تقدم هذه الدراسة بروتوكولات محسنة لإجراء تحليل الأيض في الوقت الحقيقي لاختبارات إجهاد ميتو واختبار إجهاد السكر السكري في نفس الوقت على نفس اللوحة. تم تصميم الإجراءات لكل من الخلايا الملتصقة (BMDMs) وغير الملتصقة (الخلايا اللمفاوية)، مما يتيح تقييما دقيقا وقابلا للتكرار وبشكل مواز لوظيفة الميتوكوندريا والجليكوليتية للخلايا المعنية.
مقالة منهجية
اختبارات إجهاد الميتو وتحلل السكر باستخدام الخلايا الملتصقة أو غير الملتصقة باستخدام صفيحة واحدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر التحليل الأيضي في الوقت الحقيقي قياسات خالية من العلامات لتنفس الميتوكوندريا وتحلل السكر، مما يسمح للباحثين بربط استقلاب الطاقة الخلوية بآليات الأمراض والاستجابات العلاجية عبر مجالات متنوعة. عند مقارنة أيض الطاقة بين فئران مختلفة، أو حيوانات أخرى، أو بشر، أو خلايا تحت معالجات مختلفة، من الضروري إجراء القياسات خلال جولة واحدة لضمان نتائج دقيقة وموثوقة. علاوة على ذلك، يجب أن يأخذ التصميم التجريبي نوع الخلية التي يتم تحليلها في الاعتبار، على سبيل المثال، سواء كانت ملتصقة مثل البلاعم المشتقة من نخاع العظم (BMDMs)، أو غير ملتصقة مثل الخلايا اللمفاوية. لذلك، تم تطوير بروتوكول يتيح أداء اختبارات إجهاد ميتو وتحليل السكري في نفس الطبق، رغم أن الاختبارات تتطلب حقن أدوية وبرامج تحليلية مختلفة. تم تحسين بروتوكولات التعامل المنفصلة لتحليل كل من الخلايا عالية الالتصاق (مثل BMDMs) والخلايا "العائمة" غير الملتصقة (مثل الخلايا التائية وغيرها من الخلايا اللمفاوية). هنا، تعرض بروتوكولات مفصلة لإجراء هذه الاختبارات بكفاءة وبشكل قابل للتكرار.
المقدمة
محلل Seahorse XF هو أداة فريدة تتيح قياسا فوريا للتنفس الميتوكوندري وتحلل السكر في العديد من أنواع الخلايا. من خلال قياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ومعدل التحمض خارج الخلوي (ECAR) في الوقت نفسه، تتيح هذه التقنية تشريح دقيق لمسارات الطاقة الحيوية تحت ظروف فسيولوجية أو إجهادية. جعلته تعدد استخداماته لا غنى عنه في مجالات بحثية متنوعة، بما في ذلك السرطان 1، علم الأعصاب2، علم المناعة3، شيخوخة3، 3، واكتشاف الأدوية6، حيث تعد إعادة برمجة الأيض علامة مميزة على تقدم المرض والاستجابة العلاجية. من خلال ربط الطاقة الحيوية الوظيفية بالأنماط الظاهرية الخلوية7،8، يوفر التحليل منصة قوية لكشف الآليات، وتحديد نقاط الضعف الأيضية، وتقييم تأثيرات التدخلات الجينية أو الدوائية.
في العديد من التخصصات، يتم مقارنة التأثيرات الفورية للأدوية والجزيئات الصغيرة والسيتوكينات أو المركبات الطبيعية على الأيض الخلوي بشكل أفضل تحت ظروف تجريبية متطابقة، ونفس الصفيحة، ووقت الحضانة، والمعايير البيئية، ووقت اليوم. وبناء عليه، فإن هذا النهج هو تركيب خلايا ذات علاجات أو خلفيات جينية مختلفة على نفس الصفيحة وتحليل عدة معلمات أيضية في نفس الوقت. تضمن هذه الاستراتيجية أدق مقارنة بين التغيرات المتعلقة بالأدوية أو الوراثة في استقلاب الطاقة الخلوية.
العديد من أنواع الخلايا تتصرف بشكل مختلف في الزراعة. تبقى الخلايا اللمفاوية معلقة ولا تلتصق أبدابالصفيحة، وتلتصق الخلايا البلعمية بقوة مما يصعب نقلها، وتتكاثر الخلايا السرطانية بسرعة ولكن بمعدلات متفاوتة حسب الخط. هذه الاختلافات تمثل تحديات أمام التحليل الأيضي في الوقت الحقيقي؛ لذلك، يتطلب كل نوع من الخلية في التجربة بروتوكولا مخصصا.
تقدم هذه المقالة بروتوكولات خطوة بخطوة لإجراء هذه الاختبارات باستخدام التحليل الأيضي في الوقت الحقيقي، لضمان الكفاءة وقابلية التكرار. يمكن تطبيق هذه البروتوكولات على جميع إصدارات المحللات المتوفرة في السوق.
البروتوكول
تم رعاية الفئران وفقا للإجراءات الموضحة في بروتوكول لجنة رعاية واستخدام الحيوانات التابعة للمعاهد الوطنية للصحة والمؤسسات (IACUC) في كلية ميهاري الطبية. هذه المؤسسة معتمدة من جمعية تقييم واعتماد رعاية الحيوانات المختبرية الدولية وتلتزم بسياسة خدمة الصحة العامة لعلاج واستخدام الحيوانات المخبرية في ظروف خالية من الممرضات. تفاصيل المواد والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. تحسين كثافة الخلايا
ملاحظة: كل نوع من الخلايا يظهر خصائص أيضية فريدة وتفاوتات كبيرة في الحجم. كلا العاملين حاسمان في تحديد العدد المناسب من الخلايا التي يجب تحميلها لكل بئر لتحقيق أفضل النتائج. قبل إجراء اختبار تجريبي أولي، قم بتحضير وتشغيل لوحة اختبار تحتوي على الخلايا المختارة ذات الاهتمام مطلية بكثافات مختلفة.
- بالنسبة للخلايا الملتصقة (مثل الخلايا السرطانية)، اختبر كثافات البذور التي تتراوح بين 20,000–100,000 خلية في كل بئر. بالنسبة للخلايا ذات الأيض العالي و/أو الخلايا الكبيرة (مثل الخلايا السرطانية البشرية أو الخلايا الليفية)، يبدأ تحسين الكثافة عند 10,000 خلية أو أقل في كل بئر.
- بالنسبة للخلايا غير الملتصقة (مثل الخلايا اللمفاوية)، يجب تحسين كثافة البذور ضمن نطاق 100,000–500,000 خلية لكل بئر. لجميع أنواع الخلايا، استهدف طبقة أحادية الخلية واحدة موحدة لتحقيق أفضل النتائج (راجع الشكل 1 كمثال تخطيط ألواح العينات).
- أجر اختبار Mito Stress (كما هو موضح أدناه). يمكن استخدام بيانات هذا الاختبار الأولي لتحديد الكثافة المثلى للخلية للتجربة الرئيسية. اختر الكثافة التي تظهر أكبر فرق بين ظروف الاختبار.
ملاحظة: هذا البروتوكول لا ينطبق على تحليل العينات ثلاثية الأبعاد (مثل الكرويدات الخلوية أو الأعضاء العضوية). ومع ذلك، يمكن تعديله لأخذ سمك العينة والسطح غير المستوي في الاعتبار.
2. التحضير للاختبار
- في اليوم السابق لإجراء الاختبار، ارفع خرطوشة المستشعر بلطف من لوحة المرافق وأضف 200 ميكرولتر من الماء الخالي من RNAase/DNAse إلى كل بئر من لوحة الخدمات، ثم خفض خرطوشة المستشعر إلى لوحة المرافق حتى تغمر الحساسات بالكامل في الماء.
ملاحظة: يجب أن يكون مستوى الماء مرتفعا بما يكفي لضمان غمر الحساسات بالكامل طوال الليل، لأن فلوروفورات خرطوشة الحساسات لن تعمل إذا لم ترطبها بشكل صحيح. إذا استخدمت معزز هيدروبوستر XF لترطيب الخرطوشة، يمكن وضع الخرطوشة مباشرة في محلول معاير وتستبعد خطوة ترطيب الماء. - ضع خرطوشة المستشعر/لوحة الأدوات المائية في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. لمنع التبخر من الطبق، ضع أيضا وعاء يحتوي على ماء مقطر مزدوج في الحاضنة.
- في يوم الفحص، قم بإزالة خرطوشة المستشعر/لوحة الأدوات من الحاضنة بدون ثاني أكسيد الكربون 2 وإزالة خرطوشة المستشعر بلطف من لوحة المرافق، مع وضع جانب مستشعر الخرطوشة على المنضدة.
- تخلص من الماء من لوحة المرافق ورج أي قطرات سائبة حتى جفف، وأضف 200 ميكرولتر من محلول العيار XF لكل بئر.
- ضع خرطوشة المستشعر برفق في لوحة المرافق بحيث تغمر الحساسات تماما في محلول معاير، ثم أعدها إلى حاضنة CO2 بدون CO بدرجة 37 °C.
3. تحضير وسائط الاختبار
- تحضير ميتو ستريس للإعلام:
- في أنبوب بسعة 50 مل، أضف التالي إلى 45 مل من وسط XF RPMI: 500 ميكرولتر من 100x بيروفات الصوديوم (التركيز النهائي: 1 ملليمتر)، 500 ميكرولتر من 100x لتر-جلوتامين (التركيز النهائي: 2 ملليمتر)، و550 ميكرولتر من محلول جلوكوز 45٪ (التركيز النهائي: 25 ملم)
- اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. قم بتعبئة XF RPMI متوسط إلى حجم نهائي يبلغ 50 مل. احتفظ بالوسط المحضر في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية أو حمام جاف قبل الاستخدام.
- تحضير وسائط اختبار التحلل السكري:
- في أنبوب بسعة 50 مل، أضف 250 ميكرولتر من 100x L-جلوتامين إلى 45 مل من وسط XF RPMI.
- اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4، ثم قم بزيادة ضغط XF RPMI متوسط إلى حجم نهائي 50 مل. احتفظ بالوسط المحضر في ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية أو حمام جاف قبل الاستخدام.
ملاحظة: يجب إعادة ضبط درجة الحموضة لكل من وسط اختبار ميتو إجهاد وتحلل السكر إلى 7.4 بعد إضافة مكملات تغير الرقم الهيدروجيني، حيث يمكن حتى الانحرافات الصغيرة أن تؤثر بشكل كبير على نتائج الاختبار.
4. غسل الخلايا وتغيير الوسائط قبل التحليل
ملاحظة: خطوة الغسل في ألواح XFe96/XF Pro Cell Culture ستختلف حسب استخدام أنواع الخلايا الملتصقة أو غير الملتصقة. يرجى الرجوع إلى الخطوة 9، الخلايا الملتصقة (الخلايا السرطانية، خلايا BMDM الأولية) والخلايا غير الملتصقة (الخلايا التائية والخلايا اللمفاوية الأخرى)، لتحديد أفضل طريقة غسيل لنوع الخلايا المستخدمة.
- إزالة 160–180 ميكرولتر من وسط النمو من كل بئر باستخدام ماصة متعددة، مع العمل صفا أو عمودا في كل مرة لمنع جفاف الخلايا. تجنب لمس قاع الآبار.
- باستخدام ماصة بطرف واحد، أزل ما تبقى من 20–30 ميكرولتر من الآبار، مع تجنب لمس طبقة الخلية في قاع البئر.
- أضف 180 ميكرولتر من وسط تحليل الجليكوليزر أو تحليل إجهاد ميتو (انظر الخطوة 3) إلى كل بئر، وفقا للتخطيط في الشكل 1. لتجنب إزعاج طبقة الخلايا، قم بتوزيع الوسائط بلطف على طول الجدار الجانبي لكل بئر حتى تمتلئ جميع الآبار. كلا الاختبارين في نفس اللوحة.
ملاحظة: يجب أيضا ملء الآبار التي لا تحتوي على خلايا وآبار التحكم بوسائط الاختبار. - ضع الصفيحة الصغيرة في حاضنة بدون ثاني أكسيد الكربون 2 بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 40–45 دقيقة قبل بدء الاختبار، وابدأ في تحضير الأدوية.
5. تحضير الدواء وتحميل الخرطوشة
تحذير: بعض الأدوية (FCCP، Antimycin A/ Rotenone، Oligomycin) خطيرة ويجب التعامل معها بحذر. هناك حاجة إلى تدابير مناسبة لحماية الأفراد؛ تشمل هذه استخدام القفازات ومعدات الحماية الشخصية الأخرى بالإضافة إلى التخلص من المواد في حاوية أو نفايات كيميائية معتمدة من المؤسسة.
ملاحظة: التركيز الأمثل ل FCCP/أوليغوميسين يعتمد على نوع الخلية وقبل الاختبار، يتم تعديله تجريبيا عند العمل مع خلايا حساسة جدا. قد تختلف التركيزات النهائية للأدوية حسب نوع الخلية. حضر الأدوية ووسائط الاختبار في يوم الاستخدام. لا تجمد أو تعيد الاستخدام. يمكن إكمال تحضير الدواء بالاختبار خلال هذه الفترة البالغة 45 دقيقة لتحقيق أفضل النتائج.
- باستخدام وسط اختبار إجهاد الميتو وتحليل الجليكوليزا المسخن مسبقا من الخطوة 3، يتم تخفيف المركبات وفقا للجدول 1 و/أو الجدول 2 إلى التركيزات المناسبة لكل نوع من الخلايا. جهز كل مركب في أنبوب منفصل بسعة 15 مل (إذا استخدمت جميع المركبات الستة، ستحتاج إلى ستة أنابيب).
- قم بإزالة خرطوشة المستشعر/لوحة الأدوات من حاضنة CO2 بدون CO بدرجة 37 °C وإزالة الغطاء، مع وضع دليل تحميل XF المرفق مع المجموعة، ودليل تحميل XF المطابق لمنفذ الحاقن (الدليل A للمنفذ A) بإحكام فوق أعلى خرطوشة المستشعر (انظر الشكل 2).
- باستخدام ماصة متعددة القنوات وخزان كاشف لكل دواء، أضف الحجم المطلوب تدريجيا إلى المنفذ المقابل (راجع الجدولين 1 والجدول 2 للحجم). أمسك الماصة بشكل مستقيم تماما عند تحميل الأدوية (انظر الشكل 2).
- قم بتغيير أو إعادة استخدام دليل التحميل بعد شطف وتجفيف كامل حسب الحاجة لكل منفذ (المنفذ A وB وC وD) وتخلص من رؤوس الماصات بعد كل تحميل.
ملاحظة: يجب أن تناسب رؤوس الماصات مدخلا التوجيه بإحكام، ولكن ليس بإحكام شديد، لأن رؤوس الماصات قد تعلق في الدليل! ينصح باختبار رؤوس الماصات/الماصات المستخدمة في الأدلة قبل تحميل المركبات لتجنب فقدان العينات. - بعد تحميل جميع المركبات في منافذ كل منافذها، أزل الدليل، وتأكد بصريا من أن جميع المنافذ ممتلئة، وثبت الخرطوشة بغطاءها. يجب أن تتوافق الأدوية مع الاختبار في كل جزء من نفس اللوحة (الشكل 1).
ملاحظة: التركيزات النهائية الموصى بها لإجهاد الميتو هي 1 ميكرومولار أوليغوميسين، 1 ميكرومولار FCCP، و0.5 ميكرومولار روتينون/أنتيميسين؛ للتحلل السكري، 10 ملليمولار جلوكوز، 1 ميكرومولار أوليغوميسين، و50 ملليمولار 2-DG.
6. إعداد محلل Seahorse XFe96
- قم بتشغيل المحلل وافتح برنامج WAVE (راجع الشكل 3).
- اختر اختبار إجهاد XF Mito.
ملاحظة: طالما تم استخدام وسط الفحص والمركبات المناسبة، يمكن للمحلل إجراء اختبارات الميتوكوندريا وتحليل السكر في نفس اللوح باستخدام اختبار إجهاد الميتو XF. - اختر عدد 'المجموعات' بناء على إعداد اللوحة ووضع علامة على كل مجموعة. انتقل إلى التبويب التالي لتعيين الآبار لخريطة اللوحة (راجع الشكل 3). يتم إجراء الاختبارين في نفس اللوحة.
- قم بتمييز الآبار لكل مجموعة بناء على طريقة تحميل اللوحة.
- قم بضبط البرنامج حسب نوع الخلية والغرض التجريبي. على سبيل المثال، إذا كان الإعداد يتضمن مجموعة مفعلة مسبقا قبل التحليل أو تمت إضافة منشط أثناء التشغيل، قم بتمديد وقت الحضانة في كل دورة للسماح بحدوث التفعيل.
- اختر علامة التبويب التالية، 'تشغيل الاختبار' واملأ المعلومات حسب الحاجة لحفظ ملف البيانات.
- قم بتحميل الخرطوشة المجهزة مسبقا بالأدوية (من الخطوة 5) في الجهاز عند الإشارة إلى التهيئة الجاهزة. خطوة التهيئة ستشير إلى ما إذا كانت الحساسات مرطبة بشكل صحيح وتعمل بشكل صحيح.
- ابدأ الفحص وحمل وتفريغ الألواح كما هو موضح في التعليمات أثناء البرنامج.
ملاحظة: عند تحميل الخرطوشة أو الميكروبلويت في المحلل، تأكد من إزالة جميع الأغطية! بينما تحتوي بعض نماذج المحلل على ميزة أمان يمكنها استشعار الأغطية، فإن النماذج الأقدم لا تمتلك ذلك. قد يتلف هذا الجهاز إذا بقي الغطاء سليما أثناء تشغيل اللوحة.
7. طرق التطبيع: (SRB) وعدد النواة (تلوين وتصوير DAPI)
تحذير: بعض المواد الكيميائية في مجموعة اختبار SRB تسبب التآكل وقد تحترق إذا لامست الجلد. قد يسبب DAPI رد فعل تحسسي في الجلد. يوصى باستخدام القفازات وغيرها من معدات الحماية الشخصية، وكذلك التخلص من المواد في حاوية أو حاوية نفايات كيميائية معتمدة من المؤسسة.
ملاحظة: اختر طريقة التطبيع بناء على خصائص ومعالجات الخلايا التي تم تحليلها. أي من الطريقتين مناسبتان عند مقارنة الخلايا ذات معدلات التكاثر المختلفة، حيث أن كلا الطريقتين تأخذان في الاعتبار هذه التباينات. ومع ذلك، إذا كانت العلاجات الدوائية تسبب الشيخوخة، مما يوقف التكاثر ويزيد من حجم الخلية، فإن صبغ DAPI هو النهج المفضل للتطبيع. قد لا يكون DAPI مناسبا لأنواع الخلايا التي يصعب فيها رؤية التلوين النووي (مثل الخلايا الدهنية، كريات الدم الحمراء) أو قد تكون الخلايا متعددة النوى (أي خلايا الكبد البارنشيمية، الخلايا العضلية).
- لتطبيع الخلايا باستخدام اختبار SRB (مجموعة اختبار سمية الخلايا ب السلفوهوداميني) بعد تحليل الأيض في الوقت الحقيقي، قم بإزالة اللوحة من الجهاز وإضافة ربع حجم الوسط (مثلا 50 ميكرولتر في 200 ميكرولتر من وسط الزراعة) من محلول التثبيت إلى كل بئر.
- حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المحلول وغسل الآبار بلطف ثلاث مرات بسعة 200 ميكرولتر من ماء خال من RNase/DNase، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية. للتخزين قصير الأمد (إذا لزم الأمر)، استبدل الغسيل النهائي ب PBS وخزن عند 4 درجات مئوية.
- لتطبيع فوري باستخدام اختبار SRB، قم بإزالة محلول الغسيل ودع اللوح يجف تماما في الهواء عند درجة حرارة الغرفة.
- أضف 25 ميكرولتر من محلول SRB إلى كل بئر وصبغ اللوحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام أو لف اللوح بورق الألمنيوم خلال فترة الحضانة.
ملاحظة: محلول SRB حساس للضوء، ويجب إجراء هذا الجزء من التجربة في منطقة منخفضة الإضاءة. - أزل محلول التلوين وأضف 100 ميكرولتر من محلول الغسيل 1x لغسل كل بئر 2-3 مرات.
- اغسل بأسرع وقت ممكن لتجنب التبييض وقم بإزالة محاليل الغسيل قدر الإمكان عن طريق الشفط بالتفريغ.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الذوبان 1x إلى كل بئر وضع اللوح على هزاز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قس الكثافة البصرية (O.D.) عند 565 نانومتر على قارئ الألواح لتحديد كثافة البئر بناء على تشبع الألوان (انظر الشكل 3 للمرجع البصري).
- تصدير بيانات قيم O.D. كملف إكسل. سيتم لصق هذا الجدول في برنامج WAVE للتطبيع (الخطوة 8).
ملاحظة: إذا لوحظ لون مكثف (> O.D. 3.5) بسبب فرط تحميل الخلية، يمكن استخدام طول موجي غير مثالي (مثل 490–530 نانومتر) لخفض القراءات إلى النطاق الخطي للجهاز. صحيح الخلفية عن طريق طرح مقدار الزيادة الزائدة للتحكم الذي يحتوي فقط على وسط الزراعة (بئر التحكم الخلفي) من جميع قراءات العينات.
- بالنسبة لصبغة DAPI، قم بتخفيف محلول DAPI إلى 300 نانومالتر في 1x PBS.
- اغسل كل بئر من صفيحة الخلية بلطف 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر 1x PBS.
ملاحظة: إذا كانت هناك خلايا غير ملتصقة، قم بطرد مركزي على اللوح بضغط 200 x g لمدة 3 دقائق بدون فرامل لضمان تعليق الخلايا في قاع كل بئر بعد كل خطوة غسيل. - الخلايا المثبتة في PFA بنسبة 2٪–4٪ مخففة في 1x PBS لمدة 10–15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل كل بئر من صفيحة الخلية بلطف 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر 1x PBS.
- أضف حوالي 150 ميكرولتر من محلول التلوين المخفف DAPI إلى كل بئر، لضمان تغطية الخلايا بالكامل في كل بئر.
- حضن لمدة 1–5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في منطقة منخفضة الإضاءة (أو غطاء في ورق الألمنيوم).
- قم بإزالة محلول بقع DAPI من كل بئر.
- اغسل كل بئر من صفيحة الخلية بلطف 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر 1x PBS.
- أزل أي PBS متبقية.
- صور الخلايا عند أي إثارة/انبعاث بين 358–461 نانومتر أو تحت أي إعداد مرشح DAPI على المجهر.
- تصدير بيانات قيم الانبعاث كملف إكسل. سيتم لصق هذا الجدول في برنامج WAVE للتطبيع (الخطوة 8).
- اغسل كل بئر من صفيحة الخلية بلطف 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر 1x PBS.
8. تحليل وتطبيع البيانات
ملاحظة: لتحليل البيانات، يمكن استخدام "الموجة" أو برامج أخرى. البروتوكول المقدم ينطبق على برنامج Wave.
- افتح نتائج التحليل في الموجة (راجع الشكل 3). يتم إجراء التطبيع باستخدام القيم المستخرجة من ملف Excel الذي يولده قارئ اللوحة الدقيقة بعد تلوين SRB (الخطوة 7).
- انقر على "تطبيع".
- في النافذة المفتوحة، اختر "اختيار الكل" ثم "لصق" للصق البيانات المنسوخة من جدول إكسل الذي تم إنشاؤه أثناء خطوة التطبيع. انقر على "التقديم". هذا الإجراء قام تلقائيا بتطبيع جميع بيانات التجريب.
- لإنشاء تقرير، انقر على "تصدير إلى"، وفي اللوحة التي تفتح على اليمين، اختر "مولد تقارير اختبار إجهاد XF Cell Mito." احفظ الملف المولد. أثناء التحليل، اختر فقط الآبار المخصصة لاختبار إجهاد ميتو (راجع الشكل 3).
- لإنشاء تقرير، انقر على "تصدير إلى"، وفي اللوحة التي تفتح على اليمين اختر "مولد تقرير اختبار إجهاد تحلل الخلايا XF". احفظ الملف المولد. أثناء التحليل، اختر فقط الآبار المخصصة لاختبار إجهاد التحلل السكري (راجع الشكل 3).
9. الخلايا الملتصقة مقابل الخلايا غير الملتصقة
ملاحظة: تختلف الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة في سلوكها النمو، والتصاق السطحي، ومتطلبات التعامل مع الحيوانات. تلتصق الخلايا اللاصقة (مثل خلايا السرطان، وBMDMs) بسطح الزراعة، لذا لا يتطلب الطلاء والغسل احتياطات خاصة. تبقى الخلايا غير الملتصقة (مثل الخلايا التائية أو الخلايا اللمفاوية الأخرى) معلقة وتتطلب طرقا مختلفة للطرد المركزي، وإعادة التعليق، وطرق الطلاء المختلفة. فهم هذه الفروقات أمر بالغ الأهمية لزرع الخلايا بدقة، وعلاج الأدوية، واتساق الاختبارات.
- تأكد من أن جميع الخلايا المستخدمة في التجربة مزروعة في وسط ووعاء زراعة خلوي مفضل قبل إجراء الاختبار مباشرة، ثم يتم نقلها إلى الصفيحة الدقيقة لإجراء الاختبار.
ملاحظة: بينما يوصى بوسط XF RPMI لأنواع الخلايا الموصوفة في هذا البروتوكول، استشر المصنع للتأكد من استخدام الوسط المناسب. - بالنسبة للخلايا الملتصقة (خلايا السرطان، خلايا BMDM)، قم بزرع الخلايا في لوحة XFe96/XF Pro Cell Culture Microplate قبل الاختبار بكثافة خلوية محسنة (انظر الخطوة 1) في حجم الوسط 200 ميكرولتر وضعها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 بدرجة 37 °م.
ملاحظة: يمكن طلاء خلايا BMDM حتى 24 ساعة قبل الاختبار، لأنها لا تتكاثر وستحافظ على نفس كثافة الآن. بالنسبة للخلايا الملتصقة سريعة النمو، مثل خطوط الخلايا السرطانية، ينصح بوضع الألواح في يوم الفحص إذا لم تكن هناك حاجة لعلاج إضافي وتحليلها فور التصاق الخلايا لتجنب نمو الخلايا الإضافي. إذا لم يكن هذا التصميم ممكنا، فإن التطبيع إلى كمية البروتين/البئر أو عدد النوى/البئر هو خطوة ضرورية. - تأكد من أن آبار الزوايا لكل أربع زوايا من الصفيحة الدقيقة خالية من الخلايا ولكن مليئة بالوسط، حيث يتم قياس ذلك كآبار تحكم فارغة.
- بعد 3–5 ساعات من الحضانة، راقب الصفيحة الصغيرة للتأكد من أن الخلايا ملتصقة بالصفيحة عند مستوى موحد في قاع كل بئر.
- إذا لم تكن الخلايا متصلة بعد، يمكن وضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لفترة إضافية حتى يتم تثبيت الخلايا بشكل كامل.
- بعد ذلك، جهز الميكرولوح بخلايا ملتصقة للغسل كما ذكر في الخطوة 4 للمضي قدما في الاختبار.
- بالنسبة للخلايا غير الملتصقة (خلايا T وغيرها من الخلايا اللمفاوية)، قم بتغطية الصفيحة الدقيقة ب Poly-D-Lysine قبل إضافة الخلايا إلى الصفيحة.
ملاحظة: بينما يوصى بطلاء بولي-دي-ليسين في هذا البروتوكول، قد يكون طلاء صفيحة آخر (مثل الكولاجين، الفيبرونكتين، الجيلاتين) أكثر ملاءمة. إذا كنت تستخدم طبقة بديلة، يرجى اتباع تعليمات الشركة المصنعة للاستخدام. - لتغطية الصفيحة الدقيقة، حضر 2.5 مل من محلول بولي-دي-ليسين بقوة 20 ميكروغرام/مل (تخفيف 50 مرة بمحلول ماء بمقدار 1 ملغ/1 مل) في بيكربونات الصوديوم بوزن 0.1 مل، درجة حموضة 8.0 (يوفر البيكربونات درجة حموضة مثالية لامتصاص المواد اللاصقة). يمكن إجراء هذه الخطوة قبل إجراء الاختبار أو في يوم الاختبار.
- ضع 25 ميكرولتر من المحلول على كل بئر من اللوحة وحضن على الطاولة أو على هزاز اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20–30 دقيقة.
- استنشق أو استخدم الماصة من أي محلول متبقي وغسل كل بئر مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من الماء الخالي من RNAase/DNAse.
- انتظر حتى تجف الآبار (1–2 ساعة) قبل زرع الخلايا في الصفيحة الدقيقة.
- بعد ذلك، جهز الميكرولوح بخلايا غير ملتصقة لخطوة الغسيل عن طريق طرد مركزي لللوحة بقوة 200 × جرام لمدة 3 دقائق بدون فرامل لضمان تعليق الخلايا في قاع كل بئر.
- تابع إلى الخطوة 4 وتابع بقية الفحص كما هو مذكور في الخطوات 5–7.
النتائج
تم تطوير هذا البروتوكول المشترك لتمكين إجراء كلا الاختبارين على نفس اللوحة. على سبيل المثال، تم استخدام هذه الطريقة لتوضيح إشارات التواطؤ المتقاطع mGluR1−TCR حول الكفاءة الأيضية لخلايا CD8+ التائية أثناء التنشيط10. كان ذلك لتقييم تأثير تثبيط mGluR1 على الانتقال إلى التحلل السكري وتغيرات التنفس الميتوكوندري، وهي عمليات ضرورية لأداء الخلايا التائية بشكل مثالي، مع تقليل عدد الخلايا التائية المستخدمة في كل تجربة. تم تطبيق نفس تقنية الصفيحة المفردة بفعالية أيضا على أنواع خلايا أخرى، مثل البلعم المشتقة من نخاع العظم الملتصقة (BMDMs؛ الشكل 4 والشكل 5)، وإلى الخلايا غير الملتصقة، مثل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PMBCs؛ الشكل 3). وقد ثبت أن حجب إشارة mGluR1 على خلايا CD8+ T المنشطة يؤثر على إنتاج الطاقة الميتوكوندرية وغير الميتوكوندرية. على النقيض من ذلك، لم تظهر الخلايا الساذجة تغييرات كبيرة في ملفات الطاقة الأيضية لديها (الشكل 6A,B). أظهر اختبار الإجهاد الميتو لخلايا CD8+ التائية المنشطة تنفس قاعدي وأقصى بالإضافة إلى قدرة احتياطية تنفسية عالية (الشكل 6C). الخلايا التائية التي عولجت ب CPCCOEt، وهو مضاد غير تنافسي يمنع الإشارات اللاحقة عند ارتباط الجلوتامات ب mGluR1، كان لديها معدلات استهلاك أكسجين منخفضة مثل الخلايا الساذجة وأدت إلى انخفاض إنتاج ATP (الشكل 6C). كما أظهر اختبار التحلل السكري أن الخلايا التائية المنشطة CD8+ غير المعالجة فقط هي التي تنتج ATP عبر التحلل السكري، وأظهر علاج CPCCOE نشاطا أيضيا مماثلا للحالة الساذجة (الشكل 6D). تؤكد هذه النتائج أن إشارة mGluR1 ضرورية لوظيفة خلايا CD8⁺ T بشكل صحيح عند التفعيل.
الشكل 1: يوضح هذا الشكل نظرة عامة على إعداد الصفيحة الصغيرة التي تشمل اختبار إجهاد ميتو وتحليل السكر في نفس اللوحة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تحميل خرطوشة الدواء. (أ) خريطة مفصلة للحساسات والمنافذ في الجزء الخلفي والمقدمي من الخرطوشة، مع تحديد أي دواء يجب تحميله في أي منفذ. (ب) التوجيه الموصى به للأدلة فوق الخرطوشة لتحميل المنافذ المقابلة، والموقع الموصى به لاستخدام الماصة متعددة القنوات فوق الأدلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: استخدام برنامج WAVE لتشغيل وتحليل الاختبار. (أ) يتضمن سير إعداد البرنامج اختيار نوع الاختبار، وتعيين المجموعات، وإنشاء خريطة اللوحة، وبرمجة منافذ الأدوية. (ب) ترتيب الأدوية التي سيتم تحميلها في المنافذ المقابلة يعتمد على ما إذا كانت العينة إجهاد ميتو أو تحلل السكر. (ج) لقطة مقربة لصبغة SRB خلال الخطوة الأخيرة من التطبيع. (د) بعد التطبيع، يمكن تصدير بيانات اللوحة بشكل منفصل كاختبار تحلل السكر واختبار إجهاد ميتو لنفس اللوحة. (ه) يمكن اختيار بيانات إجهاد الميتو عن طريق تعديل الاختيار الحالي لعينات إجهاد الميتو فقط. (و) يمكن اختيار بيانات التحلل السكري عن طريق تعديل الاختيار الحالي لعينات التحلل السكري فقط. البيانات النموذجية المستخدمة في هذا الشكل مأخوذة من تحليل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة البشرية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: الأداء المتزامن لجهاز Mito Stress على نفس اللوحة. تم إخضاع البلعم المشتقة من نخاع العظم المشتقة من فئران WT وTusc2 KO التي تبلغ من العمر شهرين لكلا النوعين من التحليل. تم ترك الخلايا إما دون معالجة (بشكل مزيف) أو تحفيزها باستخدام LPS (100 نانوغرام/مل) لمدة 5 ساعات قبل الطلاء (30,000 خلية/بئر). تم إجراء اختبارات إجهاد ميتو واختبار إجهاد التحلل السكري بالتوازي لتمكين المقارنة الدقيقة، كما هو موضح في الشكل 1. (أ) ملفات إجهاد الميتو لأنواع الخلايا المختلفة (WT وKO) والظروف (ساذجة ومنشطة)، يتم إنشاؤها باستخدام برنامج الموجة. تم إجراء التطبيع عبر تلوين SRB كما هو موضح في الخطوة 7. (ب) الرسوم البيانية الشريطية المقارنة للمعاملات التي تم تحليلها في كل اختبار. ∗ الدرجة ≤ 0.05، ∗∗ ≤ 0.005، اختبار T للطلاب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: الأداء المتزامن لاختبارات إجهاد التحلل السكري تجرى على نفس اللوحة. تم إخضاع البلعم المشتقة من نخاع العظم المشتقة من فئران WT وTusc2 KO التي تبلغ من العمر شهرين لكلا النوعين من التحليل. تم ترك الخلايا إما دون معالجة (بشكل مزيف) أو تحفيزها باستخدام LPS (100 نانوغرام/مل) لمدة 5 ساعات قبل الطلاء (30,000 خلية/بئر). تم إجراء اختبارات إجهاد ميتو واختبار إجهاد التحلل السكري بالتوازي لتمكين المقارنة الدقيقة، كما هو موضح في الشكل 1. (أ) ملفات إجهاد التحلل السكري لأنواع الخلايا المختلفة (WT وKO) والظروف المختلفة (ساذجة ومنشطة)، يتم إنشاؤها باستخدام برنامج الموجة. تم إجراء التطبيع عبر تلوين SRB كما هو موضح في الخطوة 7. (ب) الرسوم البيانية الشريطية المقارنة للمعاملات التي تم تحليلها في كل اختبار. ∗ الدرجة ≤ 0.05، ∗∗ ≤ 0.005، اختبار T للطلاب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: اختبارات إجهاد ميتو وتحلل السكر على لوحة واحدة باستخدام خلايا CD8⁺ T المنقاء من خلايا الطحال الفئرانية. (أ) ملفات تعريف تمثيلية لاختبار الإجهاد الميتوكوندري تقارن التغيرات المعتمدة على الأدوية في معدل استهلاك الأكسجين (OCR) لخلايا CD8+ التائية التي أجريت مع مجموعات الخلايا التائية الساذجة والنشطة والنشطة لمثبط + mGluR1. (ب) ملفات تعريف تمثيلية لاختبار التحلل السكري تقارن التغيرات المعتمدة على الأدوية في معدل الحماضة خارج الخلية (ECAR) لخلايا CD8+ T التي أجريت على مجموعات مثبطات + mGluR1 الساذجة، المنشطة، والمنشطة. (ج) الرسوم البيانية الشريطية التي تظهر التغيرات الكمية في معلمات مختلفة من التنفس الميتوكوندري لخلايا CD8+ التائية في مجموعات مثبطات + mGluR1 الساذجة، المنشطة، والمنشطة. تمثل الأشرطة متوسط ± SEM (n = 4). (د) الرسوم البيانية الشريطية التي تظهر التغيرات الكمية في معلمات مختلفة لتحلل السكر في خلايا T الساذجة، المنشطة، والمنشطة + مثبط mGluR1 CD8+ T السائدة. تمثل الأشرطة متوسط ± SEM (n = 4). ∗ ≤ 0.05، ∗∗ ≤ 0.005، اختبار T للطلاب. هذا الشكل مقتبس من أكينو وآخرون 10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| البئر النهائي (μM) | حجم محلول المخزون (μL) | حجم الوسائط (uL) | منفذ 10x (ميكرومتر) | حجم الصوت المضاف إلى المنفذ (μL) | |
| أوليغوميسين المنفذ A | 0.5 | 150 | 2850 | 5 | 20 |
| 1.5 | 450 | 2550 | 15 | 20 | |
| 2.5 | 630 | 1890 | 25 | 20 | |
| المنفذ B FCCP | 0.125 | 37.5 | 2962.5 | 1.25 | 22 |
| 0.25 | 75 | 2925 | 2.5 | 22 | |
| 0.5 | 150 | 2850 | 5 | 22 | |
| 1 | 300 | 2700 | 10 | 22 | |
| 2 | 600 | 2400 | 20 | 22 | |
| روتينون/أنتيميسين المنفذ C | 0.5 | 300 | 2700 | 5 | 24 |
الجدول 1: تحضير المركب لتحميل خراطيش مستشعرات XFe96 لإجهاد الميتو.
| البئر النهائي | حجم محلول المخزون (μL) | حجم الوسائط (μL) | 10x port | حجم الصوت المضاف إلى المنفذ (μL) | |
| منفذ A جلوكوز | 250 مللي مولار | 100 | 2400 | 20 | |
| أوليغوميسين المنفذ B | 0.5 ميكرومولار | 150 | 2850 | 5 ميكروميتار | 22 |
| 1.5 ميكرومولار | 450 | 2550 | 15 ميكروميتار | 22 | |
| 2.5 ميكرومولار | 630 | 1890 | 25 ميكروميال | 22 | |
| المنفذ C 2-DG | 50 مللي موتر | 3000 | 0 | 500 مللي متر | 24 |
الجدول 2: تحضير المركبات لتحميل خراطيش مستشعر XFe96 لتحلل الجليكولي.
المناقشة
يتيح البروتوكول المعروض هنا مقارنات دقيقة وموثوقة بين مسارين رئيسيين لإنتاج الطاقة، وهما الفسفرة التأكسدية (إنتاج ATP في الميتوكوندريا) والتحلل الجليكولي اللاهوائي (إنتاج ATP خارج الميتوكوندريا، لا يتطلب أكسجين)، بالإضافة إلى اختبارين إجهاديين مختلفين خلال فترة واحدة. بالإضافة إلى ذلك، يأخذ التصميم التجريبي في الاعتبار نوع الخلايا التي يتم تحليلها، مما يسمح بفهم أوسع لتحليل أيض الخلية، مع تقليل كمية العينة والكواشف المستخدمة.
الفروق بين اختبارات إجهاد الميتو واختبار إجهاد التحلل السكري التي تجرى على بروتوكولات أجهزة التحليل الأيضي في الوقت الحقيقي التي صممتها وبيعتها شركة Agilent, Inc. كبيرة جدا. هاتان الاختبارتان تتطلبان وسائط اختبار مختلفة، وأدوية محددة، وبرامج أدوات مختلفة. يستخدم اختبار إجهاد ميتو وسائط اختبار تحتوي على الجلوكوز، إل-جلوتامين، والبيروفات، بينما يستخدم اختبار إجهاد السكر وسط خال من الجلوكوز مكمل فقط بإل-جلوتامين. يتم فحص الاختبارات باستخدام مركبات مختلفة: أوليغوميسين → FCCP → أنتي ميسين A + روتينون لاختبار إجهاد ميتو، وأوليغوميسين → جلوكوز → 2-DG لاختبار إجهاد التحلل السكري. وبالتالي، تجرى هذه الاختبارات عادة على ألواح منفصلة في أوقات مختلفة، حيث أن محلل الأيض في الوقت الحقيقي يستوعب صفيحة واحدة فقط في كل مرة.
لمعالجة هذه القيود، تم تطوير بروتوكول مشترك يتيح إجراء كلا الاختبارين على نفس اللوح باستخدام إعداد اختبار إجهاد ميتو في ورقة سابقة10. تقدم توصيات لتحليل أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك الخلايا المناعية، الخلايا السرطانية، الخلايا الملتصقة، والخلايا المعلقة. يمكن تطبيق هذه الإرشادات بشكل فردي أو مجتمع، مما يوفر مرونة حسب أهداف المجرب والموارد المتاحة.
يسمح تطبيع الخلايا من خلال اختبار SRB أو DAPI أيضا بمزيد من المرونة، في حالة استخدام أنواع خلايا متعددة بمعدلات نمو وأحجام مختلفة 9,11. علاوة على ذلك، وبما أن هذه التقنية تتطلب لوحة واحدة فقط لاختبارين، يمكن دمجها مع مجموعة متنوعة من أنواع العينات لقياس العمليات الأيضية.
العوامل التي تؤثر على نجاح الطريقة: (1) عدد الخلايا الأمثل لكل بئر؛ (2) تثبيت الخلايا فعال؛ و(3) التحميل الدقيق للخرطوشة، حيث يجب تحميل مجموعتين منفصلتين من الأدوية في أقسام منفصلة من الخرطوشة.
تشمل المزايا العلمية والتجريبية للطريقة المقارنة المباشرة ضمن نفس السياق البيولوجي. استخدام نفس الخلايا تحت ظروف زراعة متطابقة يلغي التباين بين الصفائح أو القطع ويسمح بمقارنة أكثر دقة بين وظيفة الميتوكوندريا والدهون في نفس العينة. كما يتضمن رؤية متكاملة لعملية الأيض الخلوي. قياس كل من الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) والتحلل السكري بالتوازي يوفر لمحة شاملة عن عملية أيض الطاقة العامة للخلية ومرونتها في التبديل بين المسارات. هذا الاختبار الموازي يقلل أيضا من التغيرات البيولوجية. يتم تقليل الفروق في كثافة درع الخلية، وعدد الممر، أو الظروف البيئية لأن كلا الاختبارين يجرى على نفس مجموعة الخلايا، مما يؤدي إلى تحسين قابلية التكرار. يؤدي إجراء كلا الاختبارين في الوقت نفسه إلى تقليل التغيرات بين التشغيل الناتجة عن معايرة خرطوشة المستشعر، أو تغيرات درجة الحرارة، أو تحضير المواد الكيميائية.
تشمل الفوائد التقنية لهذه التقنية زيادة الكفاءة من خلال دمج الاختبارات، مما يوفر الوقت والكواشف والمواد الاستهلاكية للصفائح، مما يجعلها مهمة للدراسات واسعة النطاق أو عالية الإنتاجية. وهذا يسمح بتقليل متطلبات العينة. يكفي عدد الخلايا الواحد، وهو أمر مفيد عند العمل مع الخلايا الأولية المحدودة أو النادرة (مثل الخلايا اللمفاوية، الخلايا المشتقة من الدماغ). يحدث تطبيع أفضل عبر الاختبارات لأن كلا الاختبارين يستخدمان نفس اللوحة، أي التطبيع (مثل محتوى البروتين أو عدد الخلية)، وهو أكثر اتساقا وموثوقية. مع هذا الاتساق، يتم تعزيز ارتباط البيانات. الاقتران المباشر بين المعاملات الميتوكوندرية والجليكوليكية من نفس العينة يسهل التحليل الأيضي والتحليلات الإحصائية.
القيد المعروف الوحيد لهذه التقنية هو أن دمج بروتوكوليكين على لوحة واحدة يقلل من عدد النسخ المتاحة من الآبار. يوصى بتحديد عدد الحالات لكل لوحة لضمان تكرار لا يقل عن 8 بئر لكل حالة.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث من قبل المعهد الوطني لصحة الأقليات والفوارق الصحية (NIMHD)، رقم المنحة 5U54MD007586-37، مشروع تجريبي ل A. Ivanova؛ UG3HG013248 منحة مركز NHGRI لأبحاث الجينوم، مشروع البحث 2، PI-Ivanova، كما تم تقديم بعض الدعم من قبل شركة Genprex Inc. علاوة على ذلك، أجري هذا البحث في المرافق الأساسية لكلية ميهاري الطبية، التي تتلقى دعما من منح NIH MD007586 و CA163069 و S10RR025497.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب طرد مركزي بسعة 15 مل، معبأة بغطاء لولبي، معقمة، 500 أنبوب لكل وحدة | جينيسي ساينتيفك | 21-408B | |
| نصائح بيولوجيكس بيبيت-200 μ l ممتد (حزمة، معقمة) | بيولوجيكس يو إس إيه | SKU 21-0200 | |
| BioTek Synergy H1 | BIOSPX | ||
| مجهر الفلورة BZ-X700 | كينس | ||
| كورنينغ خزانات كوستار المعقمة للكاشف ذات الاستخدام الواحد | فيشر | 4873 | |
| محلول D-(+)-جلوكوز 45٪ في H20 | سيغما | G9769 | |
| DAPI، هيدروكلوريد | ثيرموفيشر ساينتيفيك | D1306 | |
| جهاز الطرد المركزي إبندورف 5810 R | إبندورف | ||
| تعطيل حرارة مصل الأبقار الجينية GenClone | جينيسي ساينتيفك | 25-514H | |
| إل-جلوتامين 200 ملليمولار (100x) | جيبكو | 25030-081 | |
| أوليمبوس بلاستيك 22-284، أوليمبوس أنابيب دقيقة 1.7 مل، بولي بروبيلين شفاف، معقم من البولي بروبيلين، مقاوم للغليان، ستير، 50/كيس، 250 أنبوب لكل وحدة | جينيسي ساينتيفك | 22-284 | |
| أنابيب الطرد المركزي المخروطي Olympus Plastics 28-108، 50 مل، كتلة من البولي بروبيلين، معقمة، 20 كيسا من 25 أنبوبا، 500 لكل وحدة | جينيسي ساينتيفك | 28-108 | |
| بارافورمالديهايد 16٪ محلول درجة كهرومغناطيسية | علم المجهر الإلكتروني | 15710 | |
| بولي-دي-ليسين هيدروبروميد متحطم بالليوبروميد | سيغما | P6407 | |
| حمام الماء بريسيجن 180 | بريسيجن ساينتيفك | 51221060 | |
| حاضنة بريسيجن ساينتيفك GCA موديل 26 | ثيلكو | 51221091 | |
| QBI 120-095-671 خليط البنسلين/ستريبتوميسين، خليط قلم/التهاب حلقي 100x، 10 × 10 مل/وحدة | جينيسي ساينتيفك | 25-827 | |
| QBI PBS، 1x، بدون كالسيميليوم، المغنيسيوم، الفينول الأحمر، 0.1 ملوم مصفى | جينيسي ساينتيفك | 25-507B | |
| RPMI 1640، مع إل-جلوتامين | جينيسي ساينتيفك | 25-506 | |
| Seahorse XF RPMI متوسط، درجة حموضة 7.4، 500 مل | أجيلينت | 103576-100 | |
| محلل Seahorse XFe96 | أجيلينت | ||
| سي هورس XFe96/XF Pro FluxPak | أجيلينت | 103792-100 | تشمل 18 خرطوشة مستشعر XFe96/XF Pro، و18 لوحة ميكرولوح XFe96/XF Pro Cell Culture، وزجاجة واحدة من محلول Seahorse XF Calibrant Solution بسعة 500 مل، و3 أزواج من أدلة تحميل XF |
| بيكربونات الصوديوم | سيغما | S6014 | |
| بيروفات الصوديوم (100 ملممتر) 100X | جيبكو | 11360-070 | |
| اختبار SRB (مجموعة اختبار سلفورودامين B) | أبكام | ab235935 | |
| ماصحة VWR متعددة القنوات عالية الأداء ومريحة التوقيع | أفانتور | 89079-956 | |
| مجموعة اختبار إجهاد XF Cell Mito | أجيلينت | 103015-100 | |
| مجموعة اختبار معدل الجليكوليكية XF | أجيلينت | 103344-100 |
المراجع
- Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
- Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
- Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
- Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
- Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
- Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
- Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
- Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
- Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
- Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً