يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزل الأولي والثقافة والتحقق من النمط الظاهري للخلايا الغضروفية المفصلية لركبة الفئران

848 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69509

⸱

نوفمبر 7, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول عزل وزراعة الخلايا الغضروفية المفصلية الأولية لركبة الفئران باستخدام الهضم الأنزيمي المتسلسل. تنتج هذه الطريقة خلايا غضروفية ذات خصائص نمطية تم التحقق من صحتها ، مما يوفر للباحثين نهجا موثوقا به لتطبيقات أبحاث الغضاريف.

الملخص

لا يزال تلف الغضروف الناتج عن الصدمة أو الشيخوخة أو الحالات الالتهابية يمثل تحديا سريريا كبيرا بسبب قدرة الأنسجة على التجدد المحدودة بطبيعتها. الخلايا الغضروفية ، كونها المكون الخلوي الوحيد للغضروف ، مسؤولة عن الحفاظ على بنية المصفوفة خارج الخلية ووظيفتها ، مما يجعلها ضرورية لفهم فسيولوجيا الغضروف وعلم الأمراض والتجديد. تقدم الدراسة الحالية بروتوكولا شاملا وموحدا للعزل والثقافة والتحقق من النمط الظاهري للخلايا الغضروفية المفصلية الأولية للفئران من مفصل الركبة. يستخدم الإجراء الفئران الصغيرة المرضعة لضمان بقاء الخلية القصوى ويستخدم الهضم الأنزيمي المتسلسل مع التربسين والكولاجيناز من النوع الثاني لاستخراج الخلايا بكفاءة. يتم التحقق من النمط الظاهري للخلايا الغضروفية من خلال التألق المناعي للكولاجين من النوع الثاني ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، ومقايسات تحفيز الإنترلوكين (IL) -1β لتأكيد الهوية الخلوية والاستجابة الالتهابية. يتيح سير العمل المحسن والقابل للتكرار هذا توليد مزارع الخلايا الغضروفية عالية النقاء المناسبة لفحص الأدوية والتحقيقات الميكانيكية وتطبيقات هندسة الأنسجة ، مما يعزز أبحاث بيولوجيا الغضروف.

المقدمة

الغضروف هو نوع متخصص من الأنسجة الضامة التي تؤدي وظائف حاسمة متعددة ، بما في ذلك توفير الدعم والتوسيد وامتصاص الصدمات1. يلعب دورا حيويا في الحفاظ على الاستقرار الهيكلي وضمان التنقل داخل نظام الهيكل العظمي2،3. يمكن أن تتسبب الإصابة الميكانيكية أو التغيرات التنكسية أو الالتهاب أو التشوهات الأيضية في تلف الغضروف4،5،6. نظرا لافتقارها المتأصل في الأوعية الدموية والأعصاب ، جنبا إلى جنب مع القدرة التكاثرية المحدودة للخلايا الغضروفية ، فإن إصلاح الغضروف يمثل تحديات كبيرة. يمكن أن تسبب أمراض مثل هشاشة العظام (مدفوعة بالتغيرات التنكسية والإصابة الميكانيكية) والتهاب المفاصل الروماتويدي (الناجم عن الاستجابات الالتهابية المناعية الذاتية) تلفا لا رجعة فيه في الغضروف ، مما يقلل بشكل كبير من نوعية حياة المرضى7،8،9. باعتبارها نوع الخلية الحصري داخل أنسجة الغضروف ، فإن الخلايا الغضروفية مسؤولة عن الوظائف الرئيسية مثل إفراز المصفوفة خارج الخلية وصيانتها ، ودعم نمو الهيكل العظمي ، والمشاركة في توسيد المفاصل وإصلاحها ، والتنظيم المركزي لنمو الغضروف والتمثيل الغذائي10،11،12.

الخلايا الغضروفية محصورة داخل ثغرات مصفوفة الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى قدرة محدودة للغاية على تكاثرها وإصلاح الأنسجة13،14. تحدد الحالة الوظيفية للخلايا الغضروفية بشكل مباشر صحة أنسجة الغضروف15. يؤدي الخلل الوظيفي للخلايا الغضروفية ، الناجم عن الشيخوخة أو الالتهاب أو الصدمة أو العوامل الوراثية ، إلى انخفاض تخليق المصفوفة وزيادة التدهور16،17. تؤدي هذه العملية المرضية إلى تنكس الغضروف (كما هو الحال في هشاشة العظام) ، مما يؤدي إلى ضعف وظائف الدعم والتوسيد والتزييت الأساسية. القدرة التجديدية المحدودة للغضروف هي السبب الأساسي للتحدي الكبير في إصلاحه وتشكل مجالا بحثيا رئيسيا في جراحة العظام الحديثة والطب التجديدي. أصبحت الأبحاث الحالية حول الغضاريف محورا رئيسيا في هذا المجال ، حيث تتطلب التدخلات القائمة على الأدوية وهندسة الأنسجة والعلاج الجيني عزل الخلايا الغضروفية للدراسات في المختبر 18،19،20،21،22،23،24،25. وبالتالي ، فإن عزل الخلايا الغضروفية وتحديدها يشكل خطوة حاسمة في العديد من الأساليب التجريبية. في حين أن خطوط الخلايا الشبيهة بالخلايا الغضروفية الخلودة مثل SW1353 تستخدم كبدائل مريحة في بعض الدراسات ، إلا أنها تفتقر إلى التعبير عن علامات النمط الظاهري الحرجة ، وأبرزها الكولاجين من النوع الثاني ، وهو ضروري لوظيفة الخلايا الغضروفية الأصلية وتكوين المصفوفة26. لذلك ، تظل الخلايا الغضروفية الأولية هي المعيار الذهبي للأبحاث التي تتطلب أهمية فسيولوجية. بالمقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا والتي تتطلب مجموعات إنزيمات متعددة أو تلاعبا ميكانيكيا واسع النطاق ، فإن نهج الهضم الأنزيمي المبسط يقلل من التعقيد ووقت المعالجة مقارنة بالطرق التي تتطلب مجموعات إنزيمات متعددة أو تلاعب ميكانيكي واسع النطاق. علاوة على ذلك ، يضمن دمج خطوات التحقق الشاملة تحديدا متسقا للخلايا الغضروفية الوظيفية ويعزز قابلية التكاثر عبر التجارب والمختبرات.

تتميز الخلايا الغضروفية بإفراز الكولاجين من النوع الثاني ، بينما تحت التحفيز بواسطة العوامل الالتهابية ، فإنها تصنع على نطاق واسع وتطلق البروتينات المعدنية المصفوفة (MMPs)27. لذلك ، بعد عزل الخلايا الغضروفية ، تم تحديد الخلايا عن طريق التألق المناعي للكولاجين من النوع الثاني ، وتم تقييم نقاء الخلايا الغضروفية باستخدام قياس التدفق الخلوي. وتحفيزها مع إنترلوكين (IL) -1β لتأكيد تخليقها المميز وإفراز مصفوفة البروتينات المعدنية. تصف هذه الدراسة عملية استخراج الخلايا الغضروفية وتوصيفها من الفئران حديثي الولادة ، مما يضع أساسا للتجارب اللاحقة المتعلقة بالخلايا الغضروفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على استخدام في هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات رعاية التجريبية ورفاهيتها في مستشفى الصداقة الصيني الياباني (رقم zryhyy21-21-05-16). يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. التجارب والأعمال التحضيرية

ملاحظة: يمكن استخدام الغضروف من مفاصل الفئران والأرانب والبشر بعد تقويم مفصل الركبة الكلي لعزل الخلايا الغضروفية. ومع ذلك ، نظرا لقابليتها العالية للحياة ، تم استخدام الفئران الرضيعة لاستخراج الخلايا الغضروفية في هذه الدراسة.

  1. نقل الفئران الرضيعة من منشأة الإنتاج الحيواني التجريبي إلى المختبر باستخدام حاويات نقل متخصصة.
  2. القتل الرحيم للفئران الرضعة عن طريق الاختناق ثاني أكسيد الكربون2 (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) وشطف أسطح أجسامها بمحلول معقم.
  3. اغمر الفئران المرضعة الرحيم في 75٪ إيثانول لمدة 10 دقائق لتطهير الملوثات السطحية.
  4. انقل الفئران الرضيعة المطهرة إلى خزانة السلامة الحيوية وضعها في أطباق بتري معقمة.
    ملاحظة: يعد التنظيف الشامل للأسطح وغمر الإيثانول للفئران الرضيعة خطوات حاسمة لمنع التلوث البكتيري أو الفطري ، مما قد يؤثر سلبا على التجارب اللاحقة.

2. عزل أنسجة الغضروف المفصلي

ملاحظة: يظهر غضروف حديثي الولادة كطبقة شفافة بيضاء مزرقة تغطي المشاشية العظمية. يجب اتباع تقنيات التعقيم الصارمة خلال هذه الخطوة لتجنب التلوث الذي قد يضر بالتجارب اللاحقة.

  1. اعزل مفصل ركبة الفئران الرضيع باستخدام مشرط ومقص للعيون ، ثم قم بإزالة أنسجة الجلد المغطاة.
  2. انقل مفصل الركبة التشريح إلى طبق بتري معقم جديد واستبدل المشرط ومقص العيون.
  3. احصد الغضروف المفصلي من مفصل الركبة باستخدام مشرط ، ثم قم بقص النسيج الضام المحيط جيدا باستخدام مقص العيون.

3. هضم أنسجة الغضروف

ملاحظة: استخدم التربسين لهضم الأنسجة الضامة المحيطة بالغضروف ، متبوعا ب 0.2٪ كولاجيناز II لهضم مصفوفة الغضروف.

  1. أضف الغضروف المحصود إلى 3 أحجام من 0.25٪ تريبسين واحتضنه في شاكر ثرموستاتي 37 درجة مئوية مع التحريك لمدة 30 دقيقة.
  2. قم بإنهاء عملية الهضم بإضافة PBS الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري الجنين (FBS). قم بإزالة الأنسجة الملتصقة من الغضروف باستخدام مقص العيون. جهاز طرد مركزي (4 درجات مئوية ، 500 × جم ، 5 دقائق) وتخلص من المادة الطافية.
  3. أعد تعليق أنسجة الغضروف في برنامج تلفزيوني ، جهاز طرد مركزي (4 درجات مئوية ، 500 × جم ، 5 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية. كرر خطوة الغسيل هذه 3 مرات.
  4. أضف 0.2٪ كولاجيناز II إلى أنسجة الغضروف المعالجة وهضمها في شاكر ثرموستاتي 37 درجة مئوية مع التحريض لمدة 4 ساعات.

4. عزل الخلايا الغضروفية وثقافتها

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. يجب ارتداء قفازات معقمة أثناء التفكك الميكانيكي لأنسجة الغضروف باستخدام مكبس حقنة على مصفاة الخلية لمنع التلوث التجريبي. في ظل ظروف الاستزراع القياسية ، تتطلب الخلايا الغضروفية الأولية عادة ما يقرب من 2-3 أيام للوصول إلى 80٪ -90٪ من التقاء الممر الأول.

  1. ضع مصفاة خلوية 200 ميكرومتر فوق طبق مزرعة معقم وقم بتصفية تعليق الغضروف المهضوم من خلال الشبكة.
  2. اطحن شظايا الغضروف المتبقية على المصفاة باستخدام مكبس حقنة معقم ، ثم اشطف المصفاة بوسط DMEM كامل.
  3. اجمع جميع المرشحات وأجهزة الطرد المركزي (4 درجات مئوية ، 500 × جم ، 5 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية.
  4. أعد تعليق الحبيبات في PBS ، وجهاز طرد مركزي (4 درجات مئوية ، 500 × جم ، 5 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية.
  5. أعد تعليق الخلايا في وسط DMEM الكامل ونقلها إلى قارورة ثقافة T25.
  6. احتضان القارورة في حاضنة مرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2).
  7. خلايا المرور عند هذا الالتقاء باستخدام التربسين-EDTA والثقافة الفرعية بنسبة 1: 2.

5. تلطيخ الكولاجين المناعي من النوع الثاني لتحديد الخلايا الغضروفية

ملاحظة: تتميز الخلايا الغضروفية الملتصقة بمورفولوجيا على شكل مغزل ومتعددة الأضلاع. تم إجراء جميع تحليلات المؤشرات الحيوية المقدمة في هذه الدراسة باستخدام الخلايا في Passage 2. تبدأ الخلايا الغضروفية في المقطع 3 في إظهار عدم تمايز أكثر وضوحا ، ويتميز بالتحول نحو مورفولوجيا على شكل مغزل تشبه الخلايا الليفية وتباطؤ في معدل التكاثر. يصبح هذا التغيير الظاهري أكثر وضوحا بعد المقطع 4. من خلال المقطع 6 ، تتبنى الغالبية العظمى من الخلايا شكلا ممدودا يشبه الخلايا الليفية. تم تحديد تخفيفات الأجسام المضادة بناء على توصية الشركة المصنعة والتحقق من صحتها من خلال تجاربنا الأولية لضمان الخصوصية المثلى وشدة الإشارة.

  1. بذور الخلايا الغضروفية في صفيحة 24 بئرا ومزرعة لمدة 24 ساعة للسماح بالالتصاق الخلية.
  2. تخلص من وسط المزرعة واغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS (أضف PBS إلى كل بئر ، واحتضن لمدة 5 دقائق ، ثم استنشط).
  3. ثبت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق ، ثم اغسلها 3 مرات باستخدام PBS.
  4. نفاذ الخلايا بنسبة 0.3٪ Triton X-100 (محضر في PBS) لمدة 10 دقائق.
  5. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS ، ثم انسدها بمحلول حجب خال من (150 ميكرولتر / بئر ، مخفف 5× في PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
  6. يتم إزالة المحلول الحاجز واحتضانه بالجسم المضاد الأولي (مضاد للقولون الثاني، تخفيف 1:200) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  7. استرجع الجسم المضاد الأساسي واغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS.
  8. أضف الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانب المترافق من Alexa Fluor 488 (تخفيف 1:50) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة في الظلام.
  9. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي واغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS.
  10. قم بتثبيته باستخدام وسط مضاد للبهتان يحتوي على DAPI وجففه في الظلام لمدة 10 دقائق.
  11. راقب الصور والتقطها باستخدام مجهر مضان مقلوب.

6. تحليل التدفق الخلوي لنقاء الخلايا الغضروفية

ملاحظة: تتميز الخلايا الغضروفية بقدرتها على تصنيع وإفراز الكولاجين من النوع الثاني ، والذي يعمل كعلامة نهائية لتحديد الهوية. خط خلايا الساركوما الغضروفية SW1353 ، بينما يظهر بعض خصائص الغضروف ، يفتقر إلى قدرة إفراز الكولاجين من النوع الثاني وبالتالي يعمل كعنصر تحكم سلبي في هذه التجربة.

  1. هضم كل من الخلايا الغضروفية وخلايا SW1353 باستخدام التربسين الخالي من EDTA.
  2. تحييد الهضم باستخدام وسط DMEM الكامل وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني.
  3. احتضان الخلايا بمحلول التثبيت / النفاذية لمدة 15 دقيقة ، ثم أضف 1 مل من الغسيل.
  4. جهاز طرد مركزي (500 × جم ، 5 دقائق) ، تخلص من المادة الطافية ، واحتضن بجسم مضاد للكولاجين من النوع الثاني 100 ميكرولتر (تخفيف 1: 100) لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء ، متبوعا بإضافة 1 مل من الغسيل.
  5. جهاز طرد مركزي (500 × جم ، 5 دقائق) ، تخلص من المادة الطافية ، واحتضان الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب IgG المترافق من Alexa Fluor 488 لمدة 30 دقيقة محمي من الضوء ، ثم أضف 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل.
  6. جهاز طرد مركزي (500 × جم ، 5 دقائق) ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كل عينة في مخزن غسيل 200 ميكرولتر ، وقم بتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

7. تحفيز IL-1β للخلايا الغضروفية

ملاحظة: يعد إنتاج البروتينات المعدنية المصفوفة (MMPs) استجابة لتحفيز IL-1β سمة مميزة للخلايا الغضروفية. لذلك ، تستخدم هذه الدراسة تحفيز IL-1β للتحقق من صحة هذه الخاصية المظهرية في الخلايا الغضروفية المعزولة.

  1. هضم الخلايا الغضروفية من قوارير الاستزراع وإعادة تعليقها في وسط DMEM كامل.
  2. عد الخلايا واضبط التركيز إلى 5 × 105 خلايا / مل باستخدام DMEM الكامل.
  3. خلايا البذور في صفيحة من 6 آبار (إجمالي 24 بئرا) ، مع 12 بئرا تم تعيينها كمجموعة تحكم فارغة و 12 بئرا كمجموعة تحفيز IL-1β.
  4. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 12 ساعة.
  5. أضف 10 نانوغرام / مل IL-1β إلى مجموعة التحفيز بعد التصاق الخلية الكامل.
  6. اجمع المواد الطافية لزراعة الخلايا بعد 24 ساعة لتحليل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
  7. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.
  8. 6 آبار تحكم Lyse و 6 آبار محفزة من IL-1β مع مخزن مؤقت RIPA لتحليل اللطخة الغربية اللاحقة.
  9. استخراج الحمض النووي الريبي من 6 آبار تحكم و 6 آبار محفزة ب IL-1β باستخدام TRIzol لتحليل qPCR.

8. التحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR)

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب المتعلقة بالحمض النووي الريبي باستخدام المواد الاستهلاكية المعالجة ب DEPC. باختصار ، تم نقع الأنابيب والأطراف في 0.1٪ DEPC لمدة 12 ساعة ، وتعقيمها (121 درجة مئوية ، 20 دقيقة) لتعطيل كل من RNases و DEPC المتبقية ، وتجفيفها بالفرن قبل الاستخدام.

  1. أضف 1 مل تريزول إلى حبيبات الخلية وتجانس باستخدام الخالط. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  2. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم والدوامة بقوة لمدة 30 ثانية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  3. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة. انقل المرحلة المائية عديمة اللون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف حجما متساويا من الأيزوبروبانول.
  4. تخلط جيدا وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 12,000 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية واحتفظ بحبيبات الحمض النووي الريبي.
  5. أضف 1 مل من الإيثانول المبرد مسبقا 75٪ إلى حبيبات الحمض النووي الريبي. دوامة جيدا وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 12,000 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية واحتفظ بحبيبات الحمض النووي الريبي.
  6. جفف حبيبات الحمض النووي الريبي بالهواء في خزانة السلامة الحيوية. قم بإذابة الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
  7. قياس تركيز الحمض النووي الريبي وجودته باستخدام مقياس الطيف الضوئي Nanodrop.
  8. النسخ العكسي لإجمالي الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) باستخدام مجموعة النسخ العكسي.
  9. تحضير خليط التفاعل الذي يحتوي على 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي ، و 4 ميكرولتر من محلول كلوريد المغنيسيوم ، و 2 ميكرولتر من خليط dNTP ، و 0.5 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 0.6 ميكرولتر من النسخ العكسي AMV ، و 1 ميكرولتر من الاشعال العشوائية ، والماء الخالي من RNase لضبط الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
  10. احتضان التفاعل عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، متبوعا ب 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبرد إلى 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بتخفيف (كدنا) بالماء الخالي من RNase.
  11. قم بإعداد خليط تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الذي يحتوي على 2 ميكرولتر من (كدنا) ، و 10 ميكرولتر من SYBR Green Real-time PCR Master Mix ، ومواد أولية أمامية وخلفية (الجدول 1) بتركيز نهائي قدره 0.2 ميكرولتر / لتر لكل منهما ، والماء الخالي من RNase إلى الحجم النهائي 20 ميكرولتر.
  12. اضبط شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: التمسخ المسبق عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. اجمع بيانات التألق خلال خطوة التمديد 72 درجة مئوية.
  13. بعد التفاعل ، سجل قيم التصوير المقطعي المحوسب لكل عينة والمرجع الداخلي. احسب مستويات التعبير النسبي للجينات المستهدفة باستخدام طريقة 2-ΔΔCT.

9. مقايسة إليسا

ملاحظة: قم بإعداد محلول عمل الأجسام المضادة البيوتينيل ومحلول العمل المترافق للإنزيم طازجا قبل الاستخدام.

  1. أخرج مجموعة ELISA من الثلاجة قبل 30 دقيقة واتركها تتوازن مع درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بإعداد جميع المحاليل المطلوبة وفقا لتعليمات المجموعة.
  3. أضف 100 ميكرولتر من العينات أو المحاليل القياسية (بتركيزات متفاوتة) إلى الآبار المعينة (تحتوي الآبار الصفرية فقط على مخزن مؤقت لتخفيف العينة / قياسي). أغلق اللوحة بغشاء لاصق واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة (باستثناء آبار التحكم الفارغة).
  4. تخلص من السائل واغسل كل بئر بسعة 350 ميكرولتر من الغسيل. احتضان لمدة 30 ثانية ، وتخلص من السائل ، واتركه حتى يجف على ورق ماص سميك. كرر الغسيل 4 مرات.
  5. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل الأجسام المضادة البيوتينيل إلى كل بئر. أغلق اللوحة واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة (باستثناء آبار التحكم الفارغة).
  6. تخلص من السائل واغسل كل بئر 4 مرات كما هو موضح في الخطوة 4.
  7. أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل المقترن بالإنزيم إلى كل بئر. أغلق اللوحة واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (باستثناء آبار التحكم الفارغة).
  8. تخلص من السائل واغسل كل بئر 4 مرات كما هو موضح في الخطوة 4.
  9. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. يحفظ من الضوء ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  10. أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر ، واخلطه جيدا ، وقم بقياس الكثافة الضوئية (OD) عند 450 نانومتر على الفور.
  11. قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام برنامج CurveExpert وحساب تركيزات العينة.

10. تحليل اللطخة الغربية

ملاحظة: قبل التجربة ، قم بإعداد المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي ، والنقل المؤقت ، و TBST ، والحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ ، وقطع غشاء PVDF إلى الحجم المناسب مسبقا. بعد ذلك ، التقط إشارات الإضاءة الكيميائية باستخدام نظام التصوير الكيميائي. اضبط الجهاز على الوضع التلقائي أو اليدوي للتعرض للتدرج ، والذي يتراوح عادة من 10 ثوان إلى 5 دقائق ، لضمان التقاط الإشارات ضمن النطاق الديناميكي الخطي ولتجنب تشبع البكسل. بعد التقاط الإشارة، حدد صورة التعريض الضوئي حيث تكون النطاقات المستهدفة واضحة والخلفية منخفضة للتحليل الكمي اللاحق.

  1. قم بإعداد مخزن تحلل RIPA (يحتوي على 1٪ PMSF و 1٪ مثبط فوسفاتاز) وأضف مخزن تحلل RIPA بنسبة 250 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار.
  2. تحلل الخلايا باستخدام اضطراب بالموجات فوق الصوتية (3 دورات ، 7-10 ثوان لكل منهما) واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  3. قم بالطرد المركزي لليحلل عند 4 درجات مئوية ، 12،000 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم اجمع المادة الطافية لقياس كمية البروتين.
  4. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينشونيك (BCA).
  5. اضبط تركيزات البروتين على نفس المستوى باستخدام مخزن تحلل RIPA.
  6. أضف 5× المخزن المؤقت للتحميل إلى العينات بنسبة 4:1 (العينة: المخزن المؤقت).
  7. قم بغلي العينات لمدة 10 دقائق ، ثم قم بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، و 12,000 × جم لمدة 10 دقائق ، واجمع المادة الطافية للرحلان الكهربائي.
  8. قم بتجميع هلام SDS-PAGE في حجرة الرحلان الكهربائي واملأه بمخزن مؤقت للرحلان الكهربائي حتى يتم غمر المشط.
  9. قم بإزالة المشط وتحميل العينات في الآبار وأضف سلم البروتين إلى الممرات المرجعية.
  10. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي حتى تصل صبغة البروموفينول الزرقاء إلى قاع الجل ، ثم قم بتفكيك الجهاز واسترداد الجل.
  11. قم بتجميع "شطيرة" النقل وإجراء النقل الرطب بجهد ثابت.
  12. سد غشاء PVDF بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في TBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  13. احتضان بجسم مضاد أولي مخفف طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  14. استعادة الجسم المضاد الأساسي وغسل الغشاء باستخدام TBST (5 × 5 دقائق).
  15. احتضان بجسم مضاد ثانوي مترافق مع HRP لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  16. استعادة الجسم المضاد الثانوي وغسل الغشاء باستخدام TBST (5 × 5 دقائق).
  17. قم بإعداد محلول ركيزة ECL وتخزينه محميا من الضوء.
  18. قم بتطبيق ركيزة ECL على الغشاء والتقط إشارات الإضاءة الكيميائية باستخدام نظام تصوير مع تعرض متدرج.
  19. تحليل شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ وحساب مستويات التعبير النسبي للبروتين لمزيد من التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهر تلطيخ التألق المناعي للكولاجين من النوع الثاني أن الخلايا الغضروفية المعزولة كانت إيجابية بشدة (الشكل 1 أ). أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أيضا أن أكثر من 98٪ من الخلايا كانت إيجابية للكولاجين من النوع الثاني (الشكل 1 ب) ، في حين أن خلايا التحكم السلبي SW1353 كانت سالبة (الشكل 1 ج). بعد التحفيز ب 10 نانوغرام / مل IL-1β لمدة 24 ساعة ، أظهر النشاف الغربي ارتفاعا ملحوظا في مستويات بروتين MMP3 و MMP13 في الخلايا الغضروفية (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يقدم البروتوكول الموصوف هنا العديد من المزايا الرئيسية لعزل وزراعة الخلايا الغضروفية المفصلية الأولية للفئران. يعد استخدام الفئران الرضيعة أمرا بالغ الأهمية لتحقيق الإنتاجية المثلى للخلايا وقابليتها للحياة ، حيث يحتوي الغضروف من الصغيرة على المزيد من الخلايا الغضروفية التكاثرية ومصفوفة أقل تمعدنا مقارنة بالغيفا. يحسن هذا الاختيار العمري بشكل كبير من كفاءة الهضم الأنزيمي واستعادة الخلايا اللاحقة.

يمثل نهج الهضم الأنزيمي المتسلسل جانبا حاسما من هذا البروتوكول. ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أبلغ المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح في هذا العمل.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل تمويل البحوث السريرية للمستشفيات الوطنية رفيعة المستوى ومبادرة نخبة المهنيين الطبيين لمستشفى الصداقة الصيني الياباني (NO. ZRJY2025-QM05).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالديهيدسولاربيولوجياP1110
5×؛ مخزن التحميلسولاربيولوجياP1040
أليكسا فلور 488-متزامن مضاد للأرانب IgGشركة تشونغشان جينغتشياو للتكنولوجيا الحيويةZF-0511
حل الحجب الخالي منتقنية الإشارة الخلوية15019
الأجسام المضادة المضادة للكولاجين IIأبكامab34712
مجموعة اختبار البروتين لحمض البيسينشونيك (BCA)سولاربيولوجياPC0020
كولاجناز IIتكنولوجيا ييسن الحيوية40508ES60
وسط تركيب فلوري يحتوي على DAPIشركة تشونغشان جينغتشياو للتكنولوجيا الحيويةZLI-9556
دولبيكو ميديف إيجلسولاربيولوجيا11995
مصل البقر الجنيني (FBS)سولاربيولوجياS9010
بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) - مضاد للأرانب IgGشركة تشونغشان جينغتشياو للتكنولوجيا الحيويةZB-2301
IL-1 & بيتا؛بيبروتك400-01B
MMP13 أرنب mAbABclonalA11148
نموذج MMP3 الأرنبABclonalA11418
الحليب الجاف خالي الدسمسولاربيولوجياD3840
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سولاربيولوجياP1020
غشاء PVDFثيرمو فيشر العلمي88518
مجموعة ELISA من نوع RAT MMP-13نوفسNBP3-06931
مجموعة ELISA لجهاز Rat MMP-3نوفسNBP3-06894
مجموعة النسخ العكسيبروميغاA3500
مخزن تحليل RIPAسولاربيولوجياR0010
مياه خالية من RNaseسولاربيولوجياR1600
جل SDS-PAGEإبيزيمPG112
مزيج رئيسي PCR في الوقت الحقيقي SYBR الأخضرتويوبوQPK-201
ترايتون X-100سولاربيولوجياT8200
تريزولسولاربيولوجيا15596026
تريبسنسولاربيولوجياT1320
مجموعة ركيزة ECL فائقة الحساسية لتركيب الركيزة الكيميائية الكيميائيةNCM BiotechP10300
β-Actin Rabbit mAbABclonalAC026

المراجع

  1. Min, Q., et al. Strong and elastic chitosan/silk fibroin hydrogels incorporated with growth-factor-loaded microspheres for cartilage tissue engineering. Biomimetics (Basel). 7 (2), 41(2022).
  2. Kloppenburg, M., Namane, M., Cicuttini, F. Osteoarthritis. Lancet. 405 (10472), 71-85 (2025).
  3. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: The value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  4. Han, Y., et al. High-precision, gelatin-based, hybrid, bilayer scaffolds using melt electro-writing to repair cartilage injury. Bioact Mater. 6 (7), 2173-2186 (2021).
  5. Molnar, V., et al. Cytokines and chemokines involved in osteoarthritis pathogenesis. Int J Mol Sci. 22 (17), 9208(2021).
  6. Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
  7. Ouyang, Z., et al. Cartilage-related collagens in osteoarthritis and rheumatoid arthritis: From pathogenesis to therapeutics. Int J Mol Sci. 24 (12), 9841(2023).
  8. Mueller, A. L., et al. Recent advances in understanding the pathogenesis of rheumatoid arthritis: new treatment strategies. Cells. 10 (11), 3017(2021).
  9. Cao, F., et al. Trends and cross-country inequalities in the global burden of osteoarthritis, 1990-2019: A population-based study. Ageing Res Rev. 99, 102382(2024).
  10. Wu, X., Fan, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. The metabolic landscape in osteoarthritis. Aging Dis. 13 (4), 1166-1182 (2022).
  11. Deng, H., et al. Altered expression of the Hedgehog pathway proteins BMP2, BMP4, SHH, and IHH involved in knee cartilage damage of patients with osteoarthritis and Kashin-Beck disease. Cartilage. 13 (1), 19476035221087706(2022).
  12. Hui, L., et al. Effects of androgen receptor overexpression on chondrogenic ability of rabbit articular chondrocytes. Tissue Eng Regen Med. 18 (4), 641-650 (2021).
  13. Drevet, S., Favier, B., Lardy, B., Gavazzi, G., Brun, E. New imaging tools for mouse models of osteoarthritis. Geroscience. 44 (2), 639-650 (2022).
  14. Wu, S., Guo, W., Li, R., Zhang, X., Qu, W. Progress of platelet derivatives for cartilage tissue engineering. Front Bioeng Biotechnol. 10, 907356(2022).
  15. Zhang, Y., et al. DL-3-N-butylphthalide promotes cartilage extracellular matrix synthesis and inhibits osteoarthritis development by regulating FoxO3a. Oxid Med Cell Longev. 2022, 9468040(2022).
  16. Krych, A. J., Saris, D. B. F., Stuart, M. J., Hacken, B. Cartilage injury in the knee: assessment and treatment options. J Am Acad Orthop Surg. 28 (22), 914-922 (2020).
  17. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  18. Morici, L., Allémann, E., Rodríguez-Nogales, C., Jordan, O. Cartilage-targeted drug nanocarriers for osteoarthritis therapy. Int J Pharm. 666, 124843(2024).
  19. Urlić, I., Ivković, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipein the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  21. Bai, L., et al. Engineering bone/cartilage organoids: Strategy, progress, and application. Bone Res. 12 (1), 66(2024).
  22. Dönges, L., et al. Engineered human osteoarthritic cartilage organoids. Biomaterials. 308, 122549(2024).
  23. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  24. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: the value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  25. Yu, L., et al. Hyaline cartilage differentiation of fibroblasts in regeneration and regenerative medicine. Development. 149 (2), dev200249(2022).
  26. Gebauer, M., et al. Comparison of the chondrosarcoma cell line SW1353 with primary human adult articular chondrocytes with regard to their gene expression profile and reactivity to IL-1β. Osteoarthritis Cartilage. 13 (8), 697-708 (2005).
  27. Yan, W., et al. Chondrocyte-targeted delivery system of Sortase A-engineered extracellular vesicles silencing MMP13 for osteoarthritis therapy. Adv Healthc Mater. 13 (16), e2303510(2024).
  28. Goldring, M. B. Chondrogenesis, chondrocyte differentiation, and articular cartilage metabolism in health and osteoarthritis. Ther Adv Musculoskelet Dis. 4 (4), 269-285 (2012).
  29. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  30. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  31. Dou, Y., Fang, Y., Zhao, C., Fu, W., Jiang, D. Editorial: Bioengineering and translational research for bone and joint diseases. Front Bioeng Biotechnol. 10, 969416(2022).
  32. Ye, K., et al. Bioengineering of articular cartilage: Past, present and future. Regen Med. 8 (3), 333-349 (2013).
  33. Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.