مقالة منهجية

زراعة الخلايا الغدية الصماء المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية عبر العضلات في الفئران

407 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69562

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

في هذه المقالة

ملخص

نوفر بروتوكولا طفيف التوغل لزراعة العضلات لجزر الخلايا الجذعية المشتقة من خلايا البنكرياس البشرية إلى فئران تعاني من نقص المناعة لزرع الزراعة في الجسم الحي ، والتحليل اللاحق.

الملخص

تشكل خلايا البنكرياس البنكرياسية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSC) مصدرا واعدا لعلاج خلايا السكري ونمذجة الأمراض. على الرغم من وجود عدة بروتوكولات تمايز، إلا أن الزرع في الجسم الحي غالبا ما يكون مطلوبا لدراسة النضج والوظيفة ضمن السياق الفسيولوجي. تعتمد معظم طرق الزراعة على مواقع مثل كبسولة الكلى أو الفراغ تحت الجلد، والتي قد تشكل قيودا تقنية أو فسيولوجية. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا لزراعة العضلات لجزر SC البنكرياس المشتقة من hPSC إلى فئران تعاني من نقص المناعة. يتيح هذا الموقع الوصول الجراحي المباشر، وتقليل التوغل، واستخراج الطعوم بشكل موثوق للتحليل لاحقا. يتيح هذا الإجراء الزرع العضلي لجزر صغيرة مشتقة من الخلايا الجذعية ويدعم تعافيها من التقييم التالي لإفراز الأنسولين بعد تحدي الجلوكوز الفموي. يتضمن البروتوكول خطوات لتحضير المجموعات والضغط، وجراحة الزراعة، وإفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز في الجسم الحي (GSIS)، واستخراج الطعم للتحليل النسيجي، مما يوفر إطارا قابلا للتكرار لزراعة العضلات في نماذج الفئران قبل السريرية.

المقدمة

السكري هو اضطراب أيضي متجانس تضاعف انتشاره خلال العقود الثلاثة الماضية ومن المتوقع أن يصيب 1.3 مليار شخص بحلول عام 2050. بينما تلعب العوامل البيئية، مثل النظام الغذائي ونمط الحياة، دورا مهما في بداية مرض السكري من النوع الثاني (T2D)، فإن الاستعداد الوراثي يساهم أيضا بشكل كبير في التسبب الثاني لمرض السكري (النوع الثاني). خلايا β البنكرياس مسؤولة عن تخليق وإفراز الأنسولين وتلعب دورا مركزيا في فيزيولوجيا مرض السكري3. لفهم كيف يساهم الخطر الجيني في خلل وظائف الخلايا β، توفر خلايا β المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية منظمة كعناقيد غدد صماء ثلاثية الأبعاد (يشار إليها لاحقا بجزر SC) نظام نموذج عالي المعلومات وذو صلة 4,5. توجه البروتوكولات الحديثة بشكل فعال تمايز الخلايا الجذعية البشرية إلى خلايا β المنتجة للأنسولين من خلال إعادة تجميع المراحل الرئيسية لتطور البنكرياس باستخدام مثبطات محددة وعوامل نمو 6,7.

تقوم هذه الأنظمة بتكرار معالم النمو بشكل موثوق بطريقة قابلة للتوسع وقابلة للتكرار، متغلبة على قيود الجزر المشتقة من المتبرعين، التي لا تدعم النمذجة التنموية وتخضع لقيود الإمداد. قدمت نماذج الفئران رؤى قيمة حول تطور البنكرياس، لكنها غالبا ما تفشل في إعادة إنتاج المظاهر الظاهرية التي لوحظت في المرضى البشربشكل كامل. وبالتالي، فإن استخدام نظام قائم على الخلايا الجذعية يمكن من توصيف المتغيرات الجينية المشاركة في تطور البنكرياس البشري وخلل الخلايا β8.

على الرغم من هذه التقدمات، تظل جزر SC الناتجة في المختبر غير ناضجة من حيث النسخ، والوظيفية، مقارنة بخلايا β البالغة الأصلية. تظهر إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز دون المستوى الأمثل وتفتقر إلى التعبير عن علامات الخلايا β الناضجة مثل MAFA وG6PC2 9,10. لسد هذه الفجوة، غالبا ما يستخدم النضج في الجسم الحي عبر الزرع إلى الفئران ذات المناعة المحدودة؛ عادة ما يحسن هذا ديناميكية إفراز الأنسولين وملفات التعبير الجيني6.

يتم تنظيم استقلاب الجلوكوز بدقة ويتطلب دمج الإشارات الجهازية. تستطيع جزر SC المزروعة دمج إشارات من عدة أعضاء، مما يوفر بيئة فسيولوجية أكثر أهمية وضرورية لتقييم العواقب الوظيفية للتنوع الجيني في خلايا β البشرية11.

تم إجراء زراعة جزر SC في الفئران في مواقع تشريحية مختلفة. الموقع التقليدي هو كبسولة الكلى، الفعالة في تعزيز نضج الخلايا β وعكس مرض السكري في القوارض المعالجة بالستربتوزوتوسين (STZ)12، لكنها تتضمن جراحة جراحية معقدة تحد من تطبيقها عبر المختبرات13. علاوة على ذلك، لا يمكن ترجمة هذه الطريقة إلى البيئات السريرية لعلاج مرضى السكري من النوع الأول بسبب حجم المرضى ومحدوديات الأوعية الدموية14. تم الإبلاغ عن مواقع زراعة بديلة، مثل الأنسجة العضلية، وتحت الجلد، والأنسجة الدهنية، مما يوفر طرقا أقل توغليا وأكثر قابلية للتطبيق سريريا. على الرغم من أن زراعة العضلات قد تشكل تحديات لتحقيق نضج خلايا β وإنتاج الأنسولين مقارنة بكبسولة الكلى12، إلا أنها لا تزال تحقق إفراز فعال للأنسولين والحفاظ على توازن الجلوكوز، مع تقديم نهج جراحي أبسط وأكثر سهولة15,16.

لذلك، نقدم في هذا البروتوكول نهجا لزراعة الأعضاء العضلية يعالج عدة قيود في بروتوكولات الزراعة الأخرى. هذه الطريقة طفيفة التوغل وتوفر استراتيجية موثوقة في الجسم الحي لنضوج جزر SC ودراسة المتغيرات الجينية المرتبطة بخلل الخلايا β.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب التي شملت الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hPSCs) والحيوانات المخبرية من قبل لجان الأخلاقيات المؤسسية والإقليمية والوطنية. تم اشتقاق وتوزيع خطوط hPSC المستخدمة هنا في الأصل وفقا للموافقات الأخلاقية المناسبة وإجراءات الموافقة المستنيرة في المؤسسات المصدر. يوضح الشكل 1 سير العمل العام، من صيانة hPSC مرورا بالتمايز الموجه في نسب البنكرياس ونضجه إلى جزر SC مناسبة للزراعة.

1. تمييز hPSCs إلى السلف البنكرياس

ملاحظة: يبني هذا البروتوكول على خطوتين تحضيريتين أساسيتين: 1) الحفاظ على وتوسيع الخلايا السطحية المنخفضة للبنكرياس، و2) تمايزها الموجه نحو سلالة البنكرياس الصماء. تم وصف كلا الخطوتين بالتفصيل7،17. يتم الحفاظ على hPSCs في صفائح مغطاة بوسائط B8 وفقا لتوصيات Lyria-Leyte وآخرين. احصد hPSCs للتمايز أثناء النمو الأسي قبل أن تتقاء. عند كثافة البذور الموصى بها، يجب أن تصل إلى 90-100٪ التقاء في اليوم التالي، جاهزة لبدء التمايز. يتم التمايز نحو سلالة البنكرياس الصماء وفقا للإجراء الذي وصفه بارسبي وآخرون. يمكن العثور على التفاصيل الكاملة عن الوسائط في الجدول 1.

  1. غط صفائح التمايز بمصفوفة خارج الخلية مشتقة من الغشاء القاعدي.
  2. زرع 0.16-0.19 مليون خلية/سم2 في اليوم 0 (1.7 مليون خلية في بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار). استخدم 1.5-2 ضعف حجم B8 + CEPT لمنع استنزاف المغذيات (3-4 مل لكل بئر في صفيحة ذات 6 آبار).
    ملاحظة: عند تمرير hPSCs أو تجارب التمايز التلقائي، نفضل أن نكمل وسط B8 ب CEPT، وهو مزيج من الكرومان 1، الإيمريكاسان، البولي أمينات، وترانس-ISRIB، بدلا من مثبط ROCK التقليدي Y-27632، بسبب قدرته المثبتة على تعزيز بقاء hPSC18. ومع ذلك، يظل Y27632 بديلا صالحا لهذا البروتوكول.
  3. قم بإجراء تغييرات وسائط باستخدام وسائط التفاضل من الموسم 1 إلى 4 وفقا للجدول التالي: الموسم 1 (الأيام 1-4)، الموسم الثاني (الأيام 4-7)، الموسم 3 (الأيام 7-9)، والموسم الرابع (الأيام 9-11).
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على التركيبات الإعلامية الكاملة؛ تم وصف تفاصيل إجرائية إضافية بواسطة بارسبي وآخرين.

2. توليد عناقيد ثلاثية الأبعاد والتمايز إلى الخلايا المنتجة للأنسولين

ملاحظة: في اليوم الحادي عشر، كان من المفترض أن تكون الخلايا المتمايزة قد تطورت إلى أسلاف للبنكرياس. لتعزيز التمايز الصماء في هذه المرحلة، تنتقل الخلايا من الزراعة المستوية إلى الزراعة ثلاثية الأبعاد.

  1. أضف 0.5 مل من محلول مضاد للالتصاق بنسبة 5٪ (مع الجهد الزائد) (انظر الجدول 1 للتفاصيل) لتغطية قاع صفيحة ميكروبئر صغيرة ب 24 بئر تحتوي على آبار هرمية مقلوبة (قطر 400 ميكرومتر). الطرد المركزي بحرارة 1300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: يخلق محلول مضاد الالتصاق سطحا مضادا للالتصاق يمنع الخلايا من الالتصاق بالبلاستيك ويعزز التجمع المتجانس.
  2. افحص الآبار الصغيرة تحت المجهر بحثا عن فقاعات هواء وإعادة الطرد المركزي حسب الحاجة لإزالة أي هواء محبوس (الشكل 2A). استنشق محلول منع الالتصاق واغسله مرتين ب 0.5 مل من PBS لكل بئر. اترك الآبار مغطاة ب PBS حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
  3. غسل الخلايا ب 1 مل من PBS-0.5 ملليمول EDTA، استنشق PBS-EDTA، وغط الآبار بالتربسين (1 مل لبئر من صفيحة ذات 6 آبار). حضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 8-12 دقيقة (حتى يسبب النقر انفصالا ملحوظا).
  4. لا تزيل التربسين؛ بدلا من ذلك، يخفف بحجم مضاعف من DMEM-F12 أو PBS، ثم يعيد تعليقه بلطف عن طريق التوصيل بالماصات. ضع التعليق في أنبوب مخروطي وتابع فورا إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: من الأفضل حضانة التربسين لفترة أطول بدلا من إجراء عملية تثبيث ميكانيكية قاسية.
  5. قم بتوصيل نظام التعليق المركزي عند 200 جرام لمدة 3 دقائق عند RT. استنشق السائل الفائق بحذر وأعد تعليق الحبيبة بلطف في طبقة S4 متوسطة مدفئة مسبقا (1.25 مل لكل بئر في بئر دقيق ب 24 بئئ).
  6. استنشق PBS من أطباق الميكروويل. بلطف أضف 1.25 مل من الخلايا المعلقة إلى كل بئر من صفيحة البئر الدقيقة.
    ملاحظة: يحتوي كل بئر من صفيحة 24 ميكروبئر على 1200 بئر صغير. كثافة البذور المطلوبة للحصول على عناقيد بالحجم المناسب هي 1,500 خلية لكل بئر صغير، أي ما يعادل 1.8 مليون خلية في كل بئر. بدلا من ذلك، يمكن استخدام آبار دقيقة ذات 6 آبار، مع تعديل الأحجام وعدد الخلايا (حوالي 8.85 مليون خلية في 5 مل من وسط المرحلة الرابعة).
  7. قم بعمل الطرد المركزي على اللوح بوزن 100 جرام لمدة 3 دقائق عند RT لتوزيع الخلايا بشكل متساو في الآبار الدقيقة. انقل ألواح البئر الدقيقة بحذر إلى حاضنة رطبة.
  8. قم بإجراء تغييرات في الوسائط باستخدام وسائط التفاضل S5 (D14-D18)، S6 (D18-D25)، وS7 (D25-D46).
    ملاحظة: تفاصيل التكوين الكاملة موضحة في الجدول 1، مع تفاصيل إجرائية إضافية موصوفة من قبل بارسبي وآخرون 7.
    يمكن استخدام كوكتيل CEPT خلال هذه الخطوة بدلا من مثبط ROCK Y-27632، بسبب قدرته المثبتة على تعزيز بقاء الخلايا أثناء تكوين العضويات18. يشير التجمع الناجح إلى تكوين تجمعات كروية مضغوطة خلال 24-48 ساعة (انظر الشكل 2B).

3. زرع جزر SC الصغيرة في العضلات المشدودة للفئران ذات المناعة الضعيفة

ملاحظة: تم زرع جزر SC الصغيرة في مراحل مختلفة من التمايز (من المرحلة 4 إلى المرحلة 7). بينما يمثل زرع جزر S7 SC المتمايزة الاستراتيجية المثلى لتقييم استجابة الجلوكوز6، فإن زراعة الجزر السلفية في المراحل المبكرة (S4-S5) أو الجزر القصيرة غير الناضجة (S6) قد تساعد في كشف فروق التمايز أو النضج التي تخفي في المختبر باستخدام ظروف زراعة محددة. ومع ذلك، فإن زراعة السلف الأقل تمايزا تحمل خطرا متزايدا لتكون التيورمات، ويرجع ذلك أساسا إلى بقايا مجموعات الخلايا غير المتمايزة.

  1. ضغط العناقيد
    1. انقل الكمية المناسبة من المجموعات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل (انظر الملاحظة).
      ملاحظة: تعتمد جرعة الخلايا على الهدف التجريبي. بالنسبة لعلم الأنسجة، يكفي من 0.5 إلى مليون خلية لكل فأر لاسترجاع الطعم بشكل موثوق، بينما تتطلب الفحوصات الوظيفية أو عكس السكري في الفئران المعالجة بSTZ عادة جرعات أعلى، تصل إلى 2-5 ملايين خلية. قبل الضغط، يجب أن تظهر جزر SC شكل كروي منتظم بقطر مستهدف ~150-250 ميكرومتر (النطاق المقبول: 100-300 ميكرومتر). هذا النطاق يتوافق تقريبا مع ~10³-4 × 10³ خلايا لكل مجموعة، ويجب تجنب التجمعات الكبيرة الحجم (>300-400 ميكرومتر) لأنها أكثر عرضة للنخر المركزي. يتم التحقق من حجم التجمع والتجانس قبل الضغط بواسطة تصوير الحقل الساطع أو المجهر المجسم للآبار التمثيلية، يليه قياس القطر باستخدام برنامج تحليل الصور القياسي.
    2. وصل الحقنة بمجموعة أنابيب الإبر واملأها بوسط S7.
    3. استنشق المجموعات إلى الأنبوب مباشرة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. اطو الأنبوب إلى نصفين وأدخل القسم المطوي في رأس ماصة بسعة 200 ميكرولتر. أدخل مجموعة إبرة رأس الأنبوب في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وثبت الأطراف على حافة الأنبوب باستخدام شريط لاصق.
    4. قم بعمل الطرد المركزي للأنبوب بقوة 100 جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية لضغط العناصر. ضع الأنبوب على الثلج فورا.
  2. نقل العناقيد إلى فئران
    ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات الجراحية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة ووفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية ورفاهية الحيوان. يجب التعامل مع مواد المخدر والشيبس والتخلص منها وفقا لإجراءات السلامة المعتمدة.
    1. تحفز التخدير في فئران NOD-scid-غاما باستخدام 3-5٪ من الإيزوفلوران.
    2. احلق الجانب الخلفي من الساق اليمنى تحت الركبة وقم بتعقيم بإيثانول بنسبة 70٪.
    3. افصل الأنبوب عن طرف الماصة ووصلها بالحقنة. اقطع الأنبوب بالقرب من العناقيد المضغوطة وثبته في الطرف الخشن من الإبرة. ادفع المحلول الملحي حتى يصل أول تجمع إلى طرف الإبرة.
    4. ضع الفأر على الأرض مائلا إلى الجانب الأيمن، ومد الساق اليمنى. أدخل الإبرة بعمق 4-5 مم في الحجرة الإنسية للفخذ الأيمن، في المنطقة بين عضلة المقرب وعضلة الغراسيلس.
    5. حقن العناقيد مع سحب الإبرة بمقدار ~3 مم. قم بتدوير الحقنة واسحب الإبرة.
    6. راقب الفأر حتى يتعافى تماما من التخدير.
      ملاحظة: للتوصيف الوظيفي (أي GSIS في الحي ، القسم 4)، يجب استخدام جزر SC لنمط جيني واحد لكل فأر؛ زراعة واحدة تكفي. ومع ذلك، للتوصيف النسيجي أو النصي للنضج بعد الزرع، يمكن استخدام كلا الساقين (مثلا، إحدى ساقيها تحمل عناقيد SC مشتقة من hPSCs تحتوي على متغير جيني مرتبط بالمرض، والساق الأخرى التي تم تصحيح المتغير). لا يمكن تأكيد الولادة العضلية الصحيحة مباشرة في الجسم الحي فور الحقن. بدلا من ذلك، يتم التحقق من نجاح الزرع بأثر رجعي من خلال التعرف الكبير على الطعم عند الاسترجاع (الشكل 3) ومن خلال التحليل النسيجي (الشكل 4).

4. إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز في الجسم الحي (GSIS)

ملاحظة: يقوم نظام GSIS في الجسم الحي ، عبر تحدي الجلوكوز الفموي، بتقييم إفراز الأنسولين الوظيفي استجابة لمحفز فسيولوجي. يجب أن تتبع جميع الإجراءات إرشادات رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية. تتحسن الاستجابات الوظيفية لخلايا β المزروعة مع النضج الحي : يمكن اكتشاف ببتيد C البشري في وقت مبكر يصل إلى أسبوعين بعد الزراعة، بينما يتم عادة تحقيق إفراز قوي مستجاب للجلوكوز خلال 4 أسابيع. يمكن أن تختلف هذه الجداول الزمنية حسب المرحلة التطورية لجزر SC عند الزرع

  1. الفئران السريعة لمدة 4-6 ساعات قبل إعطاء الجلوكوز، لضمان الوصول إلى الماء.
  2. حضر محلول D-(+)-جلوكوز بنسبة 20٪ (بدون زجاج) في الماء. قم بالتعقيم بتمرير فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر وسخنه إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  3. وزن كل فأر وحساب جرعة الجلوكوز المطلوبة عند 3 جرام/كجم من وزن الجسم.
  4. قم بتحميل الحجم المناسب من محلول الجلوكوز في إبرة جافاج منحنية بوزن 20 جرام متصلة بحقنة بسعة 1 مل.
  5. قيد الفأر بلطف وقم بإجراء التجويز الفموي لضمان إدخال إبرة الغافيج بسلاسة لتجنب شفط القصبة الهوائية.
  6. جمع عينات دم عن طريق ثقب تحت الفك السفلي أو الوريد الذيلي في البداية (0 دقيقة) و15 و30 دقيقة بعد الفتحة، باستخدام أنابيب شعرية وأنابيب طرد مركزي دقيقة بحجم 1.5 مل. اترك الدم يتجلط في درجة حرارة الغرفة لمدة تقارب 15 دقيقة، ثم خزن الأنابيب على الثلج.
  7. قم بعمل الطرد المركزي للعينات على حرارة 1,000 جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وانقل المصل إلى أنابيب جديدة. تخزين عند −80 درجة مئوية حتى يتم التحليل بواسطة ELISA.
    ملاحظة: يمكن تعديل نقاط الزمن حسب النموذج التجريبي. من الضروري استخدام اختبار قادر على التمييز بين الإنسولين البشري والفأري أو ببتيد C لتقييم إفراز الإنسولين المستخرج من الطعم في نماذج زراعة الأزواج.

5. استرجاع العناقيد المطروعة

  1. قتل الفأر وفقا لإرشادات أخلاقيات الحيوانات المؤسسية.
  2. لتقليل تلوث الأنسجة بالفرو، رش الإيثانول بنسبة 70٪ (v/v) على الجسم.
  3. قم بإزالة الجلد لكشف عضلات الأطراف السفلية وتحديد مواقع المجموعات المطروعة باستخدام عدسة مكبرة. إزالة نسيج يحتوي على طعم باستخدام المقص والملاقط.
  4. اشطف النسيج مرة واحدة باستخدام PBS وانقله إلى 4٪ (بدون زجاج) بارافورمالديهيد (PFA) على الثلج. ثبت النسيج في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات مع هز لطيف.
  5. اغسل العينة في PBS لمدة ساعة مع هز لطيف. انقل النسيج إلى 30٪ (مع الوزن) السكروز على PBS وحضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب التخلص من الأنسجة البيولوجية، وعينات الدم، والنفايات الكيميائية (بما في ذلك المثبتات وبقايا التخدير) وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية وإدارة النفايات الكيميائية.

6. تلوين النباتات الخارجة

  1. تضمين OCT
    1. قم بإدخال النسيج في قالب مملوء بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
    2. ضع القالب في حمام جاف من الثلج الأيزوبروبانول لتجميد العينة بسرعة. خزن عند -80 درجة مئوية حتى التقسيم.
    3. باستخدام جهاز التبريد، قم بقطع مقاطع بحجم 5-7 ميكرومتر وتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية.
  2. المناعة
    1. توازن الشرائح عند RT لمدة 15 دقيقة داخل الحاوية لتجنب التكثف.
    2. اشطف الشرائح ب PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
    3. حضن كل قسم بمحلول 100 ميكرولتر من محلول الحجب/النفاذية لمدة 30 دقيقة عند الحقن المقاوم (0.1٪ من المادة الخافضة للتوتر السطحي غير الأيوني في PBS، مع 5٪ مصل النوع الذي تم فيه رفع الجسم المضاد الثانوي).
    4. حضن كل قسم ب 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب/النفاذية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    5. اشطف الشرائح ب PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
    6. حضن كل قسم ب 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول الحجب/النفاذية لمدة ساعة واحدة عند RT.
    7. اشطف الشرائح ب PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
    8. قم بتركيب شرائح بمحلول تركيب 15 ميكرولتر باستخدام DAPI وتطبيق غطاء منزلق. خزن عند 4 درجات مئوية في الظلام حتى التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

النتائج المعروضة تتوافق مع زراعة العضلات لجزر SC المرحلة السابعة في فئران تعاني من نقص المناعة، وأجريت تحليلات بعد 6 أسابيع من الزراعة. تم تحليل عدد محدود من الحيوانات التي تحمل طعوم تمثيلية لتوضيح جدوى الإجراء. في هذه الدراسة، يعرف النجاح بأنه الاسترجاع الكبير للطعم العضلي تليه تأكيد نسيجي للبقاء وهوية الغدد الصماء لجزر SC المزروعة. يوضح الشكل 1 سير عمل التمايز العام، من صيانة hPSC مرورا بتمايز ونمو نسب البنكرياس الموجه إلى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول، نصف زراعة الجزر الصغيرة عن طريق العضلات بأنها نهج بسيط، قابل للتكرار، وقليل التوغل للنضج الحي ، مع إمكانية التقييم الوظيفي. على الرغم من أن زراعة الكبسولة تحت كبسولة الكلى تعتبر على نطاق واسع "المعيار الذهبي" لزرع الجزر الصغيرة أو جزر SC في القوارض، إلا أنها تتطلب خبرة تقنية أكبر وإجراء جراحي أطول. على النقيض من ذلك، يوفر الموقع العضلي بساطة إجرائية وتنفيذا سريعا، متوافقا مع مبادئ التنقية في إطار 3Rs من خلال تقليل تعقيد الجراحة والضغط النفسي حول العملية. تجعل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور دانوي هوانغفو (مركز ميموريال سلون كيتيرينغ للسرطان، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) على توفير خطوط hPSC المستخدمة في هذه الدراسة بسخاء. وقد تم دعم هذا العمل بمنح PID2021-122284NA-I00 و CNS2023-145179 من وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية MICIU/AEI/10.13039/501100011033 وNext GenerationEU/PRTR (A.B.)، وكذلك من قبل اتحاد CIBER للأبحاث الطبية الحيوية في الشبكة، CB07/08/0029 و PID2023-150719OB-I00 (M.V.)، معهد صحة كارلوس الثالث (ISCIII). مركز البحوث الطبية الحيوية في مرض السكري والاضطرابات الأيضية المرتبطة به (CIBERDEM) هو مبادرة من ISCIII ومدعومة جزئيا من صندوق التنمية الإقليمي الأوروبي (FEDER).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392كوكتيل CEPT
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)Syncomمنتج مخصصمثبط Gamma-secretase
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396كوكتيل CEPT
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptمنتج مخصص
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich82184يستخدم بنسبة 5٪ (w/v)
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483كوكتيل CEPT
RepSoxMedChemExpressHY-13012مثبط Alk5
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGمشابه T3 قابل للاختراق للخلايا
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495كوكتيل CEPT
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301مثبط ROCK
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antibodies
Rat anti-Human C-peptide (insulin)DSHBGN-ID4-sيستخدم بنسبة 150 نانوغرام/مل
Mouse anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500

المراجع

  1. Ong, K. L., et al. regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).
  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
  3. Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes. Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).
  4. Xue, D., et al. Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells. Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).
  5. Bartolomé, A. Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction. Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).
  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
  8. Shi, Z. -D., et al. Genome editing in hPSCs reveals GATA6 haploinsufficiency and a genetic interaction with GATA4 in human pancreatic development. Cell Stem Cell. 20 (5), 675-688.e6 (2017).
  9. Fantuzzi, F., et al. In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 10, e967765(2022).
  10. Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Single-cell transcriptome profiling reveals β cell maturation in stem cell-derived islets after transplantation. Cell Rep. 32 (8), 108850(2020).
  11. Lin, H., et al. Glucose metabolism and regulation in establishing human stem cell-derived β cell maturation. Cell Rep. 44 (7), 115892(2025).
  12. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  13. Thévenet, J., Gmyr, V., Delalleau, N., Pattou, F., Kerr-Conte, J. Pancreatic islet transplantation under the kidney capsule of mice: Model of refinement for molecular and ex-vivo graft analysis. Lab Anim. 55 (5), 408-416 (2021).
  14. Scholl, V. G. S., et al. Assessing implantation sites for pancreatic islet cell transplantation: Implications for type 1 diabetes mellitus treatment. Bioengineering. 12 (5), 499(2025).
  15. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), e141553(2021).
  16. Lithovius, V., et al. Non-invasive quantification of stem cell-derived islet graft size and composition. Diabetologia. 67 (9), 1912-1929 (2024).
  17. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  18. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  19. Wells, S. A., Ellis, G. J., Gunnells, J. C., Schneider, A. B., Sherwood, L. M. Parathyroid autotransplantation in primary parathyroid hyperplasia. N Engl J Med. 295 (2), 57-62 (1976).
  20. Kim, H. -I., Yu, J. E., Park, C. -G., Kim, S. -J. Comparison of four pancreatic islet implantation sites. J Korean Med Sci. 25 (2), 203(2010).
  21. Axen, K. V., Pi-Sunyer, F. X. Long-term reversal of streptozotocin-induced diabetes in rats by intramuscular islet implantation. Transplantation. 31 (6), 439-441 (1981).
  22. Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18 (1), 47-54 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة