Method Article

اختبار تحليل التخثر: منصة قائمة على الميكروفلويدكس لتوصيف شامل لتكون الجلطة الميكانيكية الحيوية بشكل شامل

DOI:

10.3791/69555

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا العمل اختبارا ميكروفلويديا يستخدم إجهاد القص لتحفيز تكوين الجلطات في الدم ويصف الجلطة بأبعاد متعددة من القراءة. يمكن للاختبار قياس ميل عينات الدم إلى البروترومبوت، وبالتالي فهو مفيد في تشخيص الأمراض، واكتشاف الأدوية، وكذلك في الدراسات الميكانيكية الأساسية المتعلقة بالجلطة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلطة هي حالة مرضية تصف تراكم غير طبيعي للصفائح الدموية وعوامل التجلط في الأوعية الدموية. بينما ركزت العديد من الأعمال على تنشيط الصفائح الدموية بواسطة المنشطات القابلة للذوبان كآلية أساسية للجلطة، غالبا ما تم تجاهل أن تدفق الدم يسهل أيضا تكوين الخثرات. خاصة في الشرايين، يرتبط الجلطة عادة بتضيق الشريان، الذي يزيد من إجهاد القص في تدفق الدم ويسهل عملية التجلط، وهي ظاهرة تسمى التجلط الميكانيكي الحيوي. لفترة طويلة، لم يكن هناك أي اختبار حيوي متاح لتقديم رؤى شاملة ومفصلة حول عملية التكون الجلطني الميكانيكي الحيوي. لمعالجة ذلك، تم تطوير اختبار تحليل الجلطات من خلال دمج الميكروفلويدكس مع التصوير الفلوري متعدد الألوان، مما يسمح بتوصيف شامل لتكوين الجلطة الحيوية مع سبع قراءات تغطي حجم وتركيب الجلطة ومستوى تنشيط الصفائح الدموية. يمكن استخدام هذا الاختبار لتحليل تخثرات الدم لتقييم الميل للتخثرات في البشر وفعالية العوامل المضادة للجلطات الشريانية، كما أنه مفيد لفهم الآليات الكامنة وراء الجلطة الشريانية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلطة هي سبب رئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية، مسؤولة عن ملايين الوفيات حول العالم كل عام. حاليا، لا يتوفر اختبار حيوي في البيئات السريرية القياسية لتقييم مخاطر الجلطة. من بين اختبارات الوظائف الدموية المخبرية التجارية ونقطة الرعاية، ثبت أن اختبارات التخثر التقليدية والتراكم غير موثوقة في التنبؤ بالجلطة أو الأحداث القلبية الوعائية الخطيرة 2,3,4. اختبار الجلطة العالمي5، PFA-100/2006، واختبارات التخثر العالمية 7,8,9,10,11 تحتوي أيضا على بيانات محدودة تدعم أدائها.

استنادا إلى الفهم الحالي، تساهم عملية الجلط بشكل رئيسي بثلاث آليات. بجانب الآلتين المعترف بهما تقليديا، وهما تجمع الصفائح الدموية الكيميائية الحيوية وتجلطها، هناك آلية ثالثة غير مدروسة وغالبا ما تقلل من تقديرها وهي تجمع الصفائح الدموية المدفوعة بالقص، والتي أطلق عليها أيضا "تجمع الصفائح الدموية الميكانيكية الحيوية"12,13. في تجميع الصفائح الدموية الميكانيكية الحيوية، يعمل إجهاد القص العالي وتدرج القص كمحرك رئيسي لربط الصفائح الدموية عبر عامل GPIbα-فون ويلبراند (VWF)، والإنتجرين αIIbβ 3-VWF، والإنتجرين αIIbβتفاعلات 3-فيبرينوجين. في الجلطة الشريانية، من المرجح أن يكون تجمع الصفائح الدموية الميكانيكي هو الآلية الأكثر أهمية، نظرا لأنها تعزز بشكل كبير بسبب تدفق القص العالي الناتج عن تضيق الشريان. لذلك، تم تسمية التجلط الناتج عن تجمع الصفائح الدموية الميكانيكية الحيوية باسم 'التخثر الميكانيكي الحيوي'12,14.

في الأعمال السابقة، كانت طريقة شائعة لملاحظة تجمع الصفائح الدموية الحيوية بشكل تجريبي هي اختبار تضيق المائكروسيويدي، حيث يتم تضمين موقع تضيق شديد في قناة مستقيمة. عندما يتم تثبيط الدم فوق القناة تحت إجهاد قص جدار فسيولوجي، يتم توليد إجهاد قص مرتفع مرضيا حول الموقع الضيق، مما يدفع تراكم الصفائح الدموية لتكوين جلطة. ومع ذلك، استخدمت الأعمال السابقة قراءة واحدة فقط (للصفائح الدموية تعكس حجم الجلطة) 15,16,17,18,19 أو على الأكثر قراءتين (واحدة للصفائح الدموية وواحدة لمؤشر حيوي آخر) 13,20، وبالتالي لم تستطع تحقيق توصيف شامل للخثرة.

تم تطوير اختبار تحليل تخثرات الدم مؤخرا، يدمج التصوير الفلوري متعدد الألوان في اختبار تضيق الميكروفلويد، محققا تتبع فوري ل7 مؤشرات حيوية (الصفائح الدموية، مستوى الفيبرينوجين، مستوى عامل فون ويلبراند، مستوى تعبير P-سيلكتين، مستوى تعرض فوسفاتيديل سيرين، انتغرين ممتد αIIbβ مستوىتعبير 3 ، إنتغرين نشط بالكامل αIIbβ3 مستوى التعبير) في جلطة، مما يضع الأساس لتوصيف شامل لتكوين الجلطة الميكانيكيةالحيوية 21. في هذا العمل، تم توفير بروتوكولات مفصلة حول إعداد وأداء اختبار تحليل تخثرات الدم بالإضافة إلى تحليل البيانات ذات الصلة. تشمل الأجهزة المطلوبة للاختبار مجهر فلوري متعدد الألوان مقلوب ونظام ميكروفلويد. يستخدم الاختبار كمية صغيرة نسبيا من دم الإنسان الكامل (أقل من 2 مل)، ويتميز بفعالية عالية من حيث التكلفة (~12 دولارا لكل عينة)، ويحصل على النتائج خلال 30 دقيقة. يمكن للاختبار الكشف بدقة عن الشذوذات متعددة الأبعاد في البروترومبوتوس لدى الأفراد وتقييم تأثير العوامل المضادة للجلطات في تغيير حجم وتركيب وحالة تنشيط الصفائح الدموية للجلطة، مما يؤيد تطبيقه الواسع لأغراض البحث والسريريةفي المستقبل. ومن الجدير بالذكر أن الفحص يجب أن يستخدم دما طازجا مكونا بالهيبارين. تخزين الدم عند 4 درجات مئوية أو لأكثر من 6 ساعات أو استخدام مضادات تخثر غير الهيبارين إما يمنع تكون الجلطة أو يؤدي إلى نتائج غير دقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع هذا البروتوكول إرشادات وقد تم الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات البحث البشري في فرع جامعة تكساس الطبي. يتكون إعداد الأجهزة التجريبية من جهاز ميكروفلويد، ومكونات تفريغ (موصلات، أنابيب، حقنة، ومضخة حقنة)، ومجهر مقلوب بمكونات بصرية تتيح تصوير الفلورة بمجال ساطع وألوان متعددة. يستخدم في المجهر بيت إضاءة متعدد المصابيح ووحدة فلتر متعددة الممرات لتقسيم 4 قنوات فلورية مع أقل قدر من النزيف المتبادل: الإثارة: 391/32، 479/33، 554/24، 638/31، والانبعاث: 435/30، 519/25، 594/32، 695/58. ارتد معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات، واقي العين، وسترة مختبر، لجميع الإجراءات التجريبية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير أجهزة الميكروفلويديك

  1. صمم قالبا رئيسيا يحتوي على قنوات مستطيلة (عرض 200 ميكرومتر × ارتفاع 50 ميكرومتر) تحتوي على موقع تضيق ضوئي بنسبة 80٪. كل قناة تحتوي على مداخل ومخارج مخصصة لتوصيلات الأنابيب (الشكل 1؛ انظر الملف التكميلي 1 لملف التصميم الأصلي).
  2. استنادا إلى التصميم، استخدم رقاقة سيليكون لصنع قالب رئيسي من نوع SU-8 فوتوريزست عبر الطباعة الضوئية القياسية. قم بلصق القالب في أسفل طبق بتري بقطر 15 سم (الشكل 2A).
  3. تحضير خليط PDMS عن طريق خلط قاعدة ما قبل البوليمر وعامل التجفيف في مجموعة مطاطي السيليكون بنسبة وزن 10:1. اسكب الخليط على القالب الرئيسي (الشكل 2B).
  4. ضع اللوحة التي تحتوي على خليط PDMS في مجفف فراغ لإزالة الغازات والقضاء على فقاعات الهواء المحبوسة.
    ملاحظة: حافظ على اللوح تحت الفراغ لمدة لا تقل عن ساعتين حتى تزال الفقاعات تماما.
  5. يتم معالجة خليط PDMS حراريا عن طريق حضنه عند 75 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  6. قم بقص PDMS المعالج بعناية من القالب الرئيسي (الشكل 2C,D) وقسمه إلى وحدات شرائح فردية.
  7. قم بإنشاء المدخل والمخرج عن طريق ثقب الفتحات في المواقع المحددة باستخدام إبرة مسبار (الشكل 2E).
    ملاحظة: استخدم جهاز رش الهواء المضغوط لإزالة أي بقايا متبقية من الثقوب المثقبة. لتقليل تلوث الأسطح، نظف أجهزة PDMS باستخدام شريط لاصق قبل اللصق.
  8. في غطاء كيميائي، رش 75٪ إيثانول على مناديل مهمة، واستخدم المناديل المبللة لمسح وتنظيف شرائح الزجاج. اترك شرائح الزجاج لتجف.
  9. في غطاء كيميائي، عالج شرائح الزجاج وشرائح PDMS بمولد عالي التردد لمدة 30 ثانية و20 ثانية على التوالي، ثم محاذاة كل شريحة مع شريحة زجاجية. اضغط الشريحة بلطف على سطح الشريحة الزجاجية حتى يمكن ربطها.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء كيميائي لأن المولد عالي التردد ينتج الأوزون أثناء الاستخدام، وهو ضار بالصحة.
  10. ربط الأجهزة حراريا عن طريق حضانها على حرارة 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التبريد، ستكون الأجهزة جاهزة للاستخدام (الشكل 2F).
  11. تخزين الأجهزة في درجة حرارة الغرفة وتحت ظروف خالية من الغبار.
  12. استخدم كماشة لإزالة الجزء البلاستيكي من إبر المجس، وثني الأنابيب المعدنية إلى زاوية 90°. ستستخدم هذه الأنابيب المنحنية كموصلات لأجهزة الميكروفلويد.

2. تحضير مستشعر الفلورسنت

ملاحظة: تستخدم التجربة ما مجموعه 7 مستشعرات فلورية: SZ22-FITC، الفيبرينوجين-أليكسا فلور 405، 2.2.9-أليكسا فلور 555، AK4-أليكسا فلور 647، Annexin V-Pacific Blue، MBC 370.2-Alexa Fluor 555، PAC-1-Alexa Fluor 647. من بينها، الفيبرينوجين 2.2.9 وMBC 370.2 متوفرة تجاريا فقط في الشكل غير المرافق وتحتاج إلى مرافق فلوري في المختبر.

  1. لاقتران الفيبرينوجين مع أليكسا فلور 405:
    1. اصنع محلول بيكربونات الصوديوم بحجم 0.1 مل، بدرجة حموضة 8.5.
    2. قم بتخفيف مخزون الفيبرينوجين إلى 1 ملغ/مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS؛ 137 ملليمولار NaCl، 2.7 ملليمولار KCl، 10 ملليمولار Na2HPO4، 1.8 ملليمولار KH2PO4، pH 7.4).
    3. أضف 1/10 حجم من محلول بيكربونات الصوديوم إلى محلول الفيبرينوجين.
    4. اخلط 1 مل من الفيبرينوجين مع 1 ملغ من أليكسا فلور 405 NHS-ester وحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على جهاز دوار. احمها من الضوئي.
    5. قم بإزالة مخزن التخزين من عمود التنقية عن طريق طرد العمود عند 1,100 × جرام لمدة دقيقتين، ثم تخلص من التدفق الزائد. حمل محلول التفاعل على العمود، وتركيب العمود على قارورة جمع متوافقة، واستخدم الطرد المركزي بقوة 1,100 × جرام لمدة 5 دقائق لجمع الفيبرينوجين-أليكسا فلور 405.
    6. استخدم مقياس الطيف لقياس الامتصاص عند طول موجة 280 نانومتر (A280؛ إشارة بروتينية) و405 نانومتر (A405؛ إشارة صبغة). احسب تركيز البروتين ونسبة F/P (التألق: نسبة البروتين المولر).
      ملاحظة: يجب أن تكون نسبة السعر إلى النسبة بين 8-10.
    7. خزن فيبرينوجين-أليكسا فلور 405 عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  2. لاقتران الأجسام المضادة 2.2.9 وMBC 370.2 مع أليكسا فلور 555:
    1. اصنع محلول بيكربونات الصوديوم بحجم 0.1 مل، بدرجة حموضة 8.5.
    2. تخفيف مخزون الأجسام المضادة إلى 1 ملغ/مل في محلول خال من الأمينات.
    3. أضف 1/10 حجم من محلول بيكربونات الصوديوم إلى محلول الأجسام المضادة.
    4. اخلط 100 ميكرولتر من الجسم المضاد مع قارورة واحدة (100 ميكروغرام) من إستر Alexa Fluor 555 NHS-ester وحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على جهاز دوار. احمها من الضوئي.
    5. قم بإزالة مخزن التخزين من عمود التنقية عن طريق طرد مركزه عند 1,100 × جرام لمدة دقيقتين، وتخلص من التدفق عبر العمود. حمل محلول التفاعل على العمود، وثبت العمود على قارورة جمع متوافقة، واستخدم الطرد المركزي بقوة 1,100 × جرام لمدة 5 دقائق لجمع 2.2.9- أو MBC 370.2-Alexa Fluor 555.
    6. استخدم مقياس الطيف لقياس الامتصاص عند طول موجة 280 نانومتر (A280؛ إشارة بروتينية) و555 نانومتر (A555؛ إشارة صبغة). احسب تركيز الأجسام المضادة ونسبة F/P (التألق: نسبة الأجسام المضادة المولرية).
      ملاحظة: يجب أن تكون نسبة السعر إلى السعر في نطاق 1-1.5.
    7. تخزين 2.2.9- وMBC 370.2-Alexa Fluor 555 في 4 درجات مئوية في الظلام.
      ملاحظة: تجنب التصنيف الزائد - قد يؤثر ارتفاع نسبة F/P على الوظيفة البيولوجية.

3. جمع الدم من البشر

ملاحظة: يجب إجراء هذا الإجراء بواسطة كوادر طبية مؤهلة (مثل الممرضين المرخصين أو أخصائيي سحب الدم المعتمدين). أيضا، احصل على موافقة كتابية مستنيرة من الأفراد المشاركين في الدراسة.

  1. جهز الحقنة عن طريق استنشاق 500 ميكرولتر من محلول تايرود (12 ملليموتر NaHCO3، 10 ملليمول هيبس، 137 ملليمولار NaCl، 2.7 ملليمولار KCl، 5.5 ملليمول دي-جلوكوز، 0.5٪ ألبومين مصل البقري، رقم الحموضة 7.4) يحتوي على 0.32 U/mL هيبارين لكل 10 مل من الدم لجمعه.
  2. اجمع الدم عن طريق الوريدي. استخدم حقنة فارغة لجمع أول 2 مل من الدم للتخلص منه. ثم انتقل إلى الحقنة التي تحتوي على الهيبارين لجمع عينة الدم. اسحب الحقنة ببطء لتقليل تنشيط الصفائح الدموية.
  3. انقل الدم المجمع إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل وابق عليه تحت 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب استخدام عينات الدم للتجارب خلال 6 ساعات من الجمع.

4. اختبار التحليل التفصيلي للترومبوس

ملاحظة: يوصى بإجراء جميع الإجراءات المتعلقة بالتعامل مع الدم في خزانة السلامة البيولوجية كلما أمكن لتجنب انسكابات الدم على الباحث التجريبي. إذا لم يكن ذلك ممكنا، استخدم درع رش على سطح الطاولة.

  1. تخفيف مونومر VWF إلى 2 ميكروغرام/مل في PBS. قم بتغطية الأجهزة الميكروفلويدية مسبقا بمونومر VWF وحضن الجهاز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  2. حضن عينة الدم باستخدام مجموعة المستشعر الفلورية 1 أو 2 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة:
    1. المجموعة 1: SZ22-FITC (0.5 ميكروغرام/مل)، الفيبرينوجين-أليكسا فلور 405 (60 ميكروغرام/مل)، 2.2.9-أليكسا فلور 555 (1 ميكروغرام/مل)، AK4-أليكسا فلور 647 (1 ميكروغرام/مل).
    2. المجموعة 2: SZ22-FITC (0.5 ميكروغرام/مل)، Annexin V-Pacific Blue (1 ميكروغرام/مل)، MBC 370.2-أليكسا فلور 555 (1 ميكروغرام/مل)، PAC-1-أليكسا فلور 647 (1 ميكروغرام/مل).
      ملاحظة: نظرا لأن مجموعتي حساسات يجب أن تستخدما بشكل منفصل، يجب اختبار كل عينة دم مرتين على الأقل (مرة مع مجموعة المستشعر 1 ومرة مع مجموعة المستشعر 2) للحصول على مجموعة بيانات كاملة.
  3. قم بتوصيل جهاز ميكروفلويديك مع موصلات ومخارج وأنابيب. اربط الطرف الآخر من موصل المدخل بأنبوب يحتوي على PBS، والطرف الآخر من موصل المخرج بحقنة. ركبوا الحقنة على مضخة الحقنة. قم بتركيب الجهاز الميكروفلويديك على مجهر مقلوب، وتحرك المرحلة يدويا للعثور على موقع التضيق تحت المجهر (الشكل 3A).
  4. املأ قناة الميكروفلويديك والأنبوب بأنابيب PBS باستخدام مضخة الحقنة بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء حول موقع التضيق.
  5. اربط أنبوب الإدخال بعينة الدم، ثم قم بدمج عينة الدم عبر قناة الميكروفلويديك باستخدام مضخة الحقنة بمعدل تدفق 0.018 مل/دقيقة (الشكل 3A).
  6. حدد وقت التعريض والكسب لكل قناة فلورية. قم بتصوير فلوري متعدد الألوان في الوقت الحقيقي عن طريق التناوب بين القنوات الأربع، مما يثير نوعا واحدا من الفلوروفور في كل مرة. وفي الوقت نفسه، ابحث عن مستوى التركيز للجلطة، وسجل الإشارات في موقع التضيق، والتي تمتد عادة من 15 إلى 30 دقيقة (الشكل 4).
    ملاحظة: يجب ضبط زمن التعريض لكل قناة بحيث تكون الإشارة الفلورية واضحة بسهولة مع تجنب التشبع (الشكل 4). في النظام الحالي، عادة ما تعرض عينات دم الأشخاص الأصحاء نطاق شدة الإشارة التالي داخل الجلطة المشكلة: SZ22-FITC، 70-110؛ الفيبرينوجين-أليكسا فلور 405، 60-100؛ 2.2.9-أليكسا فلور 555، 70-110؛ AK4-أليكسا فلور 647، 45-75؛ ملحق V-Pacific Blue، 35-65؛ MBC 370.2-أليكسا فلور 555، 45-85؛ PAC-1-أليكسا فلور 647، 10-30. ومع ذلك، من الجدير بالذكر أن نسبة صغيرة من الأشخاص الأصحاء كانت تقدم قراءة غير تقليدية. لذلك، ينصح بفحص عينات دم على الأقل من 5 أشخاص أصحاء للتأكد من اختيار وقت التعرض لكل قناة بشكل صحيح.

5. تحليل البيانات

  1. افتح ملف البيانات باستخدام ImageJ 1.53 (فيجي، المعاهد الوطنية للصحة).
    ملاحظة: يجب أن يحتوي كل ملف على 4 فيديوهات من 4 قنوات مختلفة. الإجراء التالي ينطبق عموما على أي نقطة زمنية يهتم المستخدم بتحليلها.
  2. استخدم قناة SZ22-FITC لتحديد شكل الجلطة، واستخدم 'اختيارات المضلعات' لاختيار منطقة الجلطة بشكل تقريبي (الشكل 5A,B).
  3. لكل قناة، استخدم صورة -> تعديل عتبة -> لإزالة الخلفية (الشكل 5C)، ثم استخدم تحليل -> قياس لقياس المساحة والشدة المتوسطة للإشارة داخل التخثر.
    ملاحظة: SZ22-FITC يصبغ الصفائح الدموية وبالتالي يعكس حجم الجلطمات. في المجموعة 1، يعكس الفيبرينوجين-أليكسا فلور 405 مستوى إثراء الفيبرينوجين، ويعكس 2.2.9-أليكسا فلور 555 مستوى إثراء عامل فون ويلبراند (VWF)، ويعكس AK4-Alexa فلور 647 تعبير الانتقاء P. في المجموعة 2، يعكس Annexin V-Pacific Blue التعرض الكامل للفوسفاتيديلسيرين (PS)، ويعكس MBC 370.2-Alexa Fluor 555 تنشيط الإنتجين αIIbβ3 إلى التكوين الممتد (E+ αIIbβ3)، ويعكس PAC-1-Alexa Fluor 647 تنشيط كامل للانتكترين αIIbβ3 (Act αIIbβ3)21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقوم اختبار تحليل التخثر بتدفق الدم عبر قناة ضيقة للسماح بتكوين جلطة مدفوعة بالقص، ويقوم بتصوير فلوري متعدد الألوان في الوقت الحقيقي لجمع معلومات متعددة الأبعاد عن الجلطة المشكلة. من خلال إكمال التجارب باستخدام كل من مستشعرات المجموعة 1 والمجموعة 2، يجب أن يكون المرء قادرا على توصيف الجلطة من جوانب تشمل الحجم، وتثريب البروتينات المتشابكة (عامل فون ويلبراند، الفيبرينوجين)، بالإضافة إلى مستوى تنشيط الصفائح الدموية (الذي ينعكس في تعبير الانتقاء من P، والتعرض لل PS، وتنشيطالإنتجين α IIb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال دمج اختبار تضيق الميكروفلويد مع التصوير الفلوري متعدد الألوان، يوفر اختبار تحليل الجلطة نهجا مريحا وقويا لدراسة التوجد الميكانيكي الحيوي وعلم ميكانيكية الصفائح الدموية. وفي الوقت نفسه، فإن الاختبار مفيد في مجموعة واسعة من التطبيقات. على سبيل المثال، يمكن استخدامه لفحص العوامل المضادة للجلطات التي تثبط تجمع الصفائح الدموية الميكانيكية الحيوية، حيث يمكن استنتاج الهدف الجزيئي وآلية العمل من الباركود21 للتأثير. يمكن أيضا استخدامه لدراسة الميل للبروترومبوتيك في...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم الأبحاث المتعلقة بهذه الورقة وتطوير اختبار تحليل تخثرات الدم في مختبر تشين من قبل منحة من معهد القلب والرئة والدم الوطني R00HL153678 (Y.C.)، والمعهد الوطني للشيخوخة، وجائزة مركز استقلال كبار السن من كلود دي. بيبر #P30-AG024832 (Y.C.)، وجائزة فريق UTMB لأبحاث العلوم التجريبية (Y.C.)، وزمالة ما بعد الدكتوراه لجمعية القلب الأمريكية 20POST35080023 (Y.C.), وجائزة مشروع التحول من جمعية القلب الأمريكية 25TPA1471420 (Y.C.). تم تنفيذ هذا العمل جزئيا في بنية تحتية النانو لتقنية سان دييغو (SDNI) التابعة لجامعة كاليفورنيا في سان دييغو، وهي عضو في البنية التحتية الوطنية المنسقة لتقنية النانو، والتي تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم (منحة ECCS-2025752).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حقن 10 ملهينكي ساس وولف5100-X00V0جمع عينات الدم
أنابيب فالكون بسعة 15 ملجينيسي ساينتيفك28-101تخزين عينات الدم
حقنة زجاجية محكمة الإغلاق بسعة 1 ملهاميلتون81331تجميع الأجهزة
2.2.9ميرو فاسيمنيونتلطيخ الثرومبس
إبر المجسات 20 × 1/2ماكماستر-كارM919تصنيع أجهزة PDMS
حقن 20 ملهينكي ساس وولف5200-X00V0جمع عينات الدم
70٪ إيثانولسيغما-ألدرتشEX0281-1تعقيم الحقن المقاومة للغاز وتنظيف شرائح الزجاج
AK4-أليكسا فلور 647بيو ليجند304918تلطيخ الثرومبس
أليكسا فلور 405 NHS إيسترإنفيتروجينA30000وضع علامات الفيبرينوجين
مجموعة وسم الأجسام المضادة أليكسا فلور 555إنفيتروجينA88065تسمية MBC 370.2 و2.2.9
ملحق V-Pacific Blueإنفيتروجين501121505تلطيخ الثرومبس
تنظيف الغبارأوفيس ديبوت911245تصنيع أجهزة PDMS
مجموعة سكاكين هواية الحرفية مع صندوق خشبيشفرات إكسل44282تصنيع أجهزة PDMS
ماء منزوع الأيون ثيرموفيشر ساينتفيك 751-628غسل الحقن المقاومة للاستخدام
جهاز إزالة المجففبيل آرتF420270000إزالة الغازات من PDMS
ملعقة مختبر متعددة الأغراض ذات الاستخدام الواحدليفغو17211خلط قاعدة السيليكون المطاطي مع عامل التصلب  
عمود دوران إزالة الصبغة والبيوتينزيباA44296Sوضع علامات الفيبرينوجين
الفيبرينوجينالبحث المبتكرIHUFBG25MGتلطيخ الثرومبس
مضخة الحقن فيوجن 200-Xشركة كيميكس0720Xتجميع الأجهزة
هيبارين سيغما-ألدرتشH3149عينة الدم المضادة للتخثر
مولد التردد العاليشركة إلكترو-تكنيك برودكت إنك.BD-20تصنيع أجهزة PDMS
مونومر VWF البشريشركة سينو بيولوجيولوجية10973-H08Cطلاء الأجهزة الميكروفويدي
برنامج Image J v1.53فيجي، المعهد الوطني للصحةتحليل البيانات
المجهر المقلوبلايكامدير اللعبة IL LEAD؛ مكعب الفلتر: لايكا DFT51010؛ المنارة: LED 5تجميع الأجهزة
كيموايبسكيمبرلي- كلارك بروفيشنال34120تنظيف شرائح الزجاج
أغطية قفل لويرشركة إنترناشونال ميديكال إندستريز، إنك.57100Bجمع عينات الدم
MBC 370.2كيرافاستEBW104تلطيخ الثرومبس
نظارات المجهربول مارينفيلد GmbH & السرية KGES0107222تصنيع أجهزة PDMS
مكشطة شفرة الحلاقة الصغيرةستانلي28-100تصنيع أجهزة PDMS
مطياف الفوتومترين UV-Vis من نانو دروب 2000ثيرمو ساينتفيكND-2000تركيز البروتين وقياس نسبة F/P
الفرنآلات الخط المختبر3512تصنيع أجهزة PDMS
PAC-1-أليكسا فلور 647بيو ليجند362806تلطيخ الثرومبس
كوب بلاستيكيثيرموفيشر ساينتفيك S04589خلط قاعدة السيليكون المطاطي مع عامل التصلب  
SU-8 فوتوريست ماستر  العفنمنشأة تنظيف التصنيع النانوي لجامعة كاليفورنيا في سان دييغو بجامعة كاليفورنيا سان دييغوتصنيع أجهزة PDMS
مجموعة سيلغارد 184 سيليكون إيلاستومركرايدن داوDC4019862PDMS
SZ22-FITC بيكمان كولترIM 1756Uتلطيخ الثرومبس
الأنابيبشركة كول-بالمر للآلات06422-01تجميع الأجهزة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lindstrom, M., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risks collaboration, 1990-2021. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2372-2425 (2022).
  2. Lim, H. Y., O'malley, C., Donnan, G., Nandurkar, H., Ho, P. A review of global coagulation assays - is there a role in thrombosis risk prediction. Thromb Res. 179, 45-55 (2019).
  3. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: A comparative review. Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).
  4. Zhang, Y., Jiang, F., Chen, Y., Ju, L. A. Platelet mechanobiology inspired microdevices: From hematological function tests to disease and drug screening. Front Pharmacol. 12, 779753(2021).
  5. Gorog, D. A., et al. First direct comparison of platelet reactivity and thrombolytic status between Japanese and Western volunteers: Possible relationship to the "Japanese paradox". Int J Cardiol. 152 (1), 43-48 (2011).
  6. Gorog, D. A., Becker, R. C. Point-of-care platelet function tests: Relevance to arterial thrombosis and opportunities for improvement. J Thromb Thrombolysis. 51 (1), 1-11 (2021).
  7. Lopez-Jaime, F. J., et al. Clot stiffness measured by seer sonorheometry as a marker of poor prognosis in hospitalized COVID-19 patients. Clin Appl Thromb Hemost. 28, 10760296221112085(2022).
  8. Bochsen, L., Wiinberg, B., Kjelgaard-Hansen, M., Steinbruchel, D. A., Johansson, P. I. Evaluation of the TEG platelet mapping assay in blood donors. Thromb J. 5, 3(2007).
  9. Lipets, E. N., Ataullakhanov, F. I. Global assays of hemostasis in the diagnostics of hypercoagulation and evaluation of thrombosis risk. Thromb J. 13 (1), 4(2015).
  10. Thromboelastography loinc code 67790-6. , LOINC Committee. (2022).
  11. Volod, O., Viola, F. The quantra system: System description and protocols for measurements. Methods Mol Biol. 2663, 743-761 (2023).
  12. Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nature Medicine. 15 (6), 665-673 (2009).
  13. Chen, Y., et al. An integrin alphaiibbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nat Mater. 18 (7), 760-769 (2019).
  14. Li, M., Hotaling, N. A., Ku, D. N., Forest, C. R. Microfluidic thrombosis under multiple shear rates and antiplatelet therapy doses. PLoS One. 9 (1), e82493(2014).
  15. Colace, T. V., Diamond, S. L. Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).
  16. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  17. Brazilek, R. J., et al. Application of a strain rate gradient microfluidic device to von Willebrand's disease screening. Lab Chip. 17 (15), 2595-2608 (2017).
  18. Tovar-Lopez, F. J., et al. A microfluidics device to monitor platelet aggregation dynamics in response to strain rate micro-gradients in flowing blood. Lab Chip. 10 (3), 291-302 (2010).
  19. Kim, D. A., Ku, D. N. Structure of shear-induced platelet aggregated clot formed in an in vitro arterial thrombosis model. Blood Adv. 6 (9), 2872-2883 (2022).
  20. Receveur, N., et al. Shear rate gradients promote a bi-phasic thrombus formation on weak adhesive proteins, such as fibrinogen, in a vwf-dependent manner. Haematologica. 105 (10), 2471-2483 (2020).
  21. Din, M., et al. Multi-parametric thrombus profiling microfluidics detects intensified biomechanical thrombogenesis associated with hypertension and aging. Nat Commun. 15, 9067(2024).
  22. Stein, P. D., Sabbah, H. N. Measured turbulence and its effect on thrombus formation. Circ Res. 35 (4), 608-614 (1974).
  23. Mahalingam, A., et al. Numerical analysis of the effect of turbulence transition on the hemodynamic parameters in human coronary arteries. Cardiovasc Diagn Ther. 6 (3), 208-220 (2016).
  24. Thomson, E. E., et al. Gigapixel imaging with a novel multi-camera array microscope. Elife. 11, e74988(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thrombus ProfilingBiomechanical ThrombogenesisMicrofluidic DevicesPlatelet ActivationFluorescence ImagingArterial ThrombosisVon Willebrand FactorProthrombotic TendencySyringe PumpImageJ Analysis

Related Articles