مقالة منهجية

تحليل متتبعات نظائر فيتامين أ المستقرة باستخدام LC-MS/MS

677 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69558

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لقياس الريتينويدات الموسومة نظائر والأصلية في بلازما الإنسان في نفس الوقت، باستخدام LC-MS/MS، مع حدود كشف تبلغ 6 fmol على العمود. تتضمن الطريقة إجراء استخلاص عينات بسيط ووقت تحليل قصير، مما يتيح إنتاجية عالية للعينات.

الملخص

تقدر طريقة تخفيف نظائر الريتينول (RID) إجمالي مخزون الجسم (TBS) من فيتامين A لدى البشر من خلال تخفيف النظائر المستقرة مع مخزون فيتامين A في الجسم. ولتحقيق ذلك، من الضروري تحديد نسبة نظائر البلازما للريتينول الموسوم إلى غير الموسوم بدقة وكفاءة من خلال مطيافية الكتلة. لتجنب إجراءات الاستخراج و/أو التنقية المكثفة والمستهلكة للوقت، مثل HPLC التحضيري والاشتقاق، يستخدم LC-MS/MS لإجراء تحليل سريع وحساس ومتزامن للريتينويدات الموسومة وغير الموسومة. تستخدم الطريقة مستويين من الكشف: (1) فصل أولي بين الكتلة والشحنة (m/z) لأيونات الأصل (السلف)، يليه (2) كشف أيونات الابنة (الناتج) المجزأة. ينتج عن ذلك حساسية عالية، مع حدود كشف الريتينول التي تصل إلى 6 fmol على العمود. على الرغم من مزايا مطيافية الكتلة المتتالية، إلا أن فصل الكروماتوغرافي السائل ضروري لفصل الريتينول عن إسترات الريتينيل لأن المجموعات الوظيفية النهائية تفقد أثناء التأين، مما يؤدي إلى أنماط تجزئة أيونية أب (m/z 269) ونمط أيون ابنة. تصف المقالة عزل الريتينول الداخلي والموسوب (13C أو 2H) من البلازما عن طريق استخراج المذيب، تليها القياس بواسطة LC-MS/MS تحت التأين الكيميائي بالضغط الجوي (APCI) في وضع الأيونات الموجبة.

المقدمة

فيتامين أ هو عنصر غذائي قابل للذوبان في الدهون وضروري لصحة الإنسان1. يزيد نقص فيتامين أ من القابلية للأمراض المعدية الشديدة والوفاة، ويقدر أن انتشاره عالميا بنسبة 29٪، مع مستويات أعلى في أفريقيا جنوب الصحراء (48٪) وجنوب آسيا (44٪)2. مكملات فيتامين أ هي استراتيجية فعالة لتقليل المعدلات الزائدة لوفيات الأطفال، خاصة في المناطق عالية الخطورة مثل أفريقيا جنوب الصحراء3. ومع ذلك، فإن إدخال مكملات فيتامين أ نصف السنوية إلى جانب تقوية فيتامين أ على نطاق واسع للأغذيات الأساسية وتوزيع مسحوق المغذيات الدقيقة، والتي غالبا ما تدار عبر جهات عامة وخاصة مختلفة، قد يعرض الأفراد لتناول مفرط لفيتامين أ 4,5,6,7,8,9,10 . لذا، يجب أن تغطي العلامات الحيوية لفيتامين أ من الناحية المثالية، كامل طيف حالة فيتامين أ، من النقص إلى السمية. طريقة تخفيف نظائر الريتينول (RID) هي حاليا الطريقة غير المباشرة الأكثر دقة لتقييم إجمالي مخزون فيتامين أ في الجسم لدى البشر 11,12,13، وقد تم التحقق منها مقابل تركيزات فيتامين أ في الكبد، وتعتبر أفضل مؤشر كيميائي حيوي لحالة فيتامين أ14,15. تعتمد الطريقة على مبدأ أن جرعة التتبع الفموية من فيتامين أ المستقر الموسوم بالنظير تختلط مع فيتامين أ غير الموسوم (الأثر) في مجموعات جسم قابلة للتبادل. يسمح قياس النشاط الخاص بريتينول البلازما (أي نسبة متتبع الريتينول الموسوم إلى إجمالي الريتينول في البلازما (المتتبع/التتبع في البلازما)) في وقت محدد بعد الجرعة بتقدير حالة فيتامين أ باستخدام معادلة RID 11,12,13.

لتحديد تركيزات دقيقة ودقيقة لكل من متتبع الريتينول والتتبع في البلازما، تم تطبيق طرق مختلفة لقياس كمية فيتامين A الموسوم بالنظائر المستقرة، بما في ذلك كروماتوغرافيا الغازات-مطيافية الكتلة (GC-MS)، ومطياف الكتلة بنسبة النظائر (IRMS)، ومطياف الكتلة المزدوج بالكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS/MS) 16,17,18,19,20,21,22,23، 24، 25، 26. ومن المهم أن يجمع LC-MS/MS بين الحساسية العالية والخصوصية والبساطة التشغيلية مع القدرة على قياس الريتينول الأصلي والموسوم مباشرة في المصفوفات المعقدة. لذا، لتجنب تحضير العينات الذي يستغرق وقتا طويلا، مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء التحضيري (HPLC) لنظام IRMS أو الاشتقاق ل GC-MS، يعد تحليل LC-MS/MS خيارا مثاليا لأن هذه الطريقة تتضمن إجراء استخراج بسيط، وحدود كشف منخفضة جدا للنظائر المستقرة، وأوقات تشغيل قصيرة 7,18,19. هنا، نقدم طريقة LC-MS/MS المحدثة ذات وقت تشغيل أقصر، وسير عمل بسيط مع حساسية عالية وانتقائية، كطريقة مناسبة جدا لتحليل العينات عالية الإنتاجية من التدخل البشري والدراسات الرصدية واسعة النطاق، حيث يتطلب الأمر تحديد إجمالي مخزون فيتامين أ في الجسم.

البروتوكول

تمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس أخلاقيات البحث في جامعة الفلبين، مانيلا (معرف IRB: UPMREB 2016-282-01)، ومجلس المراجعة المؤسسية في جامعة كاليفورنيا، ديفيس (رقم IRB ID: 903681-2)، وتم تسجيلها في ClinicalTrials.gov (المعرف: NCT03030339). تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية لخدمات الصحة الغانية (GHS-ERC 012/07/20)، وتم تسجيل التجربة في https://clinicaltrials.gov ك NCT04632771.

1. إعداد المعايير الداخلية

  1. محلول المخزون القياسي الداخلي: تحضير محلول المخزون الداخلي بتركيز 1 ملغ/مل من أسيتات الريتينيل في الإيثانول الذي يحتوي على 0.1٪ هيدروكسي تولوين بيوتيلايت (BHT؛ بدون تركيز). قسم محاليل المخزون إلى أليكوات وخزنها عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
    ملاحظة: بالنسبة للمعيار الداخلي، من الممكن استخدام إما ريتينيل أسيتات غير معنونة أو أسيتات ريتينيل معنونة. إذا تم استخدام معيار ريتينيل-أسيتات غير معنون، فمن الضروري الحصول على دقة أساسية لقمم أسيتات الريتينيل والريتينول (انظر الشكل 1).
  2. حل العمل القياسي الداخلي: تحضير محلول عمل معياري داخلي عن طريق تخفيف المعيار الأصلي (1 ملغ/مل) إلى 1 ميكروغرام/مل. أولا، تخفيف 60 ميكرولتر من المعيار الأصلي ب 300 ميكرولتر من الإيثانول، ثم تخفيف 60 ميكرولتر من هذا المحلول في 10,000 ميكرولتر من الإيثانول. لكل عينة، يضاف 20 ميكرولتر من المحلول القياسي الداخلي العامل، يحتوي على 20 نانوغرام من ريتينيل-أسيتات.
    ملاحظة: يمكن تخزين الحلول القياسية الداخلية عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

2. إعداد معايير المعايرة

  1. معيار مخزون المعايرة: تحضير محاليل قياسية لمخزون المعايرة بتركيز 1 ملغ/مل ريتينول في الإيثانول يحتوي على 0.1٪ BHT (بضرب/ضج) لكل من التتبع والمتتبع (traser). يخزن Aliquot الحلول ويخزن عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. استخدم كل أليكوت مرة واحدة فقط لتجنب دورات التجمد والذوبان.
  2. محلول معايرة القياسي التشغيلي: أخرج 100 ميكرولتر من محلول المخزن القياسي للمعايرة وتخفف ب 10,000 ميكرولتر من الإيثانول في قارورة حجمية. تحديد تركيز محلول المعايرة المخفف عند 325 نانومتر في مقياس طياف باستخدام كوفيت كوارتز (انظر الجدول 1 للتفاصيل).
  3. خذ أليكوت من معيار مخزون المعايرة المخفف واضبط التركيز إلى 8 ميكرومولار للتتبع وإلى 2 ميكرومولار للجهاز المتعقب باستخدام 50٪ إيثانول و50٪ أسيتونونتريل / ديسيتار2O (70:30 (v/v).
  4. تحضير معايير معايرة مكررة بسبعة تركيزات مختلفة باستخدام 50٪ إيثانول و50٪ أسيتونيتريل / dH2O (70:30 (v/v). إذا تم استخراج 200 ميكرولتر من البلازما، يجب أن تتراوح معايير معايرة التتبع من 6 ميكرومولار إلى 0.03 ميكرومولار، ويجب أن تتراوح معايير معايرة المتتبع من 0.5 ميكرومولار إلى 0.004 ميكرومولار.
    ملاحظة: لقياس دقيق للكمية، يتم قياس إسترات الريتينول والريتينيل الموسومة نظائر في البلازما باستخدام منحنيات معايرة مكررة من 7 نقاط27. أعلى نقطة على منحنى المعايرة (ضعف أعلى تركيز متوقع للتتبع والمتتبع في البلازما) تأخذ في الاعتبار عامل تركيز المستخرج المعاد تشكيله من حجم البلازما الأصلي.

3. استخراج الريتينويدات من البلازما

  1. قم بإزالة عينات البلازما من الفريزر بدرجة -80 درجة مئوية وقم بإذابة البلازما عند درجة حرارة الغرفة (حوالي 30 دقيقة).
  2. بعد إذابة الباب، قم بتدوير كل عينة ولفها لبضع ثوان للتأكد من عدم بقاء بلازما في الغطاء. بعد ذلك، ضع العينات على الثلج.
  3. شغل جهاز طرد مركزي مبرد واتركه ليبرد حتى 4 درجات مئوية. ضع علامة على أنابيب زجاجية بحجم 15 مل مع أغطية براغي (معرف الموضوع ونقطة الزمن) وماصة بحجم 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات (dH2O) في كل أنبوب عينة.
  4. من محلول العمل القياسي الداخلي، يتم إلقاء الماصة 20 ميكرولتر من الخليط القياسي الداخلي في أنبوب الزجاج.
  5. باستخدام معصة، يتم توزيع 200 ميكرولتر من البلازما في الأنبوب المناسب الذي يحتوي على المعيار الداخلي وdH2O.
  6. قم بإدخال 400 ميكرولتر من الإيثانول في كل أنبوب عينة ولف الأنبوب لخلط الإيثانول مع البلازما. لا تقم بالدوامة لتجنب بقايا البروتين التي تلتصق بجدار الزجاج.
  7. لاستخلاص الهكسان الأول، أضف 2 مل من الهكسان إلى كل أنبوب وثبت أغطية الأنابيب بإحكام.
  8. ضع الأنابيب في هزاز مداري واهزه بسرعة 15,000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي مبرد وادور بقوة 1,800 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. باستخدام ماصات باستور الزجاجية، انقل المادة الفائقة إلى مجموعة نظيفة من أنابيب الاختبار الزجاجية الموسومة. احذر من نقل ترسيب البروتين أو الماء.
  10. قم باستخراج الهكسان الثاني بإضافة 2 مل إضافية من الهكسان إلى البقايا المتبقية، وتثبيت أغطية الأنابيب بإحكام، ووضع الأنابيب في هزاز المدار وهز بسرعة 15,000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
  11. انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي مبرد وادور بقوة 1,800 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصات باستور الزجاجية، انقل المادة الفائقة إلى أنبوب الاختبار الزجاجي الذي يحتوي على الفائق من أول استخراج للهكسان (الخطوة 3.9) لكل عينة على التوالي.
  12. تبخر مذيب استخراج الهكسان المركب (أول وثاني فائض للاستخلاص لكل عينة) تحت تدفق لطيفمن N2 في غطاء أبخرة داكن لمدة تقارب 30 دقيقة. اضبط كتلة التدفئة على 35 درجة مئوية.
  13. أعد تعليق البقايا الجافة في 50 ميكرولتر من الإيثانول، ثم الدوامة لفترة وجيزة، وأضف 50 ميكرولتر من الطور المتحرك (70:30 أسيتونيتريل لكل ديسيتار2O (v/v)) ودوامة مرة أخرى.
    ملاحظة: يجب إعادة تعليق البقايا المجففة باستخدام 100 ميكرولتر من الإيثانول فقط إذا كان الهدف هو قياس إسترات الريتينيل.
  14. تم نقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق الموسومة بحجم 0.5 مل. الطرد المركزي عند 16,900 × g لمدة 5 دقائق.
  15. نقل 80 ميكرولتر من البقايا المعاد تشكيلها إلى قوارير HPLC الكهرمانية مع إدخالات بسعة 300 ميكرولتر. أغلق القارورة فورا لمنع فقدان المذيب بسبب التبخر.
  16. انقل القوارير الزجاجية إلى صندوق تجميد، وصنفها باسم الدراسة، وتاريخ الاستخراج، ومعرفات العينات، واحتزنها في فريزر بدرجة -80 درجة مئوية حتى التحليل.
    ملاحظة: يجب إكمال تحليل العينات المخزنة خلال 3-5 أيام. حجم البلازما 200 ميكرولتر يكفي عادة للكشف عن متتبع فيتامين A الموسوم حتى 90 يوما من الجرعة. ومع ذلك، يمكن ضبط حجم البلازما إلى 400 ميكرولتر إذا تم الحفاظ على نسب البلازما إلى الماء والإيثانول عند 1:1:2 من حيث الحجم.

4. إعداد عينات التحكم القياسية الداخلية

  1. تحضير محلول الإيثانول/الطور المتحرك عن طريق حقن 120 ميكرولتر من الإيثانول في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإضافة 200 ميكرولتر من الأسيتونيتريل (70:30) من الأسيتونيتريل / dH2O (v/v) والدوامة.
  2. إلى ثلاثة أنابيب منفصلة بسعة 0.6 مل، ماصة بحجم 20 ميكرولتر من محلول العمل القياسي الداخلي.
  3. أضف 80 ميكرولتر من محلول الإيثانول/الطور المتحرك المحضر والدوامة. انقل العينات الثلاثة القياسية الداخلية إلى قوارير HPLC كهرمانية مع إدخالات بسعة 300 ميكرولتر وغط القوارير فورا لمنع فقدان المذيب بسبب التبخر.

5. معايير منزل البلازما

  1. لتحضير عينات المنزل القياسية، احصل على حجم بلازما كاف يسمح بتحليل ثلاث عينات على الأقل في كل جولة تحليلية. يتم تحديد الحجم الإجمالي المطلوب للبلازما بعدد العينات التي يجب تحليلها.
  2. تحتوي Aliquot على البلازما القياسية في مبردات صغيرة عند حجم لازم لكل عملية تحليلية وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: من الضروري أن يحتوي معيار البيت على متتبع الريتينول الموسوم بالنظير المستخدم في العينات المجهولة. يمكن الحصول على مواد كافية من تجميع عينات المتطوعين في مجموعة واحدة.
  3. استخرج على الأقل ثلاث عينات قياسية من بيوت البلازما لكل عملية تحليلية بنفس حجم عينات البلازما غير المعروفة، كما تم في الخطوة 3.
  4. ضع معايير بيت البلازما في جميع أنحاء رف العينات مع وجود ما لا يقل عن 10 عينات بلازما غير معروفة بينها. استخدم معايير مصانع البلازما لحساب التغيرات داخل وبين اليوم.

6. عينات قياسية خارجية

  1. احصل على عينات خارجية معتمدة من المعايير واحتزنها عند -80 درجة مئوية. معيار خارجي معتمد على نطاق واسع هو معيار NIST لمادة مرجعية SRM 968.
  2. استخلاص ما لا يقل عن أربع عينات بلازما خارجية معيارية لكل تحليل بنفس حجم عينات البلازما غير المعروفة باستخدام الخطوة 3. استخدم عينات قياسية خارجية للتحقق من دقة النتائج التي تم الحصول عليها.

7. تحسين المركبات يدويا

  1. تأكد من تركيب مسبار APCI Heated Nebulizer في غلاف مصدر MS. جهز محلول التسريب لكل متعقب نظير مستقر عند حوالي 1 ميكروغرام/مل.
    ملاحظة: يجب أن يكون المحلول مشابها للطور المتنقل ويجب أن يحتوي على بعض الحمض للبروتونين. مذيب جيد للاستخدام هو 1:1 أسيتونيتريل لكل dH2O مع 0.1٪ حمض الفورميك (v/v).
  2. املأ حقنة هاميلتون بسعة 1 مل من نوع Luer-lock بمحلول التسرب، ثم قم بتوصيل الحقنة بالمصدر عبر أنبوب PEEK عبر اتصال التأريض. اضبط معدل تدفق التسريب إلى 10 ميكرولتر/ثانية.
  3. اختر الضبط اليدوي وتأكد من أن الآلة في وضع الضبط والمعايرة. شغل مضخة الحقنة واختر Q1 Scan Type في الوضع الإيجابي.
  4. حدد نطاق كتلة أدنى يبلغ 50 دالتون، ونطاق كتلة عليا يزيد تقريبا عن الكتلة الجزيئية للمركب المستهدف.
  5. اضبط الدورات على 500، ومعدل المسح 200 داليال/ثانية. انقر على زر التشغيل وراقب الإشارة في نافذة أطياف الكتلة.
  6. انتظر حتى تستقر الإشارة، ثم تحقق من ظهور قمم m/z المتوقعة. لنأخذ في الاعتبار قمم [M+H]+ و [M+2H]2+ لأن MS في وضع موجب.
  7. يجب أن يكون ارتفاع القمة المستهدف حوالي 1e6. يجب أن يكون التيار الأيوني الكلي (TIC) 1e7-1e9. استمر في الحقن حتى تستقر الإشارة، ثم اضغط على إيقاف. يجب أن يكون هناك ذروة مميزة ذات كثافة عالية تتكون من المركب في محلول النقع. يتم عرض إجمالي تيار الأيونات (TIC)، الذي يعرض إجمالي الإشارة لجميع الأيونات مجتمعة.
    ملاحظة: الكتلة المتوقعة ل 12مئوية ريتينول هي 269 دالتون، لذا فإن نطاق 50-300 دالتون مناسب لإظهار أيونات [M+H]+ و [M+2H]2+ .

8. مسح أيون المنتج (MS2) / فحص طيف CE

  1. اضبط كتلة البداية عند كتلة أقل، مثل 50 دالتون، وكتلة التوقف فوق كتلة Q1 مباشرة (مثلا، 269.1 لريتينول 12مئوية). اضبط الدورات إلى 5 وغير طاقة التصادم (CE) إلى 10. تحقق من الكتلة Q1 كأيون سلفي. إذا لم تظهر شظايا أصغر، زد CE إلى 20.
  2. مع زيادة CE، ستتكون أيونات منتجية أكثر. استمر في زيادة CE حتى يختفي الأيون السلفي على يمين الطيف تماما. زيادة CE أكثر لرؤية احتمال التجزئة الثانوي.

9. مسح MRM

  1. من خلال مسح MS2، اختر أكثر ثلاثة أيونات منتجية وفرة أو ملاءمة لتطويرها لمزيد من التحسين.
  2. لكل أيون ناتج، أدخل كتلة Q1 (السلف) وكتل Q3 (الضرب) المكتشفة. اضبط وقت التوقف على 200 مللي ثانية. سم كل جزء حسب الاسم (مثلا، 12C_Frag_93).
  3. اختر طاقة التصادم وحدد القيمة المثلى للCE باستخدام ميزة المنحدر. ملء عمود CE بقيمة CE المحسنة لكل جزء.
  4. تحسين إمكانية إزالة التجميع (DP) المحسنة بعد تحسين CE لتقليل التداخلات متساوية الضغط. تحسين جهد خروج خلية التصادم (CXP) لانتقال واحد في كل مرة.

10. تحسين المصدر/الغاز

  1. لا يمكن تحسين هذه المعايير تلقائيا. إذا كنت بحاجة لتحسين شدة الإشارة، قم بإجراء عملية تحسين يدوية. غير معلمة واحدة في كل مرة وقارن ما إذا كانت الإشارة زادت، أو بقيت كما هي، أو انخفضت.

11. ظروف الكروماتوغرافيا السائلة

  1. في الكروماتوغرافيا، استخدم تدرج طور متحرك ثنائي بحمض الفورميك 0.1٪ (v/v) في dH2O (A) و0.1٪ (v/v) حمض الفورميك في الأسيتونونتريل (B).
  2. اعتمادا على نظام LC المطبق، استخدم إما عمود ABZ PLUS بحجم 100 مم × 2.1 مم (3 ميكرومتر) مزود بخرطوشة C18 بحجم 4 مم × 2 مم (ل HPLC)، أو درع Premier BEH بحجم 100 مم × 2.1 مم (1.7 ميكرومتر) مزود بعمود RP18 FIT (للكروماتوغرافيا فائقة الضغط (UPLC)) لتحليل الريتينول. حافظ على الأعمدة عند درجة حرارة إما 40 °م أو 50 °م على التوالي.
  3. حقن 10 ميكرولتر من مستخلص البلازما على العمود. يحلل الإلوت بمعدل تدفق 0.4 مل/دقيقة. بالنسبة لأنظمة HPLC، يكون التدرج الخطي: 60٪ B إلى 95٪ B خلال 6.0 دقائق؛ 100٪ B من 6.1 دقيقة إلى 13.0 دقيقة؛ 100٪ B إلى 60٪ B من 13.1 إلى 14.0 دقيقة؛ و60٪ B من 14.0 إلى 17.0 دقيقة. بالنسبة لأنظمة UPLC، يعتمد التدرج الخطي على سؤال البحث. إذا كان من المقرر تحديد الريتينول فقط، فإن التدرج هو: 40٪ B إلى 60٪ B خلال 1.0 دقيقة؛ 60٪ B إلى 95٪ B من 1.0 دقيقة إلى 6.0 دقيقة؛ 100٪ B من 6.5 دقيقة إلى 7.5 دقيقة؛ 100٪ B إلى 40٪ B من 7.5 إلى 7.6 دقيقة؛ و40٪ B من 7.6 إلى 8.5 دقيقة. إذا كان الهدف هو تحليل إسترات الريتينيل أيضا إلى جانب الريتينول، فإن التدرج الخطي هو: 60٪ B إلى 95٪ B خلال 3.0 دقائق؛ 100٪ B من 3.5 دقيقة إلى 6.5 دقيقة؛ 100٪ B إلى 60٪ B من 6.5 إلى 7.0 دقيقة؛ و60٪ B من 7.0 إلى 8.5 دقيقة.

12. حالات التصلب المتعدد / التصلب المتعدد

  1. إجراء تحليل MS/MS تحت التأين الكيميائي بالضغط الجوي (APCI) في وضع الأيونات الموجبة. يتم اختيار APCI بدلا من التأين بالرش الكهربائي لأنه يوفر كثافة إشارة أعلى، ونطاق خطي أوسع، ويوفر ضوضاء خلفية أقل26.
  2. بالنسبة لانتقالات الكتلة لكل من [12C]ريتينول، [13C10] ريتينول، و[2H6] ريتينول والإسترات/الأسيتات الخاصة بها مع معلمات مراقبة تفاعلية مختارة (SRM) ل API4000 ومطياف الكتلة QTRAP 5500، تحقق من الجدول 2، الجدول 3، والشكل 2.
    ملاحظة: مراقبة الأيونات المختارة للريتينول، وإسترات الريتينيل، وأسيتات الريتينيل كانت نفس الأيون الجزئي من m/z 269 لقياس كمية APCI، حيث يتوافق هذا الأيون مع فقدان الماء أو الأحماض الدهنية أو حمض الخليك من الجزيئات المزينة بالبروتونات. نظرا لأن LC-MS/MS قادر على فصل قمم الريتينول عن إستراته، فإن حقنة واحدة تسمح بتحديد تخصيب النظائر في كل من كسر الريتينول والريتينيل-إستر في عينة واحدة.

13. قياس كمية الريتينول

  1. قم بقياس تركيزات عينات الريتينول [12C]، [2H6] ريتينول، و[13C10] من عينات الريتينول وفقا لمعايير المعايرة الخاصة بها.
  2. تحديد خسائر الاستخراج باستخدام استعادة التركيزات القياسية الداخلية لكل عينة مقابل عينات التحكم القياسية الداخلية.
  3. إجراء تأكيد تركيزات الريتينول في البلازما باستخدام المادة المرجعية القياسية (SRM) 968 من المعهد الوطني للمعايير والتقنية (NIST).

النتائج

لتوضيح فعالية الطريقة التحليلية في تحليل الريتينول الموسوم بالنظائر المستقر عبر أنظمة كروماتوغرافية مختلفة، نقدم نتائج من دراستين مختلفتين.

لاستخدام API4000 مع HPLC المسبقة، تم تحليل عينات بلازما من 111 طفلا فلبينيا تتراوح أعمارهم بين 12 و18 شهرا، تلقوا جرعة فموية من أسيتات الريتينيل 400 ميكروغرام (1.17 ميكرومول) [13C10] في اليوم 0، تلتها عينة دم 6 مل بعد 4 أيام من الجرعة، 7,28. كان متوسط تركيزات الريتينول الكلية في البلازما 1.1 ميكرومول/لتر، ومتوسط [13مئوية10] ريتينول 0.007 ميكرومول/لتر. نظرا لأن مستوى الضوضاء الخلفية داخل انتقال m/z من 279 إلى 100 كان متوسط ارتفاع ذروة ~50 cps (الشكل 1)، تم تعيين مستوى الكشف (LOD) والكمية (LOQ) للريتينول [13C10] عند 150 cps و500 cps، مما يعادل 6 fmol و19 fmol على العمود على التوالي. نظرا لأن دقة الأساس الجيدة تم الحصول عليها بين ريتينول [12C] والمعيار الداخلي المطبق لريتينيل-أسيتات، لم تكن هناك حاجة لاستخدام ريتينيل-أسيتات مستقر موسومه نظير.

يمكن تحقيق فصل كروماتوغرافي أسرع باستخدام UPLC مع QTRAP 5500، مع أوقات تشغيل أقل من 10 دقائق. اعتمادا على سؤال البحث، يمكن تطبيق طريقتين مختلفتين للفصل؛ (1) إذا كان الهدف هو تحديد الريتينول الأصلي والموسوم بالنظير المطبق بمعيار داخلي غير مميز لريتينيل-أسيتات، فإن أوقات الاحتفاظ بين الريتينول (4.37 دقيقة) وريتينيل-أسيتات (5.33 دقيقة) تعطي فصلا جيدا في الأساس (الشكل 3)؛ (2) إذا كان الهدف هو فصل الريتينول الأصلي والنظير الموسوم بالماء إلى جانب إسترات الريتينيل الأصلية والمعلمة، يمكن تحقيق فصل جيد خلال فترة تشغيل مدتها 8.5 دقيقة (الشكل 4). ومع ذلك، وبسبب قرب أوقات الاحتفاظ بين الريتينول (2.10 دقيقة) وأسيتات الريتينيل (2.43 دقيقة)، ينصح باستخدام أسيتات الريتينيل الموسوم نظيريا ([2H4] ريتينيل أسيتات) بدلا من ذلك. في هذا المثال، تم تحليل عينات الدم من 80 امرأة غانية في سن الإنجاب تلقين جرعة مكافئة من ريتينول 2 ملغ من [2H6] ريتينيل أسيتات، تلتها جمع عينات دم بعد 21 يوما من الجرعة. كان متوسط تركيزات الريتينول الإجمالية في المصل 1.89 ميكرومول/لتر، مع متوسط [2H6] ريتينول 0.027 ميكرومول/لتر ومتوسط [13C10] ريتينول 0.025 ميكرومول/لتر.

حققت الطريقة المقدمة مستوى منخفض من الكشف (LOD = 6 fmol؛ LOQ = 19 fmol على العمود)، مما يظهر حساسية عالية وخصوصية عالية لاكتشاف الريتينول المستقر الموسوم بالنظائر مع فصل واضح بين الريتينول الأصلي والمعايير الداخلية. علاوة على ذلك، عملت الطريقة بفعالية مع إعدادات HPLC وUPLC، رغم اختلاف أوقات الاحتفاظ. استخدام المعايير الداخلية الموسومة بالنظائر ([2H4] ريتينيل أسيتات) ضمن القياس الدقيق في ظروف UPLC الأسرع، إذا كان هناك حاجة لتحديد إسترات الريتينيل. أكدت المراجعة مقابل معايير المراجع المعتمدة من NIST الدقة، بينما أظهرت معاملات التباين داخل اليوم واليوم (2.3٪ و4.4٪ على التوالي) دقة ممتازة وقابلية للتكرار. يظهر التحليل الناجح لعينات البلازما/المصل من مجموعتين مختلفتين (الأطفال الفلبينيين ونساء غانيا) مع بروتوكولات جرعات مختلفة متانة وفائدة عملية في دراسات غذائية متنوعة.

figure-results-1
الشكل 1: كروماتوجرام LC-MS/MS باستخدام مطياف الكتلة API4000. تم الحصول على كروماتوغرام ريتينول في المصل بعد 4 أيام من تناول 0.4 ملغ من [13C10] ريتينيل أسيتات عن طريق الفم. تظهر مراقبة التفاعل المختارة (SRM) من m/z 269 إلى 93 فصل ريتينول [12C] (RT = 5.06 دقيقة) و[12C] ريتينيل أسيتات (RT = 5.83 دقيقة) كمعيار داخلي (IS). إشارة الريتينول [13C10] عند m/z 279 إلى 100 تتجاوز بشكل كاف كل من حد الكشف (LOD) وحد الكمية (LOQ). الظروف الكروماتوغرافية: (أ) تدرج الطور الثنائي المحمول بمقدار 0.1٪ (v/v) حمض الفورميك في dH2O و(B) 0.1٪ (v/v) حمض الفورميك في الأسيتونونيتريل؛ معدل تدفق 0.4 مل/دقيقة مع تدرج خطي من: 60٪ B إلى 95٪ B خلال 6.0 دقائق؛ 100٪ B من 6.1 دقيقة إلى 13.0 دقيقة؛ 100٪ B إلى 60٪ B من 13.1 إلى 14.0 دقيقة؛ و60٪ B من 14.0 إلى 17.0 دقيقة؛ عمود ABZ PLUS بحجم 100 مم × 2.1 مم (3 ميكرومتر)، مزود بخرطوشة C18 بمقاس 4 مم × 2 مم محفوظة عند 40 درجة مئوية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: أطياف كتلة الأيونات حاصل ضرب APCI-MS/MS. أطياف كتلة الأيونات بحقن التدفق من نوع APCI-MS/MS لريتينول (A) m/z 269 [12C]، (B) m/z 273 [2H4] ريتينول، (C) m/z 275 [2H6] ريتينول، و(D) m/z 279 [13C10] ريتينول في وضع الأيون الموجب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: كروماتوجرام LC-MS/MS باستخدام مطياف الكتلة QTRAP 5500. تم أخذ عينة كروماتوجرام LC-MS/MS لمستخلص نموذجي من معيار منزل بلازما بعد 21 يوما بعد تناول 1.0 ملغ من أسيتات [2H6] ريتينيل أسيتات و90 يوما بعد تناول 1.0 ملغ من أسيتات الريتينيل [13C10] عن طريق الفم. تظهر مراقبة التفاعل المختارة (SRM) لمتوسط الريتينول 269→93 ذروة [12مئوية] (RT = 4.37 دقيقة) وأسيتات الريتينيل (RT = 5.33 دقيقة) كمعيار داخلي (IS); الريتينول [2H6] (RT = 4.36 دقيقة) عند m/z 275→96; وذروة الريتينول [13درجة مئوية10] (RT = 4.38) عند m/z 279→100. الظروف الكروماتوغرافية: (أ) تدرج طور ثنائي متحرك بمقدار 0.1٪ (v/v) حمض الفورميك بوحدة dH2O و(B) 0.1٪ (v/v) حمض الفورميك في الأسيتونيتريل؛ معدل تدفق 0.4 مل/دقيقة مع تدرج خطي من: 40٪ B إلى 60٪ B خلال 1.0 دقيقة؛ 60٪ B إلى 95٪ B من 1.0 دقيقة إلى 6.0 دقيقة؛ 100٪ B من 6.5 دقيقة إلى 7.5 دقيقة؛ 100٪ B إلى 40٪ B من 7.5 إلى 7.6 دقيقة؛ و40٪ B من 7.6 إلى 8.5 دقيقة؛ عمود 100 مم × 2.1 مم (1.7 ميكرومتر) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT، يحافظ عليه عند 50°C. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: كروماتوجرام LC-MS/MS للريتينول وإسترات الريتينيل باستخدام مطياف الكتلة QTRAP 5500. تم أخذ عينات كروماتوجرام LC-MS/MS لمستخلص نموذجي من معيار منزل بلازما بعد 6 ساعات من تناول 1.0 ملغ من أسيتات الريتينيل [2H6] و90 يوم بعد تناول 1.0 ملغ من أسيتات [13C10] من الفم. تظهر مراقبة التفاعل المختارة (SRM) بمقدار m/z 269→93 ذروة [12مئوية] للريتينول (RT = 2.10 دقيقة); أسيتات الريتينيل [2H4] عند m/z 273→94 (RT = 2.43 دقيقة) كمعيار داخلي (IS)؛ يبلغ فصل [2ساعة6] الريتينول (RT = 2.09 دقيقة) و[2ساعة6] ريتينيل بالميتات (RT = 5.11 دقيقة) ذروته عند m/z 275→96؛ وذروة الريتينول [13درجة مئوية10] (RT = 2.10) عند m/z 279→100. الظروف الكروماتوغرافية: (أ) تدرج طور ثنائي متحرك بمقدار 0.1٪ (v/v) حمض الفورميك بوحدة dH2O و(B) 0.1٪ (v/v) حمض الفورميك في الأسيتونيتريل؛ معدل تدفق 0.4 مل/دقيقة مع تدرج خطي من: 60٪ B إلى 95٪ B خلال 3.0 دقائق؛ 100٪ B من 3.5 دقيقة إلى 6.5 دقيقة؛ 100٪ B إلى 60٪ B من 6.5 إلى 7.0 دقيقة؛ و60٪ B من 7.0 إلى 8.5 دقيقة؛ عمود 100 مم × 2.1 مم (1.7 ميكرومتر) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT، يحافظ عليه عند 50 درجة مئوية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المعايير
امتصاص الضرس (ɛ) للريتينول في الإيثانول:52,770 M-1 سم-1
عامل التخفيف:100 (100 ميكرولتر من معايرة المخزون القياسية ب 10 مل من الإيثانول)
متوسط الامتصاص المقاس:0.575
الحساب
تركيز (مول) [12C]ريتينول في الإيثانول:التركيز (مول) = الامتصاص / ɛ × طول الكوفيت
= 0.575 / 52770 M-1 سم-1 × 1 سم = 1.09 × 10-5 م
تصحيح التخفيف:1.09 × 10-5 م × 100 = 1.09 × 10-3 م أو 1.09 مللي مولار

الجدول 1: تحديد معيار المعايرة لتركيز مخزون الريتينول.

أنالايتانتقالات MRM (m/z)جهد التفكيك (V)جهد الدخول (V)طاقة التصادم (eV)جهد خروج التصادم (V)
[12C]-ريتينول/إستر269→935110276
[2H4] أسيتات الريتينيل273→945110276
[2H6] ريتينول/إستر275→965110276
[13C10]-ريتينول/إسترات279→1004110276

الجدول 2: معلمات مراقبة التفاعل (SRM) المختارة. معلمات ريتينول [12C]، ريتينول [13C10]، و[2H6] ريتينول وإسترات القيم الخاصة بها باستخدام API4000

أنالايتانتقالات MRM (m/z)جهد التفكيك (V)جهد الدخول (V)طاقة التصادم (eV)جهد خروج التصادم (V)
[12C]-ريتينول/إستر269→939410338
[2H4] أسيتات الريتينيل273→9454102011
[2H6] ريتينول/إستر275→966910253
[13C10]-ريتينول/إسترات279→10010210359

الجدول 3: معلمات مراقبة التفاعل (SRM) المختارة. معايير ريتينول [12C]، ريتينول [13C10]، وريتينول [2H6] وإستراتها باستخدام QTRAP 5500

المناقشة

تقدم طريقة LC-MS/MS المقدمة حساسية عالية للغاية، مع حدود كشف منخفضة تصل إلى 6 fmol/L، مما يمكن الباحثين من استخدام ما لا يقل عن 100 - 200 ميكرولتر من بلازما19. تعد هذه الطريقة المستهدفة للتصلب المتعددي المتعددة قوية بشكل خاص لتأكيد هوية نظائر الريتينويد عند استخدام أيونات القياس والناتج المؤهل18. ومع ذلك، نظرا لأن الريتينويدات الموسومة بالنظائر موجودة بتركيزات أقل بكثير من الريتينويدات الفسيولوجية غير الموسومة، فقد تتطلب عينات البلازما التي تحتوي على ريتينول واسترات ريتينيل الموسومة خطوة تركيز إضافية. تعتمد هذه الضرورة على عوامل مثل توقيت عينة الدم بعد تطبيق الجرعة، وتركيز جهاز التتبع الفموي، وحساسية نظام LC-MS/MS. تاريخيا، كانت تستخدم جرعات أعلى من التطبيقات لتجاوز الحساسية المنخفضة لمطياف الكتلة السابقة، لكن التطورات الحديثة سهلت استخدام الجرعات المنخفضة13. في الأمثلة المقدمة، تزيد الجرعة الفموية الأعلى من مستوى الريتينول المستقر الموسوم بالنظائر حتى في فترات زمنية لاحقة، أي عند 21 يوما مقابل 4 أيام.

نظرا لأن المجموعات الوظيفية النهائية لإسترات الريتينيل تفقد أثناء التأين، تلاحظ نفس القيم m/z ل 269 وأنماط تجزئة الأيونات الابنة المشابهة لكل من إسترات الريتينول والريتينيل. لذلك، فإن الفصل الكروماغرافي ضروري لتحديد تركيزاتهم المنفصلة18. علاوة على ذلك، وبسبب الوفرة الطبيعية العالية لنظائر مستقرة 13C في نظائر الريتينول الداخلية، يوصى بدمج أكثر من ثلاث ذرات 13C في متتبع الريتينول لتجنب الحاجة لتصحيح تخصيب الريتينول الطبيعي الأساسي بمقدار 13مئوية في بلازما الإنسان29.

تتطلب عينات البلازما معالجة قبل تحليل النظائر على خطوتين. أولا، يجب إزالة البروتين من عينات البلازما، تليها استخراج إسترات الريتينول والريتينيل باستخدام مذيب غير قطبي، مما يخلق نظاما ثنائي المراحل 18,19,20. على الرغم من تحقيق فصل واضح للطور باستخدام البروتوكول أعلاه، إلا أنه من الضروري ألا يتم إزعاج أو جمع الطور البيني في النظام ثنائي المرحلة، لأن ذلك سيزيد من وقت التجفيف ويقلل من دقة التحليل. بدلا من ذلك، استكشف فريقنا أيضا تطبيق إجراء استخلاص أحادي الطور للريتينويدات20. لهذا الغرض، يتم توصيل عينات بلازما بسعة 200 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بلاستيكي بسعة 2 مل، ويتم استخراج الريتينويدات باستخدام مزيج من الإيثانول وأسيتات الإيثيل. تطبيق هذا البروتوكول يسمح بتحليل الريتينول والريتينويدات القطبية أكثر، مثل نظائر حمض الريتينويك، مع استعادة مكافئة مقارنة بالاستخراج ثنائي المرحلة، كما أنه مشابه لطريقة استخراج الأسيتونونتريل ذات الخطوة الواحدة في كين ونابولي30.

نظرا لأن الريتينويدات عرضة للأكسدة والتماثل عند تعرضها للأشعة فوق البنفسجية والحرارة، فمن الضروري إجراء التحليل بأسرع وقت ممكن، ويجب اتخاذ الاحتياطات العامة أثناء جمع ومعالجة وتخزين بلازما30. تستخدم الطرق التقليدية لتحليل الريتينويدات الموسومة بالنظائر المستقرة عزلا و/أو اشتقاقات تستغرق وقتا طويلا. يتطلب تحليل GC-MS عزل جزء الريتينول من المصل البشري باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، تليها اشتقاق الريتينول22. على الرغم من أن الاشتقاق غير ضروري ل GC-C-IRMS، يوصى بفصل الريتينول مسبقا باستخدام خطوتي تنقية HPLC منفصلتين 17,25,31، كما يتطلب تحديد تخصيب طبيعي أساسي بمقدار 13مئوية للريتينول في بلازما الإنسان في مجموعة العينة 17,32. على النقيض من ذلك، فإن طريقة LC-MS/MS المقدمة لها عدة مزايا. يتجنب إجراءات الاستخراج و/أو التنقية الواسعة والمستغرقة للوقت، مما يتيح تحليلا سريعا وحساسا ومتزامنا لإسترات الريتينيل والريتينول الحر 16,18,26,32. علاوة على ذلك، فإن الطريقة فعالة لأنها توفر دقة عالية مع تباين منخفض وقابلة للتكيف مع أنظمة LC-MS/MS المختلفة.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يعلنون عنه.

شكر وتقدير

وقد قدمت مؤسسة بيل & ميليندا غيتس (رقم المشروع: OPP1115464) والوكالة الدولية للطاقة الذرية (IAEA) في فيينا (رقم المشروع E4.30.30) دعم هذا العمل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>مذيبات
درجة HPLC المطلقة للإيثانولفيشر10428671
درجة HPLC للأسيتونيتريلفيشر10660131
هيكسان 95٪ n-Hexane ل HPLC معتمدفيشرH/0406/17
درجة HPLC من إيزوبروبانولVWR20880.32
درجة HPLC من إيزوبروبانولVWR20880.32
الميثانول 99٪ 2.5 لترثيرمو ساينتفيك11367996
<القوي>المعايير/النظائر
الريتينول العابر بالكاملBioXtra95144
أسيتات الريتينيلسيغماPHR1236
نظير مستقر موسوم بالريتينول:ريسياكيم/بوكيم بي في
نظير مستقر يحمل علامة أسيتات الريتينيل:ريسياكيم/بوكيم بي فيلا يوجديمكن استخدام مجموعة من النظائر المستقرة لطريقة RID. قائمة بالنظائر المتاحة تجاريا المختلفة موضحة في الجدول 1. 
فيتامين أ وبي؛ (19، 19، 19، 20، 20، 20 - D6)
فيتامين أ وبي؛ (8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 19، 20-13C10)
أسيتات فيتامين أ (10، 19، 19، 19-D4)
فيتامين أ أسيتات (19، 19، 19، 20، 20، 20 - د6)
أسيتات فيتامين أ (8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 19، 20-13C10)
<قوي>معدات
موزع مذيب قابل للتعديل بسعة 5 ملسيغما-ألدرتشZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
ميزان الوزن التحليلي فيشر13592970
المكابس الشعرية (رؤوس الماصة) CP100 10x96 TIPACKجيلسونFD148314
المكابس الشعرية CP250ST 6x96جيلسونF148714
خزانة الأبخرة
مائي Microman E M100E (إزاحة إيجابية)جيلسونFD10004
مائية Microman E M250E (إزاحة إيجابية)جيلسونFD10005
Pipetman P100، 10-100ul، قاذف معدنيجيلسونF114057M
Pipetman P1000، 100-1000 ميكروليتر، قاذف معدنيجيلسونF114059M
Pipetman P20، 2-20ul، قاذف معدنيجيلسونF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
الطرد المركزي المبرد 5810 Rإبندورف
حمام مائي للصوتVWRUSC100T
مقياس الطيف الفوتونيثيرمو فيشر العلميA51119600C
عينة تيكني وكتلة حرارية.VWR
فيبراكس VXR بيسيك شيكرإيكا0002819002
Vortex mixer; MS3 الأساسي IKAفيشرMPR-555-050L
ملحق أنبوب اختبار VX2 - نوع werke VX2إيكا0000568900
<قوي>مستهلكات
أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملفيشرFB74323
100 مم × 2.1 مم (1.7 & mu؛ م) عمود درع بريميير BEH RP18 فانغارد FITالمياه186009498
100 مم × 2.1 مم (3 وميكرو؛ م) عمود سوبلكوسيل ABZ PLUSسوبيلكو57917
رؤوس الماصة بحجم 1000 أليتستارلابS1122-1830
قوارير حجمية بحجم 100 ملفيشر11323644زجاج بيركس بوروسيليكات من الفئة A المعتمد
رؤوس الماصة بحجم 200 أليتستارلابS1120-8810
خرطوشة سيكيوريتيوريتي جارد C18 عيار 4 مم × 2 ممفينومينيكسAJ0-4286
قوارير حجمية بحجم 50 ملفيشر11313644زجاج بيركس بوروسيليكات من الفئة A المعتمد
قوارير زجاجية كهرمانية بقطر 9 ملم مع إدخالاتفيشر11583680
أغطية لولب القارورة 9 ملمفيشر13206419
صندوق التجميد الكرتونيستارلابA9623-8181
كوارتز الأشعة فوق البنفسجية من هيلما كوفيتSLSCEL1600
غاز النيتروجين (أعلى نقاء وخال من الأكسجين)BOC
باستور بيبيتفيشر11546963
أنابيب زراعة بايركس 100x16ممكورنينغCLS9944916
أغطية اللولبي بطانة PTFE بقطر 16 ممكورنينغCLS999815
أغطية زجاجية زجاجية كهرمانية بحجم 2 مل PTFEفيشر11573542
غطاء برغي القارورة 9 مم سيليكون أبيض/أحمر PTFEثيرمو 13206419

المراجع

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  2. Stevens, G. A., et al. Trends and mortality effects of vitamin A deficiency in children in 138 low-income and middle-income countries between 1991 and 2013: a pooled analysis of population-based surveys. Lancet Global Health. 3 (9), E528-E536 (2015).
  3. Baye, K., et al. Estimates of child mortality reductions attributed to vitamin A supplementation in sub-Saharan Africa: scale up, scale back, or refocus. Am J Clin Nutr. 116 (2), 426-434 (2022).
  4. Bielderman, I., Vossenaar, M., Melse-Boonstra, A., Solomons, N. W. The potential double-burden of vitamin A malnutrition: under- and overconsumption of fortified table sugar in the Guatemalan highlands. Eur J Clin Nutr. 70 (8), 947-953 (2016).
  5. Brown, K. H., Engle-Stone, R., Kagin, J., Rettig, E., Vosti, S. A. Use of Optimization Modeling for Selecting National Micronutrient Intervention Strategies: An Example Based on Potential Programs for Control of Vitamin A Deficiency in Cameroon. Food Nutr Bull. 36 (3 Suppl), S141-S148 (2015).
  6. Bruins, M. J., et al. Maximizing the benefits and minimizing the risks of intervention programs to address micronutrient malnutrition: symposium report. Matern Child Nutr. 12 (4), 940-948 (2016).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Engle-Stone, R., et al. Weighing the risks of high intakes of selected micronutrients compared with the risks of deficiencies. Ann New York Acad Sci. 1446 (1), 81-101 (2019).
  9. Raiten, D. J., et al. Perspective: Integration to Implementation (I-to-I) and the Micronutrient Forum-Addressing the Safety and Effectiveness of Vitamin A Supplementation. Adv Nutr. 11 (2), 185-199 (2020).
  10. van Stuijvenberg, M. E., et al. South African preschool children habitually consuming sheep liver and exposed to vitamin A supplementation and fortification have hypervitaminotic A liver stores: a cohort study. Am J Clinical Nutr. 110 (1), 91-101 (2019).
  11. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among Equations Used for Retinol Isotope Dilution in the Assessment of Total Body Stores and Total Liver Reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  12. Green, M. H., Green, J. B., Ford, J. L. Better Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method Are Possible with Deeper Understanding of the Mathematics and by Applying Compartmental Modeling. J Nutr. 150 (5), 989-993 (2020).
  13. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  14. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  15. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  16. Fleshman, M. K., Riedl, K. M., Novotny, J. A., Schwartz, S. J., Harrison, E. H. An LC/MS method for d8-β-carotene and d4-retinyl esters: β-carotene absorption and its conversion to vitamin A in humans. J Lipid Res. 53 (4), 820-827 (2012).
  17. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  18. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  19. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  20. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Meth Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  21. Parker, R. S., et al. Study of beta-carotene metabolism in humans using 13C-beta-carotene and high precision isotope ratio mass spectrometry. Ann N Y Acad Sci. 691, 86-95 (1993).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  23. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. G., Russell, R. M. Short-term (intestinal) and long-term (postintestinal) conversion of beta-carotene to retinol in adults as assessed by a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 78 (2), 259-266 (2003).
  24. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  25. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats with C-13(4)-retinyl acetate and gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. J Nutr. 130 (11), 2844-2849 (2000).
  26. van Breemen, R. B., et al. Development of a method for quantitation of retinol and retinyl palmitate in human serum using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry. J Chromatogr A. 794 (1-2), 245-251 (1998).
  27. Fu, Y., Li, W., Flarakos, J. Recommendations and best practices for calibration curves in quantitative LC-MS bioanalysis. Bioanalysis. 11 (15), 1375-1377 (2019).
  28. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  29. van Lieshout, M., West, C. E., van Breemen, R. B. Isotopic tracer techniques for studying the bioavailability and bioefficacy of dietary carotenoids, particularly beta-carotene, in humans: a review. Am J Clinical Nutr. 77 (1), 12-28 (2003).
  30. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  31. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84, 30-39 (2014).
  32. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.