سير عمل معياري للتحليل الكمي والهيكلي والوظيفي لأفلام ليبتوسبيرا الحيوية

Summary

يقدم هذا البروتوكول سير عمل معياري بنظام BSL-2 يجمع بين اختبارات الكتلة الحيوية البنفسجية البلورية، حركية التباين الطوري بالتايم لابس، رسم خرائط ثلاثية الأبعاد/المصفوفة الكونفوكلي، البنية الفائقة لSEM، ووحدة عدوى الهامستر في الجسم لزراعة وقياس وتوصيف ودراسة الدور الوظيفي لأغشية ليبتوسبيرا الحيوية، مما يمكن من التقييم الموحد للطفرات والتدخلات المضادة للأغشية الحيوية عبر المختبرات.

Abstract

هنا، نقدم مجموعة متكاملة من البروتوكولات لزراعة ورصد الكمي والتوصيف البنيوي والوظيفي لأغشية أنواع ليبتوسبيرا الحيوية على مر الزمن. يجمع هذا السير بين اختبارات الميكروتيتر البلورية البنفسجية لقياس الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي في عدة نقاط زمنية، مع نهج تجزئة زمني يميز بين البكتيريا الملتصقة (الأغشية الحيوية) وغير المتصلة (الطور السائل)، وتصوير التباين بالطور الزمني للرصد الحركي غير التدميري، والمجهر بالليزر الكونفوكال لتوليد إعادة بناء ثلاثية الأبعاد كاملة مع قراءات مصفوفة المجسات، والمجهر الإلكتروني الماسح المدعوم بالغشاء للتحليل فوق البنيوي. بالتوازي، نفصل إجراء موحد لجمع تجمعات الأغشية الحيوية السليمة وإعدادها للحقن داخل الصفاق في نموذج الهامستر السوري الذهبي الحساس، مما يتيح التقييم المباشر للضراوة المرتبطة بالأغشية الحيوية في الجسم الحي إلى جانب عناصر تحكم العوالق المطابقة.

تم تحسين كل وحدة للسلالة الممرضة Leptospira interrogans Manilae L495، ويمكن نقل كل وحدة بسهولة إلى أنواع أخرى من Leptospira ومكتبات الطفرات لمقارنة القدرة على تكوين الأغشية الحيوية. معا، توفر هذه الوحدات المنسقة أساسا قويا لفحص استراتيجيات مضادات الأغشية الحيوية، وفحص المحددات الجينية، وتوضيح مساهمة الأغشية الحيوية في استمرارية ومسببات الليبتوسبيرا .

Introduction

الأغشية الحيوية هي مجتمعات ميكروبية منظمة يتم فيها تضمين الخلايا في مصفوفة مادة بوليمية خارج الخلية (EPS) تفرز ذاتيا تتكون من عدادات السكريات والبروتينات والأحماض النووية والدهون¹. توفر هذه المصفوفة الاستقرار الميكانيكي، وتتوسط الالتصاق بالأسطح وتعزز بقاء الميكروبات من خلال منح تحمل للضغوط البيئية مثل الجفاف، والإجهاد التأكسدي، والمضادات الحيوية ^2,3. في البكتيريا الممرضة، تسهل الأغشية الحيوية الاستمرارية، وتفادي المناعة، والعدوى المزمنة ^4,5.

مقارنة بالخلايا العوالية، التي هي عائمة حرة وأكثر تجانسا أيضيا، تظهر الخلايا المرتبطة بالأغشية الحيوية تعبيرا جينيا متغيرا ومعدلات نمو ونشاط أيضي^متغير. تمنح هذه الاختلافات تحملا أكبر للتحديات البيئية، والمضادات الحيوية، ودفاعات المضيف، مع السماح بسلوكيات منسقة مثل استشعار النصاب، واحتفاظ المغذيات، وتنظيم المكان^7،8.

تم توصيف تكوين الغشاء الحيوي بشكل واسع في نماذج كائنات مثل Pseudomonas aeruginosa، والمكورات العنقودية الذهبية، والVibrio cholerae، والتي شكلت مجتمعة فهمنا للأسس الجينية والبنيوية والفسيولوجية لنمط حياة الأغشية الحيوية. كشفت الدراسات على الزائف أن السكريات الخارجية واستشعار القاعدة يعملان معا لتشكيل هياكل الأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد^{المعقدة 9،10}. ركزت الأبحاث حول المكورات العنقودية على دور البروتينات السطحية والحمض النووي خارج الخلية في تعزيز تماسك الأغشية الحيوية وتحمل المضادات الحيوية^11,12. سلطت التحقيقات في أنواع فيبريو الضوء بشكل أكبر على التنوع اللافت في أشكال الأغشية الحيوية وأهميتها البيئية في البيئات المائية¹³. بشكل مجتمع، قدمت هذه الأنظمة إطارا مفاهيميا ومنهجيا قويا لأبحاث الأغشية الحيوية، مدعوما بالبروتوكولات الموحدة¹⁴ والتقييمات النقدية للتقنيات^{القائمة 15,16}، والتي تبرز معا الحاجة إلى نهج متناغم عند دراسة تكوين الأغشية الحيوية في بكتيريا أقل دراسة مثل ليبتوسبيرا.

كان يعتقد منذ زمن طويل أن أعضاء جنس اللولب اللبتوشيتي، وهم العوامل المسببة للربتوسبيروزيس، كانوا في الغالب عوالق. أظهرت الدراسات الحديثة تجريبيا تكوين أغشية حيوية قوية عبر عدة أنواع¹⁷. بينما تشير بعض الدراسات إلى تكوين الأغشية الحيوية في سياقات البيئية¹⁸ والمرتبطة بالمضيف¹⁹، أظهرت دراسات أخرى تجريبيا قدرة اللبتوسبيريات على تكوين الغشاء الحيوي في أنابيب الكلى في Rattus norvegicus²⁰ والزجاجية في الخيول²¹، بالإضافة إلى اكتشاف أنواع الليبتوسباير داخل الأغشية الحيوية البيئية^22,23. لذا فإن فك الرموز والآليات التي تحكم أغشية ليبتوسبيرا الحيوية أمر بالغ الأهمية لفهم انتقال العدوى البيئية، واستمرارية الخزان، وسبب الأمراض^24,25.

اختبارات الأغشية الحيوية الحالية من ليبتوسبيرا مجزأة، تتراوح من الملاحظات المجهرية النوعية^17,26 إلى الصبغات اللونية أو البنفسجية البلورية في النهاية^27,28. بينما قدمت هذه الدراسات رؤى قيمة حول تكوين الأغشية الحيوية، إلا أنها غالبا ما تفتقر إلى الدقة الحركية المطلوبة لمراقبة نضج وانتشار الأغشية الحيوية في الوقت الحقيقي وكذلك إلى السياق الفائق البنية الذي يوفره المجهر الكونفوكالي أو الإلكتروني الميكروسكوبي. يعتبر الرصد المستمر والتحليل الهيكلي ثلاثي الأبعاد ضروريين لالتقاط الطبيعة الديناميكية لتكوين وانتشار الأغشية الحيوية^14،15. تعيق هذه القيود قابلية المقارنة عبر الدراسات وتحد من التقييم المنهجي للعوامل أو التدخلات التي تؤثر على تكوين وانتشار الأغشية الحيوية، مما يبرز الحاجة إلى سير عمل موحد متعدد القراءات يلتقط الديناميكيات الهيكلية والوظيفية للبتوبروسبيروأغشية الحيوية بطريقة قابلة للتكرار والشمول.

لمعالجة هذه الفجوات، طورنا سير عمل متكامل ومعياري يوحد ست قراءات مكملة مأخوذة من نفس سلسلة الثقافات. أولا، يقوم اختبار الميكروتيتر CV عالي الإنتاجية بقياس الكتلة الحيوية الملتصقة في عدة نقاط زمنية. ثانيا، اختبار التجزئة الدقيقة في صفيحة 96 بئرا يقسم مجموعات الطور السائل (غير المتصلة أو المفصولة جزئيا)، والملحقة (الغشاء الحيوي) بواسطة OD₄₀₅ لتتبع تطورها أثناء التكوين والتشتت. يستخدم مصطلح الطور السائل هنا ليشمل الخلايا الشبيهة بالعوالق والخلايا المنفصلة، معترفا بالتسلسل الديناميكي بين الأنماط الحرة والسطحية ^29,30. ثالثا، يوفر تصوير التباين الطور بتقنية الزمن الفاصل الحركية غير المدمرة للالتصاق، وحركة التجمع، والتجمع. رابعا، المجهر بالليزر الكونفوكال (CLSM) ينتج إعادة بناء ثلاثية الأبعاد كاملة مع قراءات حية/ميتة ومصفوفة، مما يتيح قابلية العيش المعتمدة على العمق ورسم خرائط المصفوفة. خامسا، المجهر الإلكتروني الماسح المدعوم بالغشاء أو الانزلاق الغطاء (SEM) يحل الهندسة خارج الخلية والقطبية القاعدية-القمة بدقة عالية. بالإضافة إلى ذلك، تم دمج وحدة في الجسم لتقييم الضراوة باستخدام حقن داخل الصفاق لتجمعات الأغشية الحيوية في نموذج الهامستر السوري الذهبي الحساس، وهو نموذج حساس وراسخ جيدا لمرض البرمني ^31,32,33. يربط هذا النهج الأنماط الظاهرية للغشية الحيوية بالإمكانات الممرضة، مما يوفر سياقا وظيفيا يكمل التحليلات المختبرية.

مقارنة بأساليب النمط الواحد، تقدم هذه المنصة عدة مزايا: (1) قراءات كمية متزامنة (CV وOD المجزأة) والقراءات الهيكلية (CLSM/SEM)؛ (2) المراقبة الحركية غير المدمرة للالتصاق المبكر، والنمو، والنضج، والتشتت؛ (3) قابلية العيش ثلاثية الأبعاد وتوصيف المصفوفة باستخدام المجسات المستهدفة؛ (4) التصور الفائق البنيوي لبنية المصفوفة خارج الخلية؛ و(5) التقييم الوظيفي المباشر للضراوة المرتبطة بالأغشية الحيوية مقابل العوالق في نموذج هامستر الحساس، وكل منها ممكن باستخدام بنية BSL-2 القياسية. من خلال الاستفادة من تنسيقات الآبار المتعددة وركائز الزجاج أو البولي كربونات القابلة للإزالة، يدعم سير العمل شاشات تكرار المتغيرات البيئية أو المركبات المضادة للميكروبات أو المكتبات المتحولة مع الحفاظ على التعقيم ومعدل النقل والتحقق المتقاطع عبر الوحدات.

يمكن للمختبرات التي تركز على علم البيئة، والاستمرارية، وتفاعلات المضيف مع الممرض، أو اكتشاف الأغشية الحيوية أن تعتمد وحدات فردية أو خط أنابيب كامل. الموارد المطلوبة محدودة بقارئ اللوحة، ومجهر مقلوب مع تحكم بيئي للمرور الزمني، والوصول إلى مجهر كونفوكال ومنشأة SEM، ومرافق حيوانية قياسية لنموذج الهامستر، مما يتيح تبني واسع ومقارنات قابلة للتكرار عبر الدراسات.

Protocol

بيان الأخلاقيات:
تمت الموافقة على هذا البحث من قبل لجنة العناية واستخدام في معهد باستور كاليدونيا الجديدة وأجري وفقا للإرشادات التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام في معهد باستور باريس، والتوصية الأوروبية 2007/526/EC. رقم تسجيل تجربة أبحاث: IPNC-2018-ARE-001

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بزراعة ليبتوسبيرا الحية في مختبر للسلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL-2)، وفقا لإرشادات السلامة الحيوية المؤسسية. يجب إجراء جميع عمليات التلاعب بالزراعة تحت خزانة السلامة البيولوجية لضمان سلامة المشغل ومنع التلوث البيئي.

سلالة Leptospira interrogans serovar Manilae L495 المستخدمة في هذه الدراسة تم الحصول عليها أصلا من مجموعة معهد باستور (باريس، فرنسا) ومحفوظة في معهد باستور في كاليدونيا الجديدة. للحفاظ على الضراوة، يتم إعادة عزل السلالة بشكل دوري من الهامستر المصاب. في جميع التجارب المختبرية ، لم يتم الحفاظ على الثقافات بعد ست مزارع فرعية بعد التعافي من المضيف الحيواني.

يجب تنفيذ جميع إجراءات وفقا للإرشادات المؤسسية ومعتمدة من لجان العناية واستخدام المختصة. يجب أن تلتزم التجارب باللوائح الأوروبية المتعلقة برفاهية (توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63) وتوصيات خدمة الصحة العامة، لضمان أن يكون استخدام مبررا ومنظما أخلاقيا.

1. تحضير اللقاح البكتيري

1. نما خلايا أنواع ليبتوسبيرا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية في وسط EMJH³⁴ تحت ظروف هوائية ودون اهتزاز في أنابيب زجاجية ذات قاع مسطح ومغطاة لولبية حتى تصل الزراعة إلى منتصف مرحلة اللوغاريتم. في هذه الظروف، تصل سلالة L . interrogans المصلية Manilae L495، وهي سلالة منخفضة الممر تحافظ بانتظام على الهامستر في الجسم الحي ، إلى كثافة الخلايا المناسبة خلال 3-5 أيام. تأكد من وصول الزراعة إلى الجرعة الزائدة من 0.2-0.4 عند 405 نانومتر (2 إلى 5 × 10⁸ خلايا/مل) قبل التخفيف في وسط EMJH الطازج، وتحقق من الحركة وعدم التجمع بواسطة مجهر المجال المظلم بتكبير 20 مرة.
   ملاحظة: EMJH له امتصاص داخلي. قم بإفراغ مقياس الطيف الفوتومتري بموجة EMJH معقمة وطرح هذه القيمة من جميع القراءات. يمكن توحيد اللقاح إما بقياس الكثافة البصرية أو عن طريق العد المباشر للخلايا باستخدام غرفة بيتروف-هاوسر. عادة ما تعطي تخفيفة 1:100 لزراعة منتصف اللوغاريتيوم المعتمدة OD₄₀₅ = 0.02 (≈ 1 ×^{10 6} خلايا/مل). اخلط بلطف عن طريق الانعكاس؛ لا تدفق.
2. افحص أليكوت بسعة 10 ميكرولتر تحت مجهر المجال المظلم بتكبير 20 مرة. تأكد من أن ≥ 90٪ من الخلايا شديدة الحركة وعدم وجود كتل مرئية. قم بتخفيف الزراعة المتوسطة المعتمدة 1:100 في EMJH طازج للحصول على OD₄₀₅ = 0.02 (≈ 1 ×^{10 6} خلايا/مل). اخلط بلطف عن طريق الانعكاس؛ لا تدفق.
   ملاحظة: يدعم لقاح واحد عامل جميع الاختبارات اللاحقة المفصلة في هذا البروتوكول (الشكل 1). جهز 36 مل لزراعة صفيحة بذرة 24 بئر (1 مل/بئر) أو 20 مل لزراعة صفيحة بسعة 96 بئر (200 ميكرولتر/بئر). اضبط الحجم لتتناسب مع عدد الألواح المطلوبة.

الشكل 1. سير العمل العالمي لتحليل أغشية ليبتوسبيرا . يتم أولا تقييم نمو ثقافات ليبتوسبيرا التي تنمو بشكل أسي وتوحيد بكثافة بصرية. ثم توزع الثقافات على ألواح تحتوي على زجاج أو أغشية، أو أطباق مجهرية، أو صفائح ذات 96 بئرا. يتضمن سير العمل سبع وحدات: (1) تحضير اللقاح؛ (2) التلوين البنفسجي البلوري لقياس الكتلة الحيوية؛ (3) التصوير فوق البنيوي بواسطة SEM؛ (4) مراقبة الأغشية الحيوية الديناميكية باستخدام مجهر تباين الطور بالفاصل الزمني؛ (5) التصوير ثلاثي الأبعاد بواسطة CLSM مع تلوين حي/ميت؛ (6) القياس الزمني للكسور الملحقة وغير المرتبطة أثناء تكوين الأغشية الحيوية عبر الكثافة البصرية؛ و(7) دراسة الدور الوظيفي للغشية الحيوية أثناء العدوى في الهامستر السوري. يتيح هذا النهج المتكامل تحليلا متعدد الوسائط لتطور الأغشية الحيوية، وتركيبها، ومسببة الأمراض. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. البنفسج البلوري - القياس القائم على الأغشية الحيوية على الغطاء أو الأغشية

1. داخل غطاء السلامة البيولوجية BSL2، استخدم ملقط معقم لوضع غطاء زجاجي معقم بحجم 12 مم أو غشية عكربونات مائية معقمة بحجم 0.1 ميكرومتر مسطحة في أسفل كل بئر في صفيحة معقمة بسعة 24 بئر مع غطاء. انقع الغشاء/غطاء الزجاج مسبقا لمدة ساعتين عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع 1 مل من EMJH المعقم.
   ملاحظة: رغم أن ذلك ليس ضروريا، إلا أن نقع الركيزة مسبقا في EMJH يحسن الترطيب ويعزز التصاق البكتيريا قليلا.
2. أزل محلول النقع وأضف 1.5 مل من التعليق البكتيري المخفف (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 ×^{10 6} خلايا/مل) إلى كل بئر. تأكد من بقاء غطاء الغطاء أو الغشاء مثبتا بقوة في الأسفل.
3. حضن اللوحة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة في جو رطب، مع الحفاظ عليها بوضع صينية مملوءة بالماء داخل الحاضنة لمنع تبخر وسط الزراعة. بالنسبة للسلالات البطيئة النمو، يوصى بحضانة لمدة 3 أسابيع للسماح بتكوين طبقة حيوية ناضجة ملتصقة.
4. في النقطة الزمنية المطلوبة، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط الزراعة من كل بئر دون إزعاج الغشاء الحيوي. اشطف كل بئر بلطف بمقدار 1 مل من محلول ملحي معقم بفوسفات (PBS) لإزالة الخلايا غير الالتصقة المتبقية، مع إبقاء غطاء الغطاء مستويا مقابل قاع البئر لتجنب فصل الخلايا البيوغية الهشة. في هذه الظروف، يحدث نمو الغشاء الحيوي بشكل رئيسي على السطح العلوي للغطاء الداخلي، مع نمو طفيف في الجانب السفلي، لذا فإن الشطف دون رفع كاف لإثراء الخلايا المثبتة على السطح للتحليلات اللاحقة.
   ملاحظة: الأفلام الحيوية هشة للغاية في هذه المرحلة ويمكن استنشاقها بسهولة عن طريق الخطأ. يجب إجراء الطباعة ببطء ودقة على طول جدار البئر لتجنب تعطيل الغشاء الحيوي.
5. تثبيت عينات الأغشية الحيوية بإضافة 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أزل المثبت واغسله بعناية مرتين بسعة 1 مل من PBS.
   ملاحظة: للثب، تم تحضير محلول فورمالديهايد بنسبة 4٪ حديثا (16٪ مخزون خالي من الميثانول مخفف بنسبة 1:4 في PBS) ثم تم التخلص منه بعد الاستخدام، لأن البلمرة إلى بارافورمالديهيد تقلل من نشاط الربط المتقاطع.
6. أضف 1 مل من محلول البنفسجي الكريستالي (CV) بنسبة 0.1٪ (مع الجهد الزجاجي) إلى كل بئر وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، مع التأكد من تغطية الغشاء أو غطاء الغطاء بالكامل.
7. تخلص من الصبغة واشطف مرتين ب 1 مل من PBS.
   ملاحظة: البنفسج الكريستالي والبارافورمالديهايد (PFA) سامان ويمكن أن يهيج الجلد والعينين. دائما ارتد القفازات وتعامل مع كلتا المواد الكيميائية بعناية، ويفضل أن تكون بغطاء بخار. التخلص من النفايات في حاويات مخصصة للصبغات أو المواد الكيميائية وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية.
8. قم بإمالة اللوحة وصرف السائل المتبقي. جفف الآبار بالهواء في درجة حرارة الغرفة حتى تبدو الركيزة جافة تماما (≥ 4 ساعات، ويفضل أن تكون طوال الليل).
   ملاحظة: في هذه المرحلة، قد تكون الهياكل الشبيهة بالنقاط أو الشبكية مرئية على سطح الانزلاق الغطاء أو الغشاء (الشكل 2A).
9. أضف 500 ميكرولتر من محلول الاستبعاد (50٪ إيثانول، 50٪ حمض الخليك الجليدي (حجم/فول)) إلى كل بئر. حضن الطبق لمدة 15 دقيقة. يرفع ويخفض لتفكيك البنفسج الكريستالي المرتبط بالغلاف الحيوي بالكامل.
10. انقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى صفيحة دقيقة بصرية شفافة بسعة 96 بئر وقس الامتصاص عند 570 نانومتر. اطرح فراغا يحتوي فقط على الركيزة تم تحضيره عن طريق معالجة غطاء أو غشاء غير ملقح من خلال التثبيت، وتلوين CV، والغسل، والشرب لإزالة الارتباط الداخلي/الخلفية. سجل متوسط ± الانحراف المعياري لثلاثة نسخ تقنية على الأقل. قم بتخفيف العينات باستخدام عازل التبسيط إذا تجاوز الامتصاص النطاق الخطي للمقياس الطيفي.

3. تصوير الفيلم الحيوي باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)

1. داخل غطاء السلامة البيولوجية BSL2، استخدم ملقط معقم لوضع غطاء زجاجي معقم بحجم 12 مم أو غشية عكربونات مائية معقمة بحجم 0.1 ميكرومتر مسطحة في أسفل كل بئر في صفيحة معقمة بسعة 24 بئر مع غطاء. انقع الغشاء/غطاء الزجاج مسبقا لمدة ساعتين عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع 1 مل من EMJH المعقم.
2. أزل محلول النقع وأضف 1.5 مل من التعليق البكتيري المخفف (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 ×^{10 6} خلايا/مل) إلى كل بئر. تأكد من بقاء غطاء الغطاء أو الغشاء مثبتا بقوة في الأسفل.
3. حضن اللوحة عند 30 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة في حاضنة تحكم في الرطوبة لمنع تبخر وسط الزراعة. بالنسبة للسلالات البطيئة النمو، يوصى بحضانة لمدة 3 أسابيع للسماح بتكوين طبقة حيوية ناضجة وملتصقة
4. في النقطة الزمنية المطلوبة، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط الزراعة من كل بئر دون إزعاج الغشاء الحيوي.
5. ثم اشطف كل بئر بلطف بمقدار 1 مل من PBS المعقمة لإزالة الخلايا غير الالتصقة المتبقية، مع إبقاء غطاء الغطاء مستويا على قاع البئر لتجنب فصل خلايا الغشاء الحيوي الهشة. في هذه الظروف، يحدث نمو الغشاء الحيوي بشكل رئيسي على السطح العلوي للغطاء الداخلي، مع نمو طفيف في الجانب السفلي، لذا فإن الشطف دون رفع كاف لإثراء الخلايا المثبتة على السطح للتحليلات اللاحقة.
   ملاحظة: الأفلام الحيوية هشة للغاية في هذه المرحلة ويمكن استنشاقها بسهولة عن طريق الخطأ. يجب إجراء الطباعة ببطء ودقة على طول جدار البئر لتجنب تعطيل الغشاء الحيوي.
6. أضف محلول من 4٪ بارافورمالديهيد (PFA) و1٪ جلوتارالديهيد في محلول كاكوديلات الصوديوم (0.2 M، pH 7.4) مباشرة إلى البئر لتثبيت الغشاء الحيوي.
7. حضن لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ثم أزل المثبت وشطف الغطاء أو الغشاء مرتين باستخدام PBS. يحافظ هذا النهج على الغشاء الحيوي المثبت على السطح مع تقليل الانفصال، حيث يحدث معظم نمو الأغشية الحيوية على السطح العلوي للغطاء تحت ظروفنا.
   ملاحظة: للثبيت، تم تحضير محلول فورمالديهيد 4٪ و1٪ جلوتارالديهيد حديثا (مخزون خالي من الميثانول بنسبة 16٪ مخفف بنسبة 1:4 في مخزن كاكوديلات الصوديوم) ثم تم التخلص منه بعد الاستخدام، لأن البلمرة إلى بارافورمالديهايد تقلل من نشاط الربط المتقاطع.
8. اغمر الركيزة في 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم (OsO₄) مخفف في PBS لمدة ساعة واحدة لتعزيز تباين SEM. اشطف مرتين باستخدام PBS.
9. جفف العينات بغمرها بشكل متسلسل في سلسلة إيثانول متدرجة بتركيز متزايد: 25٪، 50٪، 70٪، 90٪، و100٪ (v/v)، كل منها لمدة 10 دقائق.
10. أضف 500 ميكرولتر من الهيكساميثيلديسيلازان وحضن لمدة 5 دقائق، ثم استبدلها ب HMDS طازج وحضن 5 دقائق إضافية. أزل HMDS الزائد واترك العينة تجف تماما تحت غطاء البخار.
    ملاحظة: غلوتارالديهايد، PFA، كاكوديلات الصوديوم، رباعي أكسيد الأوزميوم وهيكساميثيلديسيلازان سامة ويجب التعامل معها تحت غطاء أبخرة كيميائي مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
11. قم بتركيب العينات المجففة على قطع SEM باستخدام شريط كربون موصل مزدوج الوجه. قم بتغطية العينات بطبقة رقيقة (~10 نانومتر) من الذهب أو البلاتين، مما يوفر تباين إلكتروني كاف لتصوير SEM. يتيح ذلك تصور عالي الدقة لبنية الأغشية الحيوية، بما في ذلك تلامسات الخلية مع الخلية، وشكل المصفوفات خارج الخلية، والكثافة، والتباين، دون الحاجة إلى أصباغ أو صبغات إضافية.
12. قم بتحميل القطع في SEM باستخدام حامل العينة المناسب. إخلاء الحجرة طوال الليل، عندما يكون ذلك ممكنا، لتحسين جودة التصوير، ثم التقاط صور إلكترونية ثانوية عند 5 - 15 كيلو فولت وتكبير مناسب لكشف البنية الفائقة للفيلم الحيوي (الشكل 2).

4. تصوير التباين الطور بتقنية التايم لابس للغشية الحيوية النامية

1. مائية 500 ميكرولتر من اللقاح العامل (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 × 10⁶ خلايا/مل؛ انظر القسم 1) في طبق Hi-Q4 معقم بقطر 35 مم من الزجاج السفلي مزود بغطاء مستو مواز لإزالة تشوه الغضروف الهلالي. تجنب إدخال الفقاعات وأغلق الطبق فورا.
   ملاحظة: يحتوي طبق Hi-Q4 ذو قاع زجاجي مقاس 35 مم على 4 مناطق زراعة مميزة يمكن استخدامها لتصوير 4 ظروف مختلفة في نفس الوقت. خصص حجرة واحدة لوسط EMJH معقم كعنصر تحكم سلبي، وثلاثة أقسام أخرى لنسخ تقنية أو سلالات/طفرات مختلفة.
2. ضع الطبق على المسرح البيئي لمجهر مقلوب مزود بعدسات تباين الطور، ومحرك تركيز محرك (Biostation IMQ)، وصندوق رطب مضبوط على 30 درجة مئوية ورطوبة نسبية 95٪. تساعد هذه الحالات في تقليل التبخر أثناء التصوير الممتد (حتى 8 أيام).
3. شغل تطبيق BioStation IMQ، وفي الواجهة الرئيسية، افتح نافذة إعداد التوقيت الزمني الجديد للوصول إلى لوحة الإعدادات. قبل بدء التجربة، تحقق من المعايير البيئية على شاشة الحالة، مع التأكد من أن مؤشرات درجة حرارة الحجرة والماء تظهر مستقرة لمنع انحراف الإطار أثناء الاستحواذ.
4. في شاشة إعداد التايم لابس الجديد، اختر تبويب الحي ، وقم بضبط معلمات التصوير في لوحة حالة الملاحظة باختيار تباين الطور (Ph) كمرشح وضبط التكبير إلى 20 X.
5. في الوضع اليدوي، قم بضبط شدة الضوء ووقت التعريض لتحسين التباين مع تجنب التشبع. تحقق من ذلك باستخدام زر التحقق من التشبع. حدد أربع نقاط اكتساب تتوافق مع مراكز الأقسام الأربعة.
6. ضع المرحلة بشكل متسلسل فوق كل مقصورة باستخدام قرص الركض أو بالنقر مباشرة داخل عرض صور المراقبة الحية .
7. قم بتحسين التركيز باستخدام أزرار التركيز، وسجل كل موقع بالنقر على زر تسجيل نقاط التجربة بالتايم لابس . تظهر النقاط المسجلة كإطارات زرقاء مرقمة في عرض التحقق من نقاط المراقبة ويتم تأكيدها في تبويب النقاط.
8. برمج جدول الاستحواذ بفتح تبويب الوقت والنقر على جديد للوصول إلى مربع حوار Timelapse ، حيث يتم ضبط دورة الاستحواذ على 30 دقيقة والوقت الإجمالي على 7 أيام.
9. بعد النقر على التقديم، يقوم البرنامج تلقائيا بحساب عدد جولات الاستحواذ. تفعيل التركيز التلقائي بالنقر بزر الفأرة الأيمن على شريط العنوان، واختيار التفضيلات، وتفعيل وضع التركيز التلقائي لضمان إعادة التركيز في كل موقع مرحلة. تحقق من اتساق إعدادات التعريض، الكسب، وشدة الضوء عبر جميع النقاط، ثم حفظ التكوين بالكامل باستخدام زر الحفظ .
10. ابدأ عملية الاستحواذ بالنقر على بدء الفاصل الزمني (Start Time-lapse). ينتقل البرنامج تلقائيا إلى صور التايم لابس، مما يسمح بمراقبة مستمرة لتقدم الاقتناء واستقرار الحجرة طوال التجربة التي استمرت 7 أيام. يتم حفظ جميع الصور تلقائيا بصيغة TIFF داخل مجلد التجربة الذي ينشئه البرنامج.
11. معالجة وقياس سلسلة الصور عن طريق استيراد أكوام الصور إلى FIJI (الشكل 3A, B, C).
12. افتح مجموعات الصور المقابلة لكل موقع عبر ملف > استيراد >تسلسل الصورة، لضمان تحميل الإطارات بالترتيب الزمني.
13. حول التكديس المحاذفة إلى تدرج رمادي 8-بت باستخدام Image > Type > 8-بت لتوحيد شدة البكسل.
14. تطبيق العتبة باستخدام Image > Adjust > Threshold لعزل مناطق الأغشية الحيوية البكتيرية. تطبيق إعدادات عتبة متسقة عبر جميع الإطارات باختيار Apply، ثم حفظ النتيجة كقناع ثنائي باستخدام Process > Binary > Make Binary.
15. قم بالقياس الكمية باستخدام تحليل > تحليل الجسيمات، مع تسجيل معلمات مثل المساحة، ونسبة المساحة، والشدة المتوسطة.
16. تصدير النتائج من كل إطار تلقائيا إلى جدول بيانات عبر نافذة النتائج (ملف > حفظ ك > .csv) للتحليل الحركي. عبر عن جميع القياسات كنسبة مساحة الحقل التي يغطيها الغلاف الحيوي (تغطية السطح).

5. تصوير الفيلم الحيوي باستخدام المجهر بالليزر الماسح الكونفوكال (CLSM)

1. قم بتلقيح 1.5 مل من اللقاح العامل (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 × 10⁶ خلايا/مل؛ انظر القسم 1) في طبق زجاجي معقم بحجم 35 مم. الحضانة بشكل ثابت في صندوق رطب يحتوي على خزان ماء في حاضنة عند 30 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة التطورية المرغوبة (حتى 21 يوما).
2. في النقطة الزمنية المختارة، قم بسحب الوسط بحذر ببطء على طول جدار الطبق دون إزعاج الغشاء الحيوي. اشطف مرة واحدة ب 2 مل من PBS المعقمة لإزالة خلايا العوالق مع حرص شديد على عدم فصل أو تعطيل الغشية الحيوية.
3. جهز محاليل التلوين التي تتطلب حضانة بأغشية حيوية غير مثبتة (حية) (نفذ قبل التثبيت).
   1. للصبغ الحي/الميت، أضف صبغة حمض نووي فلورية خضراء بحجم 3 ميكرولتر SYTO9 (1.67 ملم) ويوديد بروبيديوم (18.3 ملم) إلى 10 مل PBS لصنع محلول صبغ. أضف 200 ميكرولتر من محلول التلوين مباشرة إلى البكتيريا المكونة للغشاء الحيوي، ثم حضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وشطفه مرة واحدة في PBS.
   2. يمكن أيضا استخدام جهاز تتبع الخلايا الحية لتلوين الخلايا قبل التثبيت السابق. حضن الخلايا الحية باستخدام جهاز تتبع CFDA/SE بحجم 10 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة. بدلا من ذلك، يمكن أيضا استخدام وسم الأغشية بتركيز 5 ميكروغرام/مل. اشطف مرة واحدة في PBS.
4. ثبت الغشية الحيوية بإضافة 2 مل من محلول بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ في PBS وحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أزل المثبت وشطف مرتين باستخدام PBS.
5. أضف قطرة من وسط تثبيت مضاد التصبغ لتغطية الغشاء الحيوي وتجنب الفقاعات.
6. احصل على مكدس Z على مجهر كونفوكلي مقلوب مزود بليزر أبيض قابل للضبط (WLL) وهدف غمر زيت HC PL APO CS2 63×/1.4 NA. بالنسبة ل CFDA/SE، اضبط الإثارة على 488 نانومتر واجمع الانبعاث بين 500-550 نانومتر، باستخدام ثقب صغير بوحدة واحدة (AU). بالنسبة ل FM4-64، اضبط الإثارة على 561 نانومتر واكتشف الانبعاث بين 630-700 نانومتر، أيضا باستخدام ثقب دبوس 1 AU.
7. احصل على مكدسات Z بفواصل 0.5-1.0 ميكرومتر عبر كامل سمك الطبقة الحيوية. اضبط قوة الليزر وكسب الكاشف لتعظيم النطاق الديناميكي مع تجنب التشبع (<1٪ بكسل مشبع).
8. استخدم المتوسط الخطي (2-4×) لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، والحفاظ على جميع معايير التصوير (قوة الليزر، عرض النطاق الترددي للكاشف، حجم الثقب، سرعة المسح) ثابتة عبر العينات.
9. احفظ مجموعات الصور كملفات 12-بت وأصدرها بصيغة .lif للتحليل الكمي في FIJI (ImageJ).
   ملاحظة: قبل التصوير، تأكد من توحيد إعدادات المجهر (مثل قوة الليزر، كسب الكاشف، حجم الثقب الدبوس) باستخدام عينات تحكم مصبوغة بنفس الأصباغ. تعد هذه الخطوة الأساسية لتقليل التباين بين عمليات الاقتناء والسماح بمقارنة موثوقة عبر التجارب.
10. معالجة وقياس تكدسات الصور الكونفوكال باستخدام FIJI المزودة بإضافة COMSTAT (أو برنامج تحليل ثلاثي الأبعاد مكافئ)¹⁰. قس الحجم الحيوي، متوسط وأقصى سمك، تغطية السطح، ونسب الأحياء/الميت (أو مقاييس أخرى محددة مسبقا). تصدير وجهات نظر متعامدة تمثيلية وإسقاطات بأقصى شدة لأغراض توضيحية (الشكل 3D, E).

6. القياس الدقيق-زمني للأجزاء الملتصقة وغير المرتبطة أثناء تكوين الأغشية الحيوية في اختبارات الميكروتيتر ذات 96 بئر

1. قم بتلقيح 200 ميكرولتر من اللقاح العامل (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 × 10⁶ خلايا/مل؛ انظر القسم 1) في آبار صفيحة بئر 96. الحضانة ثابتة عند 30 درجة مئوية حتى النقطة الزمنية المطلوبة (الأيام 3، 5، 7، 10، 12، 14، 17، أو 21).
   ملاحظة: تأثيرات الحدود والتبخر شائعة عند استخدام ألواح 96 بئرا، خاصة إذا كانت الحاضنة تفتقر إلى التحكم في الرطوبة. لتقليل هذه التأثيرات، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى جميع الآبار الطرفية. بالإضافة إلى ذلك، وضعت الألواح داخل صندوق رطب يحتوي على خزان مياه، ثم يوضع داخل الحاضنة لتقليل التبخر والحفاظ على رطوبة ثابتة عبر الآبار.
2. في كل نقطة زمنية، جهز ثلاثة أنواع من العينات:
   1. التعليق الكلي - توحيد محتوى البئر الكامل الذي يحتوي على الغشية الحيوية عن طريق الأنابيب بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات، لتجنب تكون الفقاعات. يمثل هذا الجزء إجمالي مجموعة البكتيريا، بما في ذلك كل من اللبتوسبيريات غير المرتبطة وتلك الموجودة في الطبقة الحيوية شبه الملتصقة. تساعد هذه الخطوة في التجانس على تشتت تجمعات الخلايا التي قد تتداخل مع قياسات الامتصاص اللاحقة.
   2. الطور السائل - من بئر ثان، قم بإزالة 180 ميكرولتر من المادة الفائقة بعناية دون الإخلال بطبقة الغشاف الحيوي. انقله إلى بئر فارغ وأضف 20 ميكرولتر من وسط EMJH الطازج. قم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل عدة مرات لتشتيت تجمعات الخلايا. يمثل هذا الجزء الخلايا غير المرتبطة الموجودة في الطور السائل، والذي قد يشمل كل من اللبتوسبيريات المعلقة بحرية وتجمعات الأغشية الحيوية المنفصلة.
   3. الفيلم الحيوي - في نفس البئر المستخدم للخطوة 2.2، أعد تعليق الفيلم الحيوي المتبقي بإضافة 180 ميكرولتر من وسط EMJH الطازج ورفع الأنبوب بلطف عدة مرات. هذا النسبة تتوافق مع اللبتوسبيرات داخل الطبقة الحيوية.
3. قس امتصاص كل تعليق عند 405 نانومتر باستخدام مقياس طيف فوتوميتر، بعد التأكد من أن كل بئر قد تم توحيده تماما، ورسم القيم لتوليد رسم بياني تمثيلي (الشكل 4أ).

7. دراسة الدور الوظيفي للغشية الحيوية أثناء عدوى المضيف

1. قم بتلقيح 200 ميكرولتر من اللقاح العامل (OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 × 10⁶ خلايا/مل؛ انظر القسم 1) في آبار صفيحة بئر 96. حضانه ثابتا عند 30 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة النمو المطلوبة (حتى 21 يوما).
2. لتحديد تركيز اللقاح، خصص آبار محددة لمكافحة الغشاء الحيوي تستخدم فقط لمراقبة النمو وليس للحقن الحيواني. بمجرد أن يصبح الغشاء الحيوي مرئيا بشكل كبير، قم بإزالة 180 ميكرولتر من المادة الفائقة من بئر تحكم واحد بلطف دون إزعاج الغشية الحيوية. استبدلها ب 180 ميكرولتر من وسط EMJH الطازج، وأعد تعليق تجمعات الأغشية الحيوية بعناية دون توليد فقاعات، وقس OD₄₀₅ لتقدير تركيز البكتيريا.
   ملاحظة: من حيث المبدأ، غسل الآبار قبل القياس قد يساعد في إزالة الخلايا غير الملتصقة. ومع ذلك، نظرا لأن أغشية ليبتوسبيرا الحيوية تظهر التصاق ضعيف في صفائح 96 بئرا، فإن الغسيل يؤدي إلى فقدان غير منضبط لمادة الغشاء الحيوي. لهذا السبب، تم تنفيذ خطوة إعادة التعليق دون غسل مسبق لضمان قابلية التكرار بين الآبار وتركيزات بكتيرية ثابتة.
   عادة ما تحتوي آبار التحكم في الأغشية الحيوية على ~2 ×^{10 8} ليبتوسباير، والتي تم اختيارها كلقاح قياسي لتجارب عدوى الهامستر. يحدد هذا التركيز أيضا العدد المستهدف من اللبتوسبيريات العوالق المستخدمة كأدوات تحكم. عند تضمينها، يتم إعداد ضوابط العوالق عن طريق زراعة ليبتوسبيرا حديثا في وسط EMJH تحت ظروف اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام، والتي تتوافق مع مرحلة النمو الأسية المتوسطة إلى المتأخرة التي تعطي كثافة خلوية مماثلة.
3. لتلقيح، استخدم آبار بيوغشية منفصلة (وليس آبار التحكم). قم بإزالة 180 ميكرولتر من السوبريانتانت بعناية من الآبار للقضاء على معظم ليبتوسبيريات الطور السائل.
4. اجمع ال 20 ميكرولتر المتبقية التي تحتوي على تجمعات الأغشية الحيوية باستخدام رأس ماصة بسعة 200 ميكرولتر لتجنب تعطيل البنية.
   ملاحظة: الغشاء الحيوي هش. تأكد من أن المجمعات مرئية قبل وبعد الجمع. جهز آبارا إضافية في حال احتجت التكرار.
5. انقل التجمعات إلى حقنة مملوءة مسبقا ب 300 ميكرولتر من وسط EMJH الطازج. دع الركام تستقر بالجاذبية.
6. قم بتوصيل إبرة 21 جيلون وطرد التيار الكهرومغناطيسي الزائد بلطف حتى يصل حجم نهائي إلى 200 ميكرولتر. تأكد من عدم بقاء فقاعات الهواء وأن تجمعات الأغشية الحيوية مرئية.
   ملاحظة: انتظار تسوية المجاميع يقلل من الخسارة أثناء تعديل الحجم. قبل الاستخدام الحي ، تحقق من أن التجمعات تبقى سليمة بعد مرورها عبر إبرة 21 جيلون (الشكل 4C, D).
7. إجراء حقن داخل الصفاق ل2 × 10⁸ ليبتوسبائر في وسط EMJH بسعة 200 ميكرولتر.
   ملاحظة: استخدم هامستر سوري ذهبي عمره 7-8 أسابيع (كلا الجنسين)، يتم الحفاظ عليه في ظروف سكن قياسية. بالنسبة للضوابط، حقن 200 ميكرولتر من وسط EMJH فقط (واحد لكل نسخة).
8. راقب مرتين يوميا لمدة تصل إلى 21 يوما للكشف عن علامات سريرية للليبتوتسبيروزس (تشوه الفراء، السجود، وانخفاض الاستجابة للتحفيز). قم بالقتل الرحيم فورا عبر استنشاق ثاني أكسيد الكربون إذا لوحظ المعاناة وسجل وقت القتل الرحيم كوقت الوفاة.
9. في اليوم 21، قم بقتل جميع الناجية.
   ملاحظة: قم بإجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة مع زراعة محضرة في تواريخ مختلفة. كل نسخة مكررة تشمل حيوانين لكل حالة واحد للتحكم السلبي.

Results

عندما يتم تحضير اللقاح بشكل صحيح، تدخل المزارع مرحلة منتصف اللوغاريتيم خلال 3-5 أيام وتظهر قيم OD₄₀₅ ~ 0.2-0.4 مع حقول ساطعة ومتحركة للغاية تحت مجهر الحقل المظلم (≥ 90٪ من الخلايا متحركة) ولا توجد كتل مرئية. تظهر التحضيرات غير المثالية على شكل بكتيريا بطيئة، وحركة غير متجانسة عبر الحقل؛ غالبا ما تنتج هذه الثقافات أغشية حيوية ضعيفة ويجب التخلص منها. في الممارسة العملية، تأكيد الحركة وزيادة الضربة جنبا إلى جنب مباشرة قبل التصنيف يقلل من فشل المحاولات. إن إنشاء بوابات مراقبة الجودة هذه في مرحلة اللقاح هو أفضل مؤشر على النجاح عبر التطبيقات اللاحقة. على الرغم من أن المنهجية كانت محسنة لسلالة L. interrogans المصلية Manilae L495، إلا أن نفس الإجراءات طبقت أيضا على سلالة Leptospira biflexa Patoc لإثبات التطبيق بين الأنواع. عادة ما يشكل L. biflexa أغشية حيوية أقل تماسكا ورقة مقارنة ب L. interrogans، ومع ذلك تبقى التسلسل التطوري والخصائص البنيوية المميزة قابلة للكشف مع تعديلات المعاملات المناسبة. وبالتالي، فإن إدراج كلا النوعين يؤكد على قابلية سير العمل للتكيف مع الليبتوسبيرا الممرضة والسابروفيتية على حد سواء.

بعد 21 يوما من الحضانة الثابتة عند 30 درجة مئوية في غرفة رطبة (أو المدة المناسبة لأنواع ليبتوسبيرا المستخدمة)، تصبح الأغشية الحيوية مرئية للعين المجردة على كل من أغطية الزجاج والأغشية البولي كربونات المحبة للماء. ينتج النمو الناجح أنماط CV مميزة بعد 2-3 أسابيع مثل آثار أقدام على شكل نقاط أو تفرعات أو شبكية ملتصقة بالسطح (الشكل 2أ).

في جولة نموذجية، يصل L . النوع البري Manilae L495 إلى ~ 50٪ من التغطية السطحية بحلول الأسبوع الثالث، بينما تصل مستويات الطفرات منخفضة الأغشية الحيوية إلى ~ 20٪ وأنماط الأغشية الحيوية عالية ~ 70-80٪، مما يؤسس نطاقا ديناميكيا عمليا للفحص. قد يختلف مدى تكوين الغشاء الحيوي أيضا حسب نوع وسلالة Leptospira ؛ على سبيل المثال، تطور سلالة L. biflexa Patoc الأغشية الحيوية المرئية بشكل أسرع، حيث اعتبرت الدراسات السابقة أن الهياكل التي تبدأ في وقت مبكر يصل إلى 120 ساعة بعد التلقيح هي أغشية حيوية^{ناضجة 35}.

يوفر التلوين البنفسجي الكريستالي طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لقياس الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي. في الأغشية الحيوية المتطورة جيدا، يؤدي التلوين إلى لون بنفسجي عميق موضع في منطقة الانزلاق الغطاء أو الغشاء، مما يشير إلى مستويات عالية من الكتلة الحيوية المثبتة (الشكل 2أ). توفر الإشارات البصرية أثناء خطوات التلوين والذوبان مؤشرات مفيدة لنجاح البروتوكول. على سبيل المثال، قد يكون توزيع الأقراص القلبية غير المتساوي أو التلوين الباهت ناتجا عن البذور الناقصة، أو التبخر، أو الغسيل العدواني الذي يفصل الأغشية الحيوية المبكرة.

تعكس قراءات الامتصاص عند 570 نانومتر كمية الصبغة المحتجزة، وبالتالي كثافة الغشاء الحيوي النسبية (الشكل 2B). في التجارب التمثيلية، تظهر ثقافات L. interrogans التي نمت في ظروف مثالية قراءات متسقة وقابلة للتكرار من التيار الزائد عبر النسخ، مما يعكس تكوين الأغشية الحيوية المستقر. على النقيض من ذلك، غالبا ما تلاحظ اختلافات كبيرة بين النسخ المكررة عندما تتعرض العينات لعملية ضغط مفرطة أثناء تغيرات الوسط، مما يشير إلى ضعف الالتصاق أو انفصال جزئي للغشاء الحيوي. يجب اعتبار هذا التغير علامة على مشاكل تقنية، ويجب استبعاد العينات المتأثرة أو مراجعة البروتوكول بعناية. ومن الجدير بالذكر أن L. biflexa Patoc يشكل أغشية حيوية أكثر اتساعا على كل من الغطاء الزجاجي وأغشية البولي كربونات تحت ظروف مشابهة، وهو ما ينعكس في قيم امتصاص CV الأعلى، مما يدل على أن البروتوكول قابل للتكيف وفعال عبر أنواع Leptospira .

التحضير الناجح للموجات الإلكترونية (SEM) قادر على كشف ترسبات مصفوفة خارج الخلية في وقت مبكر من اليوم الثالث، تليها بنية مستقطبة بشكل لافت في الأغشية الحيوية الناضجة: وجه قاعدي خشن ومجرى (غالبا بقنوات > 5 ميكرومتر) يثبت بنية داخلية مسامية، ووجه قمة أكثر نعومة حيث تقع اللولب متشابك في مصفوفة كثيفة (الشكل 2ج، D، E، F). غالبا ما تلتقط الحقول عالية التكبير خيوط متفرعة خارج الخلية وبروزات شبيهة بالفطريات أحيانا؛ ميزات تتوافق مع ديناميكيات الاندماج التي تلاحظها الزمنية (الفيديو الإضافي 1). في التحضيرات غير المثالية، قد تلاحظ مصفوفات منهارة، وشحن، وخطوط خلايا غير واضحة، عادة ما تعكس عدم كفاية التثبيت بعد التثبيت، أو الطلاء الموصل غير الكافي، أو سوء التجفيف. عندما تظهر القطبية القاعدية-القمية والقنوات الشاملة، تتوافق قراءات SEM بشكل وثيق مع تقديرات الكونفوكال للسمك والمسامية، مما يؤكد التنفيذ الناجح لكل من التحضير والتصوير.

في سلاسل الفاصل الزمني الفعالة، تظهر النقاط المعزولة خلال 24-72 ساعة وتتجمع تدريجيا لتشكل تجمعات أكبر تمتد عبر السطح قبل أن تبطئ حدود الفضاء حركتها (الشكل 3أ، ب، ج). يؤدي التقسيم الكمي إلى زيادة أحادية في إجمالي المساحة المغطاة، بينما ترتفع أعداد المجموعات، وتبلغ ذروتها، ثم تنخفض مع سيطرة التصادمات والاندماجات بين ~12 و216 ساعة. تشير هذه الحركيات (المساحة للأعلى، عدد التجمعات للأسفل) إلى تراكم نشط بدلا من ترسيب بسيط. المحاولات الفاشلة أو على الحافة تفتقر إلى النقاط المبكرة، تظهر منحنيات مسطحة بمساحة مع مرور الوقت، أو تعاني من انحراف التركيز المرتبط بعدم استقرار درجة الحرارة والرطوبة. الحفاظ على بيئة مستقرة بدرجة حرارة 30 درجة مئوية مع رطوبة 95٪ واستخدام التركيز التلقائي في كل نقطة زمنية عادة ما يعيد مسارات واضحة مناسبة لمقارنة الطفرات أو المعالجات.

تظهر مكدسات Z الممثلة من الأغشية الحيوية الناضجة بنية شبيهة بالرغوة متعددة الطبقات عادة ما تتجاوز سمكها 50 ميكرومتر، مع تلوينات معظم الخلايا حية (SYTO 9-إيجابي) وأحيانا فراغات مركزية تشير إلى إعادة ترتيب جماعي أثناء النمو (الشكل 3D). يمكن استخدام مجسات المصفوفة لدراسة تركيب المصفوفة: حيث تبرز WGA حواتم متعدد السكاريد، وتسميات BOBO-3 توفر وفرة في الحمض النووي خارج الخلية، والصبغات الانتقائية للبروتين لا تضيف الكثير من الإشارات الخارجية المرتبطة بالخلايا (الشكل 3ه). تشمل النتائج غير المثالية تكدسات رقيقة أو غير متصلة تهيمن عليها يود البروبيديوم، أو تبييض ضوئي قوي، أو إعدادات كسب غير متسقة، وكلها تقوض قابلية المقارنة الكمية. تفسير السمك والحجم الحيوي ونسب الحي إلى الميت معا (مع الحفاظ على قوة الليزر، وكسب الكاشف، والثقوب الدقيقة ثابتا عبر الظروف) يؤكد حالة النضج ويدعم المقارنات المباشرة مع البنية الفائقة للSEM والكتلة الحيوية CV.

عادة ما تتبع عملية تكوين الغشاء الحيوي لليبتوسبيرا مراحل مميزة، رغم أن التوقيتات والقيم الدقيقة قد تختلف حسب النوع أو السلالة. باستخدام سلالة L. interrogans Manilae L495 كمرجع، يشمل التقدم المتوقع على مدى 21 يوما مرحلة أولية (الأيام 0-3) حيث تبقى البكتيريا في الغالب عوالق مع طبقة حيوية قليلة (الشكل 4أ). يتبع ذلك مرحلة نمو أسية (الأيام 3-7) حيث تزداد البكتيريا العوالق والبكتيريا المرتبطة بالأغشية الحيوية، لتصل إلى حوالي 9 × 10⁸ خلايا/مل، مصحوبة بتكوين وتوسع تجمعات الأغشية الحيوية. بين اليومين السابع والثاني عشر، تنخفض بكتيريا العوالق بشكل كبير، بينما تبلغ الخلايا المرتبطة بالأغشية الحيوية ذروتها، حيث تمثل حوالي 80٪ من السكان. وأخيرا، خلال مرحلة النضج (الأيام 12-21)، تنخفض أعداد بكتيريا الأغشية الحيوية دون زيادة في الخلايا العوالقة، ومع ذلك يستمر حجم وتعقيد الطبقة الحيوية في النمو. ملاحظة هذا التسلسل من التغيرات تشير إلى أن البروتوكول يلتقط بفعالية التطور والنضج الديناميكي لأغشية ليبتوسبيرا الحيوية.

عند تنفيذها بشكل صحيح، يستخدم بروتوكول العدوى لقاح يحتوي على ~2 × 10⁸ ليبتوسبائر في 200 ميكرولتر EMJH، محضرة من ثقافات العوالق الدقيقة (5 أيام) أو بيوفيغلما (21 يوما). على الرغم من أن هذين النوعين من الزراعة يمثلان حالات فسيولوجية مميزة، إلا أن هذا الاختلاف مقصود، حيث تهدف التجربة إلى تحديد ما إذا كانت أغشية ليبتوسبيرا الحيوية — التي تتميز بانخفاض النشاط الأيضي والتمايز البنيوي — تحتفظ بقدرتها على بدء العدوى. يدعم هذا التباين دراسات النسخ التي تظهر تحولات كبيرة في التعبير الجيني بين العوالق والغشاء الحيوي ليبتوسبيرا^35,36. يتم جمع تجمعات الأغشية الحيوية بعناية للحفاظ على هيكلها وتبقى سليمة بعد المرور عبر إبرة 21 جالون، كما تم تأكيده قبل الحقن (الشكل 4C, D). بعد الحقن داخل الصفاق، عادة ما تظهر الهامستر السوري الذهبي علامات سريرية للليبتوسبيروزيس خلال 3 إلى 5 أيام (مثل الخمول، تشابك الفراء، السجود). أما الضابطون السلبيون الذين حقنوا بوسط EMJH وحده فلم تظهر أي علامات مرض. تختلف تطور وشدة العلامات السريرية، بالإضافة إلى وقت القتل الرحيم، حسب اللقاح: غالبا ما تسبب البكتيريا العوالق أعراضا مبكرة وأكثر حدة، بينما قد تسبب التراكمات المشتقة من الغشاء الحيوي عدوى متأخرة لكنها مستمرة (الشكل 4ب). المراقبة مرتين يوميا لمدة تصل إلى 21 يوما تسمح بالتقاط مسار المرض بالكامل.

الشكل 2. التلوين البنفسجي البلوري والقياس الكمي والتصوير فوق البنيوي لأغشية ليبتوسبيرا الحيوية. (أ) تلوين البنفسجي البلوري (CV) للأغشية الحيوية المزروعة على ركائز مختلفة. يسمح التلوين بتقنية CV بتصور بنية الأغشية الحيوية وأنماط الالتصاق الأولية للأنواع والركائز المختلفة. i. L. interrogans حول مرشح البولي كربونات; ii. L. biflexa على مرشح البولي كربونات; 3. ل. الاستجوابات على غطاء زجاجي; iv. L. biflexa على غطاء زجاجي. (ب) مثال على تكوين الأغشية الحيوية الكمي الذي تم تقييمه بواسطة امتصاص الغلاف القلبي الصناعي (OD570 نانومتر) مع مرور الوقت لأنواع L. interrogans و L. biflexa. تلتقط هذه القراءة الحركية ديناميكيات الالتصاق المبكر وتراكم الكتلة الحيوية، مما يبرز الفروقات في نمو الأغشية الحيوية بين الأنواع الممرضة والسابروفيتية. تم تعديل هذا الرقم من²⁷. (C-E) المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لأغشية L. interrogans: (ج) فيلم حيوي عمره 3 أيام يظهر تكوين مستعمرات دقيقة مبكرة وترسيب مصفوفة خارج الخلية أوليا؛ (د) فيلم حيوي عمره 14 يوما يعرض بنية ناضجة مع تنظيم مصفوفي وثلاثي الأبعاد واسع؛ (E-F) فيلم حيوي عمره 3 أسابيع يوضح التصلب الهيكلي ونضج المصفوفة على مدى الاستنتاج. يوفر هذا المزيج من تلوين الأجزاء القلبية، والقياسات الكمية للتوزيع الزائد، وتصوير SEM نظرة شاملة على تطور الأغشية الحيوية، من الالتصاق المبكر إلى التنظيم الناضج للبني، مما يمكن من المقارنة المباشرة عبر الأنواع ومدة الزراعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3. تصور تكوين الأغشية الحيوية ليبتوسبيرا . تظهر صور التباين الطور التي تم التقاطها بواسطة BioStation تطور الفيلم الحيوي عند (A) 48 ساعة، (B) 96 ساعة، و(C) 144 ساعة. (D) إعادة بناء CLSM لفيلم حيوي Leptospira يظهر الحجم الحيوي الكلي مع شرائح متعامدة للتصوير ثلاثي الأبعاد. (ه) التلوين الكونفوكلي لطبقة حيوية ناضجة باستخدام DAPI (أخضر) وWGA (أحمر)، مع إبراز الخلايا البكتيرية ومكونات المصفوفة خارج الخلية. تم تعديل هذا الرقم من³⁷. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4. القياس القياسي الزمني لكسر العوالق والأغشية الحيوية والتقييم الوظيفي للأغشية الحيوية لبتوسبيرا . (أ) حركيات تكوين الأغشية الحيوية تقاس بالامتصاص عند 405 نانومتر. لكل نقطة زمنية، تم أخذ قراءات من البئر الكلي، وجزء الغشاء الحيوي، والفائق الذي يحتوي على ليبتوسبيريات العوالق، مما يسمح بالتمييز بين البكتيريا الملتصقة والبكتيريا التي تسبح بحرية. (ب) أمثلة على منحنيات البقاء للهامستر التي تم حقنها بمواد بيوغية، أو ليبتوسبائر العوالقية، أو التحكم في EMJH. التي تحقن بالأغشية الحيوية تظهر ضراوتها أقل، حيث ينجو بعضها 21 يوما، بينما يسبب اللبتوسبيريات العوالق وفيات سريعة. (C-D) التحقق الأولي من سلامة الأغشية الحيوية: تكون التجمعات مرئية في الحقنة قبل الحقن (C) وتبقى سليمة بعد المرور عبر إبرة 21 جيلون (D، الأسهم البيضاء)، مما يؤكد الحفاظ على بنية الغشية الحيوية أثناء التعامل. تم تعديل هذا الرقم من³⁶. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

يقدم هذا البروتوكول سير عمل معياري ومتكامل لدراسة أغشية ليبتوسبيرا الحيوية، حيث يدمج الكتلة الحيوية الكمية (البنفسجي البلوري)^9,27، والديناميكا (تباين الطور السري)، والتركيب ثلاثي الأبعاد (المجهر بالليزر الكونفوكلي مع مجسات مستهدفة)³⁸، والبنية الفائقة (المجهر الإلكتروني الماسح)، والتقييم الوظيفي (عدوى الهامستر). باستخدام نفس سلسلة الثقافة عبر الوحدات، يتم تقليل تأثيرات الدفعات وتمكين التحقق المتقاطع داخل التجربة، وهو أمر مهم بشكل خاص للسبيروشيتات البطيئة النمو والهشة. كل وحدة تكمل الأخرى: CV تقيس "كم"، وتظهر التايم لابس "مدى السرعة"، وتكشف CLSM عن "ما بداخله"، وSEM تحل "كيف تبني"، وتوفر الاختبارات في الجسم "إثبات الوظيفة". إدراج L. biflexa يظهر القدرة على التكيف عبر الأنواع، مع التركيز على تكوين الأغشية الحيوية الأسرع والأكثر كثافة، ويؤكد المرونة المنهجية³⁵.

يعتمد نجاح كل وحدة على جودة اللقاح وحالته الفسيولوجية. الزراعة العوالق المتوسطة (3-5 أيام)، شديدة الحركة وخالية من الركام، تنتج التصاقات قابلة للتكرار وتطور الأغشية الحيوية. يجب استخدام العزل منخفض الممر فقط لضمان تكوين وتكرار الغشاء الحيوي القوي.

يرسخ اختبار CV سير العمل من خلال سرعته وقابليته للتوسع، ومعدل الإنتاجية ^9,27. يتيح ذلك الفحص السريع للطفرات أو الوسائط أو المركبات المضادة للأغشاء الحيوية. ومع ذلك، نظرا لأن أغشية ليبتوسبيرا الحيوية هشة وغير متجانسة، فإن التلاعب اللطيف والتحقق من النسخ ضروريان. لا يستطيع CV التمييز بين البنى المدمجة والمسامية أو اكتشاف تركيب المصفوفات - ومن هنا دورها كبوابة فحص للتحليلات الهيكلية الأعمق.

يجسر التصوير الزمني هذه الفجوة من خلال كشف حركية الأغشية الحيوية في الوقت الحقيقي. تلتقط هذه التقنية ظهور وتجمع وتثبيت التجمعات المتحركة المتحركة، كاشفة عن ظواهر عابرة لم تتجاوز اختبارات النهاية النتائج. الاستقرار البيئي (درجة الحرارة، الرطوبة، التركيز التلقائي) أمر بالغ الأهمية. أظهرت هذه التسجيلات أنه حتى عندما تبدو الكتلة الحيوية للذكورة الحيوية مستقرة، يمكن أن تتباعد الديناميكيات — مما يشير إلى إعادة ترتيب هيكلي أو فقدان قابلية البقاء في الطبقات الأعمق.

يوفر CLSM رؤى حجمية وكيميائية دون وجود آثار جفاف³⁹. يكشف التلوين الحي/الميت عن تدرجات حيوية للخلايا داخل الأغشية الحيوية، متوافقة مع تقارير عن انتشار محدود للأكسجين وطبقات الأيض ^6,40. تكشف الليكتينات وأصباغ الأحماض النووية عن وفرة من الحمض النووي خارج الخلية وزهور الجليكان المحددة، مما يسمح بقياس وتوصيف مكونات المصفوفة^41,42. غالبا ما تكشف بيانات CLSM عن فراغات داخلية، مما يعكس التعديلات الجماعية التي ظهرت في التايم لابس³⁸. ومع ذلك، تشمل القيود خصوصية المجسات، والتبييض الضوئي، والدقة المحورية المحدودة بالحيود؛ لذلك، يجب توحيد واختبار إعدادات المجهر وأداء الصبغة مسبقا لضمان نتائج موثوقة وقابلة للمقارنة عبر التجارب.

يوفر SEM دقة فائقة هيكلية مكملة⁴³. في المراحل المبكرة، يحل التجمعات الناشئة؛ عند النضج (≈ 15-21 يوما)، يكشف عن هيكلية مستقطبة: طبقة قاعدية خشنة ومجرى للتثبيت والتبادل، وسطح أغنى بالمصفوفة القمية أكثر نعومة³⁷. التثبيت الدقيق، وتجفيف HMDS، والارتباط مع بيانات الكونفوكال يخفف من الآثار الناتجة عن الجفاف أو الانهيار⁴⁴.

معا، تتيح هذه الوحدات الأربعة التحقق المتقاطع الداخلي: عندما تتقارب CV وCLSM وSEM، تكون الاستنتاجات قوية؛ عندما تتباعد، تكون هذه التناقضات نفسها مفيدة — تكشف، على سبيل المثال، زيادة الكتلة الحيوية مع انخفاض القدرة على الاستمرار أو الكتلة الحيوية غير المتغيرة مع تغير تركيب المصفوفة.

لا تزال هناك عدة قيود جوهرية. الأغشية الحيوية لليبتوسبيرا غير متجانسة وحساسة، مما يجعلها حساسة للتعامل مع اللعبة والجفاف. تدمج CV الكتلة الحيوية الكلية ولكن ليس القابلية للبقاء¹⁶؛ لا يمكن لمسح CLSM تجاوز الحدود الضوئية³⁸؛ SEM يعرض عرضة لتحف التحضير. من المتوقع حدوث وفيات في الطبقات الأعمق بسبب تدرجات الأكسجين⁶، لكن هذا التحيز منهجي وقابل للمقارنة عبر الظروف. يصل نضج الأغشية الحيوية إلى هضبة حوالي 15-21 يوما، مرتبطا بتوقيعات النسخ لتحديد العناصر الغذائية³⁶. المراحل اللاحقة لا تزال غير موصوفة بشكل جيد.

توفر اختبارات الحياة في الجسم السياق الوظيفي. يختبر حقن التجمعات داخل الصفاق ما إذا كانت الخلايا المشتقة من الغشاء الحيوي تختلف في الضراوة أو الاستمرارية عن نظيراتها العوالقة. على الرغم من أن اللقاح داخل الصفاق ليس طريقا طبيعيا، إلا أنه يوفر نموذجا مقارنا مسيطر عليه³⁶. التنوع الإجمالي يسبب بعض التباين، لكن التعامل المتسق وحجم اللقاح المطابق يخفف من ذلك. ومن المهم أن صفات استمرار الأغشية الحيوية (مثل تحمل الإجهاد الناتج عن ECM) لا تترجم بالضرورة إلى زيادة الضراوة الحادة، مما يبرز الدور البيئي وليس الممرض لتكوين الأغشية الحيوية²⁴.

يتيح التصميم المعياري الاستخدام القابل للتوسع. للفحص السريع، يكفي السير الذاتية والمرور الزمني (time-lapse). للرؤية الميكانيكية، تضيف CLSM وSEM دقة تركيبية ومعمارية. يمكن للوحدات دمج الاضطرابات الإنزيمية أو الكيميائية (DNase، الجليكوزيداز)، أو مجسات بديلة للجليكانات أو الأحماض النووية، أو أنظمة ميكروفلويدية لاختبار استجابات التدفق. يمكن لنفس اللقاح أن يغذي تحليلات النسخ أو البروتيومية، مما يربط مباشرة النمط الظاهري للغشاء الحيوي بالتنظيم (مثل إشارات c-di-GMP، الاستجابة للتجويع). يشمل هذا الإطار أيضا فحص الطفرات، واختبارات الاضطراب البيئي، وتقييم مركبات مضاد للأغشية الحيوية أو مضادة للضراوة.

يحول هذا السير المتكامل الملاحظات المعزولة إلى فهم متعدد الأبعاد متماسك لأفلام ليبتوسبيرا الحيوية. من خلال الجمع بين معدل النقل (CV)، والديناميكيات (التايم لابس)، والكيمياء والعمق (CLSM)، والبنية الفائقة (SEM)، يلتقط النهج الطبيعة المتحركة والمسامية والاستقطابية لمجتمعات ليبتوسبيرا بدقة. وبتوسيع الدراسات^{السابقة} 17,35,36، تظهر أن التجارب المنسقة والمعيارية تكشف عن ظواهر غير مرئية للدراسات ذات الطريقة الواحدة — مثل ارتفاع الكتلة الحيوية رغم انخفاض قابلية الحياة، أو التباين في الحركة بين الأنواع. في النهاية، يدعم هذا النهج تحليلات مقارنة وقابلة للتكرار وذات صلة وظيفية عبر الأنواع والطفرات والظروف، مما يوفر أساسا لتصميم استراتيجيات علم الأحياء الدقيقة الميكانيكية، والمرونة البيئية، وتصميم استراتيجيات الأغشية المضادة للأغشية الحيوية.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 & غشاء بولي كربونات مائي معقم	it4IP	1000M25/861N101/13
غطاء زجاجي معقم بقطر 12 مم	SPL	330164
16٪ بارافورمالديهايد (PFA)	ثيرمو ساينتفيك	28908
إبرة 21G	BD Medical	304432
الصفيحة الصغيرة ذات 24 بئر	NUNC	143982
طبق زجاجي قاع بقطر 35 مم	إيبيدي	81218-200
طبق Hi-Q4 الزجاجي السفلي بقطر 35 مم	إيبيدي	81156
صفيحة دقيقة ببئر 96	NEST	701001
وسيط تركيب مضاد التلاشي	بيوراد	29410
طبقة الطلاء الكربوني	لايكا مايكروسيستيم	Em ACE600
متتبع CFDA/SE	الأسطورة الحيوية	423801
لاصق الكربون الموصل	علم المجهر الإلكتروني	77816
البنفسج الكريستالي (CV)	سيغما	C3886
مجهر الحقل المظلم	لايكا مايكروسيستيم	11888846	Leica DM4000 B مجهزة بمكثف مكثف داكن (الفئة n°؛ 11505142)
الإيثانول	VWR للكيماويات	83813.36
FM4-64	إنفيتروجين	T3166
حمض الخليك الجليدي	سوبيلكو	1.00063
محلول غلوتارالديهايد	سيغما-ألدرتش	G5882
هيكساميثيلديسيلازان	أكروس أورجانيكس	120581000
الحاضنة	ميمرت	IN30
المجهر الكونفوكلي المقلوب	لايكا مايكروسيستيم	لايكا DMI6000 TCS SP8 X	المجهر الكونفوكال SP8
مجهر مقلوب مزود ببصريات التباين الطوري	نيكون	CELL-S2	بيوستييشن IM-Q
ليبتوسبيرا متوسط القاعدة EMJH	بيكتون ديكنسون	BD  279410	وسط EMJH لليبتوسبيرا
رباعي أكسيد الأوزميوم (OsO4)	سيغما	BCCG9181
بروبيديوم يوديد	البيوتيوم	40017
المجهر الإلكتروني الماسح	جيول	JSM-IT300
مخزن كاكوديلات الصوديوم	الكيمياويات العلمية الحرارية	15453149
مقياس الطيف Varioskan Lux	ثيرمو ساينتفيك	VLBL00GD0
محلول ملحي معقم مع فوسفات	بيوسولف	0016232301BS
حقنة (1 مل)	تشيرانا	CH03002L
صبغة حمض النووي الفلورية الخضراء SYTO9	إنفيتروجين	S34854