مقالة منهجية

تصوير فائق الدقة للخلية بالكامل عبر DNA-PAINT على قرص دوار مع إعادة تعيين فوتونات بصرية

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69531

⸱

يناير 6, 2026

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول إجراء إجراء المجهر العميق لتحديد الموقع لجزيء واحد (SMLM) باستخدام مجهر كونفوكال قرصي دوار مع إعادة تعيين فوتونات بصرية، مما يمكن تصوير DNA-PAINT دون الحاجة إلى بصريات مخصصة أو إضاءة معقدة.

الملخص

يتيح مجهر تحديد الموقع لجزيء واحد (SMLM) التصوير على نطاق نانوي للهياكل الخلوية، لكنه عادة ما يقتصر على التصوير بالقرب من الانزلاق الداخلي بسبب محدودية التألق الداخلي الكلي (TIRF) والإضاءة عالية الميل والإضاءة البصرية (HILO). هنا، يتم تقديم بروتوكول يستخدم مجهر كونفوكي قرصي دوار مزود بإعادة تعيين فوتونات بصرية (SDC-OPR) لإجراء SMLM في خلايا كاملة. تمكن هذه الطريقة من التصوير الجزيء الواحد بدقة عالية عبر كامل حجم الخلية باستخدام تراكم نقاط الحمض النووي للتصوير في الطبوغرافيا النانوية (DNA-PAINT) دون الحاجة إلى بصريات مخصصة أو أنظمة إضاءة معقدة. يوفر البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لتكوين مجهر قرص دوار متوفر تجاريا (مثل CSU-W1 SoRA) لتصوير SMLM، بما في ذلك معاملات الاستحواذ المحسنة للتصوير العميق. تم تحديد خطوات تحضير العينات لوضع علامات على الأهداف داخل الخلية باستخدام مجسات متقاربة بالحمض النووي لإجراء تصوير DNA-PAINT، بما في ذلك استراتيجيات التصوير متعدد الألوان لعدة أهداف. يتبع اكتساب الصور تحديد موقع جزيء واحد وإعادة بناء باستخدام حزم برمجية قياسية. كما تناقش الاعتبارات الحيوية لتقليل الخلفية، وتحسين الدقة الجانبية، وضمان جودة التصوير عبر عمق الخلية الكامل. يتيح هذا البروتوكول المتاح للباحثين إجراء SMLM عميق وكامل الخلايا باستخدام معدات كونفوكال قياسية، مما يوسع نطاق الأسئلة البيولوجية التي يمكن معالجتها من خلال التصوير الجزيء الواحد إلى ما وراء المناطق القريبة من الغشاء.

المقدمة

المجهر التوطين للجزيء الواحد (SMLM)1 هو عائلة من تقنيات الدقة فائقة التي تحقق الدقة على المستوى النانوي عن طريق فصل انبعاث الفلوروفورات الفردية وتحديد موقعها بدقة عالية. يتطلب SMLM الناجح نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (SNR) لاكتشاف أحداث جزيء واحد، وهو ما كان تقليديا يقتصر استخدامه على الإعدادات البصرية التي توفر إثارة مكثفة ومحلية. أكثر التكوينات شيوعا هي المجهر الانعكاسي الداخلي الكلي (TIRF)2 والإضاءة البصرية المصفحة عالية الميل (HILO)3. يقلل TIRF من الفلورة الخلفية من خلال إنشاء حقل متلاشي يحث الفلوروفورات بشكل انتقائي ضمن بضعة نانومتر من الانزلاق الداخلي، مما يقلل من الإضاءة خارج نطاق التركيز. ومع ذلك، يجعل هذا القيد TIRF غير مناسب لتصوير البنى البيولوجية الأعمق، مثل العضيات التي تمتد إلى المجال خارج الخلية. يوفر المجهر هيلو أعماق اختراق أكبر، مما يسمح بالتصوير على بعد عدة مئات من النانومترات فوق الركيزة الزجاجية. يأتي ذلك على حساب تقليل مجال الرؤية (FOV)4 وإضاءة غير متساوية مع مستويات أعلى متزايدة، مما يحد من قابليتها للتطبيق على البنى الخلوية الأكبر. مؤخرا، وسعت تقنيات المجهر الصفائح الضوئية (LSM) مثل المجهر الضوئي الشبكي 5,6,7 ومجهر الإضاءة ذات المستوى الواحد (soSPIM)8 إلى تصوير الحجم وتصوير الأنسجة. من خلال تشكيل شعاع الإثارة إلى صفائح ضوئية رفيعة ومنظمة، تحقق LSM تقسيمات بصرية مع تقليل السمية الخلفية والضوء. يلتقط SoSPIM مستويات البؤرة المتعامدة على محور الكشف في تعريض واحد، مما يتيح التصوير الحجمي السريع بدقة شبه متساوية الاتجاه. أظهر تطبيق soSPIM تقنية SMLM ثلاثية الأبعاد في خلايا كاملة وعضيات صغيرة (>عمق 20 ميكرومتر) بدقة متساوية الخواص تصل إلى 40 نانومتر،ومع خلفية خارج التركيز قليلة جدا 9. على الرغم من قوتها، تتطلب هذه الطرق عادة عينات شفافة، وبصريات متخصصة، ومحاذاة معقدة، وتظل حساسة للانحرافات البصرية والتشتت في العينات الأكثر سمكا.

يقدم المجهر الكونفوكلي بديلا من خلال رفض الضوء خارج البؤرة باستخدام ثقب صغير أمام الكاشف، مع مرايا المسح الشعاعي10. تتيح هذه القدرة على تقسيم الأجزاء البصرية التصوير الحجمي العميق مع نسبة ضوضاء عالية في الضوضاء. على وجه الخصوص، يجمع المجهر الكونفوكال القرصي الدوار (SDC) بين سرعة واكتشاف المجال الواسع للتصوير التقليدي وقدرة التقسيم في أنظمة المسح النقطي. يتم تحقيق ذلك في SDC التقليدي من خلال دمج قرص دوار بنمط ثقوب متوازية، غالبا ما يجمع مع مصفوفة عدسات دقيقة محاذاة. تجمع العدسات الدقيقة جزءا كبيرا من الفلورة المنبعثة وتركز عبر الثقوب الصغيرة، مما يقلل من الإشارة الخلفية. يوفر هذا التكوين تقسيما بصريا سريعا دون الحاجة إلى بصريات متخصصة أو تحضير إضافي لتركيب العينات، مما يجعله خيارا قويا يمكن تنفيذه وتحسينه بسهولة لالتقاط صور SMLM الحجمية العميقة11.

في هذه الدراسة، تم استخدام وحدة الماسح الكونفوكال الدوارة CSU-W1 المجهزة بإعادة تعيين الفوتونات البصرية (SDC-OPR). على عكس SDC القياسي، يقدم SDC-OPR مصفوفة عدسات دقيقة ثانية تسقط الفوتونات المنبعثة على نمط ثقب مكملرقم 12، لتقليل التشتت واستعادة الفوتونات التي كانت ستتخلص من عادة. هذا التحويل الفوتوني يحسن فعليا دالة انتشار النقاط (PSF)، مما يعزز الدقة الجانبية تتجاوز SDC التقليدي مع رفض الضوءالخارج عن التركيز 13. على وجه التحديد، تقوم مصفوفة العدسات الدقيقة SDC-OPR بإعادة توجيه الفوتونات خارج المحور إلى أقرب نقاط منشأها، مما يزيد من السطوع الفلوري المكتشف مقارنة ب SDC القياسي. علاوة على ذلك، يمكن تضخيم فوائد الدقة ل SDC-OPR من خلال فك الالتفاف في الصورة. تقوم خوارزميات فك الالتفاف التكراري بتحسين PSF حسابيا، وتقليل الخلفية، وتحسين نسبة الإشارة إلى الخلفية دون الحاجة إلى تغييرات في التكوين البصري. يوفر هذا النهج المشترك ميزة كبيرة من حيث دقة تحديد المواقع مقارنة ب SDC القياسية لتجارب تحديد الموقع لجزيء واحد14.

هنا، يعرض بروتوكول قوي وقابل للتكرار لمجهر تحديد الموقع للجزيء الواحد باستخدام مجهر كونفوكال قرصي دوار مزود بإعادة تعيين الفوتونات البصرية (SDC-OPR). يجمع هذا النهج بين دقة DNA-PAINT على المستوى النانوي مع السرعة ومجال الرؤية والعمق في تصوير الأقراص الدوارة. يعتمد DNA-PAINT، وهو تعديل لتراكم النقاط لتصوير الطبوغرافيا النانوية (PAINT)15، على التهجين المؤقت لخيوط "المصور" الموسومة بالفلورية مع خيوط "التحام" المكملة المثبتة على الأهداف الجزيئية. تولد هذه الأحداث القابلة للعكس إشارات فلورية عشوائية يمكن تحديدها بدقة، مما يمكن من إعادة بناء البنية الفائقة الخلوية بدقة عالية. يتيح DNA-PAINT استخدام الفلوروفورات عالية الاستقرار الضوئي، ويوفر حركيات ربط قابلة للضبط للتحكم الدقيق في ظروف التصوير، ويخفف من التبييض الضوئي من خلال التجديد المستمر لسلاسل التصوير الفلوري16.

لضمان قابلية التكرار والنوعية، يعتمد النهج على مرافق أجسام مضادة مخصصة للحمض النووي تربط خيوط الالتحام بالأجسام المضادة الثانوية. تم تقديم خطوات تحضير العينة التفصيلية، بما في ذلك اقتران الأجسام المضادة والحمض النووي، لدعم نتائج تجريبية قوية. يتم التحقق من صحة البروتوكول على البنى الخلوية المميزة جيدا مثل مجمعات المسام النووية (NPCs)17 والأنابيب الدقيقة في عينات ثابتة، مما يوفر نقطة مرجعية لتقدير دقة إعادة البناء. يتم تقييم التغيرات في الدقة، التي يتم قياسها بدقة تحديد الموقع كبديل، بشكل إضافي كدالة لمجال الرؤية وعمق التصوير.

بالإضافة إلى ذلك، يتم إثبات كفاءة هذا السير في التصوير متعدد الإرسال باستخدام استراتيجية Exchange-PAINT18، وهي استراتيجية تتيح التصور التسلسلي لأهداف متعددة باستخدام نفس الصبغة ومصدر ليزر واحد مبني على DNA-PAINT. يتم تطبيق سير عمل Exchange-PAINT على التصوير متعدد الألوان فائق الدقة للميتوكوندريا، والأنابيب الدقيقة، والخلايا غير القابلة للعب داخل نفس العينة.

معا، يوفر هذا البروتوكول إرشادات شاملة وملاحظات رئيسية للتكيف حول اقتران الأجسام المضادة والحمض النووي، وتحضير العينات، وحالات التصوير، وتحليل البيانات، مما يمكن الباحثين من إجراء تصوير DNA-PAINT القابل للتكرار على SDC-OPR. من خلال توسيع التصوير عالي الدقة إلى ما هو أبعد من حدود العمق ومجال الرؤية في الأساليب القائمة على TIRF، توسع هذه الطريقة قابلية تطبيق SMLM ليشمل مجموعة واسعة من السياقات البيولوجية.

البروتوكول

المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المخازن

  1. تحضير الهيكل الخلوي (CB):
    1. جهز 10 مللي مولار MES (pH 6.1) مع 150 ملليمولار NaCl، 5 ملليمول EGTA، 5 ملليمول دي-جلوكوز، و5 ملليمولار ملغ كلير2 في محلول فوسفات مفلتر 1x (PBS).
    2. خزن عند 4 درجات مئوية وقم بالفلتر قبل الاستخدام.
  2. تحضير مخزون حمض البروتوكاتشويك (PCA) ب 40x:
    1. قم بإذابة 154 ملغ من PCA في 10 مل من الماء المقطر والمصفى.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.0 باستخدام NaOH.
    3. أليكوت وخزنها عند -20°م لمدة أقصاها 6 أشهر.
      ملاحظة: إذا ظهر أي أليكوت باللون البني، تخلص منه، لأن ذلك يشير إلى الأكسدة.
  3. تحضير مخزون 100x من بروتوكاتشوات-3,4-ديوكسيجيناز (PCD):
    1. حضر محلول جليسرول بنسبة 50٪ يحتوي على 50 ململ KCl، و1 ملليمول EDTA، و100 ملليمول من محلول تريس.
    2. قم بإذابة 2.2 ملغ من PCD في 3.4 مل من محلول الجلسرول.
    3. أليكوت وخزن عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر كحد أقصى.
  4. تحضير مخزون ترولوكس 100x:
    1. قم بإذابة 50 ملغ من ترولوكس (6-هيدروكسي-2,5,7,8-تتراميثيلكرومان-2-حمض كربوكسيل) في 215 ميكرولتر ميثانول حتى يتحول المحلول إلى اللون الأخضر داخل غطاء بخار كيميائي باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).
    2. أضف 1.6 مل من الماء المقطر والمصفى. دع المحلول يتحول إلى اللون الأبيض ويبدأ في التصلب.
    3. أضف 175 ميكرولتر من 1M NaOH 1M. دع المحلول يبدأ بالتحول إلى سائل مرة أخرى.
    4. في حجم 10 ميكرولتر، استمر في إضافة 1 M NaOH حتى يتم توضيح المحلول تماما (حوالي 40 ميكرولتر).
    5. أليكوت وخزن عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر كحد أقصى. الحل النهائي يبدو مائلا إلى اللون الأصفر.
      ملاحظة: المحلول النهائي بمقدار 100x له pH 11، لكن التخفيف إلى 1x ينتج pH بين 7-8.
  5. مخزن C+
    1. حضر محلول 1 مللي مولار EDTA، و500 ملليمول NaCl، و0.02٪ محلول Tween-20 في 1x PBS.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl و/أو NaOH حسب الحاجة.
    3. مكمل ترولوكس اختياري: أضف كميات مطلوبة من مخزون PCA (40x)، PCD (100x) وTrolox (100x) ليؤدي إلى تخفيف 1x، واترك المحلول ليتوازن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (23 °م) قبل الاستخدام.
      ملاحظة: حضر طازجا أسبوعيا. إذا كنت تستخدم ترولوكس، استخدمه خلال 4 ساعات من الخلط.
  6. مخازلات التلوين المناعي (بارافورمالديهايد PFA، جلايسين، وتريتون):
    1. لتحضير 4٪ من PFA من أمبولة PFA بوزن 10 مل 16٪:
      1. داخل غطاء أبخرة كيميائي، افتح الأمبولة بعناية.
      2. أطلق 10 مل من 16٪ PFA في أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم 50 مل.
      3. قم بتخفيف بنسبة 1:4 في 1x PBS للحصول على 4٪ PFA، مع إضافة ~30 مل من PBS المفلتر 1x إلى PFA المغلق 16٪، بحيث يكون الحجم النهائي ~40 مل.
      4. أليكوت في أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1 مل وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
    2. بالنسبة ل60 ملليموتر جلايسين في تحضير PBS:
      1. ازن 225 ملغ من الجليسين في أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم 50 مل.
      2. أضف 50 مل من PBS مفلتر 1x.
      3. دوامة حتى يتم خلطها بالكامل وتصفية.
      4. خزن عند 4 درجات مئوية حتى الحاجة المطلوبة.
    3. لتحضير 0.1٪ لترايتون X-100:
      1. أولا، جهز مخزون عمل من 10٪ ترايتون X-100 عن طريق تخفيف 1 مل من ترايتون X-100 بنسبة 100٪ إلى 9 مل من PBS مفلتر 1x (الحجم النهائي = 10 مل)، ثم استخدم الماصة وامزج ببطء لمنع زيادة الفقاعات. خزن عند 4 درجات مئوية حتى الحاجة المطلوبة.
      2. من المخزون العامل بنسبة 10٪، أضف 0.1 مل من 10٪ ترايتون X-100 إلى 9.9 مل من PBS مفلتر مرة واحدة للمخزون النهائي 0.1٪، ثم امزج ببطء مرة أخرى. خزن عند 4 درجات مئوية حتى الحاجة المطلوبة.

2. اقتران الأجسام المضادة والحمض النووي

  1. تركيز الجسم المضاد باستخدام وحدة مرشح طرد مركزي فائق الترشيح بقوة 100 كيلو دالتون:
    1. اغسل وحدة فلتر الطرد المركزي فائق الترشيح بقدرة 100 كيلو دالتون مع 100 ميكرولتر من فلتر PBS مفلتر 1x لمدة 30 دقيقة عند 14,000 جرام و4 درجات مئوية.
    2. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد مع 200 ميكرولتر من PBS مفلتر 1x إلى وحدة مرشح الطرد المركزي فائق الترشيح بقوة 100 كيلو دالتون التي تم غسلها مسبقا، وادار لمدة 30 دقيقة عند 14,000 × جم، 4° مئوية. تأكد من أن تركيز الأجسام المضادة يزيد عن 1.5 ملغ/مل بعد التركيز باستخدام مرشح الطرد المركزي فائق الترشيح. بهذه الطريقة، عادة ما يركز مرشح الطرد المركزي فائق الترشيح الجسم المضاد بمقدار ~3x.
    3. اقلب وحدة المرشح الطرد المركزي فائق الترشيح بقوة 100 كيلو دالتون إلى أنبوب نظيف، وادور لمدة 6 دقائق عند 1000 x جم، و4 درجات مئوية. هذا هو الجسم المضاد المركز في PBS.
    4. قس حجم الأجسام المضادة المركزة (1 أو 2 ميكرولتر) لحساب التركيز الجديد وتشغيل طيف امتصاص UV-Vis باستخدام مطياف UV-Vis ميكروحجم. اضبط الخلفية على 1x PBS واحفظ الأطياف.
  2. تقليل شريط الالتحام الحمض النووي المثير:
    1. قم بإذابة 7.7 ملغ من DTT الموزن مسبقا في 100 ميكرولتر من الماء المفلتر، ثم انقله إلى أنبوب جديد.
    2. أضف 100 ميكرولتر من 3 مللي مولار EDTA في 1x PBS إلى أنبوب DTT الأصلي، الدوامة، وانتقل إلى نفس الأنبوب في الخطوة 2.2.1، مما ينتج 200 ميكرولتر من 250 ملليمولار DTT في 1.5 مللي مولار EDTA في 1x PBS.
    3. قم بإذابة سلسلة الالتحام الحمض النووي المثيرة إلى 1x PBS مفلتر لتركيز نهائي يبلغ 1 مللي مول. سجل طيف UV-Vis لمحلول خيوط الربط في الحمض النووي (مخفف إلى 10 ميكرومولار في 1x PBS) وحفظه باستخدام مطياف UV-Vis الميكروحجمي.
    4. اخلط 13 ميكرولتر من الحمض النووي المائل (1 مللي مول) مع 30 ميكرولتر من DTT (250 مللي م)، ورجها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية).
      ملاحظة: تخزين أي خيوط ربط DNA غير مستخدمة في 13 ميكرولتر على درجة حرارة -20 °م للتفاعلات المستقبلية.
  3. اقتران الأجسام المضادة مع الرابط المتقاطع:
    1. قم بإذابة رابط متقاطع لاستير ماليميد-PEG2-سوكسنيميديل في DMSO إلى 10 ملغ/مل (23.5 ملميول). خزن في 10 ميكرولتر أليكوات عند -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
    2. امزج الأجسام المضادة المركزة من الخطوة 2.1 مع زيادة 20 ضعف الضرس من الرابط المتقاطع. حضن لمدة 90 دقيقة، مع هز، عند 4 درجات مئوية.
  4. تصفية الأجسام المضادة بترشيح الرابط المتقاطع باستخدام عمود إزالة الملح للدوران بقدرة 7.0 كيلو دالبير يحتوي على راتنج استبعاد الحجم (قطع وزن جزيئي 7 كيلو دالتون):
    1. قم بإزالة الإغلاق السفلي لعمود إزالة الأملاح الدورانية بقوة 7.0 كيلو دالتون وفك الغطاء. ضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1500 × g، 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: حدد ميل الراتنج بعد الدوران الأول. لجميع الاستخدامات اللاحقة للعمود، ضع الميل مواجها مباشرة للخارج على جهاز الطرد المركزي. ضع عينات وغسولات في المركز وتجنب ملامسة سرير الراتنج.
    2. أضف 300 ميكرولتر من PBS المصفاة 1x إلى فلتر عمود إزالة الملح الدوراني بقوة 7.0 كيلو دالتون، ثم فك الغطاء، وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1500 x g، و4 درجات مئوية. كرر ذلك مرتين إضافيتين.
      ملاحظة: اترك عمود إزالة الملح الدوراني بقوة 7.0 كيلو داما مع 300 ميكرولتر من 1x PBS حتى يصبح تفاعل الأجسام المضادة والرابط جاهزا؛ لا تدع العمود يجف.
    3. أزل آخر 300 ميكرولتر من غسيل PBS عن طريق الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة عند 1500 × جرام و4 درجات مئوية.
    4. ضع محلول الأجسام المضادة ورابط الربط على مركز طبقة الراتنج باتجاه القطرة. ضع عمود إزالة الملح بقوة 7.0 كيلو دالتون في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف، وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1500 × جرام و4 درجات مئوية. منتج الأجسام المضادة والرابط المتقاطعة موجود الآن في أنبوب الطرد المركزي الدقيق؛ حافظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد.
  5. تنقي خليط DNA-DTT باستخدام أعمدة الدوران الخالية من الملح باستخدام Sephadex G-25 (راتنج استبعاد الحجم لتنقية DNA):
    1. تقوم دوامة بإزالة الملح من أعمدة الدوران (تنقية الحمض النووي) بحيث يكون الراتنج موزعا بشكل متساو. قم بإزالة الإغلاق السفلي وفك الغطاء، وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف.
    2. إزالة الأملاح المركزية لأعمدة الدوران (تنقية الحمض النووي) بضغط 735 × جرام لمدة دقيقة واحدة لإزالة حاجز التخزين.
    3. ضع أعمدة الدوران الخالية من الملح (تنقية الحمض النووي) في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف خليط DNA/DTT ببطء إلى مركز الراتنج. الطرد المركزي عند 735 × g لمدة دقيقتين. الحمض النووي المنقى والمخفض سيكون الآن في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
  6. اجمع بين الحمض النووي ومنتجات الأجسام المضادة والروابط المتقاطعة:
    1. أضف الحمض النووي المختزل إلى ناتج الأجسام المضادة والرابط المتقاطع عند زيادة 10 أضعاف زائد مولي من الأجسام المضادة DNA. امزج الحمض النووي المنقى مع منتج الأجسام المضادة والرابط المتقاطعة فور التنقية. وهذا يمنع الحمض النووي من إعادة الارتباط.
    2. حضن الغرفة طوال الليل، مع هز، عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: اخلط الحمض النووي مع الجسم المضاد في وقت متأخر من بعد الظهر وقم بتنقيه فورا في صباح اليوم التالي. الحضانة الممتدة للحمض النووي والأجسام المضادة يمكن أن تؤدي إلى ارتفاع نسبة الحمض النووي إلى الأجسام المضادة.
  7. إزالة الحمض النووي الزائد باستخدام وحدة مرشح طرد مركزي فائق الترشيح بقدرة 100 كيلو دالتون في صباح اليوم التالي:
    1. اغسل وحدة المرشح الطرد المركزي بقدرة 100 كيلو دالتون بسعة 300 ميكرولتر من PBS مفلتر 1x لمدة 30 دقيقة عند 14,000 × جم، و4 درجات مئوية.
    2. أضف خليط الأجسام المضادة للحمض النووي مع 300 ميكرولتر من PBS المفلتر 1x إلى وحدة المرشح الطرد المركزي فائق الترشيح بقوة 100 كيلو دالتون، وادور لمدة 30 دقيقة عند 14,000 x جم، و4 درجات مئوية.
    3. اقلب وحدة فلتر الطرد المركزي فائق الترشيح إلى أنبوب نظيف، وادور لمدة 6 دقائق عند 1000 × جرام و4 درجات مئوية. هذا هو المنتج المركز في PBS.
    4. تخفيف المنتج إلى 100 ميكرولتر في PBS مفلتر 1x.
    5. سجل طيف UV-Vis للناتج (1 أو 2 ميكرولتر) باستخدام مطياف UV-Vis الميكروحجم، مع خلفية 1x PBS، وحفظ الأطياف.
    6. قس التركيز النهائي ونسبة الحمض النووي إلى الأجسام المضادة من الأطياف. لاحظ تحولا في ذروة امتصاص الجسم المضاد من 280 نانومتر إلى 260 نانومتر، بسبب الامتصاص الإضافي من الحمض النووي. استخدم الخطوة 2.8 لتحديد التركيز ونسبة الحمض النووي إلى الأجسام المضادة.
    7. تخزين المنتج في ظروف التخزين الأصلية للأجسام المضادة المستخدمة. إذا كنت في حالة تجمد، تجنب دورات التجمد والذوبان.
  8. احسب نسبة الحمض النووي إلى الأجسام المضادة من أطياف الأشعة فوق البنفسجية-البصرية:
    1. من أطياف الحمض النووي النقي (10 ميكرومولار في 1x PBS)، قس قيم الامتصاص عند 260 نانومتر () و280المعادلة 1 نانومتر (المعادلة 2). اقسمها على تركيز الحمض النووي (10 ميكرومولار) لإيجاد معاملات الامتصاص المولية للحمض النووي (المعادلة 3 و المعادلة 4).
    2. كرر العملية للجسم المضاد ليجد المعادلة 5 و المعادلة 6، مع تذكر القسمة على تركيز الأجسام المضادة المستخدمة في الأطياف.
    3. من أطياف المنتج، يعتمد الامتصاص عند 260 نانومتر و280 نانومتر على كل من امتصاص الحمض النووي والجسم المضاد:
      المعادلة 7
      المعادلة 8
      حيث يكون cDNA و cAb تركيزات الحمض النووي والأجسام المضادة على التوالي داخل المنتج النهائي. حل هذه المعادلات في نفس الوقت لإيجاد التركيز المولاري لكل من الحمض النووي والأجسام المضادة داخل المنتج. احسب نسبة الحمض النووي إلى الأجسام المضادة باستخدام هذه التراكيز.
      ملاحظة: يمكن حساب تركيز الجسم المضاد للأطياف الأولى بقياس حجم الجسم المضاد المتبقي بعد الترشيح باستخدام وحدة مرشح الطرد المركزي فائق الترشيح بقوة 100 كيلو دالتون ومقارنتها بالحجم الأصلي (بتركيز معروف) للأجسام المضادة المستخدمة.

3. زراعة الخلايا

  1. خلايا HeLa Kyoto mEGFP-Nup107.
    1. جهز مخزونا من وسط زراعة الخلايا، وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو، مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) و1٪ بنسلين/ستربتوميسين (P/S)، وخزنها عند 4 درجات مئوية. قم بتسخين الوسط مسبقا قبل الاستخدام ب30 دقيقة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. اعتمادا على ظروف العمل، ينصح بتقسيم وتصفية الكمية اللازمة لمنع التلوث.
    2. خلايا البذور بحجم 2 × 105 خلايا/مل في 7 مل من وسائط DMEM المكملية مسبقا في قوارير T25. ضع قوارير الخلايا في حاضنة مناسبة عند 37 درجة مئويةوبيئة 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون.
    3. تأكد من المرور كل 48-72 ساعة لتجنب الازدحام.
      1. خذ قارورة T25 التي تحتوي على الثقافة المتلاقية ووسائط الشفط من القارورة.
      2. بيبت 1 مل من تريبسين EDTA (TE)، لضمان التغطية الكاملة بإمالة القارورة بلطف. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق للسماح بانفصال الخلية عن القارورة.
      3. أضف 2 مل من مادة DMEM المكملة وقم بتقسيم الثلاثة.
      4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم 15 مل مع إضافة 7 مل إضافية من وسط DMEM المكمل.
      5. الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق. تحقق بعناية من وجود تكون الحبيبات في أسفل الأنبوب دون إزعاجه.
      6. استنشاق وسط وإعادة تعليق الحبيبات الخلوية في وسط DMEM مكمل.
      7. زرع 2 ×10 خلايا/مل في قارورة T25 جديدة تحتوي على 7 مل من وسط مشمس مسبقا. الحضانة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
        ملاحظة: إذا لم تكن متأكدا من كثافة الخلايا، يمكن استخدام جهاز قياس الدم لتحديد عدد الخلايا. يوصى بالبدء بتعليق حبيبات بسعة 1 مل قبل العد.
  2. خلايا U2OS CRISPR mEGFP-Nup96
    1. جهز مكمل 10٪ FBS و1٪ P/S مع مكونة من 5A لمكوي، وفقا للخطوة 3.1.1.
    2. خلايا بذور بحجم 2 × 105 خلايا/مل في 7 مل من وسط مكوي 5A المكمل في قوارير T25. الحضانة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    3. المرور كل 48 ساعة للحفاظ على نمو الزراعة أقل من 80٪ من التقاء الجمع:
      1. استنشق الوسائط من القارورة وغسل الثقافة الملتصقة بلطف ب 2 مل من المحلول المصفى مسبقا التسخين (37 درجة مئوية) 1x PBS.
      2. استنشق PBS وأضف 2 مل من أكيوتاز، ثم قم بإمالة القارورة ببطء لضمان التغطية الكاملة، ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
      3. أضف 2 مل من مكوي 5A مكمل وقم بالتثبيت.
      4. أضف 7 مل من الوسائط إلى تعليق الخلية وانقله إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي بسعة 15 مل أو 50 مل للطرد المركزي. استخدم جهاز الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق وتحقق من وجود الحبيبات في أسفل الأنبوب.
      5. أعد تعليق حبيبات الخلية في مكملة مكوي 5A.
      6. زرع البذور بمقدار 2 × 10خلايا /مل في قارورة T25 جديدة مع وسط مسبق تسخين بحجم 7 مل. الحضانة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
        ملاحظة: سخن جميع المحاليل المضافة إلى الخلايا إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء أو خرز. بالنسبة لأكيوتاز، سخن فقط 2 مل من الليكوت لمدة لا تزيد عن 5 دقائق لتجنب التحلل.

4. صبغ المناعة ل Nup96، الميتوكوندريا، والأنابيب الدقيقة

  1. تحضير خلايا U2OS mEGFP-Nup96
    1. باتباع الخطوات الموضحة في الخطوة 3.2، استنشق الوسائط من قارورة T25 وغسل الخلايا الملتصقة بلطف بمقدار 2 مل من PBS مفلتر 1x.
    2. استنشق PBS وأضف 2 مل من أكيوتاز، ثم قم بإمالة القارورة ببطء للأعلى والأسفل، وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لتعزيز انفصال الخلايا.
    3. أضف 2 مل من مكوي 5A مكمل وقم بالتثبيت.
    4. تعليق الخلية العليا مع 7 مل من وسط ماكوي 5 أمبير ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي بقطر 15 مل أو 50 مل قبل الطرد المركزي عند 400 x g لمدة 5 دقائق. مرة أخرى، تحقق من وجود الحبيبات في أسفل الأنبوب.
    5. أعد تعليق حبيبات الخلية في مكملة مكوي 5A.
    6. تزرع الخلايا بحجم 1 ×10 خلايا /مل في شرائح دقيقة ب 8 آبار وتحتضن في حاضنة الخلايا (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2) خلال الليل.
      ملاحظة: خلايا البذور قبل 24 ساعة من إجراءات التثبيت والتلوين المناعي، للسماح بالالتصاق.
  2. صبغ خلايا U2OS mEGFP-Nup96 المناعية لتصوير Nup96
    1. بعد الحضانة الليلية، استبدل وسائط 5A من ماكوي في شرائح الميكروسلايد ذات 8 آبار ب PBS مفلتر 1x. بسرعة، استنشق PBS وأضف محلول تثبيت PFA 4٪ المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) في غطاء بخار كيميائي.
    2. اترك الخلايا لتثبت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية)، ويفضل أن يكون ذلك داخل غطاء البخار الكيميائي، قبل غسل PFA والتخلص من الفضلات. يمكن الآن تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.
    3. أزل محلول تثبيت PFA بنسبة 4٪ واغسل الشريحة 3 مرات 3 دقائق باستخدام 1x PBS.
      تحذير: استخدم PFA في غطاء بخار كيميائي أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    4. بعد التثبيت، قم بنفاذ منفذ غشاء الخلية بإضافة 0.1٪ من ترايتون X-100 في محلول 1x PBS. اتركه لمدة 5 دقائق، ثم اغسل 3 × 3 دقائق مع 60 ملليموتر جليسين في 1x PBS، لتهدئة التألق الذاتي لبقايا PFA.
      ملاحظة: محلول نفاذية ترايتون حساس جدا للوقت وقد يغير سلامة بنية الخلية إذا ترك لفترة طويلة.
    5. أضف 5٪ من BSA في 1x PBS لمدة ساعة واحدة في الظلام، لمنع الخلايا قبل الصبغ المناعي.
    6. تحضير 20 نانومتر من الجسم النانوي المضاد ل GFP المتراكب بالحمض النووي في محلول حجب (5٪ BSA في 1x PBS) لمنع حجب الارتباط غير النوعي. حضن الشريحة مع خليط الجسم النانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية)، ثم اغسل خيوط الحمض النووي غير المرتبطة 3 × 3 دقائق باستخدام PBS مفلتر واحد.
      ملاحظة: نقطة التوقف: بعد التثبيت، والحجب وإضافة الأجسام المضادة، يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية طوال الليل. يتم تضمين نقطة التوقف هذه أساسا بسبب الوقت المطلوب لتحضير العينة، وليس كونه ضرورة صارمة للبروتوكول. يمكن إجراء التصوير فورا بعد هذه الخطوات إذا رغب ذلك.
  3. صبغ المناعة لخلايا U2OS mEGFP-Nup96 لتصوير الميتوكوندريا والأنابيب الدقيقة
    1. بعد الحضانة الليلية، استبدل وسط DMEM في شرائح الميكرو سلايد ذات 8 آبار ب 200 ميكرولتر من 0.3٪ جلوتارالديهيد و0.25٪ ترايتون X-100 في مخزن الهيكل الخلوي (CB) واترك لمدة دقيقتين للتثبيت المسبق.
    2. استبدل محلول التثبيت المسبق بمحلول الهيكل الخلوي (CB) مع إضافة 2٪ جلوتارالديهايد. اتركها لمدة 10 دقائق لتثبيت الخلايا، ثم اغسل الشريحة 3 × 3 دقائق ب 60 مللي مولار جلايسين في PBS، كما في الخطوة 4.2.4.
      تحذير: استخدم جلوتارالديهايد في غطاء أبخرة كيميائي أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    3. أضف حمض سلمون مقطوع الحمض النووي للحيوانات المنوية بمقدار 3٪ من BSA في 1x PBS لمدة ساعة واحدة في الظلام، لمنع الخلايا قبل الصبغ المناعي.
    4. أضف 5 ميكروغرام/مل من مضاد التوبولين المقترن بالحمض النووي (مقترن كما هو موضح أعلاه) لتصوير الأنابيب الدقيقة، و/أو جسم مضاد TOM20 بقياس 1:200 لتصوير الميتوكوندريا، في 2٪ من BSA لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). اغسل 3 × 3 دقائق مع 1x PBS.
    5. أضف 25 نانومتر من مادة sdAb المضادة لIgG المرتبطة بالحمض النووي واحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). اغسل 3 × 3 دقائق مع 1x PBS.
      ملاحظة: نقطة التوقف: بعد التثبيت، والحجب وإضافة الأجسام المضادة، يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية طوال الليل. يتم تضمين نقطة التوقف هذه أساسا بسبب الوقت المطلوب لتحضير العينة، وليس كونه ضرورة صارمة للبروتوكول. يمكن إجراء التصوير فورا بعد هذه الخطوات إذا رغب ذلك.
  4. تحضير خلايا HeLa Kyoto mEGFP-Nup107
    1. استنشق الوسائط من قارورة T25 لخلايا HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 وغسل القارورة بلطف بمقدار 2 مل من PBS مفلتر 1x.
    2. استنشق PBS وأضف 2 مل من Trypsin EDTA (TE) وقم بإمالة القارورة ببطء للأعلى والأسفل، ثم حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. أضف 2 مل من مادة DMEM المكملة وقم بتقسيم الثلاثة.
    4. أضف محلول الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم 15 مل مع إضافة 7 مل إضافية من وسائط DMEM المكمل والطرد المركزي بقوة 400 × جرام لمدة 5 دقائق. تحقق من تكوين الحبيبات في أسفل الأنبوب.
    5. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في وسط DMEM المكمل.
    6. خلايا البذور بحجم 1 × 105 خلايا/مل في شرائح دقيقة ب 8 آبار.
      ملاحظة: خلايا البذور قبل 24 ساعة من التصوير.
  5. صبغ المناعة في HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 للأنابيب الدقيقة
    1. بعد الحضانة الليلية، استبدل وسط DMEM في شرائح الميكرو سلايد ذات 8 آبار ب 200 ميكرولتر من 0.3٪ جلوتارالديهيد و0.25٪ ترايتون X-100 في مخزن الهيكل الخلوي (CB) واترك لمدة دقيقتين للتثبيت المسبق.
    2. استبدل محلول التثبيت المسبق ب 2٪ جلوتارالديهيد في CB واتركه لمدة 10 دقائق لتثبيت الخلية. اغسل 3 مرات 3 دقائق مع 60 ملليموتر جلايسين بمقدار 1x PBS.
      تحذير: استخدم الجلوتارالديهايد في غطاء بخار كيميائي أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    3. أضف 5٪ من BSA في 1x PBS لمدة ساعة واحدة في الظلام، لمنع الخلايا قبل الصبغ المناعي.
    4. أضف 5 ميكروغرام/مل من مضاد التوبولين المترافق-بالحمض النووي (مترافق كما هو موضح أعلاه)، لتصوير الأنابيب الدقيقة بنسبة 5٪ BSA في 1x PBS لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). اغسل 3 × 3 دقائق مع 1x PBS.
      ملاحظة: نقطة التوقف: بعد التثبيت، والحجب وإضافة الأجسام المضادة، يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية طوال الليل. يتم تضمين نقطة التوقف هذه أساسا بسبب الوقت المطلوب لتحضير العينة، وليس كونه ضرورة صارمة للبروتوكول. يمكن إجراء التصوير فورا بعد هذه الخطوات إذا رغب ذلك.
    5. ملاحظة: عند العمل مع الأجسام المضادة البديلة أو خطوط الخلايا، قم بضبط عوامل التخفيف للأجسام المضادة المرتبطة بالحمض النووي أو الجسم النانوي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  6. تحضير التصوير
    ملاحظة: هذه الخطوة مشتركة في جميع بروتوكولات التلوين المناعي.
    1. أضف جسيمات الذهب النانوية بوزن 90 نانومتر مخففة بنسبة 1:2 في الماء منزوع الأيونات مباشرة إلى كل بئر، باستخدام حجم البئر الكامل. حضن لمدة 5 دقائق لتمكين تصحيح الانجراف المستقبلي أثناء التصوير. غسل الآبار 3 مرات مع 1x PBS.
    2. لتصوير Nup96، أضف خيط التصوير المطلوب عند 1 نانومتر في مخزن C+ مع إضافة 1x ترولوكس، 1 PCA، و1x PCD.
    3. لتبادل-PAINT للميتوكوندريا و/أو الأنابيب الدقيقة، أضف أول خيط مصور مرغوب عند 1 نانومتر في مخزن C+ فقط. بعد تصوير الجولة الأولى، اغسل العينة جيدا ولكن بحذر بعد الجولة الأولى لإزالة جميع خيوط التصوير المتبقية دون تحريك العينة. عادة، مع 5 غسولات و30 ثانية انتظار بينهما يكفي. ثم أضف خيط المصور الثاني عند 1 نانومتر في مخزن C+ فقط للجولة الثانية من التصوير.

5. إعداد التصوير ومعلماته: مجهر تحديد موقع جزيء واحد

ملاحظة: تم التقاط الصور المعروضة في هذا البروتوكول في منشأة المجهر فائق الدقة LMCB في كلية لندن الجامعية، المملكة المتحدة، باستخدام مجهر كونفوكال قرصي دوار متوفر تجاريا، مزود بكاميرا sCMOS، وتم تشغيله عبر برنامج NIS-Elements.

  1. استخدم نظام كونفوكال على قرص دوار مع إثارة متعددة البؤر وكاميرا sCMOS.
  2. شغل النظام قبل 30 دقيقة من التصوير: شغل المجهر، والكاميرا، والليزر، ثم شغل الكمبيوتر. انتظر حتى يتم تحميل برنامج NIS-Elements بالكامل.
  3. اختر وضع التصوير المناسب في NIS-Elements: القرص الدوار القياسي أو SDC-OPR SoRA فائق الدقة، قبل تعيين معلمات الاستحواذ.
  4. اختر هدف الغمر بالزيت 60× Apo NA 1.49 لتصوير SDC أو SDC-OPR لتعظيم اكتشاف أحداث جزيء واحد وتحسين المعالجة اللاحقة.
  5. اختر التكبير المناسب (1×، 2.8×، أو 4×) بناء على الهدف، وإعدادات الكاميرا، والعينة التي سيتم دراستها. عدل تقسيم الكاميرا وفقا لذلك: 1× تجميع 1× تكبير، 2× تجميع 2.8×، و4× تجميع ل4×. في هذا الإعداد، يتوافق هذا مع أحجام بكسل فعالة تبلغ 108 نانومتر ل 1× (بدون تجميع) أو 4× (4× تجميع)، و78 نانومتر ل 2.8× (2× تجميع). يتطلب التجميع للحصول على أحجام بكسل مناسبة ل SMLM، بحيث تتطابق تقريبا مع انحراف معيار PSF (عادة 100-150 نانومتر)19,20.
    ملاحظة: التكبيرات الأعلى (2.8× أو 4×) تزيد من كثافة طاقة الليزر، مما يحسن من توحيد الإضاءة. هذا يقلل من مجال رؤية، لذا يجب تعديل التقسيم بشكل متناسب (أي 2× تعريض لتكبير 2.8×؛ 4× تعريض لتكبير 4×) للحفاظ على حجم البكسل.
  6. حدد وقت التعريض لاكتساب DNA-PAINT وقم بمزامانه مع سرعة دوران القرص الدوار (قابلة للتعديل من لوحة CSU-W1). تأكد من أن سرعة الدوران هي مضاعفة لوقت التعريض، أو اضغط على زر المزامنة لمطابقة أقرب عدد دورات متوافق تلقائيا. تحقق من الشاشة بحثا عن تشوهات الشريط (striping)، حيث يشير ذلك إلى إعدادات غير متزامنة. في التجارب المقدمة هنا، تم استخدام وقت تعريض 300 مللي ثانية.
    ملاحظة: سرعة دوران أقراص SoRa المحسنة بالعدسات الدقيقة في وحدة SDC التي تدور وتزامن تؤثر على ملف إثارة الشعاع، مما يؤثر على متوسط توزيع كثافة الطاقة على المنطقة المضاءة. لهذا السبب، قد تكون هناك حاجة لأوقات تعرض أعلى مقارنة بإعدادات TIRF.
  7. قم بتكوين الطول الموجي لليزر، والطاقة، وعجلة المرشح (سيقترح نظام NIS-Elements مرشحا مناسبا). سيتم تحديد طول موجة الليزر بواسطة طيف صبغة المصور.
    ملاحظة: في هذا العمل، تم استخدام Cy3B، الذي يثار بشكل مثالي باستخدام ليزر 561 نانومتر. يوفر Cy3B أفضل نسبة إشارة إلى خلفية ل DNA-PAINT، مما يجعله الخيار المفضل لهذا التطبيق.
  8. قم بضبط قوة الليزر عبر لوحة الليزر (0٪-100٪). لتصوير DNA-PAINT، اضبط الليزر على أقصى قدرة (100٪). بالنسبة لهذا النظام، يعادل هذا 1.75 مللي واط (≈ 65 واط/سممربع) بعد الهدف للتكبير بمقدار 4×، و3 مللي واط (≈ 50 واط/سممربع) ل2×، و5 مللي واط (≈ 15 واط/سممربع) ل 1×.
    1. لتسجيل الطاقة بعد الهدف، استخدم مقياس طاقة ليزر معاير وضع المستشعر على مرحلة المجهر بالقرب قدر الإمكان من مكان مستوى العينة. احرص على تجنب ملامسة العدسة الموضوعية. سجل القدرة لكل تكوين مستخدم.
  9. ضع قطرة من زيت الغمر على هدف الزيت النظيف 60× Apo NA 1.49.
  10. ثبت العينة المحضرة (من الخطوات 4.2-4.5) على المسرح باستخدام محول المسرح. هذا مهم لتقليل الانحرافات أثناء التقاط الصورة ولمنع الحركة أثناء تبادل المخزن المؤقت، خاصة في تجارب الألوان المتعددة.
  11. انتقل إلى وضع الحقل الساطع ضمن طريقة التصوير المحددة وركز على المستوى الزجاجي باستخدام الجسيمات النانوية كمرجع. فعل نظام التركيز المثالي (PFS). نظام PFS أو نظام مشابه للحفاظ على التركيز طوال فترة الاكتساب أمر بالغ الأهمية لأن الانحرافات في الاتجاه المحوري لا يمكن تصحيحها بالمعالجة اللاحقة.
    ملاحظة: يحافظ نظام نيكون PFS على العينة في تركيز حاد من خلال مراقبة وضبط المسافة المستمرة بين مستوى مرجعي ثابت ومستوى بؤرة العينة باستخدام عدسة إزاحة وكاشف CCD خطي. من خلال العمل بشكل مستقل عن التقاط الصورة، يقوم النظام بتصحيح انحراف التركيز في الوقت الحقيقي (~ميلي ثانية).
  12. مع تفعيل PFS، اختر مستوى التصوير المطلوب. بالنسبة لخلايا U2OS mEGFP-Nup96 أو خلايا HeLa Kyoto mEGFP-Nup107، استخدم إشارة 488 GFP من الخلايا غير القابلة للطاقة الموسومة ب GFP لتحديد أسطح الخلية وتحديد المستوى البؤري الأمثل. استخدم طاقة ليزر منخفضة (~10٪ من أقصى طاقة ليزر) خلال هذه الخطوة لتجنب التبييض الضوئي.
  13. حدد اسم التجربة ومسار الحفظ. ضع علامة على مربع الوقت لتحديد الفترة، والمدة، وعدد الحلقات. للاكتساب المستمر، اضبط الفترة على No Delay وأدخل فقط عدد الحلقات، والذي يعادل العدد الإجمالي للأطر.
    ملاحظة: تأكد من أن مربع PFS في الأسفل محدد، ثم اضغط على Run. سيوفر البرنامج تلقائيا تقديرا لمدة التجربة وسيحفظ البيانات عند الانتهاء. لإيقاف التجربة قبل انتهائها، اضغط على إنهاء لحفظ التقدم الحالي، أو إلغاء التجربة لإنهاء التجربة دون حفظ.
  14. بالنسبة للبروتين الأول، احصل على 17,000-20,000 إطار مع وقت دمج 300 مللي ثانية.
    ملاحظة: يجب تحسين تركيز سلسلة التصوير في هذه المرحلة لضمان عدم تداخل إشارات الجزيئات الفردية مع توفير مواقع كافية لإعادة البناء. تشبه هذه العملية عملية الاستحواذ النموذجي على SMLM، حيث يتم ضبط تركيز جهاز التصوير لتحقيق عدد كاف من الأحداث لإعادة البناء مع تقليل التداخل. التركيز الأمثل يعتمد على البنية التي يتم تصويرها. على سبيل المثال، الهياكل ذات العلامات العالية مثل الأنابيب الدقيقة عادة ما تتطلب تركيزات أقل للصور (أقل من 1 نانومال).
  15. قم بإزالة المخزن التصويري للبروتين التالي باستخدام ماصة، مع الحرص على عدم إزعاج العينة. أثناء مراقبة العينة من خلال كاميرا المجهر، أضف بعناية 200 ميكرولتر من مخزن C+ بدون جهاز التصوير لغسل الصبغة الأولى.
  16. كرر هذه الخطوة حتى لا يتم اكتشاف إشارة فلورية من أول محلول لجهاز تصوير الحمض النووي (عادة 5 غسولات).
  17. أضف محلول تصوير ثان وتحقق من اكتشاف أحداث جزيء واحد مرة أخرى.
  18. الحصول على 17,000-20,000 إطار مع زمن دمج 300 مللي ثانية للبروتين الثاني.
  19. كرر الخطوات 5.14-5.18 لكل بروتين إضافي سيتم تصويره.
  20. للتصوير ثلاثي الأبعاد، احصل على مكدسات z بمسافة 0.5-1 ميكرومتر عبر ارتفاع الخلية الكامل. تم ذلك باستخدام بروتوكول JOB21 محدد مصمم لبرنامج الاستحواذ (عناصر NIS) الذي يصور فيديو لعدد محدد مسبقا من الإطارات في مواقع z محددة، مع الحفاظ على PSF طوال فترة الاستحواذ.
    ملاحظة: حزمة البرمجيات، إلى جانب تعليمات المستخدم التفصيلية، متوفرة ضمن بروتوكول JOB21. كما يتضمن وصف كامل للوظيفة. يمكن تحميل البرنامج، المسمى "MultiZ_DNAPaint.bin"، من تبويب المواد في المنشور. لتشغيل الوظيفة، قم بتنزيل هذا الملف واستيراده إلى مستكشف وظائف NIS-Elements، باتباع التعليمات خطوة بخطوة المقدمة.

6. معالجة الصور وتحليلها

ملاحظة: تمت معالجة الصور أولا عن طريق فك الالتفاف باستخدام برنامج متوافق، تلاها تحليل تحديد الموقع بجزيء واحد باستخدام برنامج بيكاسو الذي طوره مختبر يونغمان16.

  1. افتح مجموعات صور ND2 في برنامج NIS-Elements AR.
  2. للصور ثنائية الأبعاد، اختر فك الالفاف ثنائي الأبعاد. بالنسبة للصور ثلاثية الأبعاد، كرر هذا الإجراء لكل مكدس z فردي.
  3. اختر فك الالتفاف الأعمى، وهو ثقب فعال بقيمة 0.01، واضبط مستوى الضوضاء على الضوضاء. ثم أدخل معدل إثارة الليزر ومعدل الانبعاث، هنا 560 نانومتر و571 نانومتر على التوالي. يتم الحصول على معلمات أخرى تلقائيا من بيانات ND2 الوصفية لتوفير تقدير تقريبي لدالة انتشار نقطة الصورة المصدر (PSF).
  4. حدد عدد التكرارات (هنا، 12)، اختر إنشاء مستند جديد، واضغط على فك اللف. احفظ الملف الناتج بعد المعالجة.
    ملاحظة: تقوم الخوارزمية بتحسين جودة الصورة بشكل تكراري من خلال تنفيذ عمليات الالتفاف التي تحسن PSF حتى الوصول إلى التقارب أو العدد المحدد من التكرارات. يوصى بالفحص البصري للصورة المفككة. يتطلب تعديل عدد التكرارات اعتمادا على القيود الحسابية وجودة الصورة.
  5. قم بتحميل مكدس الصور المفكك في وحدة بيكاسو لوكليز.
  6. من شريط القوائم، اختر تحليل → المعلمات، وأدخل المعلمات الخاصة بالكاميرا وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. بالنسبة لكاميرا sCMOS المستخدمة في هذه الدراسة (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): الكسب الكهرومغناطيسي: 1، الخط الأساسي: 100، الحساسية: 0.23 (عامل التحويل، الإلكترونات/العداد)، الكفاءة الكمومية: 0.95 (حسب طول موجة الإثارة المستخدم).
    ملاحظة: الكفاءة الكمومية غير مستخدمة منذ إصدار بيكاسو 0.6.0 ومحفوظة فقط للتوافق مع الإصدارات السابقة.
  7. اضبط طول جانب الصندوق إلى 7. يتم تحديد طول الصندوق باستخدام الصيغة [6 × σPSF + 1]، حيث σPSF هو الانحراف المعياري ل PSF. هذا التحسين يعزز دقة التوطين، مما يحسن دقة الصورة المعاد بناؤها.
  8. اختر حجم البكسل المناسب لتكوين التصوير، وفقا للخطوة 5.5 في القسم.
  9. بعد ذلك، اختر تدرج صافي أدنى مناسب (مثلا، ~1000، حسب العينة) وفعل Preview لعرض المواقع المكتشفة. افحص النتائج وضبط عتبة التدرج حسب الحاجة لتقليل الكشف الخلفي وضمان تحديد الموقع بدقة.
  10. من شريط القوائم، اختر تحليل → تحديد ملاءمة (تحديد وتركيب) لبدء تحديد المواقع وتركيب جميع إطارات الفيلم. بعد المنافسة، يتم حفظ هذه العملية تلقائيا ملف .hdf5 و .yaml.
    ملاحظة: ملف .hdf5 يخزن موقع التوطين لكل توافق غاوسي والمزيد من المعلمات. يحفظ ملف .yaml معلومات عن الفيديو وإجراءات التحليل ويمكن فحصه باستخدام محرر نصوص.
  11. قم بتحميل ملف .hdf5 في وحدة Picasso Render لعرض خريطة التوطين المعاد بناؤها وإجراء تصحيح الانحراف (hift).
  12. في بيكاسو ريندر، اختر Postprocess → Undrift من RCC. أدخل قيمة تقسيم تبدأ من 1000. عند الانتهاء، سيظهر مخطط الانجراف المحسوب xy. كرر العملية تدريجيا مع قيم تقسيم أقل (مثلا 500، ثم 250)، مع ملاحظة تحسينات تدريجية في الانجراف الزمني.
    ملاحظة: يمكن إجراء تصحيح الانجراف باستخدام الجسيمات النانوية كعلامات ائتمانية أيضا؛ ومع ذلك، عند تصوير المستويات المرتفعة، قد لا تكون إشارة الجسيمات النانوية مرئية. في هذه الحالات، يطبق فقط تصحيح الانجراف المتكرر (RCC).
  13. تأكد من حفظ ملف تصحيح الانحراف، واختيار ملف → حفظ التوطينات قبل إغلاق نافذة Picasso Render.
  14. قم بتحميل ملف تصحيح الانجراف من الخطوة 6.13 إلى وحدة بيكاسو فلتر لخطوات معالجة إضافية، عن طريق فرض عتبات على مقاييس جودة تحديد الموقع للجزيء الواحد، مثل: (1) دقة التوطين (lpx, lpy); (2) عرض PSF (sx, sy); (3) عدد الفوتونات؛ و(4) أي معايير إضافية لإزالة الضوضاء أو النقاط الشاذة أو البقع التي لم يتم حلها جيدا.
    ملاحظة: lpx و lpy (دقة التمركز في x و y) يقدران عدم اليقين في الموقع النقطي الموضعي على محوري x و y ويتم حسابهما بناء على الحد الأدنى لكرامير-راو (CRLB).
  15. لتصفية خاصية واحدة، اختر العمود المناسب في رأس الجدول، واختر رسم → مخطط مدرج من القائمة.
    ملاحظة: اختيار عمودين يرسم مخطط تكراري ثنائي الأبعاد.
  16. لتصفية حسب نطاق خصائص محدد، انقر واسحب عبر المنطقة المطلوبة داخل مخطط مدرج 1D أو 2D. ستظهر المنطقة المحددة مظللة باللون الأخضر، وأي أحداث توطين بقيم خارج هذا النطاق سيتم استبعادها فورا من قائمة التوطين.
  17. تصفية البيانات حسب الفوتونات، sx، sy، lpx، وlpy، مع الاحتفاظ فقط بنطاق الجزء المركزي من توزيع كل معلمة لضمان الاحتفاظ بأكثر التوطيبات موثوقية.
    ملاحظة: الجزء المركزي من توزيع عرض PSF عادة ما يتراوح بين 0.4 و1.2 × حجم بكسل. استبعد التوزيعات الثانوية التي غالبا ما تكون ناتجة عن تداخل الإشارات أو النقاط التي لم يتم تحديدها بشكل جيد.
  18. احفظ البيانات المصفاة باختيار ملف → الحفظ من القائمة.
  19. كرر العملية من الخطوة 6.1 إلى 6.18 لجميع الفيديوهات التي تم تصويرها لكل حل مصور.
  20. افتح الملف المصفى في وحدة Picasso Render. تمثل شدة هذه الصورة فائقة الدقة عدد التموضعات. يمكن تغيير التباين باختيار إعدادات العرض → العرض وتغيير قيمة الكثافة القصوى.
  21. لحفظ صورة القناة ذات الدقة الفائقة لقناة واحدة، اختر "دقة التوطين الفردي" من قسم التمويه. يمكن أيضا إضافة شريط مقياس من قسم شريط السلالم.
  22. لحفظ صورة الدقة الفائقة لجميع القنوات، افتح جميع ملفات .hdf5 المعالجة. يمكن تغيير لون كل قناة باختيار عرض → الملفات من القائمة.
  23. قم بمحاذاة جميع القنوات باختيار المعالجة اللاحقة → قنوات Align (محاذاة).
  24. اختر ملف → تصدير الصورة الكاملة لحفظ صورة .png أو ملف → تصدير العرض الحالي لتكبير معين للصورة.
    ملاحظة: استخدم ممارسات تسمية وتوثيق الملفات المتسقة لإمكانية إعادة الإنتاج. يضيف برنامج بيكاسو تلقائيا لاحقة لكل ملف محفوظ. يمكن استخراج مقاييس الحد الأدنى لكرامير راو وتحليل الجيران الأقرب (NeNA)22 عن طريق اختيار عرض → عرض المعلومات من القائمة. يقوم NeNA بقياس التوزيع المكاني للفلوروفورات المحلية من خلال تقييم المسافة الإقليدية بين التقطيعات المجاورة. بينما يوفر CRLB حدا أدنى نظريا لدقة التموقع بناء على إحصائيات الفوتونات والضوضاء الخلفية، يقدم NeNA تقديرا تجريبيا لدقة التموقع مشتق مباشرة من مجموعة البيانات نفسها. لهذا السبب، يستخدم NeNA على نطاق واسع في SMLM كمقياس مكمل ل CRLB، لأنه يلتقط ليس فقط الحدود النظرية بل أيضا التأثيرات العملية مثل تصحيح الانحراف وأخطاء التركيب والتباين التجريبي. يتم استخراج مقياس NeNA من وحدة بيكاسو ريندر. يستخدم CRLB لتناسب جزيء واحد لتحديد قيم دقة تحديد الموقع المستنيرة (σSMLM). القيمة المبلغ عنها هي المتوسط بين σx و σy، لجميع التوظيفات، والتي هي قيمة النمط لتوزيع دقة التموقع في x و y على التوالي.

النتائج

لإثبات قدرات التصوير فائقة الدقة لنظام SDC-OPR (الشكل 1A)، تم تقييم دقة التصوير داخل المستوى من خلال إجراء تجارب تصوير DNA-PAINT (الشكل 1B) على مجمعات المسام النووية (NPCs)، وهي بنية مرجعية بيولوجية17. يظهر الشكل 1C صورة ممثلة من DNA-PAINT SDC-OPR للنوكليوبورين 96 (Nup96)، موسوم ببروتين فلوري أخضر محسن أحادي السطح (mEGFPs) ومعلم بأجسام نانوية مضادة ل GFP متقاربة بالحمض النووي، في خلايا U2OS. تكشف اللوحات المكبرة عن البنية التحتية ل NUP، ويظهر الشكل 1D بروتينات Nup96 المزدوجة (المشار إليها بالسهام) متوافقة مع التناظر المتوقع بثمانية الأطياف للمسام النووية. في الشكل 1E، تم قياس المسافة الإقليدية بين أزواج Nup96 عن طريق محاذاتها ورسم مخطط المقطع العرضي للصورة المجمعة (n = 16 زوجا). كشف التحليل عن فصل من القمة إلى القمة (13 ± 2) نانومتر (الشكل 1E)، متوافقا مع نتائج نماذج EM وكذلك تصوير HILO وTIR23. كل ملاءمة ذروة عرضت انحرافا معياريا قدره 4 نانومتر، مؤكدة دقة تحديد الموقع العالية (σSMLM = 3.3 نانومتر، NeNA = 4.4 نانومتر) التي تم تحقيقها باستخدام DNA-PAINT على SDC-OPR. ومن الجدير بالذكر أن هذه الدقة تم الحفاظ عليها عبر جميع مجالات الرؤية البالغة 53 × 53 ميكرومتر مربع، وهو أمر استثنائي للأنظمة القائمة على الكونفوكل.

لإثبات القدرة على التصوير متعدد الألوان، تم تصنيف Nup96 والميتوكوندريا والأنابيب الدقيقة في خلايا U2OS على الحمض النووي للحصول على ال DNA باستخدام Exchange-PAINT18. تستخدم هذه التقنية خيوط تصوير DNA متعامدة مرتبطة بفلوروفور واحد، مما يمكن جميع الأهداف من الإثارة بنفس مصدر الليزر (الشكل 2A). بدلا من الحصول على الإشارات في نفس الوقت، يفصلها عبر جولات تصوير متسلسلة، مما يسهل دمجاها مباشرة في أي نظام SDC-OPR تجاري. يظهر الشكل 2B Nup96 باللون الأزرق مع جسم نانوي مضاد ل GFP، والميتوكوندريا باللون الأحمر مع جسم مضاد ثانوي مضاد TOM20، والأنابيب الدقيقة باللون الأخضر مع جسم مضاد أولي مضاد لأنابيب α. ومن الجدير بالذكر أن دقة تحديد الموقع المميزة لجزيء واحد التي تم الحصول عليها لتصوير Nup96 بلون واحد تم الحفاظ عليها عبر جميع الأهداف في التجربة متعددة الأهداف، مما أدى إلى دقة تحديد المواقع 3.9 نانومتر لل NPC، و4.0 نانومتر ل α-التوبولين، و3.3 نانومتر للميتوكوندريا (لوحات الشكل 2B 1، 2، و3).

لتصوير مجال الرؤية الكبيرة، تم تصوير الأنابيب الدقيقة في خلايا HeLa باستخدام تكبيرات مختلفة متوفرة في نظام SDC-OPR، مع إعدادات تجميع مختلفة للكاميرا للحفاظ على أحجام البكسلات بين 78 نانومتر و108 نانومتر (الشكل 3). يظهر الشكل 3A هيكل خلوي الأنابيب الدقيقة ل 10 خلايا HeLa، مع ألوان تمثل دقة الموقع. عند تكبير 1×، يكون متوسط دقة تحديد الموقع أسوأ بشكل ملحوظ مقارنة بتكبيرات أعلى (الشكل 3B-D)، مع ملاحظة تباين أكبر. ويرجع ذلك إلى انخفاض كثافة طاقة الليزر على مجال الرؤية الأكبر، حيث يصبح ملف الإضاءة الغاوسي واضحا، مما يؤدي إلى انخفاض الدقة نحو حواف مجال الرؤية (FOV). ومع ذلك، فإن تحقيق متوسط دقة تحديد الموقع 9.5 نانومتر عبر مجال رؤية واسع النطاق 211 × 211 ميكرومتر مربع يعد أمرا مثيرا للإعجاب للأنظمة القائمة على الكونفوكال ويتيح تحقيقا عالي الدقة في التغاير البيولوجي.

وأخيرا، يتم إثبات إمكانية تصوير الخلايا الكاملة من خلال الحصول على صور DNA-PAINT لشبكة الأنابيب الدقيقة في خلايا HeLa ثابتة بحجم كونفوكلي ~500 نانومتر وخطوة z 1 ميكرومتر باستخدام أعلى تكبير في النظام (4×، 53 × 53 ميكرومتر مربع). يعرض الشكل 4A صور إعادة بناء جزيء واحد لكل مستوى z، إلى جانب دقة تحديد المواقع وقيم NeNA المقابلة لها. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير تصور ثلاثي الأبعاد بالألوان لشبكة الأنابيب الدقيقة في خلية HeLa في الشكل 4C. مع زيادة العمق، يقل عدد الفوتونات المكتشفة بسبب التشتت والانحرافات البصرية، مما يؤدي إلى انخفاض دقة تحديد المواقع لكل من دقة التموضع المستمدة من الحد الأدنى لكرامير-راو (CRLB) (الشكل 4A، يمين) وتلك المحسوبة باستخدام مقياس NeNA. ومع ذلك، فإن المستوى العالي من جمع الفوتونات الذي يمكن لنظام SDC-OPR يتيح σSMLM ≤ 10 نانومتر لعمق تصوير يصل إلى 9 ميكرومتر مع توزيعات ضيقة. في الواقع، تم حل هياكل الأنابيب الدقيقة الخيطية ذات الجدران المزدوجة بوضوح عند أعماق مختلفة: بالقرب من واجهة الغطاء والخلية، في مواقع محورية متوسطة، وفي أعلى الخلية، مع مسافة بين القمة إلى الذروة بين 30 نانومتر و40 نانومتر (الشكل 4C)، متوافقا مع القيم المبلغعنها 24. تسلط هذه النتائج الضوء على قدرة SDC-OPR على تقديم تصوير عالي الدقة عبر مجال رؤية كبيرة وعبر ارتفاع الخلايا بأكمله.

الشكل 1
الشكل 1: مجهر تحديد موقع جزيء واحد في المستوى لعينات خلايا مختلفة وتصوير فائق دقة متعدد الألوان. (أ) مخطط لنظام إعادة تعيين الفوتونات البصرية (SDC-OPR) للقرص الدوار، ويتميز بمصفوفة عدسات دقيقة مصممة لتعظيم جمع الفوتونات. (ب) مخطط DNA-PAINT: تتزايد خيوط الحمض النووي الموسومة بالفلورية، والمعروفة بسلاسل التصوير، بشكل مؤقت مع تسلسلات DNA مكملة (خيوط التثبيت) التي تثبت بالجسم المضاد/الجسم النانوي المستهدف البروتين المعني. تولد هذه الأحداث القصيرة العمر إشارات فلورية تظهر على شكل وميض عشوائي. (ج) صورة DNA-PAINT ممثلة على نظام SDC-OPR باستخدام تكبير 4× لNPC لخلايا U2OS. تظهر القدرة عالية الدقة في الإدخال حيث يتم حل الشخصيات الفردية بوضوح. (D) يتيح DNA-PAINT المعزز ب SDC-OPR تصور NPCs منفردة، حيث تبرز الأسهم البيضاء أزواج بروتينات Nup96 المميزة ضمن بنية المسام. (ه) توزيع قياسات المسافة بين دايمرات Nup96 (n=16 زوجا) ضمن وحدات تماثل NPC واحدة. تم تعديل هذا الشكل من زازا وآخرون 14. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. 

الشكل 2
الشكل 2: Exchange-PAINT للتصوير متعدد الألوان باستخدام مجهر SDC-OPR. (أ) مخطط تبادل-طلاء لثلاثة أهداف تم تصويرها بالتسلسل. تم تصنيف ثلاثة أهداف بروتين إما بأجسام مضادة وظيفية للحمض النووي، أو شظايا Fab، أو أجسام نانوية. تم تصوير خيوط جهاز التصوير Cy3B بشكل متسلسل حسب نوع السلسلة مع خطوات غسيل بين جولات التصوير. (B) تصوير تبادل-PAINT ثلاثي الألوان لخلايا U2OS باستخدام مجهر SDC-OPR باستخدام تكبير 4×، يظهر الأنابيب الدقيقة (باللون الأحمر؛ موسوم بأنابيب مضادة α متقاربة بالحمض النووي)، الميتوكوندريا (خضراء؛ TOM20 التي تستهدف DNA-nanobodies)، وNPC (أزرق؛ Nup96 موسوم ب mEGFP مع أجسام نانوية مضادة ل GFP). شريط المقياس: 5 ميكرومتر. تركز منطقة التكبير على الدقة المحسنة التي تم الحصول عليها في نظام SDC-OPR، مع التركيز على (1) الميتوكوندريا، (2) الأنابيب الدقيقة و(3) NUP. أشرطة المقياس = 1 ميكرومتر. تم تعديل هذا الشكل من زازا وآخرون 14. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: تصوير DNA-PAINT ضمن مجال رؤية كبيرة على مجهر SDC-OPR. صور الميكروتيوبول DNA-PAINT (وسم مضاد ل α التوبولين) تم الحصول عليها بتكبير متعدد: (A) تكبير 1× وإعادة 1 (مجال رؤية 211 × 211 ميكرومتر مربع)، (B) 2.8× و2 تجمع (مجال رؤية 76 × 76 ميكرومتر مربع)، (C) 4× تكبير و4 تجميع (مجال رؤية 53 × 53 ميكرومتر مربع). يمثل اللون دقة تحديد المواقع من 0 إلى 16 نانومتر في حالة التكبير 1x و0-4 نانومتر في الحالات الأخرى. (د) دقة تحديد المواقع تقاس على مسافات مختلفة (بالميكرومتر) من مركز مجال الرؤية لتكبيرات 1× (أحمر)، 2.8× (أصفر)، و4× (أخضر). تم تعديل هذا الشكل من زازا وآخرون 14. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4
الشكل 4: تصوير DNA خلية كاملة-طلاء خلية كاملة. (أ) يسار. تصوير الأنابيب الدقيقة الحجمية في خلايا HeLa عبر DNA-PAINT تم الحصول عليه باستخدام SDC-OPR بتكبير 4×، مع إظهار مقاطع محورية من z = 0 إلى 9 ميكرومتر (خطوات 1 ميكرومتر). كل مستوى يعرض موقع z ، ودقة التوطين، ومقياس NeNA. أشرطة السلالم: 5 ميكرومتر (xy). صحيح. دقة تحديد الموقع مقابل عمق الاختراق لجميع المستويات. (B) عرض ثلاثي الأبعاد لشبكة الأنابيب الدقيقة على نفس خلية HeLa الموجودة في (A). يمثل اللون عمق الاختراق من 0 إلى 9 ميكرومتر. (C) صور مكبرة لمناطق صغيرة مميزة من كل عمق اختراق موشار إليه في (A). تم تعديل هذا الشكل من زازا وآخرون 14. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

لقد كسر المجهر الفلوري فائق الدقة حاجز الحيود، مما عزز الدقة المكانية بشكل كبير. ومع ذلك، فإن اعتماده الواسع في الأبحاث البيولوجية يواجه تحديات مستمرة. ومن الجدير بالذكر أن المقايضات بين مجال الرؤية، والدقة، وعمق الاختراق تجعل من الصعب تحسين العوامل الثلاثة في نفس الوقت. تم معالجة هذه التحديات من خلال الاستفادة من القدرات المشتركة ل SMLM والميكروسكوب الكونفوكالي للقرص الدوار، والتي تعزز بواسطة إعادة تعيين الفوتونات البصرية (SDC-OPR). من خلال دمج مصفوفات العدسات الدقيقة في تكوين SDC القياسي، كما أتاح نظام SDC-OPR التجاري، زادت مجموعة الفوتونات بينما تم تقليل حجم الثقب الفعال، مما أدى إلى تحسين كبير في الدقة. بالمقارنة مع SDC القياسي، أظهر نظام SDC-OPR تحسنا ملحوظا في قوة التحديد، حيث نجح في تمييز الميزات المفصولة ب 10 نانومترو14 في المستوى البؤري، بينما كان SDC القياسي قادرا فقط على حل المسافات التي تزيد عن 20 نانومتر11. تؤكد هذه القدرة المحسنة على المعالجة فائدة إعادة تعيين الفوتونات لتحقيق الفصل على مقياس الجزيئي. على وجه التحديد، تم تحقيق دقة تحديد موقعية جانبية أقل من 2 نانومتر عند المستوى البؤري (z = 0 ميكرومتر)، مع بقاء الدقة الجانبية أقل من 10 نانومتر على أعماق تصل إلى 9 ميكرومتر، مع مجال رؤية قابل للتكيف للغاية يبلغ 53 × 53 ميكرومتر مربع أو 76 × 76 ميكرومتر مربع. حتى عند مجال رؤية كبير يبلغ 211 × 211 ميكرومتر مربع، قدم النظام دقة تحديد موقعية متوسطة مثيرة للإعجاب تبلغ 9.5 نانومتر داخل المستوى. تسلط هذه النتائج الضوء على قدرة النظام على التصوير عالي الدقة في جميع أنحاء الخلايا بأكملها.

فيما يتعلق بتفاعلات الاقتران للأجسام المضادة المختلفة المستخدمة، يجب اتباع البروتوكول بعناية لضمان نسبة مثالية للأجسام المضادة إلى الحمض النووي. تجاوز هذه النسبة قد يقلل من دقة تحديد الموقع وقد يؤثر سلبا على القياسات الكمية، مثل تلك التي أجريت في qPAINT25. لذلك، من الضروري التحقق من النسبة باستخدام مطياف UV-Vis ميكروحجم، لضمان نسبة نهائية 1:1 بين الحمض النووي والأجسام المضادة.

خطوة حاسمة للحصول على صور فائقة الدقة عالية للأنابيب الدقيقة هي التثبيت الصحيح. طرق التثبيت التقليدية التي تعتمد فقط على تركيزات عالية من الأمامية الخيالية غالبا ما تعطل هياكل الأنابيب الدقيقة. بدلا من ذلك، فإن استخدام جلوتارالديهيد (GA) وحده أو مع PFA يحسن بشكل كبير الحفاظ على البنية 26,27.

للتصوير الأمثل، فإن هدف الفتحة الرقمية (NA) العالي ضروري لتعظيم جمع الفوتونات لكل حدث جزيء واحد. في نظام SDC-OPR التجاري، تكون قوة الليزر أقل عمدا من مجاهر TIRF التقليدية المستخدمة في SMLM لتقليل تبييض العينات. بينما يلغي DNA-PAINT مخاوف التبييض الضوئي وقد يستخدم نظريا طاقة ليزر أعلى، فإن الأنظمة التجارية الحالية تفرض قيودا، مما يتطلب أوقات تعريض أطول مقارنة بإضاءة TIRF. علاوة على ذلك، وبما أن الإضاءة في SDC-OPR تكون متقاطعة، فإن الجزيئات لا تثار باستمرار أثناء التعرض. وبالتالي، فإن أوقات التعريض الأطول ضرورية مقارنة بإضاءة TIRF المستمرة؛ في هذه الدراسة، تم استخدام زمن تعرض بلغ 300 مللي ثانية. ومع ذلك، اعتمادا على متطلبات الدقة في تجربة معينة، يمكن استخدام أوقات تكامل أقصر (مثل 150-200 مللي ثانية) مع أقل قدر من فقدان الدقة28.

يعد تحسين تركيز سلسلة التصوير خطوة حاسمة لضمان بقاء إشارات الجزيئات المفردة منفصلة بشكل جيد مع الاستمرار في توليد ما يكفي من المواقع لإعادة بناء دقيقة. هذا التعديل مشابه لعمليات اقتناص SMLM القياسية، حيث يتم التحكم بعناية في التوازن بين كثافة الأحداث وتداخل الإشارة. يجب تعديل التركيز الأمثل لجهاز التصوير لكل هدف مختلف. على سبيل المثال، بالنسبة للأنابيب الدقيقة، يوصى بتركيز خيط تصوير أولي أقل من 1 نانومتر، مع إجراء تعديلات حسب الحاجة.

الحفاظ على التركيز المستقر أثناء عمليات الاقتناء الممتدة أمر بالغ الأهمية، حيث لا يمكن تصحيح انحراف المحور (z) بعد المعالجة. يمكن تعويض الانجراف الجانبي (xy) بواسطة علامات RCC أو علامات الائتمان. في هذا النظام، يضمن نظام التركيز المثالي (PFS) في المجهر استقرارا في التركيز خلال ساعات من التصوير.

باختصار، يوفر دمج SMLM مع SDC-OPR منصة قوية للتصوير عالي الدقة عميقا داخل الخلايا بأكملها، متجاوزين التنازلات التقليدية بين الدقة والعمق ومجال رؤية. ومع ذلك، لتحقيق قدرات النظام بشكل كامل، من الضروري الانتباه الدقيق للظروف التجريبية، من تصريف الأجسام المضادة وثبيتها إلى إعدادات الاستحواذ ومعالجة البيانات. تلعب كل خطوة، من تحضير العينة إلى تصحيح الانحراف، دورا حاسما في تحقيق بيانات موثوقة وعالية الدقة. مع تحسين البروتوكول بعناية، يقدم هذا النهج حلا قويا ومتعدد الاستخدامات للتصوير الكمي على نطاق نانوي في عينات بيولوجية معقدة. من المتوقع أن يساعد هذا البروتوكول المجتمع في اعتماد مجهر تحديد الموقع بجزيء واحد والحصول على صور فائقة الدقة من مستويات عينات يصعب الوصول إليها باستخدام إضاءة TIRF أو HILO التقليدية. يتم تسهيل الهدفين باستخدام مجاهر تجارية متوفرة عادة في منشآت المجهر حول العالم.

من حيث التطبيقات الأخرى والمستقبلية، فإن الطريقة قابلة للتطبيق على عينات الخلايا الكاملة وكذلك على عينات الأنسجة الأكثر تعقيدا عند أعماق تصوير أكبر، كما أظهر في الدراسات السابقة14. على عكس الطرق التي تتطلب التقسيم الفيزيائي، تتيح هذه التقنية التصوير الحجمي للأنسجة السليمة، مع الحفاظ على البنية الطبيعية وتقليل التشويهات الناتجة عن التقسيم. استخدام مجسات ألفة أصغر، مثل الأجسام النانوية، يعزز اختراق الأنسجة أكثر مقارنة بالأجسام المضادة كاملة الطول، مما يسمح بوضع علامات أكثر تجانسا عبر العينات السميكة. يفتح هذا النهج الباب لدراسة تنظيم الخلايا والتوزيعات الجزيئية في الموقع بدقة أعلى. بعيدا عن هذه التطبيقات، تتيح الاستراتيجية أيضا الفحص عالي الإنتاجية للهياكل النانوية والتجمعات الجزيئية الحيوية، مما يمكن من إجراء تحقيقات منهجية في التباين والوظيفة الهيكلية. بالإضافة إلى ذلك، أسفرت التطورات الحديثة في DNA-PAINT عن مجسات تصوير ذاتية التبريد، إما تعتمد على تفاعلات الصبغة-المثقلة أو الصبغة-الصبغة 29,30,31، والتي تقلل فعليا من إشارات الخلفية، وتزيد من شدة الفلورة، وتحسن الدقة المكانية، مما يتيح معدلات اكتساب أسرع. دمج هذه المسبارات الفلوروجينية في إطار SDC-OPR لديه القدرة على تعزيز سرعة التصوير ودقة التصوير بشكل أكبر. الجمع بين هذه التطورات ونقاط قوة نظام SDC-OPR يمكن أن يوسع تطبيقه على العينات البيولوجية الأكثر تعقيدا، مما يؤسس المنصة كأداة مرنة لرسم خرائط تفصيلية للهياكل الخلوية والجزيئية في مجموعة واسعة من الأنسجة.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يعلنون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل منظمة برنامج علوم الحدود البشرية (HFSP) من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه متعددة التخصصات ل CZ (LT0025/2023-C) ومجلس أبحاث الهندسة والعلوم الفيزيائية لدعم M.T. (EP/R513143/1 و EP/W524335/1) وO.P.L.D (EP/R513143/1 و EP/T517793/1). كما تعترف إس. إس بالجمعية الملكية من خلال زمالة دوروثي هودجكين (DHF\R1\191019 و DHF\251006). وقد حظي هذا العمل أيضا بدعم من مبادرة تشان زوكربيرغ (2023-321188) ومنح BBSCR (BB/Y513064/1) ل S.S.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(±)-6-هيدروكسي-2,5,7,8-تتراماثيل كرومان-2-حمض الكربوكسيليكميرك 238813-5Gترولوكس
3,4-حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك ميرك 37580-25G-FPCA
60&00; عدسة أبو NA 1.49 الموضوعيةنيكون
عمود إزالة الأملاح بالدوران 7.0 KDA يحتوي على راتنج إزالة الحجم&nb;شركة فيشر العلمية المحدودة89882أعمدة إزالة الأملاح في زيبا للدوران للخطوة 2.4
الأكيوتاز - وسط انفصال خلايا الإنزيمخلية الترويجC-41310
ألباكا sdAb (1H1) مضاد GFP مع حمض نووي مخصص (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')الفوتونيات الضخمةمنتج مخصصالجسم النانوي المضاد ل GFP لذبابة الفاكهة
ألباكا sdAb (1H1) مضاد GFP مع الحمض النوويالفوتونيات الضخمةMASSIVE-TAG-Q-FAST مضاد GFP - F3الجسم النانوي المضاد ل GFP ل NUP
التوبولين المضاد لألفا (YL1/2)ثيرمو فيشر العلميMA1-80017
مضاد الأرانب IgGالفوتونيات الضخمةMassive-sdAB-FAST 2-Plex، sdAB F2 الثانوي
Anti-TCRζ (6B10.2)بيو ليجند644102
مصل البقر الألبومينميرك A4503-10GBSA
أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 ملشركة فيشر العلمية المحدودة17705004
أنبوب طرد مركزي مخروطي بسعة 50 ملVWR الدولية734-0448
CSU-W1 SoRaنيكونمجهر SDC-OPR
إزالة الأملاح من أعمدة الدوران باستخدام سيفاديكس G-25 (راتنج استبعاد الحجم لتنقية الحمض النووي) شركة فيشر العلمية المحدودة11743309العلامة التجارية: سايتيفا. أعمدة G-25 للخطوة 2.5
دي-جلوكوزميرك G8270-1KG
وسائط DMEMثيرمو فيشر العلمي11965092
DMSO، لامائيةثيرمو فيشر العلميD12345
DTT  (ديثيوثرايتول)ثيرمو فيشر العلمي15976082
EDTAثيرمو فيشر العلمي15575020
EGTAمارك324626
مصل الأبقار الجنينيثيرمو فيشر العلميA5256701
جلوتارالديهايدسيرفا2311402
الجلسرولميرك G5516-500ML 
الجلايسينMP Biomedicals219482580
ماليميد-PEG2-سوكسنيميديل  ميرك 746223-50MG
وسائط مكوي 5Aشركة فيشر العلمية المحدودة16600082
MES (حمض الإيثانسولفونيك 2-(N-مورفولينو)ميركM3671-50G
الميثانولشركة فيشر العلمية المحدودة32213-25L
MgCl2شركة فيشر العلمية المحدودة10418464
أنابيب الطرد المركزي الدقيق 0.5 ملشركة فيشر العلمية المحدودة11508232
أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملإبندورف10509691 
مطياف الأشعة فوق البنفسجية البصرية الميكروحجميةثيرمو فيشر العلميND-ONE-Wنانودروب
NaCl2سيغما-ألدرتشS6546-1L 
الجسيمات النانوية 90 نانومتر - ذهبتشخيص الخلاياG-90-100
كاميرا Orca Fusion-BT CMOSهاماماتسو
البنسلين-ستريبتوميسينثيرمو فيشر العلمي15070063ملاحظة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (محلول 1x)شركة فيشر العلمية المحدودة11530546PBS
فورمالديهايد 16٪ ثقب (بدون ثن)، خال من الميثانولشركة فيشر العلمية المحدودة11586711PFA
كلوريد البوتاسيوم  ميرك   P9541-500G
بروتوكاتشوات 3,4-ديوكسيجيناز  ميرك P8279-25UN PCD
الصوديوم  الهيدروكسيدشركة فيشر العلمية المحدودة12963614
الجسم المضاد TOM20أبكامAb186735
مخزن تريسVWR الدوليةA4577.1000
ترايتون  X-100   VWR الدولية1086031000
توين-20ميرك P9416-50ML
وحدة مرشح طرد مركزي فائق الترشيح، 100 كيلو دالتون MWCOميرك UFC510024الشركة المصنعة: أميكون ألترا
μ-شريحة 8 بئر عالية من الزجاج السفليإيبيديIB-80807
μ-Slide VI 0.5 قاع زجاجيإيبيديIB-80607

المراجع

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DNA PAINT
تصوير فائق الدقة للخلية بالكامل عبر DNA-PAINT على قرص دوار مع إعادة تعيين فوتونات بصرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.