يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

علم الأمراض المخططة الناتج عن الفيروسات اللينتيفيرالية كنموذج ما قبل سريري لترنح الدماغ العمودي الدماغي المضحك بالبوليغلوتامين

419 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69550

⸱

مارس 13, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

في هذه المقالة

ملخص

تحدث ترنح البوليغلوتامين الشوكي المخيخي نتيجة توسعات CAG التي تنتج بروتينات عرضة للتجمع. يصف هذا البروتوكول إنتاج الناقلات، وتوصيل الإشارات المجسمة، وتحليل الشوائب وفقدان العلامات العصبية، موفرا منصة محكمة لدراسة الآليات وتقييم العلاجات المستهدفة للأمراض التنكسية العصبية.

الملخص

الترنح العصبي متعدد الجلوتامين الشوكي المخيخي هو مجموعة من ستة أمراض تنكسية عصبية ناجمة عن طفرة في مسار CAG ثلاثي النيوكليوتيد ضمن منطقة الترميز لكل جين مسبب. تؤدي هذه الطفرة إلى توسع غير طبيعي في البوليغلوتامين في البروتين، مما يجعله عرضة للتجمع وتكوين شوائب داخل الخلايا العصبية، وهي سمة مميزة لهذه الأمراض. الآليات الجزيئية التي تقوم عليها مسببات هذه الأمراض معقدة وغير مفهومة بالكامل. حتى الآن، لا تزال هذه الأمراض غير قابلة للشفاء. فهم الآليات الجزيئية في المناطق الدماغية الضعيفة أمر ضروري لتطور العلاج. هناك حاجة إلى منصات تجريبية مرنة وخاصة بالمنطقة لاختبار الآليات والتدخلات بسرعة دون الحاجة إلى الوقت والتكلفة لتوليد عدة خطوط معدلة وراثيا، حتى وإن لم تعالج الثغرات الانتقائية. في السنوات الأخيرة، طورنا نحن وآخرون عدة نماذج تعتمد على العدسات لدراسة تأثير توسع التعبير البروتيني في مناطق محددة من الدماغ. تظهر هذه النماذج خصائص عصبية مرضية وسلوكية تحاكي بعض سمات المرض، مما يبرز أهميتها في فهم المرض وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة. في هذه الورقة، نصف تطوير نموذج مخطط باستخدام SCA2 كمثال. نسلط الضوء على تطور وإنتاج ناقل الفيروسات العدسية، والحقن الستيريوتاكسي للناقلات التي تعبر عن الشكل الموسع للأتاكسين-2 (البروتين المسبب للمرض). وأخيرا، نصف علامتين رئيسيتين للأمراض العصبية: تكوين الشوائب وفقدان العلامات العصبية. من خلال توفير منصة محكمة تعيد إنتاج هذه السمات المرضية الرئيسية، يقدم هذا النموذج أداة قيمة لتحليل آليات التنكس العصبي الخاصة بالمنطقة وتقييم التدخلات العلاجية المستهدفة.

المقدمة

ترنيلات البوليغلوتامين الشوكي المخيخية (polyQ SCAs) هي مجموعة من ستة اضطرابات عصبية تنكسية جسدية سائدة ناجمة عن توسعات متكررة ثلاثية النيوكليوتيدات في CAG في جينات مسببة مختلفة، مما يؤدي إلى مسارات البوليغلوتامين السامة (polyQ) داخل البروتينات المشفرة1. من بينها، أكثر حالات SCA متعددة الأنواع شيوعا هي مرض SCA3/ماتشادو-جوزيف وSCA22. تؤثر هذه الاضطرابات بشكل أساسي على الخلايا العصبية في مناطق محددة من الدماغ، بما في ذلك المخيخ وجذع الدماغ، بالإضافة إلى المخطيات ومناطق أخرى. وبالتالي، تسبب اضطرابات في التنسيق الحركي التدريجي، اضطرابات في المشي، تنكس عصبي شديد، وموت مبكر3.

تم تطوير عدة نماذج حيوانية لدراسة SCAs متعدد الأنواع ولاختبار الأساليب العلاجية. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا، وخطوط الضرب، ونماذج الفئران ذات التعبير الشرطي لتوضيح الأساس الجزيئي لتقدم المرض والمسارات الخلوية المشاركة4،5. ومع ذلك، فإن إنشاء نموذج حيواني جديد للمرض يستغرق وقتا طويلا ومكلفا، وغالبا ما لا يكون مناسبا لدراسة مشاركة الدماغ الإقليمية في مسببات الأمراض6.

تقدم نماذج الفئران القائمة على لينتيفيرال (LV) بديلا مكملا للنماذج التقليدية، مع تكلفة أقل وإمكانية دراسة مناطق محددة من الدماغ 7,8. تسمح ناقلات فيروس اللينتي بتوصيل الجينات المنقولة الكبيرة (حتى 8 كيلوبايت)، مما يؤدي إلى تحفيز سريع للأمراض في مناطق محددة في الدماغ دون الحاجة لتعديل الخط الجرثوي، ويمكن استخدامها في الحيوانات من أعمار مختلفة. يمكن أن يحقق الحقن المباشر للناقلات الفيروسية العدسية في منطقة الدماغ المستهدفة تعبيرا خاصا بمنطقة محددة للجينات الممرضة أو العلاجية مع قدرة مناعية أقل مقارنة بناقلات فيروسية أخرى4. علاوة على ذلك، يتجنب الولادة بعد الولادة تعويض النمو لدراسة آليات المرض في ظروف تشبه إلى حد كبير بداية الإنسان9. يمكن تعديل مستويات التعبير عن طريق تعديل جرعة الفيروس، مما ينتج نمطاطا ظاهريا مضبوطة من شدة المرض ويسهل نمذجة تقدم المرض بدرجات معينة. بالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الطريقة بالتعبير الخاص بنوع الخلية اعتمادا على المروجالمختار 4,7.

أظهرت عدة دراسات عملية وفائدة نماذج الفئران المعتمدة على LV لنمذجة SCAs متعدد Q 10,11,12,13. طورنا نحن وآخرون نماذج قائمة على LV ل SCA11 وSCA212 وSCA311 و12 وSCA714، مما شكل منصات للتعبير السريع أو الإسكات لجينات الأمراض المحددة للمنطقة مع إعادة إنتاج الجوانب الرئيسية لعلم الأمراض العصبية.

باختصار، يوفر النهج الفيروسي اللينتيفيروسي الموضح هنا أداة متعددة الاستخدامات وفعالة لنمذجة مسببات المرض في SCAs متعدد القيود. من خلال التغلب على بعض العيوب الرئيسية في النماذج الحيوانية الحالية، تسرع هذه الطريقة دراسات إثبات المفهوم وتوفر تحكما أكبر في بداية المرض، وتحديد موقعه، وشدة المرض - وهي ميزات تجعلها مناسبة للغاية للفحص العلاجي ودراسة الآليات الجزيئية. هنا، نصف طريقة قابلة للتكرار لإنشاء وتوصيف نموذج فيروسي مخطط لاضطراب البوليغلوتامين الشوكي المخيخي الشوكي، مما يتيح تحليلا تفصيليا للأحداث الممرضة المبكرة وتقييم العلاجات المرشحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لإرشادات أبحاث الحيوان: الإبلاغ عن تجارب الحياة الحية (ARRIVE) ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل إدارة الطب البيطري والبيطري (DGAV). تم استخدام فئران C57BL/6J في هذه الدراسة وتم وضعها في أقفاص قياسية تحت دورة إضاءة 12 ساعة و12 ساعة ظلام، مع توفير الطعام والماء بحرية اللازم.

ملاحظة: المواد المستخدمة في هذا البروتوكول موصوفة بشكل أوسع في جدول المواد.

1. تغليف ناقلات الفيروسات العدسية

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بناقلات الفيروسات العدسية في مختبر BSL-2 وفقا لإرشادات السلامة الخاصة بالمؤسسة. استخدمنا نظام النقل الفوري الأربعة بسبب سلامته البيولوجية الأعلى مقارنة بأنظمة إنتاج الفيروسات العدسية الأخرى (انظر الشكل 1 لتفاصيل البلازميد المنتقل).

  1. قم بإذابة خلايا HEK 293T في حمام مائي وزرعها في قارورة T75 باستخدام وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 2 ملليموتر L-جلوتامين، 10٪ FBS، و1٪ Pen-Strep. تم استخدام هذا الوسيط الكامل DMEM في جميع خطوات البروتوكول. استخدم الخلايا عند الممر رقم ≤10 لضمان عدادات فيروسية عالية ونتائج متسقة.
    ملاحظة: تحقق دائما من وجود تلوث بالميكوبلازما قبل المتابعة.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪-90٪، قم بتوسيعها إلى قارورتين T175 عن طريق تقسيم الزراعة الأولية بنسبة 1:2. قم بزرع 20 طبق زراعة بحجم 100 مم بحجم 3.8 × 10و6 خلايا لكل طبق (الحجم النهائي 10 مل) وحضنها لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ CO. عد الخلايا باستخدام استبعاد الأزرق التريبان باستخدام جهاز قياس الدم النويباوري.
    ملاحظة: فكر في استبعاد Pen-Strep من الوسط لتقليل إجهاد الخلية، وبالتالي تعظيم نقل الخلية.
  3. في اليوم التالي، حضر خليط النقل كما هو موضح في الجدول 1. دوامة ودورانا لفترة وجيزة ليتم التجانس. حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10–20 دقيقة للسماح بتكوين مجمعات DNA: PEI.
  4. بعد الحمض النووي DNA: تم السماح لمجمعات PEI بالتكون لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم عدل الخليط إلى 5 مل مع DMEM كامل.
    أزل 5 مل من الوسط من كل طبق زراعة (نصف الحجم الكلي) واستبدله بخليط 5 مل من التحويل. وهذا يحافظ على حجم الزراعة النهائي عند 10 مل أثناء التحويل.
  5. قم بتحويل الخلايا باستخدام البلازميدات الثلاث التي تحتوي على التعبئة والبلازميد الناقل كما هو موضح في الجدول 1.
    ملاحظة: يجب تجهيز جميع البلازميدات المستخدمة لإنتاج الفيروسات العدسية باستخدام مجموعات تنقية خالية من السموم الداخلية. علاوة على ذلك، يجب التحقق من سلامة البلازميد من خلال تحليل إنزيمات التقييد لتأكيد صحة مناطق LTR وشريط الجين المعدل قبل النقل.
  6. أضف 5 مل من خليط النقل الداخلي إلى كل لوح وحضن لمدة 6 ساعات. استنشق كل الوسط واستبدله ب 10 مل من الوسط الطازج. احتضن لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: لزيادة عيار الفيروس، اجمع الوسط عند 48 ساعة، أضف 10 مل من الوسط الطازج إلى كل طبق، ثم اجمع مرة أخرى بعد 24 ساعة. يمكن تخزين الوسط الذي تم جمعه سابقا عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. هذا يسمح بتركيز ضعف الحجم ويزيد من عيار الفيروس.
  7. تصفية جميع الوسط المكيف الذي يحتوي على ناقلات فيروسات عدسية باستخدام وحدة مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر.

2. تنقية ومعايرة ناقلات الفيروسات العدسية

  1. انقل المادة الفائقة المفلترة إلى أنابيب الطرد المركزي المخروطي المناسب وجهاز الطرد المركزي عند 65,000 × g لمدة ساعة و30 دقيقة عند 4 درجات مئوية، باستخدام دوار دلو متحرك.
  2. تخلص من المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق كل حبيبة في 400 ميكرولتر من 1٪ BSA مخففة في 1x PBS، لتجنب تكون الفقاعات. احتضن الحوض على الثلج لمدة ساعة على الأقل.
  3. بعد ساعة من الحضانة، اخلط كل أنبوب بلطف لضمان أن الحبيبات معاد تعليقها بالكامل ومتجانسة، ثم تجمع جميع الحبيبات المعلقة في أنبوب واحد.
  4. املأ الأنبوب بنسبة 1٪ BSA/PBS حتى يمتلئ ثلثيه على الأقل لمنع الانهيار أثناء الطرد المركزي.
  5. استخدم جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 65,000 × جرام لمدة ساعة و30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإطلاق ناقلات الفيروسات العدسية. تخلص من السائل العلوي بعناية وجفف حافة الأنبوب بورق معقم.
  6. أعد تعليق الحبيبة التي تحتوي على ناقلات الفيروسات العدسية في 45 ميكرولتر من 1٪ BSA/PBS، لتجنب الفقاعات. أغلق الأنبوب بفيلم شفاف وقم بالحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
  7. في اليوم التالي، حضر 10 ميكرولتر من ناقلات الفيروسات العدسية. احتفظ بمقياس 10 ميكرولتر للمعايرة: 5 ميكرولتر لمجموعة p24 ELISA و2 ميكرولتر لمجموعة qPCR. قم بتعديل ناقلات الفيروسات العدسية باستخدام ELISA و qPCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: اختيار طريقة المعايرة يعتمد على الاحتياجات التجريبية، مثل التقييم السريع أو القياس الدقيق للوحدات المعدية. يقوم ELISA المبني على p24 بقياس بروتين الكبسيد وبالتالي يقيس الجسيمات الفيزيائية الكلية؛ إنه سريع، أقل تكلفة من الطرق الأخرى، وقابل للتكرار بشكل كبير. ومع ذلك، لا يميز بين الجسيمات المعدية وغير المعدية، مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير العيار الوظيفي. يقيس المعايرة المعتمدة على qPCR عدد الجينومات الفيروسية (vg) المعبأة في الجسيمات، مما يوفر تقديرا أكثر دقة للفيرويون المحتوية على الجينوم ويسمح بالمقارنة المباشرة بين تحضيرات الناقل. ومع ذلك، لا يزال غير قادر على تقييم فعالية عدوى الجسيمات الفيروسية. أخيرا، تقيس الاختبارات القائمة على العدوى، مثل قياس التدفق الخلوي للناقلات الفلورية أو تكوين مستعمرات مقاومة المضادات الحيوية بشكل مباشر وحدات التحويل الوظيفي (TU/ml) وهي الأكثر صلة بيولوجيا، رغم أنها أكثر كثافة للجهد وتعتمد على نوع الخلية، وتستغرق وقتا طويلا، وأكثر تكلفة15,16.

3. الجراحة الستيريتاكسية لتوليد الفيروسات الثنائية في المخطط الفأري

  1. تحضير الحيوانات
    1. قم بوزن الحيوان وحساب الجرعة المطلوبة من التخدير. أعط التخدير داخل الصفاق بجرعة 10 ميكرولتر/جم من وزن الجسم باستخدام محلول جاهز. يتم تحضير هذا المحلول بدمج 7.5 مل من 0.9٪ NaCl، و500 ميكرولتر من الميديتوميدين (1.0 ملغ/مل)، و1.0 مل من ميدازولام (5.0 ملغ/مل)، و1.0 مل من الفنتانيل (0.05 ملغ/مل)، ليصبح الحجم النهائي 10 مل. اترك حوالي 10 دقائق لتحفيز التخدير الكامل.
    2. أكد عمق التخدير (مثل رد فعل قرص إصبع القدم). ضع مرهم العيون على كلتا العينين واحلق فروة الرأس.
    3. ضع الحيوان في إطار الستيريوتاكسيك على وسادة تدفئة. ضع الرأس باستخدام قضبان الأذن وقضيب العض.
      ملاحظة: عدد الحيوانات التي يجب حقنها والجدول الزمني يعتمدان على التجربة ويجب تحديده من خلال تحليل القوة الإحصائية المبدئية بناء على الفرضيات المحددة وأحجام التأثير المتوقعة. على سبيل المثال، في دراستناالسابقة 12، تم تحليل الأدمغة المحقونة بعد 4 و8 و12 أسبوعا من الحقن لتقييم تقدم التغيرات العصبية المرضية.
  2. تحضير الحقنة وتحميل الفيروسات
    1. استخدم إبرة هاميلتون القياسية للتحميل وإبرة رأس 26G للحقن. تحميل 2 ميكرولتر من محلول الفيروس اللينتيفيروسي في المحقنة. تأكد من أن الجرعة الفيروسية لكل موقع حقن هي 400 نانوغرام من مستضد p24/مل، أو 5 ×10 9 IU/mL10، 12، 17.
    2. قم بتركيب الحقنة في مضخة الحقن الدقيقة الآلية (مثل Stoelting). قم بتهيئة الحقنة في وضع التسريب حتى تظهر قطرة سائل عند طرف الإبرة. تأكد من أن الميل موجه للأمام.
    3. اضبط معايير المضخة - السرعة: 0.25 ميكرولتر/دقيقة، الحجم لكل نصف كرة: 2 ميكرولتر، نوع الحقنة: مناسب لما يستخدم.
      ملاحظة: حجم الحقن يعتمد على نوع القوارض والمنطقة المستهدفة في الدماغ التي سيتم تحويلها. حقن 1 ميكرولتر ستؤدي إلى تعبير بؤري، بينما تتطلب الأحجام الكلية الأكبر (حتى 10 ميكرولتر) معدلات حقن بطيئة جدا وتحمل خطرا أكبر لتعطل الأنسجة أو الارتجاع.
  3. الاستهداف والحقن المخططات
    1. عقم فروة الرأس بنسبة 70٪ إيثانول. قم بعمل شق في منتصف المنتصف (~1–1.5 سم) باستخدام شفرة مشرط معقمة من بين الأذنين والعينين.
    2. كشف الجمجمة ونظفها، وإزالة الشاحاحة باستخدام أعواد قطنية. حدد موقع بريغما وسجل نقطة الصفر الستيريوتاكسية (يدويا أو رقميا).
    3. تحديد إحداثيات الحقن بالنسبة للبريغما (لفأر عمره 8-12 أسبوعا ويحمل تقريبا 18-20 جرام): الجزء الأمامي الخلفي (AP) +0.6 مم؛ المتوسط الجانبي (ML) ±1.8 مم؛ الظهر البطني (DV): –3.3 مم.
    4. قم بالتدريب بعناية عند إحداثيات AP/ML المحددة. تقدم ببطء لتجنب اختراق الدماغ. بدلا من ذلك، توقف بمجرد أن يصبح العظم رقيقا بما فيه الكفاية - وهذا يدل على رؤية الأوعية الدموية في الجاف الأم عبر الجمجمة. ثقب الجافة بحذر بإبرة صغيرة.
    5. اختبر أن الثقب في الموضع الصحيح عن طريق خفض إبرة الحقن. اختبر عدم انسداد الإبر عن طريق حقن جزء من المحلول حتى يصبح قطرة واضحة للانخفاض.
    6. اخفض إبرة الحقن ببطء إلى إحداثي DV. حقن 2 ميكرولتر من محلول الفيروس لكل نصف كرة بمعدل 0.25 ميكرولتر/دقيقة. بعد الحقن، انتظر 5 دقائق قبل سحب الإبرة ببطء لتجنب الارتجاع.
    7. حقن ترميز اللينتيفيروس للبروتين البري (ATXN2WT أو ATXN3WT) في نصف الكرة الدماغي الواحد، وترميز اللينتيفيروس للبروتين الطافر/الموسع (ATXN2MUT أو ATXN3MUT) في الجانب المقابل (عشوائي أو محدد مسبقا)12,13.
      ملاحظة: باستخدام أطلس دماغالفأر 18، يمكن استهداف جميع مناطق الدماغ تقريبا بشكل ستيريوتكس خارج المخطط، بما في ذلك القشرة الدماغية، والحصين، والجوهر الأسود، والمخيخ. نظرا لأن المخيخ هو الموقع الأساسي للأمراض في SCAs، فإنه يمثل هدفا ذا صلة خاصة لتوصيل الناقلات. لتطوير نموذج الفأر SCA3 المخيخي هذا، استخدمنا إحداثيات 1.6 مم من الروسترال إلى لامبدا، 0 مم من الخط الأوسط، و1 مم بطني إلى سطح الجمجمة، مع ضبط شريط الفم عند −3.3، لضمان استهداف دقيق لقشرة المخيخ12,15.
  4. المراقبة أثناء الجراحة
    1. راقب حركة الشوارب وردود أفعالها. إذا لاحظت حركة، أعط جرعة تخدير إضافية (ثلث الحجم الأولي).
  5. إغلاق الجرح وتعافيه
    1. أغلق الشق بغرز نايلون 5-0 متقطعة 3–5. أعط مزيجا من الأدوية المضادة تحت الجلد بجرعة 10 ميكرولتر/جم وزن الجسم لعكس تأثيرات المخدر الأولي. يتم تحضير هذا المحلول بدمج 1.5 مل من 0.9٪ NaCl، و500 ميكرولتر من أتيباميزول (5.0 ملغ/مل)، و5.0 مل من فلومازينيل (0.1 ملغ/مل)، و3.0 مل من نالوكسون (0.4 ملغ/مل)، ليصبح الحجم النهائي 10 مل.
    2. ضع الحيوان في قفص تعافي نظيف فوق وسادة تدفئة وراقبه طوال الليل.
      ملاحظة: من المثالي أن تكون غرفة الحقن مجهزة بخزانة أمان بيولوجية لمعالجة الناقلات. يجب على الباحثين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف مختبر وقفازات وحماية للعين. يجب التخلص من جميع النفايات (مثل الإبر، الحقن، والمواد الملوثة) في حاويات معرضة للخطر البيولوجي وفقا للوائح المؤسسية والوطنية.

4. جمع الأنسجة، تحضيرها، ومعالجتها

  1. التحضير
    1. جهز جميع أدوات التشريح والحلول المطلوبة لقتل الموت الرحيم للفئران وجمع الأنسجة (مثل التخدير، 4٪ بارافورمالديهيد [PFA] في PBS).
    2. جهز 4٪ PFA مسبقا، وخزنها مجمدة، وقم بإذابة الطعم لا تزيد عن 24 ساعة قبل الاستخدام. تأكد من أن المحلول مبرد جيدا قبل التروية.
      تحذير: PFA سام. تعامل فقط داخل غطاء البخار مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) والتدريب.
    3. أعط جرعة قاتلة من بنتوباربيتال (100–200 ملغ/كجم، داخل الصفاق) لتخدير الحيوان. تأكيد التخدير العميق بغياب رد فعل قرص إصبع القدم؛ إذا استمر الانعكاس، أعط جرعة إضافية.
  2. التروية عبر القلب
    1. ضع الحيوان في جهاز التشريح وثبته. باستخدام الملقط، ارفع جلد البطن وقم بعمل شق عمودي صاعد بالمقص (الشكل 2A، السهم الوردي).
    2. ارفع اللفافة السطحية وقم بعمل شق علوي حتى يصبح الكبد مرئيا، لتجنب إصابة الأعضاء البطنية.
    3. اقطع الحجاب الحاجز أفقيا، ثم قم بتمديد الشق نحو الإبط (الشكل 2A، السهم الأبيض). انعكس وثبت جدار الصدر إلى الخلف.
    4. أدخل إبرة تروية في قمة البطين الأيسر، مع التأكد من عدم اختراق جدار البطين. قم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن باستخدام مقص ناعم (الشكل 2B).
    5. ابدأ التروية عبر القلب باستخدام 50 مل من بارافورمالديهيد 4٪ (PFA) البارد جدا بمعدل تدفق 1-2 مل/دقيقة.
      ملاحظة: غالبا ما يسبب المحلول البارد انحناء الذيل وارتعاش العضلات، وهو مؤشر على تدفق جيد للتروية.
  3. تشريح الدماغ
    1. جهز أنبوبا يحتوي على كمية كافية من PFA 4٪ لغمر الدماغ بالكامل. اقطع رأس الفأر بمقص كبير. تخلص من الجثة في كيس بيولوجي مغلق للحرق.
    2. اعكس فروة الرأس لكشف الجمجمة. حدد الثقبة الكبرى وابدأ بإزالة الجمجمة عن طريق القطع الجانبي بمقص دقيق، بشكل مواز للدماغ (الشكل 2C).
    3. كرر العملية على الجانب المقابل، ثم اقطع الجمجمة بين العينين فوق البصيلات الشمية.
    4. ارفع الجمجمة من المخيخ نحو البصيلات الشمية لكشف الدماغ. باستخدام الملعقة، أزل الدماغ بحذر من الخلف إلى الأمام وغمره في 4٪ من PFA لمدة لا تزيد عن 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    5. استبدل محلول التضمين ب 20٪-30٪ سكروز في PBS وحضن عند 4 درجات مئوية حتى يكتمل التسرب. في البداية يطفو الدماغ ثم يغوص بمجرد أن يتم اختراقه بالكامل، عادة خلال 24 ساعة. إذا بقي طافيا، قم بتمديد الحضانة حتى تستقر في قاع الأنبوب.
      ملاحظة: هذه الخطوة في الحماية بالتبريد تقلل من آثار التجمد عن طريق تقليل محتوى ماء الأنسجة.
      جفف الدماغ والأنبوب بلطف، ثم خزن عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.
  4. التقسيم بالتبريد وجمع الأنسجة الطافية
    1. قبل التقسيم، اضبط الكريوستات على -20 درجة مئوية والسمك المطلوب.
      ملاحظة: بالنسبة للمخطط الهوائي، توفر المقاطع التاجية بسماكة 20-25 ميكرومتر حلا وسطا مثاليا بين الحفاظ الهيكلي واختراق الأجسام المضادة، مما ينتج مقاطع متينة بما يكفي للتعامل مع الحفاظ على جودة صبغ عالية ودقة مكانية عالية. يجب أيضا تحديد ظروف التقسيم بالتبريد لمناطق دماغية أخرى، حيث يمكن أن يختلف السماكة المثلى حسب البنية الخلوية. بالنسبة للمخيخ، ينصح عموما باستخدام مقاطع سهمية بحجم 25–35 ميكرومتر، حيث يحافظ هذا السماكة على التنظيم الطبقي للقشرة المخيخية.
    2. انقل الدماغ على الثلج الجاف ودعه يستقر داخل الكريوستات لمدة 5-10 دقائق. هذه الخطوة مهمة لمنع تلف الأنسجة.
    3. إزالة البصيلات الشمية بمشرط؛ يجب أن تكون ناعمة وسهلة القطع. ضع قطرة بحجم حبة البازلاء من O.C.T. الطازج على قرص العينة وضع المخيخ في ملامسة (الشكل 1D). ضع الدماغ في موقع التشريح التاجي. بمجرد تجميدها، أضف المزيد من O.C.T. لدمج كامل الدماغ.
      ملاحظة: يكون O.C.T. شفافا عند درجة حرارة الغرفة ويصبح أبيض معتما عند تجميده بالكامل؛ إذا بقي لامعا، اترك وقتا أطول للتجميد في جهاز التجميد.
    4. ثبت قرص العينة في الحامل وقص حتى يصبح المخطط (دائرتان بيضاويتان في كل نصف كرة) مرئيا. إذا تلقت نصفي الكرة الدماغية علاجات مختلفة، اخترق أحد نصفي الكرة بإبرة للحفاظ على الاتجاه. سجل هذا لتحليله لاحقا.
    5. انتقل إلى وضع التقسيم واجمع المقاطع العائمة الحرة في صفيحة بسعة 48 بئر باستخدام فرشاة دقيقة أو ماصحة باستور زجاجية مصقولة بالنار.
      ملاحظة: طريقة الطفو الحر تحسن اختراق الأجسام المضادة، وتقلل من الخلفية، وتسمح بالتخزين طويل الأمد، وتضمن الأجزاء المتساوية لتغطية كاملة للخطوط المخططة.
    6. املأ الآبار ب PBS الذي يحتوي على 0.05٪ أزيد الصوديوم.
      تحذير: أزيد الصوديوم سام - تعامل معه بمعدات الحماية الشخصية والتخلص من النفايات بشكل مناسب.
    7. ضع القسم الأول في البئر A1، والثاني في A2، واستمر في التسلسل. عندما تمتلئ اللوح، إما الاستمرار في صفيحة جديدة أو العودة إلى البئر A1 والاستمرار حتى يتم تقسيم المخطط بالكامل (~3 صفائح كاملة ب48 بئر). أغلق الألواح بفيلم شفاف ويخزن عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: لتحليل المخطط الكامل، اختيار عمود واحد من الصفيحة يعطي مقاطع متباعدة بشكل متساو تمثل المنطقة بأكملها.

5. الكيمياء المناعية مع صبغ DAB

  1. اغسل الأقسام 3 مرات في PBS لإزالة بقايا أزيد. حضن في محلول فينيل هيدرازين (0.2 - 0.3 ملغ/مل في PBS) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    تحذير: فينيل هيدرازين مسرطن - قم بهذه الخطوة في غطاء بخاري وتخلص من النفايات باعتبارها خطيرة.
  2. اغسل ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق، 10 دقائق، 10 دقائق متتالية. حجب الأنسجة لمدة ساعة واحدة في علاج التغذية الرجعي في PBS الذي يحتوي على 10٪ مصل ماعز طبيعي (NGS) و0.1٪ ترايتون X-100.
  3. حضن النوم طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأساسية في التخفيف الموصى به (مثل مضاد أتاكسين-2 للفأر، 1:1000 في محلول الانسداد) تحت تحريك خفيف. اغسل ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق، 10 دقائق، 10 دقائق متتالية.
  4. حضانة الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل (1:200 في محلول الانسداد) لمدة ساعتين في العلاج الصناعي تحت تحريك خفيف. اغسل ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق، 10 دقائق، 10 دقائق متتالية.
  5. حضن في مجمع ABC لمدة 30–40 دقيقة عند RT. اغسله 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق، 10 دقائق، 10 دقائق متتالية.
  6. تحضير محلول DAB طازج: لكمية 2.5 مل من الماء فائق النقي، أضف قطرة واحدة ودوامة؛ أضف نقطتين DAB وVortex؛ أضف قطرة واحدة H₂O₂ ودوامة مرة أخرى.
    تحذير: ال DAB مسرطن - أمسك به في غطاء بخار وتخلص من الفضلات بشكل صحيح.
  7. قم بتطوير أقسام في محلول DAB بشكل فردي حتى تصل شدة التلوين المطلوبة (عادة من 1 إلى 10 دقائق). أوقف التفاعل فورا عن طريق نقله إلى PBS.
    ملاحظة: تفاعل DAB ينخفض مع مرور الوقت؛ اعمل بكفاءة. إذا كان هناك أكثر من جزء واحد في البئر في نفس الوقت، تأكد من عدم تلامسها، لأن ذلك سيؤثر على عملية التلوين.
  8. اغسل ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق، 10 دقائق، 10 دقائق متتالية. قم بتركيب أجزاء على شرائح مغطاة بالجيلاتين واتركها تجف تماما. لا تضع تسمية على الشرائح بقلم جرافيت، فقد يتداخل مع التصوير.
  9. جفف، تنظيف، وغط الغطاء كما يلي: اغمر في ماء مقطر لمدة 30 ثانية، ثم جفف عبر سلسلة الإيثانول: 75٪، 96٪، 100٪ (3 دقائق لكل منهما). نظف في بديل الزيلين لمدة 5 دقائق ثم جففه بالهواء. ضع غطاء الغطاء باستخدام وسط تثبيت سريع التصلب واتركه ليجف داخل غطاء البخار لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل التصوير أو التخزين.

6. قياس الحجم المستنفد من DARPP-32 في مخطط الفأر باستخدام FIJI (ImageJ)

  1. الحصول على الصور
    1. التقط صورا لمقاطع إكليل دماغية تمتد عبر كامل المخطط (تقريبا بريغما +1.0 إلى –0.5 مم). حافظ على إضاءة متسقة وتكبير (مثل 10x)، ودقة. حفظ الصور بصيغة TIFF مع أسماء ملفات متسلسلة (مثل Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. تحضير الصورة في فيجي
    1. افتح كل صورة في فيجي. معايرة حجم البكسل: اذهب لتحليل > تعيين المقياس. استخدم مقياس معروف من ميكرومتر أو بيانات الصورة الوصفية (مثلا، 1 بكسل = 1 ميكرومتر).
    2. تحويل الصور إلى 8-بت: صورة > النوع > 8-بت. قم بضبط السطوع/التباين إذا لزم الأمر لرؤية المنطقة المستنفدة بشكل مثالي (تجنب العتبة في هذه المرحلة).
  3. اختيار العائد على الاستثمار للمناطق المستنفدة
    1. استخدم أداة المضلع، اليد الحرة، أو أداة الفرشاة لتحديد المنطقة التي نفدت من DARPP-32 (عادة تكون أفتح أو بدون تلوين في المخطط الهوائي). اذهب إلى تحليل > قياس لتسجيل المساحةبميكرومتر 2.
    2. احفظ العائد على الاستثمار عن طريق الذهاب إلى مدير العائد على الاستثمار > إضافة > المزيد > الحفظ أو استخدام وظيفة القياس المتعدد لتحليل الدفعات.
    3. كرر ذلك لجميع أقسام الدماغ ذات الصلة.
  4. حساب الحجم المستنفد
    1. اضرب المساحة المستنفدة في كل قسم في المسافة بين المقاطع (عادة 120 – 240 ميكرومتر، حسب سمك القطع والتباعد).
      الحجم لكل مقطع (مم3) = المساحة المستنفدة (مم2) × فاصل القسم (مم)
    2. اجمع الحجم عبر جميع الأقسام:
      الحجم الكلي المستنفد (مم3) = Σ (المساحة × الفترة)
    3. اختياري: تراكب للتصور. استخدم الصورة > التراكب > From ROI لعرض المناطق المستنفدة عبر الأقسام. تصدير صورة ملخصة أو رسوم متحركة للشخصيات.
  5. تحقق دائما من المحاذاة مع أطلس دماغ الفأر للحصول على رسم دقيق للخرائط الروسترو-ذيلية. حلل كل نصف كرة على حدة لتمييز التأثيرات الأحادية (مثل حقن WT مقابل حقن الطفرة).

7. قياس كميات البروتين في المخطط الفأري

  1. القياس اليدوي باستخدام FIJI
    1. قم بتحميل ومعايرة الصورة. افتح الصورة في فيجي. قم بمعايرة حجم البكسل (تجاوز هذه الخطوة إذا كنت تستخدم صورا مع بيانات وصفية).
    2. اذهب إلى تحليل > مقياس التعيين، وأدخل المسافة المعروفة (مثلا، 1 بكسل = 0.5 ميكرومتر). في FIJI، اذهب إلى الإضافات > تحليل عداد الخلية > عداد > عداد الخلية. انقر على التهيئة، ثم اختر الصورة.
    3. اختر نوع العلامة (مثل النوع 1) للتجميعات. انقر يدويا على كل تجميع مرئي لوضع علامة عليه. بيانات السجل: ستعرض FIJI العد في لوحة عداد الخلايا. عدد السجلات لكل صورة/قسم. تصدير العد يدويا أو استخدم ماكرو لتجميع النتائج.
  2. القياس شبه الآلي باستخدام IHCAggreCount
    1. رفع الصور ومعالجتها. افتح IHCAggreCount وانقر على رفع الصورة (الشكل الإضافي 1).
      ملاحظة: تم تطوير تطبيق IHCAggreCount من قبل مختبرنا كأداة علمية مستقلة تهدف إلى تبسيط وتوحيد كمية تجمعات الخلايا من صور المجهر. تم بناء البرنامج بالكامل بلغة بايثون باستخدام بنية معيارية تفصل بين التعامل مع الصور، والمعالجة، وتصحيحات الاختيار، وحساب القياس، وغيرها. IHCAggreCount متوافق بالكامل مع ويندوز 10 وويندوز 11، بالإضافة إلى macOS 13 Ventura وmacOS 14 Sonoma، وقد تم اختباره بنجاح على كلتا المنصتين. مقارنة بطرق فحص الصور اليدوي التقليدية، يوفر البرنامج مزايا تحليلية كبيرة: يقلل من ذاتية المستخدم، ويلغي الخطوات اليدوية المتكررة، ويسرع معالجة الصور، ويضمن قياسات قابلة للتكرار، ويتيح استخراجا متسقا في مناطق الاهتمام، ويسمح بالمعالجة الدفعية لبيئات متعددة. بشكل عام، يوفر التطبيق سير عمل أسرع وأكثر موضوعية وأكثر قوة لاكتشاف الكرات الكروية وقياسها مقارنة بالنهج اليدوي التقليدي. الطلب متاح من المؤلفين عند الطلب المعقول.
    2. ستظهر الصورة في عرض الصورة الأصلية. انتقل إلى تبويب المعالجة. طبق HiLo لتعزيز التجميعات/تباين الخلفية (انظر الشكل التكميلي 2). تطبيق عتبة سطوع لتصفية التجمعات من الخلفية (الشكل التكميلي 3). استخدم فلتر الحد الأدنى لإزالة الجسيمات الصغيرة (الضوضاء) (الشكل التكميلي 4). يمكنك اختياريا تطبيق عتبة الاستدارة لاستبعاد الأشكال غير المجمعة (الشكل التكميلي 5).
    3. لاكتشاف تجمعات IHC، اذهب إلى تبويب العام واضغط على حساب مجموع المجمعات وحساب مساحة التجميع. يتم تمييز جميع التجمعات المكتشفة ومدرجة في جدول المصفوفة (المعرف، المساحة، الحجم المتوسط؛ الشكل الإضافي 6).
  3. تصحيحات يدوية (اختياري)
    1. اذهب إلى تبويب التصحيح، واستخدم Smart Add لاكتشاف التجميعات تلقائيا في المناطق المحددة (الشكل الإضافي 8). استخدم الإضافة اليدوية لتسمية التجمعات يدويا. استخدم Smart Delete لإزالة التسميات غير المرغوب فيها. (يتم عرض التجمعات المميزة للفحص البصري؛ الشكل التكميلي 7).
  4. نتائج التصدير
    1. انقر على تصدير CSV لتصدير بيانات الصورة الحالية. انقر على تصدير الجميع لتصدير البيانات من عدة صور تم تحليلها. دائما قم بتحليل الصور تحت نفس إعدادات السطوع/التباين والمعايير الأخرى (مثل العتبة) عبر مجموعات التجارب في IHCAggreCount.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نجحت هذه الدراسة في تحديد تعبير الأتاكسين-2 وDARPP-32 باستخدام البروتوكول الحالي. بعد الحقن المجسمي لناقلات الفيروسات العدسية في المخطط المخطط لفئران C57BL/6J، تم اكتشاف تعبير قوي لكل من الأتاكسين-2 من النوع البري والطافر بعد 12 أسبوعا. أظهرنا سابقا12 أن هذه البنى خاصة بالخلايا العصبية، حيث تنقل فعليا متوسط 20,000 خلية عصبية لكل ملم3. في ظل ظروفنا التجريبية، كشف التلوين المناعي للأتاكسين-2 عن توزيع سيتوبلازمي منتشر للأتاكسين-2 من النوع البر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصف هذه المقالة توليد نموذج فأر لينتيفيروسي مخطط لفأر متعدد Q SCA. كما يصف إنتاج ناقلات فيروسات عدسية عالية التيتر تشفر النوع البري والموسع للبروتين المسبب، وحقن الفينوتات الثنائية في مخطط الفأر بواسطة جراحة ستيريتاكسيك. بالإضافة إلى ذلك، يصف إجراء جمع الدماغ، والمعالجة النسيجة، والقياس القانوني لعلامات المرض بناء على الصور. معا، تمكن هذه الطرق من إنشاء نموذج فأر متعدد الفيروسات SCA يظهر تجمعات البروتين وفقدان العلامات العصبية في المخطط العظيم، ويمكن تطبيقه أيضا على مناطق دماغية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

يتم تمويل مختبر كليفيو نوبريغا من قبل مشروع Cure CSB، ومن قبل جمعية فيلييم جوليجان للأطفال ذوي الأمراض النادرة (سلوفينيا)، ومن معهد أبحاث مركز الغارف الطبي الحيوي (ABC-Ri). بعض مؤلفي هذه الورقة لديهم زمالة دكتوراه ممولة من مؤسسة علم التقنية (FCT)، مع المراجع التالية: تياغو موريرا-غوميز (2022.11008.BD)، إينيس تي أفونسو (2022.10161.BD)، ورافائيل جي كوستا (2022). 11973.BD).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.9% NaClالمورد المحلي—يُستخدم لتحضير مخاليط التخدير والمخدرات المضادة
أطباق زراعة الأنسجة 100 ملمSPL Life Sciences11090
مجموعة ABC (معقد أفيدين-بيوتين)VECTASTAIN Elite
Atipamezole (5.0 ملغ/مل)المورد المحلي—مضاد لمادة medetomidine
الطرد المركزي المكتبي--
مكتب سلامة بيولوجية، الفئة الثانية (متوافق مع BSL-2)--
الجسم المضاد الثانوي المرتبط بالبيوتين--
البروتين المصل البقري (BSA)NZYTechMB47002
مقاطع الدماغ (مثل مقاطع 30–40 ميكرومتر التاجية) الملطخة للمادة DARPP-32--
مكون إضافي لمعد الخلايا (FIJI)مبني / ImageJ—أداة لعد التراكمات يدويًا
حاضنة CO2 (37 درجة مئوية، 5% CO2، مرطب)--
محطة عمل الكمبيوترالمورد المحلي—يُستخدم لمعالجة الصور وتنفيذ البرامج
أنابيب الطرد المركزي المخروطيةBeckman Coulter358126
مسحات قطنيةالمورد المحلي—يُستخدم لإزالة الغشاء المخاطي
جهاز تبريد كريوستات مزود بحامل أقراص--
DAB (ديامينوبنزيديين)--
قارئ الإحداثيات الرقمي الاستريوتاكسيStoelting/WPI51725عرض رقمي لقياس الإحداثيات
وسط دميكوكو المعدل (DMEM، سكر عالي)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
كحول إيثيلي 70، 96 و100%--
كحول إيثيلي 70%المورد المحلي—للطهير الراس
Fentanyl (0.05 ملغ/مل)المورد المحلي—مكون التخدير
مصل بقر جنيني (FBS)، مجمدGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (توزيع ImageJ)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/برنامج مفتوح المصدر لتقدير التراكمات يدويًا
ملقط ناعم (لضغط إصبع القدم)المورد المحلي—لمراقبة عمق التخدير
Flumazenil (0.1 ملغ/مل)المورد المحلي—مضاد للمادة midazolam
ملقط ومشرطالمورد المحلي—لإزالة الغشاء المخاطي وكشف الجمجمة
سرنجات Hamilton من سلسلة 700/1700 مايكرولتر/مقاومة للغازHamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203لتحميل المحلول الفيروسي
إبر Hamilton صغيرة بمحور قابل للإزالة (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205للتوصيل الفيروسي
لوح تسخين (للقوارض)Kent Scientific / SOMNIعلى سبيل المثال 04-777-177للحفاظ على درجة حرارة الجسم
خلايا HEK 293T (≤ مرور 10، خالية من الميكوبلازما)ATCC أو ما يعادلهاCRL-3216
بيروكسيد الهيدروجين--
برنامج IHCAggreCountيتم توفيره عند الطلبN/Aبرنامج برمجي مملوك للشركة لاكتشاف وتقدير التراكمات شبه الآلي
مجهر عكسي (لتحديد كثافة الخلايا)--
خلاط معملي بالهز--
نواقل عدوى فيروسية (WT والمتغير)داخلي / مرفق مركزيN/Aمحلول فيروسي للحقن
L-جلوتامين (200 ملي مولار)Gibco/Thermo Fisher25030081
مجهر ضوئي مزود بكاميرا (مجال مشرق)--
Medetomidine (1.0 ملغ/مل)المورد المحلي—مكون التخدير
مثقاب دقيق (متوافق مع الاستريوتاكسي)Stoelting / المورد المحلي—لإجراء شق في الجمجمة
مضخة حقن دقيقة (مثل Stoelting)Stoelting/WPI53210مضخة حقن أوتوماتيكية للمحاليل الفيروسية
مايكروبيبيت (P1000، P200، P10) ورؤوسها--
صور المجاهر (مقاطع IHC)تم إنشاؤها داخليًاN/Aصور الكيمياء النسيجية المناعية المراد تحليلها
شفرات الميكروتوم (منخفضة الارتفاع، يمكن التخلص منها)--
Midazolam (5.0 ملغ/مل)المورد المحلي—مكون التخدير
وسط تثبيت--
Naloxone (0.4 ملغ/مل)المورد المحلي—مضاد لمادة fentanyl
حامل الإبر وإبر التشريح الدقيقة--
مصل الماعز العادي (NGS)--
مركب O.C.T.Tissue-Tek
مرهم العين (Bepanthen Eye and Nose Ointment، 5% Dexpanthenol)Bayer11568-0053يمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة
خلاط مداري--
مجموعة p24 ELISAZeptoMetrix0801111
Parafilm--
بارافورمالدهيد (PFA)--
PBS--
PBS بدون Ca2+/Mg2+، PH 7.0Gibco/Thermo Fisher10-010-031
pCMV-dR8.2AddgenePlasmid #12263
بنسلين-ستربتوميسين (100×)Gibco/Thermo Fisher15140122
Pentobarbital--
Phenylhydrazine--
pMD2.GAddgenePlasmid #12259
Polyethylenimine (

المراجع

  1. Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias. Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).
  2. Durr, A. Autosomal dominant cerebellar ataxias: polyglutamine expansions and beyond. Lancet Neurol. 9 (9), 885-894 (2010).
  3. McIntosh, C. S., Li, D., Wilton, S. D., Aung-Htut, M. T. Polyglutamine Ataxias: Our Current Molecular Understanding and What the Future Holds for Antisense Therapies. Biomedicines. 9 (11), 1499(2021).
  4. Henriques, C., et al. Viral-based animal models in polyglutamine disorders. Brain. 147 (4), 1166-1189 (2024).
  5. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The Construction of Transgenic and Gene Knockout/Knockin Mouse Models of Human Disease. Transg Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  6. Tello, J. A., Williams, H. E., Eppler, R. M., Steinhilb, M. L., Khanna, M. Animal Models of Neurodegenerative Disease: Recent Advances in Fly Highlight Innovative Approaches to Drug Discovery. Front Mol Neurosci. 15, 883358(2022).
  7. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. Development of a gene therapy with lentiviral vectors for spinocerebellar ataxias. Methods Mol Biol. 2974, 215-225 (2026).
  8. Parr-Brownlie, L. C., et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 8, 14(2015).
  9. Zwi-Dantsis, L., Mohamed, S., Massaro, G., Moeendarbary, E. Adeno-Associated Virus Vectors: Principles, Practices, and Prospects in Gene Therapy. Viruses. 17 (2), 239(2025).
  10. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. From the disruption of RNA metabolism to the targeting of RNA-binding proteins: The case of polyglutamine spinocerebellar ataxias. J Neurochem. 168 (8), 1442-1459 (2024).
  11. Matsuzaki, Y., Oue, M., Hirai, H. Generation of a neurodegenerative disease mouse model using lentiviral vectors carrying an enhanced synapsin I promoter. J Neurosci Meth. 223, 133-143 (2014).
  12. Marcelo, A., et al. Autophagy in Spinocerebellar ataxia type 2, a dysregulated pathway, and a target for therapy. Cell Death Dis. 12 (12), 1117(2021).
  13. Alves, S., et al. Striatal and nigral pathology in a lentiviral rat model of Machado-Joseph disease. Human Mol Genet. 17 (14), 2071-2083 (2008).
  14. Alves, S., et al. Lentiviral vector-mediated overexpression of mutant ataxin-7 recapitulates SCA7 pathology and promotes accumulation of the FUS/TLS and MBNL1 RNA-binding proteins. Mol Neurodegenerat. 11 (1), 58(2016).
  15. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6 (1), 34(2006).
  16. Arrasate, A., et al. Establishment and Characterization of a Stable Producer Cell Line Generation Platform for the Manufacturing of Clinical-Grade Lentiviral Vectors. Biomedicines. 12 (10), 2265(2024).
  17. Nóbrega, C., et al. Overexpression of Mutant Ataxin-3 in Mouse Cerebellum Induces Ataxia and Cerebellar Neuropathology. Cerebellum. 12 (4), 441-455 (2013).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Compact Second Edition, Gulf Professional Publishing. (2004).
  19. Bateup, H. S., et al. Distinct subclasses of medium spiny neurons differentially regulate striatal motor behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14845-14850 (2010).
  20. Nóbrega, C., et al. Molecular hallmarks of neurodegeneration in polyglutamine spinocerebellar ataxias. Cell Death Dis. 16 (1), 826(2025).
  21. Murakami, Y., et al. AAV-based gene therapy ameliorated CNS-specific GPI defect in mouse models. Mol Ther Meth Clin Dev. 32 (1), 101176(2024).
  22. Wada, H., et al. AAV-based gene therapy ameliorates neurological deficits in a mouse model of childhood-onset neurodegeneration with cerebellar atrophy. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 33 (11), 5829-5839 (2025).
  23. Konno, A., Shinohara, Y., Hirai, H. Production of Spinocerebellar Ataxia Type 3 Model Mice by Intravenous Injection of AAV-PHP.B Vectors. Int J Mol Sci. 25 (13), 7205(2024).
  24. Jansen-West, K., et al. Plasma PolyQ-ATXN3 Levels Associate With Cerebellar Degeneration and Behavioral Abnormalities in a New AAV-Based SCA3 Mouse Model. Front Cell Dev Biol. 10, 863089(2022).
  25. Nóbrega, C., Mendonça, L., Matos, C. A. A Handbook of Gene and Cell Therapy. , Springer International Publishing. Cham. (2020).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Ther. 24 (2), 132-142 (2013).
  28. de Almeida, L. P., Ross, C. A., Zala, D., Aebischer, P., Déglon, N. Lentiviral-Mediated Delivery of Mutant Huntingtin in the Striatum of Rats Induces a Selective Neuropathology Modulated by Polyglutamine Repeat Size, Huntingtin Expression Levels, and Protein Length. J Neurosci. 22 (9), 3473-3483 (2002).
  29. Fisher, E. M. C., Bannerman, D. M. Mouse models of neurodegeneration: Know your question, know your mouse. Sci Transl Med. 11 (493), eaaq1818(2019).
  30. Bii, V. M., Collins, C. P., Hocum, J. D., Trobridge, G. D. Replication-incompetent gammaretroviral and lentiviral vector-based insertional mutagenesis screens identify prostate cancer progression genes. Oncotarget. 9 (21), 15451-15463 (2018).
  31. Alves-Cruzeiro, J. M. D. C., Mendonça, L., Pereira de Almeida, L., Nóbrega, C. Motor Dysfunctions and Neuropathology in Mouse Models of Spinocerebellar Ataxia Type 2: A Comprehensive Review. Front Neurosci. 10, 572(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

2
علم الأمراض المخططة الناتج عن الفيروسات اللينتيفيرالية كنموذج ما قبل سريري لترنح الدماغ العمودي الدماغي المضحك بالبوليغلوتامين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.