اختبار تحليل التخثر: منصة قائمة على الميكروفلويدكس لتوصيف شامل لتكون الجلطة الميكانيكية الحيوية بشكل شامل

Summary

يصف هذا العمل اختبارا ميكروفلويديا يستخدم إجهاد القص لتحفيز تكوين الجلطات في الدم ويصف الجلطة بأبعاد متعددة من القراءة. يمكن للاختبار قياس ميل عينات الدم إلى البروترومبوت، وبالتالي فهو مفيد في تشخيص الأمراض، واكتشاف الأدوية، وكذلك في الدراسات الميكانيكية الأساسية المتعلقة بالجلطة.

Abstract

الجلطة هي حالة مرضية تصف تراكم غير طبيعي للصفائح الدموية وعوامل التجلط في الأوعية الدموية. بينما ركزت العديد من الأعمال على تنشيط الصفائح الدموية بواسطة المنشطات القابلة للذوبان كآلية أساسية للجلطة، غالبا ما تم تجاهل أن تدفق الدم يسهل أيضا تكوين الخثرات. خاصة في الشرايين، يرتبط الجلطة عادة بتضيق الشريان، الذي يزيد من إجهاد القص في تدفق الدم ويسهل عملية التجلط، وهي ظاهرة تسمى التجلط الميكانيكي الحيوي. لفترة طويلة، لم يكن هناك أي اختبار حيوي متاح لتقديم رؤى شاملة ومفصلة حول عملية التكون الجلطني الميكانيكي الحيوي. لمعالجة ذلك، تم تطوير اختبار تحليل الجلطات من خلال دمج الميكروفلويدكس مع التصوير الفلوري متعدد الألوان، مما يسمح بتوصيف شامل لتكوين الجلطة الحيوية مع سبع قراءات تغطي حجم وتركيب الجلطة ومستوى تنشيط الصفائح الدموية. يمكن استخدام هذا الاختبار لتحليل تخثرات الدم لتقييم الميل للتخثرات في البشر وفعالية العوامل المضادة للجلطات الشريانية، كما أنه مفيد لفهم الآليات الكامنة وراء الجلطة الشريانية.

Introduction

الجلطة هي سبب رئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية، مسؤولة عن ملايين الوفيات حول العالم كل عام^. حاليا، لا يتوفر اختبار حيوي في البيئات السريرية القياسية لتقييم مخاطر الجلطة. من بين اختبارات الوظائف الدموية المخبرية التجارية ونقطة الرعاية، ثبت أن اختبارات التخثر التقليدية والتراكم غير موثوقة في التنبؤ بالجلطة أو الأحداث القلبية الوعائية الخطيرة ^2,3,4. اختبار الجلطة العالمي⁵، PFA-100/200⁶، واختبارات التخثر العالمية ^7,8,9,10,11

Protocol

يتبع هذا البروتوكول إرشادات وقد تم الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات البحث البشري في فرع جامعة تكساس الطبي. يتكون إعداد الأجهزة التجريبية من جهاز ميكروفلويد، ومكونات تفريغ (موصلات، أنابيب، حقنة، ومضخة حقنة)، ومجهر مقلوب بمكونات بصرية تتيح تصوير الفلورة بمجال ساطع وألوان متعددة. يستخدم في المجهر بيت إضاءة متعدد المصابيح ووحدة فلتر متعددة الممرات لتقسيم 4 قنوات فلورية مع أقل قدر من النزيف المتبادل: الإثارة: 391/32، 479/33، 554/24، 638/31، والانبعاث: 435/30، 519/25، 594/32، 695/58. ارتد معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات، واقي العين، وسترة مختبر، لجميع الإجراءات التجريبية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول....

Results

يقوم اختبار تحليل التخثر بتدفق الدم عبر قناة ضيقة للسماح بتكوين جلطة مدفوعة بالقص، ويقوم بتصوير فلوري متعدد الألوان في الوقت الحقيقي لجمع معلومات متعددة الأبعاد عن الجلطة المشكلة. من خلال إكمال التجارب باستخدام كل من مستشعرات المجموعة 1 والمجموعة 2، يجب أن يكون المرء قادرا على توصيف الجلطة من جوانب تشمل الحجم، وتثريب البروتينات المتشابكة (عامل فون ويلبراند، الفيبرينوجين)، بالإضافة إلى مستوى تنشيط الصفائح الدموية (الذي ينعكس في تعبير الانتقاء من P، والتعرض لل PS، وتنشيط_{الإنتجين α IIb.......}

Discussion

من خلال دمج اختبار تضيق الميكروفلويد مع التصوير الفلوري متعدد الألوان، يوفر اختبار تحليل الجلطة نهجا مريحا وقويا لدراسة التوجد الميكانيكي الحيوي وعلم ميكانيكية الصفائح الدموية. وفي الوقت نفسه، فإن الاختبار مفيد في مجموعة واسعة من التطبيقات. على سبيل المثال، يمكن استخدامه لفحص العوامل المضادة للجلطات التي تثبط تجمع الصفائح الدموية الميكانيكية الحيوية، حيث يمكن استنتاج الهدف الجزيئي وآلية العمل من الباركود²¹ للتأثير. يمكن أيضا استخدامه لدراسة الميل للبروترومبوتيك في.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
حقن 10 مل	هينكي ساس وولف	5100-X00V0	جمع عينات الدم
أنابيب فالكون بسعة 15 مل	جينيسي ساينتيفك	28-101	تخزين عينات الدم
حقنة زجاجية محكمة الإغلاق بسعة 1 مل	هاميلتون	81331	تجميع الأجهزة
2.2.9	ميرو فاسيمنيون		تلطيخ الثرومبس
إبر المجسات 20 × 1/2	ماكماستر-كار	M919	تصنيع أجهزة PDMS
حقن 20 مل	هينكي ساس وولف	5200-X00V0	جمع عينات الدم
70٪ إيثانول	سيغما-ألدرتش	EX0281-1	تعقيم الحقن المقاومة للغاز وتنظيف شرائح الزجاج
AK4-أليكسا فلور 647	بيو ليجند	304918	تلطيخ الثرومبس
أليكسا فلور 405 NHS إيستر	إنفيتروجين	A30000	وضع علامات الفيبرينوجين
مجموعة وسم الأجسام المضادة أليكسا فلور 555	إنفيتروجين	A88065	تسمية MBC 370.2 و2.2.9
ملحق V-Pacific Blue	إنفيتروجين	501121505	تلطيخ الثرومبس
تنظيف الغبار	أوفيس ديبوت	911245	تصنيع أجهزة PDMS
مجموعة سكاكين هواية الحرفية مع صندوق خشبي	شفرات إكسل	44282	تصنيع أجهزة PDMS
ماء منزوع الأيون	ثيرموفيشر ساينتفيك	751-628	غسل الحقن المقاومة للاستخدام
جهاز إزالة المجفف	بيل آرت	F420270000	إزالة الغازات من PDMS
ملعقة مختبر متعددة الأغراض ذات الاستخدام الواحد	ليفغو	17211	خلط قاعدة السيليكون المطاطي مع عامل التصلب
عمود دوران إزالة الصبغة والبيوتين	زيبا	A44296S	وضع علامات الفيبرينوجين
الفيبرينوجين	البحث المبتكر	IHUFBG25MG	تلطيخ الثرومبس
مضخة الحقن فيوجن 200-X	شركة كيميكس	0720X	تجميع الأجهزة
هيبارين	سيغما-ألدرتش	H3149	عينة الدم المضادة للتخثر
مولد التردد العالي	شركة إلكترو-تكنيك برودكت إنك.	BD-20	تصنيع أجهزة PDMS
مونومر VWF البشري	شركة سينو بيولوجيولوجية	10973-H08C	طلاء الأجهزة الميكروفويدي
برنامج Image J v1.53	فيجي، المعهد الوطني للصحة		تحليل البيانات
المجهر المقلوب	لايكا	مدير اللعبة IL LEAD؛ مكعب الفلتر: لايكا DFT51010؛ المنارة: LED 5	تجميع الأجهزة
كيموايبس	كيمبرلي- كلارك بروفيشنال	34120	تنظيف شرائح الزجاج
أغطية قفل لوير	شركة إنترناشونال ميديكال إندستريز، إنك.	57100B	جمع عينات الدم
MBC 370.2	كيرافاست	EBW104	تلطيخ الثرومبس
نظارات المجهر	بول مارينفيلد GmbH & السرية KG	ES0107222	تصنيع أجهزة PDMS
مكشطة شفرة الحلاقة الصغيرة	ستانلي	28-100	تصنيع أجهزة PDMS
مطياف الفوتومترين UV-Vis من نانو دروب 2000	ثيرمو ساينتفيك	ND-2000	تركيز البروتين وقياس نسبة F/P
الفرن	آلات الخط المختبر	3512	تصنيع أجهزة PDMS
PAC-1-أليكسا فلور 647	بيو ليجند	362806	تلطيخ الثرومبس
كوب بلاستيكي	ثيرموفيشر ساينتفيك	S04589	خلط قاعدة السيليكون المطاطي مع عامل التصلب
SU-8 فوتوريست ماستر  العفن	منشأة تنظيف التصنيع النانوي لجامعة كاليفورنيا في سان دييغو بجامعة كاليفورنيا سان دييغو		تصنيع أجهزة PDMS
مجموعة سيلغارد 184 سيليكون إيلاستومر	كرايدن داو	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	بيكمان كولتر	IM 1756U	تلطيخ الثرومبس
الأنابيب	شركة كول-بالمر للآلات	06422-01	تجميع الأجهزة