يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تأسيس أعضاء الأورام، والأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان الورمي، والأرومات الليفية المتوافقة من نفس مريض سرطان المريء

528 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69548

⸱

أبريل 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الأعضاء السرطانية، والأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs)، والأرومات الليفية غير المرتبطة بالورم (CFs) في نفس المريض المصاب بسرطان الخلايا الحرشفية المريء (ESCC). يمكن أن يتجنب استخدام هذه المواد المطابقة مع المرضى مشاكل التفاوت بين المرضى ويوفر منصة تجريبية مناسبة لأبحاث ESCC.

الملخص

في سرطان الخلايا الحرشفية المريء (ESCC)، لا يزال اكتساب مقاومة العلاج وتكرار الورم تحديات سريرية رئيسية. تعرف الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs)، وهي مكونات رئيسية للبيئة الدقيقة للورم، بتأثيرها على تقدم ESCC والاستجابة العلاجية. ومع ذلك، لا تزال العديد من جوانب دور CAFs في الأورام الخبيثة غير معروفة، ويفترض أن ذلك بسبب التفاوت بين المرضى لدى مرضى ESCC. يعتقد أن العديد من سلالات خلايا ESCC البشرية المتاحة للبحث تحاكي جزئيا طبيعة السرطان البشري. كما يتم نشرها في المختبر لسنوات وعقود في طبق بتري، مما يؤدي إلى التكيف مع ظروف الزراعة. علاوة على ذلك، تحمل خطوط خلايا ESCC البشرية تغيرات جينية وفوق جينية مختلفة بين المرضى الأصليين، مما يؤدي إلى تباين بين المرضى. ومع ذلك، تم استخدام خطوط خلايا سرطانية مزروعة طويلة الأمد في معظم الدراسات السابقة للتجارب على CAFs غير المتطابقة مع المرضى. لذا قد يؤدي التباين بين المرضى داخل كل خط خلوي سرطاني وبين الخلايا السرطانية وCAFs إلى انخفاض قابلية التكرار وموثوقية النتائج. للقضاء على التباين بين المرضى، تم عزل ثلاثة أنواع خلايا مميزة من نفس المريض: عضويات السرطان والخلايا الليفية من منطقة ESCC مقسمة جراحيا، والأرومات الليفية المقابلة (CFs) من منطقة غير ورمية مجاورة كعناصر تحكم خاصة بالمريض لمرضى الطيران الداخلي. يتم تقديم بروتوكول مفصل يتيح العزل المتزامن للأعضاء العضوية السرطانية، وCAFs، وCFs. نمت العضويات السرطانية بشكل جيد في ظروف ثلاثية الأبعاد. تم صبغ الخلايا الكيميائية والألياف التليفية بشكل إيجابي للفيمنتين، أحد علامات الأرومات الليفية، الذي يدعم إثراء هذه الخلايا في السلالات الليفية. يتيح لنا البروتوكول الموصوف تأسيس عضويات ESCC والأرومات الليفية المطابقة للمرضى، مما يوفر منصة تجريبية قيمة تستبعد التباين بين المرضى في دراسة التفاعلات بين الورم والبنوم.

المقدمة

يرتبط سرطان المريء بمعدلات الإصابة والوفيات المرتفعة حول العالم1. يصنف بشكل عام إلى نوعين فرعيين رئيسيين في علم الأنسجة: سرطان الخلايا الحرشفية المريء (ESCC) وسرطان الغدة المريء (EAC)2. يعد ESCC أكثر انتشارا من EAC، مع معدل إصابة أعلى بشكل خاص في شرق آسيا وأفريقيا3. استراتيجيات العلاج ل ESCC راسخة نسبيا 4,5. بالنسبة للآفات في المرحلة المبكرة المحصورة في الطبقة المخاطية، يشترط الاستئصال بالمنظار كخيار علاجي وقليل. في المرضى الذين يعانون من مرض متقدم محليا لكنه قابل للاستئصال، أظهر الجمع بين العلاج الكيميائي الإشعاعي المساعد الجديد مع استئصال المريء فعالية سريرية. بالنسبة للحالات غير القابلة للاستئصال أو النقائل، يظل العلاج الكيميائي الجهازي هو الركيزة الأساسية للعلاج. ومع ذلك، لا تزال المقاومة العلاجية وتكرار الأمراض تشكلان تحديات سريرية كبيرة.

تتكون الأورام ليس فقط من خلايا سرطانية، بل أيضا من بيئة دقيقة معقدة تتكون من أنواع مختلفة من خلايا البنوم. من بينها، أظهرت الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs)، وهي المكونات الخلوية الرئيسية في البيئة الدقيقة للورم، أدوارا حاسمة في تقدم الورم والاستجابة العلاجية 6,7,8,9. في ESCC، تم الإبلاغ بشكل متزايد عن تورط CAFs في الأورام الخبيثة والعلاجية 10,11,12. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية الدقيقة لCAFs التي تقوم عليها أورام ESCC الخبيثة غير واضحة إلى حد كبير.

في معظم الدراسات السابقة، تم تقييم تأثيرات CAFs على الخلايا السرطانية باستخدام خطوط خلايا ESCC المختلفة التي انتشرت في أطباق بتري لسنوات عديدة، أو حتى عقود. هذه الخطوط الخلوية ستتكيف مع ظروف الزراعة ولا تشبه الأورام الأصليةكثيرا. علاوة على ذلك، فإن خطوط خلايا ESCC مشتقة من مرضى مختلفين وتحمل تغيرات جينية وفوق جينية متنوعة، وهي متميزة بوضوح في خلايا ESCC المعنية، وتعمل كاختلافات بين المرضى. قد تكون النتائج التجريبية من خط خلايا سرطاني واحد غالبا غير متسقة مع نتائج سلسلة خلايا سرطانية أخرى. لذلك، قد تؤدي التجارب التي تستخدم خطوط خلايا ESCC مختلفة وCAFs غير المتطابقة مع المريض إلى صعوبة في معالجة تفاعلات هذه الخلايا بدقة بطرق قابلة للتكرار وموثوقة.

لمعالجة هذه القيود، تم تطوير بروتوكول لعزل الأعضاء الورمية المتطابقة مع المريض، وCAFs، والأرومات الليفية غير الورمية (CFs) في نفس الوقت من نفس العينة الجراحية ESCC. عادة ما تعيد الأعضاء المشتقة من المريض الخصائص المعمارية والظاهرية الرئيسية للأورام الأولية مع الحفاظ على التباين الجزيئي. شكلت الأعضاء السابقة الكروية تحت ظروف زراعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وأظهرت قدرة تكاثرية مستقرة. تم التأكد من أن كل من CAFs وCFs مثربة لمجموعات الخلايا الليفية الإيجابية للفيمنتين، وهو مؤشر للأرومات الليفية.

يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة وقابلة للتكرار لمعالجة الأنسجة، والتفكك الإنزيمي، وزرع العضويات، وعزل CAF/CF، ومرور الكلب، والحفاظ على التبريد. ولمساعدة الباحثين في تقييم التطبيق قبل التنفيذ، تم تضمين معلومات عملية: عادة ما تتكون الأورجينويدات خلال 3–5 أيام، وتصل إلى جاهزية الممر خلال 7–10 أيام، ويمكن توسيعها بشكل مستقر لأكثر من عشرة مرات. يمكن تمرير CAFs وCFs على الأقل لثمانية أجيال. يمكن حفظ العضويات والأرومات الليفية بالتجميد خلال حوالي 20 يوما. تصل معدلات نجاح التأسيس إلى حوالي 70٪ للأعضاء العضوية و80٪ للكائنات الكيميائية والCF. علاوة على ذلك، يتضمن اختبار وسط مشروط معتمد باستخدام وسط مكيف ب CAF أو CF، مما يوفر نهجا قويا لتقييم تأثيرات الخلايا البمثيرة على سلوك الورم العضوي. مجتمعة، تقدم هذه المنصة المتطابقة بين الورم العضوي والسترومال نموذجا تجريبيا وذو صلة بيولوجية للتحقيق في تفاعلات ESCC بين الأورام والسترومال ودعم تطوير استراتيجيات علاجية دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالأنسجة البشرية بموجب الموافقات المؤسسية المناسبة للسلامة البيولوجية وفي خزانة سلامة بيولوجية معتمدة. قدم المريض موافقة مستنيرة خطية، وتمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة أخلاقيات البحث في كلية الطب بجامعة جونتيندو. يظهر الشكل 1 نظرة عامة على الإجراء من البروتوكولات 2 إلى 6. تم تحديد تركيب وتركيزات كل مكون في وسط ESCC العضوي (Eso_v1) بناء على دراسات كيجيما وآخرون 14 ودراساتأخرى 15، 16، 17 مع تعديلات طفيفة فقط. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. المواد الكيميائية وتحضير الأنسجة

  1. جهز المواد الفعالة والمعدات.
    1. قم بتعقيم جميع الأدوات، بما في ذلك المقص والمقطاق والماصات، قبل بدء الإجراء.
    2. جهز 10 مل من محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS) في أنبوب بسعة 15 مل.
    3. جهز أنابيب منخفضة التثبيت بحجم 15 مل ووضع علامات عليها حسب مصدر العينة (مثل أنبوب غسل الورم (A)، أنبوب هضم الورم (B)، أنبوب الغسيل غير الورمي (C)، أنبوب الهضم غير الورمي (D)).
    4. تغطي الماصات عن طريق استنشاق وتوزيع مصل البقر الجنيني (FBS) 2–3 مرات لتقليل التصاق الخلايا أثناء المعالجة.
      ملاحظة: يمنع طلاء FBS شظايا الأنسجة من الالتصاق بالأسطح البلاستيكية أثناء التفكك الميكانيكي.
  2. تحضير المحاليل الإنزيمية
    1. تحضير محلول الإنزيم I لهضم الأورام عن طريق خلط 2.7 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو مع 10٪ FBS و1x بنسلين-ستربتوميسين (PS) (فيما بعد، DMEM/10٪ FBS)، 0.3 مل من 10 ملغ/ملتر كولاجناز، 0.15 مل من 10000 PU/mL dispase، و0.03 مل من 2.5 ميكروغرام/ملتر أمفوتريسين B. دافئ حتى 37 درجة مئوية.
    2. تحضير محلول الإنزيم II للهضم غير الورمي عن طريق خلط 2.7 مل من DMEM/10٪ FBS، و0.3 مل من 1 ملغ/مل كولاجناز، و0.03 مل من 2.5 ميكروغرام/مل أمفوتيرسين B. دافئ حتى 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يسهل الكولاجناز والديسباس تفكك نسيج الورم.
  3. تحضير وسط زراعة العضوية
    1. حضر وسط عضوي ESCC (Eso_v1 وسط) يحتوي على 60٪ وسط قاعدي عضوي، و40٪ وسط مكيف ب L-WRN18 (انظر الخطوة 1.4)، 50 نانوغرام/مل EGF (عامل النمو)، 1 ملليمولم N-أسيتيل-L-سيستين (مضاد أكسدة)، 5 ملليمول نيكوتيناميد (فيتامين قابل للذوبان في الماء)، 500 نانومال A83-01 (مثبط TGF-βR (يمنع نمو الأرومات الليفية))، 1x B-27 (مكمل زراعة خال من المصل)، 1x N-2 (مكمل زراعة خال من المصل)، و10 ميكرومولار Y-27632 (مثبط ROCK).
    2. عدل المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يوفر الوسط المكيف ب L-WRN (فائق من خلايا L-WRN) إشارات WNT وR-spondin وNoggin ضرورية لبدء العضويات. Y27632 موجود في الوسط طوال فترة الثقافة.
  4. تحضير وسط مكيف ب L-WRN
    1. قم بإذابة قارورة من خلايا L-WRN وزرعها في طبق بحجم 100 مم يحتوي على 10 مل من DMEM/10٪ FBS وزراعة لمدة يوم إلى يومين.
    2. استبدل الوسط ب 10 مل من DMEM/10٪ FBS يحتوي على G418 (آخر 500 ميكروغرام/مل) وهيغروميسين B (آخر 500 ميكروغرام/مل)، وزراعة الخلايا حتى تصل الخلايا إلى 80٪ التقاء الداخلي.
    3. تمرير الخلايا على طبقين بحجم 100 مم يحتوي على 10 مل من DMEM/10٪ FBS (مع G418 وHygromycin B) وزراعة حتى تصل الخلايا إلى 100٪ التقاء الداخلي.
    4. مرر الخلايا إلى خمسة أطباق بحجم 150 مم تحتوي على 20 مل من DMEM/10٪ FBS (بدون مضادات حيوية) لكل طبق وزراعة حتى 100٪ التقاء البعض.
    5. استنشق الوسط وتخلص منه من كل طبق بحجم 150 مم.
    6. أضف 25 مل لكل طبق من وسط الجمع (وسط قاعدي عضوي مع 5٪ FBS).
    7. احتضن لمدة 24 ساعة.
    8. اجمع الوسط من جميع الأطباق الخمسة (25 مل × 5 = 125 مل) في زجاجة زجاجية معقمة.
    9. كرر الخطوات 1.4.6–1.4.8 ليصبح المجموع 8 مجموعات (حجم الهدف المجمع: ~1,000 مل).
    10. قم بترشيح الCM المجمع باستخدام فلتر على الزجاجة.
    11. أليكوت 40 مل في 25 أنبوبا معقما بسعة 50 مل.
    12. تخزين السعرات عند −80 درجة مئوية.
  5. تحضير وسط زراعة الأرومات الليفية
    1. حضر فيبروبلاست متوسط-1.
    2. عدل المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  6. تحضير أطباق مناولة المناديل
    1. قم بصب عدة قطرات (من ثلاث إلى خمس) من FBS مع رأس P1000 على طبقين بحجم 100 مم لتكوين طبقة (Dish T للأنسجة الورمية، Dish N للأنسجة غير الورمية).
      ملاحظة: الطلاء FBS يعزز التقطيع الميكانيكي الأكثر نعومة ويمنع التصاق شظايا الأنسجة الصغيرة بسطح الطبق.
  7. مناولة الأنسجة وتحديد العينات
    1. تأكد من أن عينات الأورام وغير الأورام تنقل على الجليد.
    2. ضع المناديل على طبق بحجم 60 مم يحتوي على كمية صغيرة من DMEM/10٪ FBS وخزنها على الثلج حتى الاستخدام. ابدأ المعالجة خلال 16 ساعة من الاستئصال الجراحي للحفاظ على الصلاحية.
    3. تحديد نسيج الورم من خلال ملمسه الصلب وشكل سطحه غير المنتظم، الذي يختلف عن نسيج غير الورم.

2. معالجة الأنسجة، الغسيل، والهضم الإنزيمي

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لهضم الأورام المفروم ومقاطع الأنسجة غير الورمية باستخدام محاليل إنزيمية مختلفة.

  1. قم بتقطيع الورم والأنسجة غير الورمية
    1. انقل كل عينة من النسيج (حوالي 5 مم × 5 مم) إلى طبقها المغطى ب FBS الخاص بها (طبق T لأنسجة الورم وطبق N للأنسجة غير الورمية).
    2. قم بتقطيع كل نسيج إلى قطع بحجم ~0.5 مم باستخدام مشرط معقم.
      ملاحظة: الأجزاء الصغيرة تزيد من سهولة الوصول إلى الإنزيم وتحسن كفاءة الهضم.
  2. اغسل المناديل المفرومة.
    1. غط ماصة بحجم 10 مل ب FBS لمنع التصاق الأنسجة.
    2. أضف 5 مل من PBS إلى كل طبق باستخدام الماصة المطلية ب FBS وأعد تعليق النسيج المفروم بلطف.
    3. انقل التعليق إلى أنبوب غسل الورم المقابل (الأنبوب A) أو أنبوب الغسيل غير الورمي (الأنبوب C).
    4. كرر الخطوات 2.2.2 و2.2.3 (الحجم الكلي: 10 مل).
    5. اترك الأنابيب تبقى لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة؛ إزالة المادة الفائقة مع ترك حوالي 0.5–1 مل من PBS والأنسجة في الأسفل.
    6. أضف 10 مل من PBS الطازجة مع ماصة جديدة؛ بعد تغطية الماصة ب FBS، قم بعمل الماصة على التعليق بقوة مع تجنب تكون الفقاعات.
      ملاحظة: يساعد التوصيل القوي بالماصات في التفكك الميكانيكي وإزالة الدم والمخاط. تجنب الفقاعات يمنع تحلل الخلايا الناتج عن القص. جميع خطوات الغسيل تهدف إلى إزالة الحطام.
    7. اترك الأنابيب تبقى لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة؛ إزالة المادة الفائقة مع ترك حوالي 0.5–1 مل من PBS والأنسجة في الأسفل.
    8. كرر عملية الغسيل (الخطوات 2.2.6 و2.2.7) مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسولات.
  3. نقل الأنسجة إلى أنابيب الهضم.
    1. أضف 10 مل من PBS الطازجة مع ماصة جديدة؛ بعد تغطية الماصة ب FBS، يتم نقل نسيج الورم إلى أنبوب الهضم الورمي (الأنبوب B) والنسيج غير الورمي إلى أنبوب الهضم غير الورمي (الأنبوب D).
    2. اترك الأنابيب تقف لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم أزل الفائق مع ترك حوالي 0.5 مل من PBS والأنسجة في الأسفل.
  4. قم بإجراء الهضم الإنزيمي.
    1. هضم أنسجة الورم
      1. أضف كامل حجم محلول الإنزيم I (كولاجناز + ديسباس) إلى أنبوب الهضم الورمي (الأنبوب B).
      2. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين مع تدوير لطيف.
    2. هضم الأنسجة غير الورمية
    3. أضف الحجم الكامل من محلول الإنزيم II (الكولاجناز فقط) إلى أنبوب الهضم غير الورمي (الأنبوب D).
      1. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع تدوير لطيف.
    4. استمر في الخطوة 3 (معالجة عينات الورم) أو الخطوة 6 (بذر الأرومات الليفية المقابلة)، حسب أصل العينة.
      ملاحظة: تم تحديد أنواع الإنزيمات المستخدمة لهضم الأنسجة الورمية وغير الورمية، بالإضافة إلى أوقات المعالجة، بناء على تحسين تجريبي سابق. غالبا ما تحتوي أنسجة الأورام على مصفوفة خارجية كثيفة؛ التوزيع مع الكولاجناز يعزز القدرة الهضمية.

3. معالجة عينات الأورام لعزل الأعضاء وCAF

ملاحظة: تتم هذه الخطوة لعزل خلايا الورم الظهارية لتكون الخلايا العضوية والأرومات الليفية البمثابة (CAFs) من نفس عينات الورم المهضومة.

  1. تصفية وجمع الخلايا المشتقة من الأورام.
    1. ضع مصفاة خلايا بسعة 100 ميكرومتر على أنبوب مخروطي بسعة 50 مل.
    2. قم بترطيب المصفاة مسبقا بتمرير 3 مل من DMEM/10٪ FBS من خلالها.
      ملاحظة: يقلل الترطيب المسبق من فقدان الخلايا عن طريق منع الالتصاق بألياف الشبكة الجافة.
    3. انقل جميع محتويات أنبوب الهضم الورمي (الأنبوب B) إلى المصفاة باستخدام طرف P1000 مغطى ب FBS لإزالة شظايا الأنسجة غير المهضومة.
    4. أضف 6 مل إضافية من DMEM/10٪ FBS لغسل العناقيد المتبقية عبر المصفاة.
    5. قم بإزالة المصفاة وإعادة الترشيح إلى الأنبوب B (يمكن أيضا استخدام أنبوب جديد منخفض التثبيت بسعة 15 مل).
  2. اغسل وركز الفلترة.
    1. قم بجهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. أزل المادة الفائقة باستخدام ماصة ذات مرة واحدة.
    3. أضف 10 مل من DMEM/10٪ FBS، وامزجه بلطف عن طريق الانعكاس، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
    4. استنشق السوبرناتينت بعناية مع الاحتفاظ بالحبيبة.
    5. قلل الحجم المتبقي إلى 40 ميكرولتر باستخدام ماصة P200.
  3. خصص الخلايا لزراعة العضوية وزراعة CAF.
    1. خصص 30 ميكرولتر لزراعة العضويات.
    2. خصص 10 ميكرولتر لزراعة CAF.
      ملاحظة: توفر هذه النسبة تجريبيا تجمعات كافية من الخلايا الطهارية والأروى الليفية للتوسع المتوازي.

4. البذر العضوي (الزراعة ثلاثية الأبعاد)

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتحديد عضويات ESCC من تعليق خلوي مشتق من ورم.

  1. جهز قباب مصفوفة الأغشية القاعدية.
    1. قم بتسخين صفيحة 24 بئر قياسية إلى 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يؤدي تسخين اللوح مسبقا إلى تسريع تصلب قباب مصفوفة الغشاء القاعدي.
    2. اخلط 30 ميكرولتر من التعليق المشتق من الورم مع 90 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء البارد كالجليد (بنسبة 1:3).
    3. ضع 30 ميكرولتر لكل قبة على أربعة آبار.
    4. دع القباب تتصلب لمدة 15 دقيقة في حاضنة CO₂.
  2. إضافة وسيط زراعة الأورجينويد
    1. حضر وسط عضوي مع مكملات مخلوطة مسبقا (FGF10، SB202190، ومضادات حيوية مثل 1× أمفوتريسين B و100 ميكروغرام/مل بريموسين إذا تم استخدامها).
      ملاحظة: البئر 1: Eso_v1؛ البئر 2: Eso_v1 + 10 ميكرومولار SB202190؛ البئر 3: Eso_v1 + 100 نانوغرام/ملتر FGF10؛ البئر 4: Eso_v1 + 10 ميكرومولار SB202190 + 100 نانوغرام/مل FGF10 (التركيزات النهائية).
    2. أضف بلطف 1 مل من الوسط إلى كل بئر على طول الجدار.
    3. الحضانة تحت ظروف زراعة CO₂ القياسية.
    4. غير المتوسط كل 3-5 أيام.
      ملاحظة: الخلط المسبق للمكملات يمنع الحاجة إلى رمي كميات صغيرة مباشرة على قباب مصفوفة الغشاء الهشة. تضاف المضادات الحيوية فقط خلال أول 6 أيام بعد تأسيس العضوية. تحدد ظروف الزراعة (FGF10 +/-، SB202190 +/-) بناء على معدل النمو والشكل (ويفضل أن تكون كروية).
  3. راقب تكوين العضويات.
    1. راقب القباب يوميا باستخدام المجهر المقلوب.
      ملاحظة: الشكل المتوقع: اليوم 3–5 → الكرويدات المرئية؛ اليوم السابع إلى العاشر → الكروات الكثيفة جاهزة للمرور.
    2. تمر العضويات عندما تصل إلى حجم يقارب 100–200 ميكرومتر أو تظهر ازدحاما في القبة بنسبة 90٪ أو أكثر.

5. بذر CAF

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتحديد CAFs من تعليق خلوي مشتق من ورم.

  1. ضع بذور CAF على طبق مغطى بالكولاجين.
    1. جهز طبق مغطى بالكولاجين بحجم 60 مم يحتوي على 1.5 مل من متوسط الأرومات الليفية-1.
    2. أضف 10 ميكرولتر من ترشيح الورم المخصص لزراعة ال CAF.
    3. أضف مضادات حيوية مثل 1× أمفوتريسين B و100 ميكروغرام/مل بريموسين.
    4. الحضانة تحت ظروف زراعة CO₂ القياسية.
    5. غير المتوسط كل 3-5 أيام.
      ملاحظة: من الناحية التجريبية، غالبا ما يكون وسط الأرومات الليفية-1 أكثر ملاءمة من الأوساط الأخرى للاستقرار والنمو الأولي لسرطانات التليف الأكيمي والتليف السي. تضاف المضادات الحيوية فقط خلال أول 6 أيام.
  2. مراقبة نمو CAF
    1. راقب ظهور شكل المغزل الشبيه بالأرومات الليفية بدءا من الأيام 3–5.
    2. الخلايا الليفية الممرية عند 90٪–100٪ من التقاطع.
      ملاحظة: إذا حدث تلوث بالخلايا الظهارية، يمكن عزل الخلايا الليفية بشكل انتقائي عن طريق تعديل مدة التريبسين، حيث تنفصل الخلايا الليفية أسرع من الخلايا الظهارية أثناء المرور.

6. التصنيف في CF

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة للحصول على CFs متطابقة مع المريض من أنسجة غير ورمية مجاورة.

  1. اغسل وجهز الهضم غير الورمي.
    1. قم بالطرد المركزي لأنبوب الهضم غير الورمي (الأنبوب D) بقوة 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
    2. أزل المادة الفائقة باستخدام ماصة ذات مرة واحدة.
    3. أضف 10 مل من DMEM/10٪ FBS، وامزجه بلطف بالعكس، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
    4. استنشق السوبرناتانت بحذر، مع الاحتفاظ بالحبيبة.
    5. كرر الخطوات 6.1.3 و6.1.4 مرة أخرى.
  2. بذور CF على طبق مغطى بالكولاجين
    1. انقل التعليق بالكامل إلى طبق مطلى بالكولاجين بقطر 60 مم يحتوي على 1.5 مل من الميدروبلاست الليفية-1.
    2. أضف مضادات حيوية مثل 1× أمفوتريسين B و100 ميكروغرام/مل بريموسين.
    3. الحضانة تحت ظروف زراعة CO₂ القياسية.
    4. غير المتوسط كل 3-5 أيام.
      ملاحظة: مضادات حيوية تضاف فقط خلال أول 6 أيام.
  3. راقب نمو التليف الكيسي.
    1. راقب شكل المغزل الشبيه بالأرومات الليفية يبدأ في 3–5 أيام.
    2. الخلايا الليفية الممرية عند 90٪–100٪ من التقاطع.

7. انتقال الأعضاء والحفاظ على التجميد

  1. انتقال عضوي.
    ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو توسيع العضوية بمجرد وصولها إلى كثافة مناسبة.
    1. استنشق الوسط القديم واغسل كل بئر ب 1 مل من PBS.
    2. أضف 0.5 مل من التريبسين المسخن مسبقا كعضوي في كل بئر.
    3. استخدم رأس P1000 بقوة باستخدام حافة الطرف لتعطيل قبة ماتريكس الغشاء السفلي.
      ملاحظة: القص الميكانيكي يساعد في تفكيك مصفوفة الغشاء الكثيفة في القاع، مما يحسن الوصول إلى الإنزيمات.
    4. احتضن لمدة 10–15 دقيقة في حاضنة CO₂ حتى تذوب جميع الكتل الهلامية. تفكك الأعضاء إلى 20–50 كتلة خلية.
      ملاحظة: تجنب الانفصال الكامل للخلية الواحدة، لأنه يقلل من قابلية البقاء.
    5. اجمع نظام التعليق في أنبوب منخفض التثبيت بسعة 15 مل.
    6. اشطف البئر أربع مرات ب 0.5 مل من DMEM/10٪ FBS وانقل جميع الشطولات إلى نفس الأنبوب منخفض التصل.
    7. قم بجهاز الطرد المركزي للأنبوب عند حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
    8. أزل الفائق السوبرناتينت وأعد تعليق الرصاصة في الحد الأدنى من DMEM/10٪ FBS; اضبط حجم نظام التعليق إلى 80 ميكرولتر.
    9. امزج 80 ميكرولتر من التعليق العضوي مع 240 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء البارد كالجليد (بنسبة 1:3).
    10. قم بتغليف الخليط على صفيحة ذات 6 آبار مسخنة مسبقا (37 درجة مئوية)، مع 4–6 قبب لكل بئر.
    11. دع القباب تتصلب لمدة 15 دقيقة، ثم أضف 3 مل من Eso_v1 وسط (التركيب الأمثل في الزراعة الأولية عند الخطوة 4.2) لكل بئر.
    12. غير المتوسط كل 3-5 أيام.
      ملاحظة: تمر العضويات عندما تصل إلى قطر يقارب 100–200 ميكرومتر أو عندما يتجاوز ازدحام القبة 90٪. لا يتم إجراء عد الخلايا. في الزراعة الفرعية الروتينية، يتم تقسيم الأعضاء بنسبة 1:4 إلى 1:10. من المتوقع حدوث تجدد سريع للكرويدات خلال 48–72 ساعة.
  2. الحفظ بالتبريد العضوي
    1. اغسل كل بئر ب 3 مل من PBS.
    2. أضف 1.5 مل من التربسين كعضو عضوي في كل بئر، استخدم الماصة بقوة، واحتضن لمدة 10 دقائق.
    3. اجمع التعليق بالكامل في أنبوب منخفض التثبيت بسعة 15 مل واغسل البئر أربع مرات.
    4. قم بطرد مركزي للأنبوب عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق وإزالة السوبرناتان.
    5. أعد تعليق الحبيبة في 2 مل من 90٪ FBS و10٪ DMSO.
    6. أليكوت 0.5 مل في كل مبرد.
    7. ضع القوارير في حاوية مجمدة وخزنها عند −80 درجة مئوية طوال الليل.
    8. نقل القوارير إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
      ملاحظة: يتم تخزين العضويات عندما يصل قطرها إلى حوالي 100–200 ميكرومتر أو عندما يتجاوز ازدحام القبة 90٪.
  3. استعادة العضويات المجمدة
    1. قم بإذابة التجميد بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    2. انقل المحتويات إلى 5 مل من DMEM/10٪ FBS في أنبوب بسعة 15 مل.
    3. قم بجهاز الطرد المركزي في الأنبوب عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
    4. أزل المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 40–60 ميكرولتر من DMEM/10٪ FBS.
    5. اخلط التعليق مع مصفوفة الغشاء البارد جدا بنسبة 1:3.
    6. قم بتغليف الخليط على لوح مسخن مسبقا مكون من 6 آبار (37 درجة مئوية) على شكل 4–6 قبب لكل بئر.
    7. دع القباب تتصلب لمدة 15 دقيقة، ثم أضف 3 مل من Eso_v1 وسط (التركيب الأمثل في الزراعة الأولية عند الخطوة 4.2) لكل بئر.

8. مرور الأروى الليفية والحفاظ على التجميد

  1. مركبات CAF وCFs الجارية
    ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو توسيع الخلايا الليفية بمجرد وصولها إلى كثافة مناسبة.
    1. اغسل الصحن ب 2 مل من PBS.
    2. أضف 0.4 مل من 0.25٪ تريبسين.
    3. حضن لمدة 5 دقائق في حاضنة CO₂، مع مراقبة الانفصال تحت المجهر.
    4. قم بتحييد التربسين باستخدام DMEM/10٪ FBS وانقل كامل تعليق الخلية إلى طبق بحجم 100 مم يحتوي على 10 مل من الوسط.
      ملاحظة: تمر الأرومات الليفية عندما تصل إلى 90٪ إلى 100٪ من التلاقي. بالنسبة للثقافات الفرعية الروتينية، يتم تقسيمها بنسبة 1:3. تجريبيا، يتباطأ أو يتوقف تكاثر الأرومات الليفية عندما تكون كثافة الخلايا منخفضة.
  2. حفظ الأرومات الليفية بالتبريد
    1. اغسل الخلايا ب 5 مل من PBS.
    2. أضف 1 مل من 0.25٪ تريبسين، ثم حضن لمدة 5 دقائق في حاضنة CO₂.
    3. قم بتحييد التربسين باستخدام DMEM/10٪ FBS وانقل كامل تعليق الخلية إلى أنبوب بسعة 15 مل.
    4. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
    5. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في 2 مل من 90٪ FBS/10٪ DMSO.
    6. أليكوت 0.5 مل في كل مبرد.
    7. ضع القوارير في حاوية مجمدة وخزنها عند −80 درجة مئوية طوال الليل.
    8. انقل القوارير إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.

9. اختبار الوسط المشروط

ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو تقييم التأثيرات الباراكرينية للأرومات الليفية على عضويات الأورام في ESCC باستخدام وسط مكيف (CM). يوفر هذا الاختبار نموذجا قابلا للتكرار بين الستروما والورم عندما لا يتم تحسين الزراعة المباشرة بعد.

  1. تحضير الوسط المكيف ب CAF/CF
    1. زراعة نفس عدد ال CAFs أو CFs في 3 مل من DMEM/10٪ FBS على أطباق 60 مم حتى تلاقي 80٪–90٪.
    2. اغسل الخلايا مرة واحدة ب 2 مل من PBS.
    3. أضف 3 مل من DMEM/2٪ FBS.
    4. حضانة لمدة 48 ساعة في حاضنة CO₂.
    5. اجمع المادة الفائقة في أنبوب بحجم 15 مل.
    6. الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوي.
    7. اجمع 2.5 مل من المادة الفائقة في أنبوب جديد بسعة 15 مل.
    8. أليكوت الوسط المكيف إلى أجزاء تتراوح بين 100–500 ميكرولتر وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  2. تحضير وسط اختبار العضوي
    1. جهز وسط عضوي ESCC كما هو موضح في الخطوة 1.3.
    2. اخلط الوسط العضوي والوسط المكيف بنسبة 1:1 (50٪ v/v).
  3. زراعة العضويات السرطانية باستخدام وسط اختبار العضويات.
    1. بعد مرور الأعضاء كما هو موضح في الخطوة 7، يتم إدخال الأعضاء العضوية في قبة واحدة بسعة 20 ميكرولتر من نوع مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر على صفيحة 48 بئر مسخنة مسبقا (37 درجة مئوية).
    2. بعد تصلب القبة، أضف 0.3 مل من وسط اختبار العضوية إلى كل بئر.
    3. استبدل وسط الفحص العضوي كل 3-7 أيام.
    4. تقييم شكل وحجم الأعضاء العضوية السرطانية.
      ملاحظة: جميع المواد المشتقة من الإنسان تعامل على أنها قد تكون معدية. يتم دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات والكمامات والنظارات الواقية. قد يسبب الكولاجيناز، والديسباس، وثنائي ميثيل كسلفوكسيد (DMSO) تهيج الجلد والعين والتنفس؛ لذلك، يتم تجنب الاتصال المباشر والاستنشاق. تجرى جميع الإجراءات الإنزمية التي تشمل الأنسجة البشرية وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية. يتم جمع النفايات السائلة التي تحتوي على أنسجة بشرية في حاويات بيولوجية محكمة الإغلاق ويتم تعقيم النفايات قبل التخلص منها. يتم التخلص من النفايات الكيميائية، بما في ذلك DMSO والمحاليل الإنزيمية، وفقا لإرشادات النفايات الخطرة المؤسسية. جميع الأجهزة القابلة لإعادة الاستخدام تغسل بنسبة 70٪ إيثانول ويتم تعقيم التعقيم قبل إعادة الاستخدام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم أخذ عينات من الأنسجة من منطقة الورم ومنطقة غير ورمية مجاورة تقع على بعد 3 سم من الورم، وتم استئصالها جراحيا من مريض مصاب ب ESCC لم يتلق العلاج الكيميائي المساعد الجديد. تم عزل العضويات السرطانية وCAFs من منطقة الورم، بينما تم عزل CFs من المنطقة غير الورمية. تم تقطيع الأنسجة الجراحية إلى قطع بحجم حوالي 0.5 مم (الشكل 2A)، ثم عولجت إنزيميا، وبعدها تم عزل الأعضيات السرطانية والأرومات الليفية بشكل منفصل. احتاجت الأعضاء والأروميات الليفية إلى حوالي 18-21 يوما ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

استخدمت التقارير السابقة العضويات السرطانية وأنواع CAF المطابقة للمريض للتحقيق في دور CAFs في تكاثر ومقاومة الأدوية في سرطانات القولون والثدي والبنكرياس وسرطان الرأس والرقبةالبشرية 20,21,22,23,24. أظهرت هذه الدراسات أن CAFs تؤثر على التكاثر ومقاومة الأدوية. من ناحية أخرى، حسب أفضل المعرفة الحالية، لا توجد تقارير منشورة تصف است...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل جائزة الباحث الشاب من جامعة جونتيندو (2024 و2025) لبي. ز. ومنح للبحث العلمي من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان (23K07362، 21K08693). نود أن نشكر جميع أعضاء أقسام علم الأمراض والأورام، وقسم جراحة المريء والجهاز الهضمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق 100 ممTPP93100
100x بنسلين-ستريبتوميسين (PS)ناكالاي26253-84
أنبوب 15 ملفاست جينFG2001
لوحة زراعة الخلايا ذات 24 بئرTPP92024
لوحة زراعة الخلايا ذات 48 بئرTPP92448
أنبوب 50 ملفاست جينFG2004
طبق 60 ممTPP93060
لوحة زراعة الخلايا ذات 6 آبارTPP92006
A83-01كايمان9001799
DMEM/F12 المتقدمة جيبكو12634010الوسط القاعدي العضوي = DMEM/F12 متقدم + جلوتاماكس + 1x PS
جهاز Alexa488 مضاد للفأرة IgGإنفيتروجينA11029
أمفوتيرسين Bثيرموفيشر15290018
الأجسام المضادة المضادة للفيمنتين (V9)سانتا كروزSC-6260تخفيف 1/500 للاستخدام
B-27ثيرموفيشر17504044
فلتر الزجاجةسارتوريوس180F15
مصفاة الخلايا، 100 وميكرو؛ م بوربي دي فالكون352360
كولاجناز، النوع الأولسيغماC0130
ديش 60 مم مغطاة بالكولاجينإيواكي4010-010
كبريتات ثنائي الميثيل (DMSO)واكو043-07216
Dispase Iجودو شوسي386-02271
دولبيكو الوسيط المعدل (DMEM)ناكالاي08459-64
إكليبس Ti2نيكون
مصل الأبقار الجنيني (FBS)سيراناS-FBS-CO-015
متوسط نمو الأرومات الليفية 2بروموسيلC-23020متوسط الأرومات الليفية-1 = متوسط نمو الأرومات الليفية 2
G418إنفيفوجينالنملة-GN-1
غلوتا ماكس جيبكو35050061
HFDM-1KSK87-160الأرومية الليفية المتوسطة-2 = HFDM-1 + 1٪ FBS + 1 × PS
Hoechst33342 ناكالاي04929-82
هيغروميسينإنفيفوجينant-hg-1
نظام إنكيوسايتإيسن للعلوم الحيوية
خلايا L-WRNATCCCRL-3276
ماتريجيلكورنينغ354234مصفوفة الغشاء القاعدي = المادة
N2ثيرموفيشر17502048
ن-أسيتيل-إل-سيستينواكو017-05131
نيكوتيناميدTCIN0078
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ناكالاي14249-24
بريموسينإنفيفوجينANT-PM-05
EGF البشري المؤتلفبيبروتيكAF-100-15
FGF-10 البشري المؤترخبيبروتيكPEP-100-26
SB202190سيليكS1077
المشرط، رقم 11ريشة8-3086-02
STEMFULLباكليت سوميتوموMS-90150أنبوب 15 مل منخفض التثبيت = STEMFULL
TrypLE Expressجيبكو12605028تريبسين للأورجينويد = TrypLE Express
تريبسنناكالاي35556-44
Y-27632سيليكS1049

المراجع

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Abbas, G., Krasna, M. Overview of esophageal cancer. Ann Cardiothorac Surg. 6 (2), 131-136 (2017).
  3. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  4. Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
  5. Lordick, F., et al. Oesophageal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 27 (suppl 5), v50-v57 (2016).
  6. Chhabra, Y., Weeraratna, A. T. Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity. Cell. 186 (8), 1580-1609 (2023).
  7. Caligiuri, G., Tuveson, D. A. Activated fibroblasts in cancer: Perspectives and challenges. Cancer Cell. 41 (3), 434-449 (2023).
  8. Mezawa, Y., Orimo, A. The roles of tumor- and metastasis-promoting carcinoma-associated fibroblasts in human carcinomas. Cell Tissue Res. 365 (3), 675-689 (2016).
  9. Mezawa, Y., Orimo, A. Phenotypic heterogeneity, stability and plasticity in tumor-promoting carcinoma-associated fibroblasts. FEBS J. 289 (9), 2429-2447 (2022).
  10. Qiu, L., et al. Cancer-associated fibroblasts: An emerging target against esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 546, 215860(2022).
  11. Xue, M., Tong, Y., Xiong, Y., Yu, C. Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 13, 1257266(2023).
  12. Dunbar, K. J., Wong, K. K., Rustgi, A. K. Cancer-associated fibroblasts in esophageal cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 17 (5), 687-695 (2024).
  13. Pimkhaokham, A., et al. Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: Possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res. 91 (11), 1126-1133 (2000).
  14. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  15. Fuchino, T., et al. Characterization of residual cancer by comparison of a pair of organoids established from a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy. Hum Cell. 37 (2), 491-501 (2024).
  16. Shen, S., et al. Advancing precision medicine in esophageal squamous cell carcinoma using patient-derived organoids. J Transl Med. 22 (1), 1168(2024).
  17. Zhang, S., Wang, C. Protocol to establish patient-derived xenograft and organoid for radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma. STAR Protoc. 5 (4), 103273(2024).
  18. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  19. Mashima, Y., et al. KIF24 depletion induces clustering of supernumerary centrosomes in PDAC cells. Life Sci Alliance. 5 (11), e202201470(2022).
  20. Hogstrom, J. M., et al. Simultaneous isolation of hormone receptor-positive breast cancer organoids and fibroblasts reveals stroma-mediated resistance mechanisms. J Biol Chem. 299 (8), 105021(2023).
  21. Schuth, S., et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 312(2022).
  22. Farin, H. F., et al. Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses. Cancer Discov. 13 (10), 2192-2211 (2023).
  23. Zapatero, M. R., et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 187 (25), 7335-7349 (2024).
  24. Rademaekers, M., Johansson, E. O., Johansson, E., Roberg, K., Wiechec, E. Tumor-matched and unmatched cancer associated fibroblasts exhibit differential effect on proliferation and FMOD and MMP9 gene expression in head and neck squamous cell carcinoma cells when co-cultured in spheroids. Cancer Cell Int. 24 (1), 190(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عضويات سرطان المريء الخلايا الحرشفيةالبيئة الدقيقة للورمعلامات الخلايا الليفيةالخلايا الليفية المتطابقة مع المريضالزراعة ثلاثية الأبعادالتفاعلات بين الورم والسدى
تأسيس أعضاء الأورام، والأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان الورمي، والأرومات الليفية المتوافقة من نفس مريض سرطان المريء
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.