يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة مبيض الفأر الوليدية وقياس الجريبات الكاملة: نهج فعال في المختبر لدراسة تنظيم الجريبات الأولية

689 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69498

⸱

ديسمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه الدراسة بروتوكولات لزراعة مبايض الفئران بعد الولادة على الأجزاء الغشائية وقياس الجريبات الكاملة في المبيض بأكمله. أظهرت النتائج أن التعامل الفني أثناء زراعة المبايض يؤثر بشكل كبير على عدد الجريبات الأولية، مما يبرز أهمية الحفاظ على الاتساق لتقليل التنوع غير البيولوجي.

الملخص

في الثدييات الإناث، تتكون الجريبات البدائية خلال تطور المبيض الجنيني وتعد المصدر الوحيد للحفاظ على وظيفة المبيض لدى البالغين. تعد الآليات الكامنة وراء كيفية تجمع الجريبات الأولية، والحفاظ على السبات، وتفعيلها لتطور الجريبات، وخضوعها لموت الخلايا مهمة لفهم فسيولوجيا المبيض والحالات المرضية. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لتربية مبايض الفئران بعد الولادة على مدخلات غشائية، وهو نهج يتيح زراعة وعلاج المبايض السليمة بالدواء لمدة تصل إلى 10 أيام، حسب مرحلة تطور المبيض. يمكن تحقيق تغييرات في ظروف الزراعة عن طريق نقل الإدخال الذي يحتوي على المبايض المزروعة بين الآبار على لوحة، مما يمنع التداخل الفيزيائي مع الأنسجة أثناء الزراعة. تم عزل مبايض P5 وزراعتها على مدرج بحجم 12 مم في صفيحة ب 24 بئر كمثال. تم فصل كل مبيض ضمن قطرة من وسط DMEM/F12 مغطى ب 10٪ FBS، 3 ملغ/ملليتر BSA، 10 mIU/mL FSH، ومضاد حيوي-مضاد للفطريات، وتم تثبيته بلطف على إدخال الغشاء. كان يتم تغيير الوسيط كل يومين، وتم الحفاظ على الثقافة لمدة خمسة أيام إجمالا. بعد الزراعة، تم تثبيت المبايض في 4٪ بارافورمالديهايد لمدة ساعتين وتمت معالجتها لتلوين الأجسام المضادة الكاملة لمؤشر البويضات DDX4. تم تصنيف الجريبات وقياسها بناء على حجم البويضات والشكل النووي لخلايا البصيلات الجسدية. أظهرت النتائج أن عدد الجريبات الأولية في كل مبيض تأثر بشكل كبير بوضع الأنسجة بشكل صحيح على إدخال الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤدي الاختلافات في عدد المبايض في كل إدخال إلى ظهور اختلافات غير بيولوجية ويجب تجنبها.

المقدمة

تكوين البيضات هو عملية منظمة ومعقدة للغاية تؤدي إلى إنتاج بويضات ناضجة. في الثدييات، يبدأ تكوين البويضات في المبايض الجنينية، حيث تتمايز الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) إلى بويضات أولية. كل بويضة أولية محاطة بطبقة من خلايا ما قبل الحبيبات الحرشفية، مكونة جريبا أوليا. معظم هذه الجريبات البدائية تصبح خاملة بعد التكوين، وتعمل كاحتياطي مبيضي 1,2,3. في المبيض البالغ، يعد التنشيط الدوري للجريبات الأولية لتطوير الجريبات، المعروف باسم تكوين الجريبات، ضروريا للحفاظ على إنتاج البويضات الناضجة وهرمونات الستيرويد المبيضية 4,5. في غياب إشارات التنشيط، يمكن أن تبقى الجريبات البدائية البشرية ساكنة لمدة تصل إلى 50 عاما. قد يساهم السكون المطول في انخفاض جودة البويضات، بالإضافة إلى زيادة معدل فقدان الجريبات البدائية في المبايض المتقدمة في العمر6. تظل الآليات التي تكمن وراء كيفية تنشيط مجموعة معينة من الجريبات بينما تبقى أخرى ساكنة وتخضع لموت الخلايا بشكل دوري أسئلة مفتوحة.

عملية تكوين البويضات محفوظة بشكل كبير في الثدييات، مما يجعل الفئران نموذجا مثاليا لدراسة تكوين البويضاتالثديية 7. في الفئران، يكتمل تكوين الجريبات الأولية بحلول اليوم الرابع بعد الولادة (P4). تخضع نسبة صغيرة من الجريبات البدائية لتطور جريبي فور تكوينها. خلال تطور الجريبات، يزداد حجم البويضة بسبب تعزيز تكوين الأعضاء، وتخليق mRNA والبروتينات4. تنتقل خلايا الحبيبات الحرشفية إلى خلايا حبيبية مكعبية وتصبح تكاثرية8. تنمو هذه الجريبات النامية إلى مرحلة الإباضة حوالي اليوم الحادي والعشرين، وهو الوقت الذي تبلغ فيه الإناث الفئران سن البلوغ. تعرف هذه المرحلة من تطور الجريبات في المبايض بعد الولادة عادة باسم "الموجة الأولى من تكوين الجريبات". نظرا لأن تكون الجريبات في الموجة الأولى تعكس عن كثب عملية تطور الجريبات، توفر مبايض الفأر بعد الولادة نموذجا مثاليا لدراسة تنظيم الجريبات الأولية وتكوين بصيلات المبيض9.

يعتمد تصنيف بصيلات المبيض بشكل أساسي على شكل الخلايا الجسدية للجريبات وحجم البويض. في مبيضات الفئران، يتم التعرف على الجريبة الأولية الخاملة بطبقة واحدة من خلايا ما قبل الحبيبات الحرشفية التي تحيط ببويضة أولية، قطرها حوالي 20 ميكرومتر. يمكن تصنيف الجريبات النامية إلى بصيلات أولية، ثانوية، ثالثية، وأنترالية. تحتوي الجريبة الأولية على بويضة يبلغ قطرها عادة أكثر من 25 ميكرومتر وتحيط بها طبقة واحدة من خلايا الحبيبات المكعبة (الشكل التكميلي 1). تحتوي البصيلة الثانوية على طبقتين من خلايا الحبيبات، بينما تتكون الجريبات الثالثة من ثلاث طبقات أو أكثر من خلايا الحبيبات. الجريبة الشربية أكبر من الجريبة الثالثية، وتحتوي على طبقات متعددة من خلايا الحبيبات، ولديها تجويف مملوء بالسائل يعرف باسم الجريب العصبي. مع تطور الجريبات، تزداد حجم البويضة لتصل إلى حوالي 80 ميكرومتر بحلول وقت الإباضة. بالإضافة إلى ذلك، تحيط الجريبات النامية بعدة طبقات من خلايا الثيكا الرقيقة، والتي تقع خارج خلايا الحبيبات 10,11,12.

الحجم الصغير نسبيا لمبايض الفئران بعد الولادة يجعل من زراعة المبيض الكاملة نهجا عمليا للبحث. تمكن هذه الطريقة بفعالية من دراسة تطور المبيض والجريبات داخل المبيض السليم، حيث تحافظ على البيئات الدقيقة الفيزيائية والفسيولوجية مع تقليل التداخل من الأنسجةالمحيطة. تسمح هذه الطريقة بإجراء تجارب قد يكون من الصعب تنفيذها في نماذج الحية الحية (in vivo). تشمل الأمثلة التصوير الحي لتطور المبيض، والعلاجات متعددة الأدوية المسيطر عليها زمنيا، وتحليل نشاط إفراز المبيض من خلال تحليل البروتين لوسط الزراعة13,14. علاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا النهج لدراسة تأثير العوامل الإفرازية دون تفاعل مباشر بين الخلية والخلية من خلال تجارب الزراعة المشتركة. في هذه التجارب، يمكن وضع أنواع مختلفة من الأنسجة على إدخالات أغشية منفصلة داخل وسط مشترك15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يساعد استخدام مبايض الفئران المشروط التي تخرج جينيا في المختبر في توضيح الآليات الرئيسية المشاركة في تنشيط ونمو الجريبات الأولية.

في هذا المقال، نقدم طرقا لتربية مبايض الفئران بعد الولادة باستخدام إدخالات الغشاء وقياس الجريب الكامل في المبيض بأكمله (الشكل 1). تشمل التقنيات الموضحة هنا 1) تشريح مبايض الفئران الوليدة، 2) زراعة مبايض الفئران الوليدة، 3) تغيير الوسط أثناء الزراعة، 4) تثبيت الأنسجة وتلوين الأجسام المضادة بالكامل، و5) تصوير الأنسجة وقياس الجريبات. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت هذه الدراسة دوكسوروبيكسين لتحفيز فقدان الجريبات البدائية تجريبيا، مما وفر نموذجا لدراسة الآليات الكامنة وراء استنزاف احتياطي المبيض. أظهرت النتائج أن عدد المبايض لكل إدخال وموقعها داخل الإدخال أثناء الزراعة أثرا على عدد الجريبات الأولية. يبرز هذا أهمية الحفاظ على ترتيب مزرعة متسق لمنع الاختلافات غير البيولوجية في نتائج التجارب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إسكان الفئران الذكور والإناث في CD-1 معا بنسبة 1:1 كأزواج تزاوج. تم تعيين تاريخ ميلاد الجراء الجديدة كيوم ما بعد الولادة 0. تمت الموافقة على جميع تجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) في جامعة ميزوري (رقم البروتوكول: 36647).

1. المواد الكيميائية ووسائل الإعلام الثقافية

  1. جميع الكواشف المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد. جهز جميع المواد والوسائط قبل زراعة المبيض.
  2. وسائط الزراعة: اصنع ~5 مل من وسط DMEM/F-12 مع 3 ملغ/مل من ألبومين مصل البقر (BSA)، و10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و10 ميكرويون/مل هرمون محفز الجريبات (FSH).
    ملاحظة: يجب تجهيز الوسائط بشكل جديد بإضافة مخزونات BSA (30 ملغ/مل)، وFBS، وFSH (10 IU/mL) إلى وسائط DMEM/F-12. توازن الوسط في طبق بتري لمدة حوالي 30 دقيقة في حاضنة 5٪CO2 عند 37 درجة مئوية. خزن المخزون عند -20 درجة مئوية وقم بإذابته فورا قبل الاستخدام. يخزن Aliquot بكميات مناسبة لتجنب التجميد المتكرر وذوبان المخزونات.

2. ثقافة المبايض

  1. قتل إناث فئران P5 عن طريق قطع الرأس. قم بإزالة المبايض وأنسجة الجراب المرفقة باستخدام المقص الجراحي والملاقط. ضع المبايض في طبق بتري بقطر 60 مم مع محلول ملحي دولبيكو المبرد مسبقا يحتوي على مضاد حيوي مضاد للفطريات (الشكل 2A,B).
  2. باستخدام زوج من حقن الأنسولين (1 مل)، قم بتشريح وإزالة نسيج الجورية من المبيض تحت جهاز ستيريو (الشكل 2C,D). انقل المبايض باستخدام ماصة بسعة 1 مل إلى طبق بتري بحجم 30 مم يحتوي على 3 مل من وسط الزراعة وضع الطبق في حاضنةثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: تجنب وخز أو ضغط المبايض. قم بإجراء شقوق نظيفة وموحدة عبر الجراب المبيض باستخدام حقن الإنسولين لتحرير المبيض. املأ رأس الماصة مسبقا بحوالي 50 ميكرولتر من الوسط، وضع رأس الماصة بجانب المبيض، ثم استنشقه إلى الطرف لنقله.
  3. تحت غطاء التدفق الطبقي، جهز اللوح بوضع 400 ميكرولتر من الوسائط وإدخال في كل بئر (الشكل 2E,E'). الوسط خارج الوسط، وغشاء الإدخال يصبح معتما بمجرد أن يبتل بواسطة الوسط.
  4. بالنسبة للزراعة التي تحتوي على علاج دوكس لمدة 24 ساعة، حضر وسط يحتوي على دوكس بتركيز 0.1 ملغ/مل طازجا عن طريق تخفيف مخزون دوكس (10 ملغ/مل) باستخدام الوسط.
    ملاحظة: يجب التخلص من المواد التي تحتوي على دوكس بشكل صحيح وفقا لإرشادات اللجان المؤسسية للسلامة البيولوجية والصحة والسلامة البيئية.
  5. تحت جهاز التجسم، يمكنك نقل ما يصل إلى ثلاثة مبايض إلى إدخال باستخدام ماصة بحجم 1 مل (الشكل 2F,G). قلل كمية الوسائط المنقولة إلى الإدخال وقم بإزالة أي وسائط زائدة فورا. بمجرد وضع المبايض بلطف في الفتحة، استخدم ماصة بسعة 200 ميكرولتر لنقل حوالي 200 ميكرولتر من الوسط من البئر إلى الإدخال مع التأكد من تغطية الغشاء بالكامل. انقل الوسط إلى البئر ومركز المبايض على الغشاء. املأ طرف الماصة بوسط الزراعة لمنع امتصاص المبيض داخل الطرف عند تمركزه. تأكد من ترك مساحة كافية بين المبايض وأن يكون مثبتا على إدخال الغشاء (الشكل 2H)، بدلا من البقاء معلقا في الوسط (الشكل 2I). احذر من لمس المبايض والغشاء.
  6. في الزراعة التي تستمر 5 أيام، يتم تغيير الوسط كل يومين بإزالة 200 ميكرولتر من الوسط (نصف الكمية الإجمالية) من البئر وإضافة 200 ميكرولتر من الوسائط الطازجة إلى البئر (الشكل 2J).
  7. بالنسبة للزراعة التي استغرقت 24 ساعة علاجا دوائيا، يتم نقل الإدخال مع المبايض إلى بئر جديد يحتوي على 400 ميكرولتر من وسط الزراعة الطازج بعد 24 ساعة الأولى، باستخدام الخطوات التالية:
    1. أزل الإدخال الذي يحتوي على المبايض من البئر باستخدام ملقط.
    2. اشطف أسفل الإدخال لفترة وجيزة عن طريق غمره في طبق بحجم 60 مم مع وسط زراعة طازج.
    3. انقر بلطف على أسفل الإدخال على طبق فارغ بحجم 60 مم لإزالة الوسائط الزائدة من الإدخال. ضع الإدخال في البئر مع مادة جديدة من الثقافة.
      ملاحظة: أزل الوسط الزائد من الإدخال لضمان استقرار المبايض على الغشاء فور تغيير الوسط أو نقل الإدخال.

3. التثبيت والتلوين المناعي على كامل التركيب

  1. لتثبيت المبايض المزروعة، أزل الإدخال من اللوحة باستخدام ملقط وضعه في طبق بتري بقطر 60 مم يحتوي على 5 مل من DPBS. انقل حوالي 100 ميكرولتر من DPBS بجانب المبايض وأعد تعليقهما باستخدام ماصة بسعة 1 مل.
  2. باستخدام ماصة بسعة 1 مل، انقل المبايض من الإدخال إلى أنبوب إيبندورف بسعة 1.5 مل. قم بإزالة DPBS من الأنبوب وإضافة 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد. ثبت المبايض على درجة حرارة 4°C لمدة ساعتين.
    ملاحظة: قد يحتاج طرف الماصة إلى قص أوسع لمنع تلف الأنسجة إذا كانت المبايض كبيرة جدا بحيث لا يمكن المرور من خلالها.
  3. اغسلي المبايض الثابتة بسعة 1 مل من PBST2 (PBS، 0.1٪ Tween [v/v]، 0.5٪ Triton [v/v]) ثلاث مرات على الأقل، ساعة لكل منهما على هزاز دوارة. يوصى بترك الأنسجة في PBST2 طوال الليل (12-16 ساعة) عند 4 درجات مئوية لتعزيز اختراق الأجسام المضادة.
    ملاحظة: قد يكون هذا نقطة توقف؛ يمكن تخزين الأنسجة في PBST2 حتى ثلاثة أيام قبل حضانة الأجسام المضادة الأولية.
  4. حضن المبايض بهيليكاز 4 مضاد للصندوق الميت (DDX4) في 100 ميكرولتر من محلول تخفيف الأجسام المضادة (1٪ BSA [بدون ضد]، 10٪ سيروم Donkey [v/v]، 0.1 M جليسين، 0.1٪ Tween، و0.5٪ Triton في PBS) عند تخفيف 1/400 (2.3 ميكروغرام/مل) عند 4 °م لمدة 12-16 ساعة.
  5. في اليوم التالي، أزل الجسم المضاد الأساسي وأضف 1 مل من PBST2 إلى الأنبوب. اغسل المناديل ثلاث مرات على الأقل، ساعة لكل منها على شاكر دوار.
    ملاحظة: قد يكون هذا نقطة توقف؛ يمكن أن تبقى الأنسجة في PBST2 حتى ثلاثة أيام بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية.
  6. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية AF488 عند تخفيف 1/500 (1.5 ميكروغرام/مل) في PBST2. حضن النسيج بما لا يقل عن 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف عند 4 درجات مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  7. في اليوم التالي، اغسل المناديل جيدا في PBST2 ثلاث مرات على الأقل، ساعة واحدة لكل منهما على هزاز دوار. ينصح بغسل المناديل لمدة تصل إلى 8 ساعات لتقليل الخلفية. تأكد من تغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء من هذه الخطوة للأمام.
  8. إزالة PBST2 وإضافة 100 ميكرولتر من DAPI بتخفيف 1/1000 (1 ميكروغرام/مل) في PBS إلى الأنبوب. حضن الأنسجة في DAPI لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. اغسلي المبايض في PBST2 مرة واحدة لمدة 30 دقيقة وركبيها على شريحة مجهرية مع فاصل تصوير. انقل المبايض إلى مركز الفاصل باستخدام ماصة بحجم 1 مل وإزالة PBST2 الزائد. أضف حوالي 5 ميكرولتر من وسط تثبيت مضاد التزعيل وضع شريحة مجهر على أعلى الفاصل. أغلق حواف الفاصل بطلاء أظافر شفاف للتخزين طويل الأمد.
    ملاحظة: قبل تصوير الشرائح الصغيرة، تأكدي من جفاف طلاء الأظافر تماما وعدم وجود وسط تثبيت على الجزء الخارجي من طبقة الغطاء. قد تضر هذه المواد بأهداف المجهر. بالإضافة إلى ذلك، تجنب استخدام وسائط تثبيت زائدة، لأن المبايض تحتاج إلى البقاء ثابتة أثناء التصوير.
  10. صور المبايض باستخدام مجهر كونفوكلي بتكبير 10 أضعاف وحجم خطوة Z تبلغ 10 ميكرومتر. قم بضبط الإعدادات واستخدم تعويض Z (كسب الإثارة) لتصوير المبيض بالكامل. يمكن القيام بذلك باستخدام الخطوات التالية:
    1. قم بضبط قوة الإثارة وكسب الكاشف عن طريق مراقبة تشبع الإشارة باستخدام المقطع التكراري، حيث قد يختلف بين الأنسجة. ابدأ بقوة ليزر منخفضة وزد تدريجيا حسب الحاجة.
    2. لتصوير المناطق الأعمق، قم بتمكين تعويض Z لكاشف الكسب، حيث قد تنخفض شدة الإشارة مع العمق. استخدم متوسط إطارات لا يقل عن 10 وفعل المسح ثنائي الاتجاه X-Scanning بسرعة 600 هرتز.
      ملاحظة: مع هذه الإعدادات، يجب ألا يتجاوز التصوير 10 دقائق لكل مبيض (~200 ميكرومتر). عادة ما يكون التلوين المناعي الفلوري الكامل للمبايض باستخدام مضاد DDX4 قويا ونادرا ما يبيض ضوئيا.

4. قياس الجريبات

  1. لقياس الجريبات في كل مبيض، افتح الصور باستخدام برنامج ImageJ. عند الفتح، تأكد من اختيار وضع الألوان كملون وأن تقسيم القنوات تم تحديده في المربع تحت التقسيم إلى نوافذ منفصلة. اختر الصورة التي تهمك، ثم استخدم أداة الصورة/التحول/الدوران لوضع المبيض بشكل متماثل داخل الصورة.
    ملاحظة: يمكن مشاهدة الصور التي تلتقطها الكونفوكال وتحليلها ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج إيماريس (الشكل 3A,B) أو برنامج ImageJرقم 16.
  2. استخدم أداة التحليل/الأدوات/الشبكة لتقسيم المبيض إلى شبكات (الشكل 3C,C').
  3. استخدم أداة الإضافات/التحليل/عداد الخلايا لتحديد جميع الشبكات التي تغطي المبيض (الشكل 3D، D'، الشبكات المحددة ب 4). من بين هذه الشبكات، قم بتحديد كل شبكة أخرى في كل صف لقياس الجريبات (الشكل 3E,E'، الشبكات المحددة ب 8). الشبكات على حافة المبيض التي تحتوي على أقل من 10 بويضات لا تدرج لقياس الجريبات.
    ملاحظة: قم بتهيئة عداد الخلايا واختر أنواع العدادات التي تعتبرها سهلة القراءة.
  4. يمكن التعرف على البويضات من خلال وجود بنية حلقية موجبة ل DDX4 تحيط بنواة إيجابية ل DAPI. الجريبات البدائية تحتوي على بويضات بحجم يقارب 20 ميكرومتر في القطر محاطة بخلايا حرشفية جسدية. تحتوي الجريبات النامية على بويضات يزيد قطرها عن 25 ميكرومتر ومحاطة بطبقة أو أكثر من خلايا الحبيبات المكعبة (الشكل التكميلي 1).
  5. عد الجريبات الأولية في كل شبكة معلمة (كما هو موضح في الشكل 3E,E' مع عداد النوع 8). راجع الجريبات باستخدام أقسام/أكوام بصرية في الشبكة، ووضع علامة عليها باستخدام أداة عداد الخلية على التوالي. تأكد من عدم العد المزدوج للجريبات البدائية في قسمين بصريين متتاليين/مكدستين. عد الجريبات النامية في جميع الشبكات الموسومة بعداد النوع 4.
    ملاحظة: استخدم خيار التكبير للمساعدة في تصور وعد البويضات عبر الأكوام.
  6. احسب عدد البصيلات الأولية في المبيض بأكمله (nf) عن طريق ضرب متوسط عدد البصيلات الأولية لكل شبكة (nfgrid) في عدد الشبكات التي تشمل المبيض (nggrids). nf = شبكة NF × ngrids.
    ملاحظة: تم إجراء تحليلات إحصائية، وتم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام برنامج بريزم 10.2.0 (برنامج GraphPad Software، الإصدار 10، كاليفورنيا). تم تقييم الفروقات بين المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاه اختبار المقارنة المتعددة لتوكي. تم النظر في الدلالة الإحصائية عند p < 0.05. تعرض البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري (SE).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذا المقال، نعرض طرق زراعة المبايض لحديثي الولادة، وتلوين الأجسام المضادة بالكامل، والتصوير الكونفوكلي، وقياس الجريبات لتقييم ما إذا كان عدد وموقع المبايض في الإدخال أثناء الزراعة يؤثر على نتيجة التجريب، وبشكل خاص على عدد الجريبات في المبيض. قمنا بزراعة المبايض بالإعدادات التالية: مبيض واحد أو اثنان أو ثلاثة لكل مبيض للزراعة المستقرة، وثلاثة مبايض لكل إدخالة للزراعة العائمة. تم زراعة المبايض تحت حالتين: مجموعة ضابطة أو مجموعة عولجت بالأدوية مع علاج دوكس لمدة 24 ساعة عند 0.1 ميكروغرام/مل. بعد 24 ساعة من الزرعة، تم تحوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، عرضنا طرقا لزراعة مبايض الفئران الوليدية ولقياس جريب المبيض الكامل. يمكن لنهج الزراعة أن يحافظ على الجريبات الأولية والنامية مبكرا في المختبر. تتطلب طريقة قياس الجريبات المثبتة بالكامل معالجة نسيجية قليلة، مما يوفر الوقت ويحافظ على سلامة الأنسجة، مما يضمن القياس الدقيق للجريبات.

يشير عدد البصيلات البدائية التي لوحظت في مجموعة الضبط إلى أنه، رغم وجود انخفاض طفيف مقارنة بعدد الجريبات المبلغ عنها في المبايض في اليوم العاشر بعد الولادة (حوالي 4,300...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا توجد تضارب مصالح يمكن الإفصاح عنه.

شكر وتقدير

وقد تم دعم البحث المبلغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم R35GM158131. حظيت EADM بدعم مؤسسة لالور. يشكر المؤلفون بكل امتنان لمركز المجهر الخفيف المتقدم بجامعة ميزوري على دعمهم ومساعدتهم في هذا العمل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألواح زراعة الخلايا ذات 24 بئرفيشر ساينتيفيك 09-761-146 
أليكسا فلور 488 حمار مضاد للأرنبمختبرات جاكسون لأبحاث المناعة711-546-152
ضد المضاد (100X)جيبكو15240-062
مصل البقر ألبومينسيغما-ألدرتشA1470-25G
فأر CD-1 IGSمختبرات تشارلز ريفر  022الفئران
إدخالات زراعة الخلاياميليبورPICM01250
حقنة إنسولين Comfort Point مع إبرة 1cc 28G × 1/2إكسل26027
DAPIثيرمو ساينتفيك62248
نموذج الأرنب في DDX4أبكامab13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)جيبكو11320-033
دوكسوروبسين هيدروكلوريد  سيغما-ألدرتشPHR1789
DPBS (1X)جيبكو14190-144
مصل الأبقار الجنينيسيغما-ألدرتشF0926-500ML
فيجي-إيميج جالمعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
خلاطات الموترات من فيشربراند - سرعة متغيرةفيشر ساينتيفيك 88-861-043شاكر
هرمون محفز الجريباتسيغما-ألدرتشF4021-10UG
فورما ستيري-سايكل i160ثيرمو ساينتيفيك؛i160حاضنة ثاني أكسيد الكربون
الجلايسينفيشر ساينتيفيك BP381-500
إيماريس أوكسفورد إنسترومنتس (https://imaris.oxinst.com/)إيماريس 10.2
لايكا TCS SP8لايكا مايكروسيستمزSN 8100001409كونفوكال
مصل الحمار العاديمختبرات جاكسون لأبحاث المناعة017-000-121
أوليمبوس SZ61مجاهر أوليمبوسSZ61ستيريوسكوب
بارافورمالديهايد فيشر ساينتيفيك 15714
فاصل تصوير SecureSealمختبرات جريس البيولوجية654002
ترايتون X-100سيغما-ألدرتشX100-500ML
20 سنةسيغما-ألدرتشP1379-500ML
وسيط تثبيت مضاد للتلاشي في VECTASHIELDمختبرات فيكتورH-1000

المراجع

  1. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: Mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  2. Ikami, K., Nuzhat, N., Lei, L. Organelle transport during mouse oocyte differentiation in germline cysts. Curr Opin Cell Biol. 44, 14-19 (2017).
  3. Pepling, M. E. Follicular assembly: Mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  4. Lintern-Moore, S., Moore, G. P. The initiation of follicle and oocyte growth in the mouse ovary. Biol Reprod. 20 (4), 773-778 (1979).
  5. Picton, H. M. Activation of follicle development: The primordial follicle. Theriogenology. 55 (6), 1193-1210 (2001).
  6. Smitz, J. E., Cortvrindt, R. G. The earliest stages of folliculogenesis in vitro. Reproduction. 123 (2), 185-202 (2002).
  7. Jagarlamudi, K., Rajkovic, A. Oogenesis: Transcriptional regulators and mouse models. Mol Cell Endocrinol. 356 (1-2), 31-39 (2012).
  8. Binelli, M., Murphy, B. D. Coordinated regulation of follicle development by germ and somatic cells. Reprod Fertil Dev. 22 (1), 1-12 (2010).
  9. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  10. Bristol-Gould, S. K., et al. Postnatal regulation of germ cells by activin: The establishment of the initial follicle pool. Dev Biol. 298 (1), 132-148 (2006).
  11. Pedersen, T., Peters, H. Proposal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary. J Reprod Fertil. 17 (3), 555-557 (1968).
  12. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol Reprod. 54 (1), 197-207 (1996).
  13. Levy, E. W., Leite, I., Joyce, B. W., Shvartsman, S. Y., Posfai, E. A tug-of-war between germ cell motility and intercellular bridges controls germline cyst formation in mice. Curr Biol. 34 (24), 5728-5738 (2024).
  14. Nagamatsu, G., Shimamoto, S., Hamazaki, N., Nishimura, Y., Hayashi, K. Mechanical stress accompanied with nuclear rotation is involved in the dormant state of mouse oocytes. Sci Adv. 5 (6), eaav9960(2019).
  15. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reprod Toxicol. 49, 117-135 (2014).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  17. Bristol-Gould, S. K., et al. Fate of the initial follicle pool: Empirical and mathematical evidence supporting its sufficiency for adult fertility. Dev Biol. 298 (1), 149-154 (2006).
  18. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  19. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  20. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Sci Rep. 8 (1), 13499(2018).
  21. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. J Ovarian Res. 13 (1), 121(2020).
  22. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. Expression of Stat3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  23. Luan, Y., Yu, S. Y., Abazarikia, A., Dong, R., Kim, S. Y. TAp63 determines the fate of oocytes against DNA damage. Sci Adv. 8 (51), eade1846(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة مبيض حديث الولادةالتكميم الكامل للعينةتحديد مراحل نمو الجريباتمؤشر الخلايا البيضية DDX4زراعة الغشاء المدرجفيزيولوجيا المبيضتنشيط الجريبات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.