطحية الكبيرة.
    2. ابدأ بورق صنفرة 1200، ثم تقدم إلى صنفرة 2500. اضغط ضغطا خفيفا أثناء هذه العملية. راقب سمك العينة بشكل دوري باستخدام المجهر الانعكاسي أثناء التلميع.
    3. بمجرد الوصول إلى السماكة المطلوبة، قم بتلميع جانبي العينة باستخدام ورق صنفرة 4100. يمكن إجراء التلميع يدويا أو باستخدام آلة تلميع شبه آلية مضبوطة على سرعة دوران منخفضة. نظف العينة جيدا بالماء المقطر باستمرار خلال كل خطوة تلميع.
      ملاحظة: الحفاظ على العينات وورق الصنفرة رطبة أثناء التلميع يساعد في تقليل الحرارة ويمنع تلوث السطح من أوراق الصنفرة الخشنة.
    4. للتلميع النهائي، ضع كمية صغيرة من معجون الألماس (مثل 6 ميكرومتر أو 3 ميكرومتر) على قطعة قماش تلميع لباد مثبتة على قرص تلميع. اختر حجم جسيمات معجون الألماس حسب خشونة سطح العينة.
      ملاحظة: معجون 6 ميكرومتر مناسب للتلميع الدقيق الأولي، بينما ينصح باستخدام معجون 3 ميكرومتر للتلميع النهائي بالمرآة. عندما يكون ذلك ممكنا، فإن استخدام كلا المعجينين بشكل متسلسل يعطي أفضل النتائج. ومع ذلك، لا يزال من الممكن تحقيق تلميع مرض باستخدام معجون 6 ميكرومتر فقط.
    5. قم بتلميع جانبي العينة بلطف مع ضغط منخفض. استخدم الهواء المضغوط أو القطن لتجفيف سطح العينة المصقول قبل إجراء الفحوصات المجهرية.
    6. لفصل العينة عن الأسطوانة، سخن الشمع باستخدام صفيحة ساخنة ونظف أي شمع متبقي من العينة باستخدام الأسيتون اللامائي.
      ملاحظة: عند التعامل مع الشمع المثبت والأسيتون اللامائي، اعمل داخل غطاء بخار وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة. بعد الاستخدام، اجمع البقايا في حاويات نفايات متوافقة كيميائيا ومعنونة بوضوح مع أغطية مناسبة بشكل صحيح. اتبع الإجراءات القياسية المؤسسية للتخزين الآمن والتخلص من النفايات الكيميائية الخطرة.
    7. قم بتركيب العينة بين شريحة زجاجية وغطاء الغطاء باستخدام زيت الغمر كوسط تثبيت وتقييم اتجاه ألياف الكولاجين باستخدام مجهر الضوء المستقطب. ابدأ بتكبير منخفض (مثل 5x-10x) لمسح العينة وزيادة إلى تكبير متوسط (مثل 20x-40x) لتحديد المناطق المحتملة لمزيد من الاستكشاف باستخدام المجهر الإلكتروني.
      ملاحظة: للمضي قدما في سير العمل المرتبط والتحليل اللاحق للعينة بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح، ينصح بعدم إغلاق العينة.

4. تحضير العينات للمجهر الإلكتروني الماسح

  1. أزل العينة بعناية من شريحة الزجاج. قم بسحب غطاء الغطاء بلطف عن شريحة الزجاج باستخدام رأس الماصة. استخدم ورق الفلتر لإزالة زيت الغمر الزائد. اغسل العينة بصابون محايد. قم بالغسل داخل وعاء صغير لتجنب فقدان العينة عن طريق الخطأ.
    ملاحظة: إذا كان زيت الغمر المتبقي لا يزال موجودا على العينة، نظف السطح بلطف باستخدام مسحة قطنية مبللة قليلا بنسبة 70٪ إيثانول.
  2. اترك العينة لتجف في الهواء على ورق فلتر. يمكن أيضا استخدام الهواء المضغوط أو القطن لتجفيف العينة. بعد أن تجف تماما، قم بتركيب العينة على جزء صغير باستخدام شريط الكربون. غطى العينة بطبقة من الذهب بحجم 10 نانومتر لمنع الشحن أثناء التصوير.
  3. استخدم مجهر FIB-SEM ثنائي الشعاع لاستكشاف العينة بطرق مختلفة.
    1. في وضع SEM (المجهر الإلكتروني الماسح)، باستخدام إلكترونات ثانوية أو إلكترونات متناثرة، يتم تقييم شكل العينة، والمادة الحيوية، وواجهة العظم الجديدة في المناطق التي تم اختيارها سابقا بواسطة المجهر البصري.
    2. في وضع المجهر الإلكتروني الماسح بشعاع الأيونات المركز (FIB-SEM)، يتم إجراء التصوير المقطعي بتقنية القطع والعرض.
  4. في وضع SEM مع كاشف الإلكترونات الثانوي، يتم اختيار المناطق التي تم تحليلها سابقا باستخدام المجهر الضوئي المستقطب والأشعة الإلكترونية للمضي قدما في التقاط التصوير المقطعي بالشرائح والعرض.
  5. قم بضبط المعايير لحجم الخندق، حجم البكسل، وسمك الشريحة بناء على الميزات المعنية. في إعدادنا، تم إجراء تصوير مقطعي بشريحة وعرض بحجم خندق 15 ميكرومتر × 10 ميكرومتر × 10 ميكرومتر، وحجم بكسل 20 نانومتر، وسمك شريحة 60 نانومتر. يوصى باستخدام حجم فوكسل إيزومتري كلما أمكن لتحسين جودة التصوير عبر جميع الأبعاد الثلاثة (XYZ).
    ملاحظة: قد تختلف هذه المعايير حسب نظام FIB-SEM المحدد. استشر مشغل المعدات لتحديد الظروف المثلى بناء على متطلباتك التحليلية وقدرات النظام.

5. محاذاة ومعالجة المرشحات وتقسيم تصوير FIB-SEM المقطعي للشرائح والرؤية

  1. تولد التصوير المقطعي بالقطع والمشاهدة سلسلة من الصور المرقمة بالتسلسل. للمضي قدما في المحاذاة، حول السلسلة إلى ملف MRC، ويشار إليه عادة باسم المكدس.
  2. قم بتنفيذ توليد ملفات MRC ومحاذاة مكدس الصور باستخدام برنامج IMOD.
    ملاحظة: برامج أخرى، مثل Avizo وFIJI/ImageJ، تقدم أيضا إضافات محاذاة المكدس. للحصول على إرشادات مفصلة، يرجى الرجوع إلى كل وثائق خاصة بالبرنامج. بالإضافة إلى ذلك، أعمال بيدي وآخرون23. يقدم نظرة عامة على الأساليب المبنية أثناء محاذاة المكدس.
  3. لإنشاء ملف MRC، افتح الطرفية أو موجه الأوامر، وانتقل إلى المجلد الذي يحتوي على تسلسل الصورة، ونفذ الأمر التالي: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. بالنسبة للصور التي ليست بصيغة TIFF، استخدم raw2mrc بدلا من ذلك. أضف -g (مثلا، tif2mrc -g) لتحويل صور RGB 24-بت إلى تدرج رمادي 8-بت. هذا سيقلل بشكل كبير من وقت الحساب.
  4. شغل إيتومو من الطرفية واختر خيار محاذاة الأقسام التسلسلية. اتبع التسلسل لمحاذاة المكدس: (1) تحميل المكدس غير المحاذف في إطار واحد. (2) تبويب Algin باستخدام المحاذاة التلقائية الأولية. (3) أنشئ تبويب مكدس باستخدام إنشاء التكديس المحاذ، ثم افتح المكدس المحاذي.
    ملاحظة: قد تستغرق هذه العملية عدة دقائق، حسب حجم المكدس وأداء النظام.
  5. بعد الانتهاء، راجع النتيجة. سيتم تسمية ملف المكدس المحاذف stackname_ali.mrc.
    ملاحظة: يستخدم هذا الإجراء الإعدادات الافتراضية للنظام لمحاذاة المكدس. ومع ذلك، يمكن تعديل المعاملات المتعلقة بالمحاذاة الأولية والتوليد النهائي للمكدس وفقا لتفضيلات المستخدم. للحصول على إرشادات تفصيلية، يرجى الرجوع إلى وثائق IMOD: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. قم بتصفية صور إضافية باستخدام برنامج Avizo. افتح المكدس المحاذي وطبق الفلاتر التالية بشكل متسلسل: مرشح تحويل فورييه السريع (FFT)، المتوفر في إضافة مرشح صندوق الرمل (اختر خيار اتجاه الشريط الرأسي، قيمة التسامح: 2)، معالج تصحيح التظليل (ضبط اختيار القناع لتغطية كل منطقة الظل في الصورة، استخدم عامل التطبيع 100)، معادلة المخطط التكراري (التكوين الافتراضي)، والوسائل غير المحلية (تعديل القيم إلى 5؛ 0.1؛ 10؛ 3).
    ملاحظة: تتوفر مرشحات مكافئة في برامج تحليل الصور الأخرى. في FIJI/ImageJ، نوصي بالتسلسل التالي: مرشح FFT، طرح الخلفية، تعزيز التباين المحلي (CLAHE)، ومرشح الوسائل غير المحلية.
  7. تابع إلى تقسيم الصور والرسم ثلاثي الأبعاد باستخدام البرنامج. تتوفر استراتيجيات تقسيم مختلفة، بما في ذلك التقسيم اليدوي والتقسيم القائم على العتبة. يمكن لأدوات إضافية، مثل خوارزمية Watershed، أن تساعد في أتمتة العملية وتقليل الوقت المطلوب للتقسيم.

6. تحضير العينة لاستخدام المجهر الإلكتروني الناقل

  1. تحضير الصفائح باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح بشعاع الأيون المركز (FIB-SEM) لتقييم واجهة العظام/المواد الحيوية.
    ملاحظة: إذا لم تكن المادة الحيوية المزروعة خزفية أو معدنية، كما في هذه الدراسة، يمكن تحضير مقاطع فائقة الرقة المناسبة للمجهر الإلكتروني الناقل (TEM) باستخدام ميكروتوم فائق الميكروتوم. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن تقسيم المواد المعدنية يمكن أن يقلل بشكل كبير من عمر سكين الألماس.
  2. بعد صبغ الأقسام الرقيقة جدا لمدة 20 دقيقة في محلول مائي يحتوي على أسيتات اليورانيل 5٪.
    ملاحظة: عند التعامل مع أسيتات اليورانيل، اعمل داخل غطاء بخار وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة. بعد الاستخدام، اجمع أي مذيب متبقي في حاويات نفايات متوافقة كيميائيا ومعنونة بوضوح مع أغطية مناسبة بشكل صحيح. اتبع الإجراءات القياسية المؤسسية للتخزين الآمن والتخلص من النفايات الكيميائية الخطرة.
  3. حلل الأقسام باستخدام TEM. للحصول على تحليل شامل، قم بدمج التصوير مع حيود الإلكترونات في المنطقة المحددة (SAED)، والتحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDS)، والتصوير المقطعي للإلكترون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم إجراء التحليل الأولي للعينات المدمجة في الراتنج باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (microCT). تسهل هذه التقنية غير المدمرة التصور ثلاثي الأبعاد لمنطقة العيب بأكملها، مما يتيح تحليلات كمية ونوعية للعينة. يأتي التباين في تصوير الميكرو سي في الغالب من فروق كثافة المواد الموجودة في العينة. يوضح الشكل 1 تحليل الميكرو CT لعيب غير حرج في عظمة الساق في الجرذ تم زرعه بمادة CHA37 الحيوية. تم جمع العينة بعد 12 أسبوعا من الزرع وأعدتها وفقا لبروتوكول تضمين الرات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم استخدام تقنيات تصوير مختلفة لدراسة بنية العظام وتقييم فعالية المواد الحيوية في تحفيز التكامل العظمي 7,21,22,23,24. في هذا البروتوكول، أنشأنا سير عمل يتضمن التصوير بالأشعة السينية، والمجهر البصري، والمجهر الإلكتروني لتحليل نسيج العظم المعدني المكون في عيب في عظمة الساق في الفئران بعد زرع المواد الحيوية. يتطلب تنفيذ هذا السير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية قد تكون أثرت على العمل المبلغ عنه في هذه الورقة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل بمنح للمؤلفين من الوكالات البرازيلية التالية: المجلس الوطني للأبحاث التطوعية للعلوم والتقنية (CNPq/البرازيل) ومؤسسة كارلوس شاغاس فيليو دي أمبارو آ بيسكيسا دو ولاية ريو دي جانيرو (FAPERJ). نشكر LABNANO/CBPF وCENABIO/UFRJ على توفير خدمات المجهر الإلكتروني. تم إجراء تحسين اللغة ومراجعة القواعد باستخدام ChatGPT (OpenAI، GPT-5.1، 2025). تمت مراجعة جميع التعديلات والتحقق منها من قبل المؤلفين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأسيتون ميرك67-64-1
أسطوانة ألمنيوممصنوع يدويالا يوجد
إصدار أفيزو 2022.1ثيرموفيشرلا يوجدبرامج تصفية الصور، والتقسيم، والتصوير ثلاثي الأبعاد
حمض الكاكوديلك، ملح الصوديوم، ثلاثي هيدراتتيد بيلا18851مسحوق لمخزن كاكوديلات. جهز محلول مخزوني بمقدار 0.2 متر
مركب تلميع الألماس 3 وميكرو؛ حجم mتيد بيلا895-8
مركب تلميع الألماس 6 وميكرو؛ حجم mتيد بيلا895-9
عجلة دايموند x.006تكنولوجيا ساوث بايDWH 3063
عجلة دايموند x.012تكنولوجيا ساوث بايDWH 4122
قماش تلميع لبادتيد بيلا816-20
كبسولات التضمين المسطحةخدمات الطوارئ الطبية70021
غطاء زجاجينيتللا يوجد
شريحة زجاجيةنيتللا يوجد
جلوتارالدهايد، 25٪ درجة EMتيد بيلا18426/18427
Gold sputter K550Xإيميتكلا يوجد
ImageJالمعاهد الوطنية للصحة (NIH)برامج لتشكيل الصور، والتصفية، والتقسيم، والتصوير ثلاثي الأبعاد
إصدار IMOD 5.1جامعة كولورادوبرامج لتحليل الصور، والتقسيم، والتصوير ثلاثي الأبعاد
آلة التلميع الإلكترونيةتكنولوجيا ساوث بايموديل 910
منشار عجلة الألماس منخفض السرعة  تكنولوجيا ساوث بايموديل 650
مجموعة تضمين منخفضة اللزوجةخدمات الطوارئ الطبية14300مجموعة لراتنج SPURR. استعد وفقا لمواصفات ورقة البيانات  
ميكرو-سي تي سكايسكان 1273 بروكرلا يوجد
مجهر جيول 2100F 200 كيلو فولت؛جيوللا يوجد
مجهر أوليمبوس BX51أوليمبوسلا يوجد
المجهر تسكان ليرا3تسكانلا يوجد
مجهر زايس أكسيوبلانزايسلا يوجدمجهزة بصفيحة لامبدا من الدرجة الأولى
بارافورمالديهايد، درجة EMسيغماP6148مسحوق لمحلول الفورمالديهايد. حضر محلول مخزوني بنسبة 16٪
شريحة بلاستيكيةبالضبط41500
شمع تثبيت كويك ستيك 135تكنولوجيا ساوث بايلا يوجد
أوراق الصنفرة   أحجام الحبيبات 1200لا يوجدلا يوجد
أوراق الصنفرة   أحجام الحصى 2500لا يوجدلا يوجد
أوراق الصنفرة   أحجام الحصى 4100لا يوجدلا يوجد
سوبر غلولوكتايتلا يوجد
مبرد قابل للذوبان في الماء  تكنولوجيا ساوث بايلا يوجد
ورق فلتر واتمان من الدرجة الأولىسيغماWHA1001150

المراجع

  1. Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. Bone hierarchical structure in three dimensions. Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).
  2. Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists. J Str Biol: X. 6, (2022).
  3. Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration. Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).
  4. Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 86, 119-130 (2016).
  5. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  6. Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface. Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).
  7. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  8. Sim, J. H., Yeo, I. S. Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces. Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).
  9. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  10. Müller, R. Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).
  11. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  12. Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy. J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).
  13. Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning. J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).
  14. Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures. Bone. 52 (2), 676-683 (2013).
  15. Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale. Science. 360 (6388), 2189(2018).
  16. Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM. Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).
  17. Micheletti, C., et al. mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces. Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).
  18. Micheletti, C., Shah, F. A. Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges. Bone Rep. 22, (2024).
  19. Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. 50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy. Bone Res. 7 (1), (2019).
  20. Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils. J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).
  21. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  22. Keklikoglou, K., et al. Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols. Eur J Taxonomy. (522), (2019).
  23. Peddie, C. J., et al. Volume electron microscopy. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).
  24. Costa De-Moraes, S. L., et al. Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep. Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).
  25. Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. 3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds. Micron. 142, (2021).
  26. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  27. Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone. Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).
  28. Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
  29. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
  30. Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
  31. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  32. Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition. , 447-466 (2018).
  33. Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants. Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).
  34. Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering. Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).
  35. Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures. Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).
  36. McMahon, G., Malis, T. Ultramicrotomy of nanocrystalline materials. Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).
  37. Bassim, N. D., et al. Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials. J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).
  38. Witzke, K., et al. Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale. Materials. 15 (9), 3084(2022).
  39. Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy. Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).
  40. Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface. J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).
  41. Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography. Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة