توحيد نموذج MCAO داخل الضوئي من Rat Intraluminal: بروتوكول مفصل مع تدابير مراقبة الجودة

ملخص

يظهر هذا البروتوكول تقنية محسنة لإغلاق الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) لمدة 60 دقيقة في الفئران. تم التحقق من صحة البروتوكول باستخدام طرق متعددة الوسائط، محققا معدل نجاح 87.5٪ مع وفيات قليلة، وحقق نتائج قابلة للتكرار في حالات الاحتراق والسلوك لأبحاث السكتة الدماغية.

الملخص

يظل نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط للفئران (MCAO) هو المعيار المرجعي لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية الإقفاري والتحقق من صحة العلاجات الواقية العصبية. ومع ذلك، يمكن للانحرافات الجراحية الطفيفة أن تغير بشكل عميق حجم الاحتشاء والنتائج السلوكية. باستخدام إطار عمل "التصور ثم التنظيم"، أعدنا فحص كل خطوة من مراحل إنشاء النموذج والتحقق منه. تم إجراء توثيق فوتوغرافي مفصل للمعالم الجراحية الرئيسية والخطوات الحرجة لتوحيد التوجيه التشريحي ووضع الخيط. تم استخدام تلوين كلوريد 2,3,5-ثلاثي فينيل تيترازوليوم (TTC) لرسم خرائط دقيقة لحجم وطوبولوجيا الالتهابات عند 24 ساعة و72 ساعة بعد إعادة التروية. تم تصنيف العجز العصبي باستخدام مقاييس زي-لونغا، بيدرسون، وغارسيا المعدلة. خضع أربعة وعشرون ذكرا من جرذ سبراج-داولي لعملية MCAO عابرة لمدة 60 دقيقة؛ تم تقييم حجم الالتهاب الدماغي ودرجات الأعصاب عند 24 ساعة و72 ساعة. حققت حوالي 87.50٪ من الحيوانات حجب تدفق الدم الدماغي بنجاح (زي-لونغا ≥ 1 والانفاركت المعرف بشكل لا لبس فيه من قبل TTC)، مع معدل وفيات إجمالي بلغ 12.50٪، مما يدل على دقة النموذج العالية. يوفر هذا البروتوكول الموحد أساسا تقنيا قابلا للتكرار لأبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية، مما يسهل الاتساق بين المختبرات في الدراسات التي تحقق فيزيولوجيا أمراض السكتة الدماغية والتدخلات العلاجية.

المقدمة

السكتة الدماغية هي ثاني أكبر سبب للوفاة وثالث أكبر سبب للإعاقة على مستوى العالم ^1,2. تؤثر السكتة الدماغية بشكل غير متناسب على الدول ذات الدخل المنخفض والمتوسط، حيث تحدث في المتوسط قبل 15 عاما من الدول ذات الدخل المرتفع¹. النوعان الرئيسيان هما السكتة الدماغية الإقفارية (85٪) والنزيف داخل الدماغ (15٪)³. السكتة الدماغية الإقفاري، التي تمثل الغالبية العظمى من السكتات الدماغية، تنتج عن انسداد تدفق الدم الدماغي، مما يؤدي إلى موت الخلايا واحتشاء الدماغ⁴. تتضمن السلسلة الإقفارية عدة أحداث كيميائية حيوية، بما في ذلك عمليات مؤكسدة مؤكدة مهمة ^5,6.

على الرغم من الجهود الواسعة قبل السريرية والسريرية، إلا أن عددا قليلا فقط من العلاجات — وأبرزها الانفصال الوريدي مع محفز البلازمينجين النسجي واستئصال الجلطة الميكانيكية — أثبتت فعاليتها، وهذه العلاجات محدودة بنوافذ علاجية ضيقة ومعايير صارمة لاختيار المرضى. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتوضيح الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء الإصابة الإقفاري، وإصلاح الأوعية العصبية، والتعافي بعد السكتة الدماغية. نموذج حيواني قابل للتكرار وذو صلة سريرية لا غنى عنه لتحقيق هذا الهدف.

يستخدم نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) على نطاق واسع لاستكشاف السكتة الدماغية الإقفاري في القوارض^7،8. طريقة انسداد الخيوط داخل الضوئي هي واحدة من^{أكثر تقنيات} MCAO الكلاسيكية والأكثر استخداما. يمكن لهذه التقنية نمذجة كل من الإسدادات الدائمة والمؤقتة دون الحاجة إلى استئصال الجمجمة. أظهرت تقنية أحدث عبر الفخذ باستخدام الأسلاك الداخلية وعائية واعدة في تحفيز MCAO العابر في الفئران، مما يوفر نتائج أكثر اتساقا¹⁰. يتضمن هذا النموذج إغلاق الشريان الدماغي الأوسط، عادة باستخدام تقنية خيط داخل الضوء^. يسبب MCAO نقص تروية الدماغ البؤري، مما يؤدي إلى نقص التروية وإصابة إعادة التروية¹².

بينما تعتبر MCAO ذات قيمة في دراسة فيزيولوجيا مرضية السكتة الدماغية والعلاجات المحتملة، إلا أنها يمكن أن تنتج متغيرات في حجم آفة⁷. لذلك، يمكن أن تقلل التحسينات على نموذج MCAO — مثل تحسين تقنيات إعادة التروية، ووضع بروتوكولات تشغيل موحدة، وتطوير معايير تقييم موحدة — من التباين في موقع وحجم الالتهاب الداخلي، مما يعزز فائدته في أبحاث السكتة الإقفارية.

يتطلب هذا البروتوكول منحنى تعلم يتكون من حوالي 10–15 عملية جراحية^{لتحقيق نتائج} متسقة. قد تختلف معدلات النجاح بناء على خبرة المشغل وسلالة الفئران¹⁴. النموذج مناسب لدراسة السكتة الدماغية الإقفارية الحادة لكنه قد لا يحاكي بشكل كامل الأمراض المصاحبة البشرية مثل ارتفاع ضغط الدم أو السكري¹⁵. وبناء عليه، سعينا لوضع والتحقق بدقة من بروتوكول MCAO المحسن يهدف إلى تقليل التغيرات التجريبية من خلال إجراءات موحدة وتدابير صارمة لمراقبة الجودة. تم دمج أربع ابتكارات تكميلية لتحقيق مكاسب مزدوجة في التوحيد القياسي وموثوقية البيانات: (1) التقييم الزمني الطولي المزدوج — تم الحصول على درجات عصبية من مقاييس زي-لونغا، بيدرسون وغارسيا المعدلة بالتوازي مع أحجام الاحتماء المشتقة من 2,3,5-تريفينيل تيترازوليوم كلوريد (TTC) عند 24 ساعة و72 ساعة بعد إعادة التروية، مما يوضح العلاقة الزمنية بين حل الوذمة والتعافي الوظيفي؛ (2) التحقق المتقاطع ثلاثي المقياس—التقييم المزدوج المعمى للمحققين مع معايرة ثلاثية المقياس المتكاملة زاد بشكل ملحوظ من حساسية ودقة التقييم السلوكي؛ (3) تم إنشاء إجراء تشغيلي قياسي (SOP) لاستخراج حمام الثلج في 90 ثانية متبوعا بتقطيع إكليل 2 مم بخطوة واحدة في قوالب مبردة مسبقا" لتقليل التحلل الذاتي والخطأ البشري، وضمان قياسات حجمية عالية الدقة؛ (4) تم إنشاء إطار عمل متكامل لمراقبة الجودة—وهو نظام شامل يشمل الصيام قبل العملية، والتحكم في عمق التخدير، وتنظيم الحرارة قبل العملية، والوقاية من التلوث المتقاطع لتقديم إجراء تشغيل قياسي يمكن تكراره وسهل النقل في MCAO، مما يضع أساسا قويا للاتساق بين المختبرات وقابلية المقارنة بين الدراسات.

البروتوكول

تمت الموافقة والإشراف على التجربة من قبل لجنة التجارب المؤسسية للحيوانات ورعاية الحيوانات التجريبية في جامعة كابيتال الطبية. جميع البروتوكولات امتثلت لدليل NIH لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية (منشورات NIH 80-23، مراجعة 1996)، وتتطلب معدات معقمة وتقنيات معقمة.

1. اختيار الحيوانات

1. استخدم ذكور فئران سبراج-داولي (بعمر 6–8 أسابيع، ووزنها 240–270 جم) تم الحصول عليها من مورد معتمد للحيوانات المخبرية (رقم الرخصة: SCXK (بكين) 2021-0011) لتأسيس نموذج MCAO.
2. تؤوي الحيوانات بشكل تقليدي مع الطعام والماء بإجازة؛ جميع الإجراءات اتبعت مدونة الأخلاقيات الدولية.
3. استخدم المعايير التالية بناء على وزن جسم الحيوان لاختيار حجم الخيط لضمان انسجام مستمر:
   - 220–250 جم: قطر 0.33–0.35 مم
   - 250–280 جم: 0.35–0.38 مم قطر
   - 280–310 جم: 0.38–0.40 مم قطر
   ملاحظة: تأخذ هذه المواصفات في الاعتبار الزيادات المرتبطة بالعمر في قطر الأوعية وتقلل من حدوث الالتهاب الهوكي الهوكي أو الانسداد غير الكامل¹³.

2. حجم العينة

1. احسب حجم العينة باستخدام برنامج حساب حجم العينة. استنادا إلى بيانات أولية تظهر حجم احتشام متوقع بنسبة 35٪ ± 10٪ (متوسط ± SD) في مجموعة MCAO مقابل 0٪ ± 2٪ في مجموعة SHAM، تقدير حجم التأثير (د) كوهين. بالنسبة لاختبار مان-ويتني U ذو الذيلين (بديل غير معلمي لاختبار t)، مع α = 0.05 والقدرة (1-β) = 0.80، احسب الحد الأدنى لحجم العينة.
   ملاحظة: قدر حجم التأثير ب 3.5 وحجم العينة الأدنى 6 حيوانات لكل مجموعة.
2. لأخذ الوفيات المتوقعة (12.5٪) ومعدل الاستبعاد (5–10٪) في الاعتبار، أدرج 24 فأرا في مجموعة MCAO و6 فئران في مجموعة SHAM، مما يوفر طاقة كافية (>0.90) للنقطة النهائية الأساسية (حجم الاحتضام عند 24 ساعة).

3. معايير الإدراج والاستبعاد

1. يشمل الحيوانات إذا استوفرت المعايير التالية: (1) ذكور فئران سبراج-داولي، 240–270 جرام، عمرهم 6–8 أسابيع؛ (2) غياب عجز عصبي موجود مسبقا (الدرجة العصبية قبل العملية = 0); (3) تحفيز التخدير بنجاح دون مضاعفات.
2. استبعد الحيوانات من التحليل إذا أظهرت: (1) نزيف تحت عنكبوتية (SAH) واضح عند التشريح؛ (2) الوفاة المبكرة (<24 ساعة بعد إعادة التروية) غير مرتبطة بالتدخل التجريبي؛ (3) فشل في الإغلاق (الدرجة العصبية = 0 وغياب الانقسام المعرف ب TTC); (4) الفشل الجراحي التقني (مثل تمزق CCA).
   ملاحظة: تم تحديد هذه المعايير مسبقا قبل بدء الدراسة لتقليل التحيز في الاختيار.
3. سياسة استبدال الحيوانات: استبدال الحيوانات فقط التي تم استبعادها بسبب فشل جراحي تقني أو وفاة أثناء العملية للحفاظ على القوة الإحصائية. لا تستبدل الحيوانات بنمذجة غير ناجحة (فشل في الإخراج)، بل قم بالإبلاغ عنها كجزء من حساب معدل النجاح لتجنب تقليل التباين بشكل مصطنع.

4. التحضيرات قبل الجراحة

1. جهز أدوات معقمة، وخيط معقم، وحقل مغطى.
2. لا يشترط الصيام الروتيني؛ عند الضرورة، حدد مدة الصيام إلى 2–4 ساعات. تحفز التخدير باستخدام الإيزوفلوران (3–4٪) وحافظ عليه عند 1.5–2٪ في 30–40٪ O₂ أثناء الإجراء. تأكد من عمق التخدير بفقدان رد الفعل التصحيحي وضغط إصبع القدم.
3. حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 ± 0.5 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة يتم التحكم بها مع مراقبة درجة الحرارة المستقيمة.
4. احلق الرقبة وفروة الرأس، ثم نظف المنطقة بالبوفيدون-يود، ثم 70٪ إيثانول.
5. أعط البوبرينورفين (0.05 ملغ/كغ، تحت الجلد) قبل الجراحة 30 دقيقة وكل 12 ساعة بعد العملية لمدة 48 ساعة، أو ميلوكسيكام (1 ملغ/كغ، تحت الجلد) مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام^و16. تقييم الألم من خلال مراقبة سلوك العناية بالعناية، ووضعية الجسم، والنشاط العفوي؛ قدم مسكنات إضافية إذا استمرت علامات الانزعاج.

5. انسداد MCA

1. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهرية مع تمديد الرأس برفق لكشف الرقبة البطنية.
2. قم بعمل شق في منتصف الرقبة (1.5–2.0 سم) باستخدام مقص القزحية.
3. يتم فصل عضلات القص وعضلة الأومو هيويد بشكل واضح باستخدام ملقط منحني لكشف انقسام الشريان السباتي المشترك الأيسر (CCA).
4. قم بربط الشريان السباتي الخارجي (ECA) من الخلف بخيط حرير دائم 4-0 وبالقرب منه بربط مؤقت. قم بإنشاء شق صغير بين رباطي ECA باستخدام المقص المجهري.
5. قم بإغلاق مؤقت للشرايين السباتي الخارجي (ICA) باستخدام مشابك الأوعية الدموية الدقيقة (ضغط 60 جرام).
6. أدخل خيط أحادي مغطى بالسيليكون بحجم 4-0 (قطر 0.35–0.40 مم) عبر شق ECA. تقدمها بالتراجع إلى CCA، ثم أعد توجيهها إلى ICA بعد تقسيم CCA.
   ملاحظة: تأكد من دخول الخيط إلى ال ICA باتجاه قاعدة القحفية، وليس الشريان الجناحية الحنكية (PPA) الذي يتفرع جانبا. إذا واجه مقاومة عند <10 مم، اسحب الخيط، وقم بتدوير رأس الحيوان 30° نحو الجانب المقابل، ثم أعد التقدم لإعادة توجيه ما وراء مصدر PPA.
7. تقدم الخيط بمقدار 18–20 مم من انقسام CCA حتى تشير مقاومة طفيفة إلى انسداد أصل MCA. تحقق من العمق باستخدام الخط المرجعي المحدد مسبقا على الخيط (موضوع على بعد 2 مم قريبا من سدادة السيليكون)، والمقاس باستخدام كاليبر من نقطة إدخال الجذع في ECA. حرر مشبك CCA بمجرد أن يصبح الخيط في مكانه.

6. إعادة التروية

1. بعد 60 دقيقة من الإغلاق، أعد فتح الشق وقم بفك رباط ECA المؤقت.
2. اسحب الخيط بلطف حتى يتجاوز طرفه جذع ECA، مما يعيد تدفق الدم. ضع رباطا دائما قريبا من الجذع فورا لمنع النزيف الخلفي. أغلق الجرح على طبقات.
3. انقل الفأر إلى قفص تعافي دافئ للمراقبة المستمرة.

7. جراحة الوهم

1. جهز الحيوان باتباع نفس الإجراء الموضح أعلاه لعلاج MCAO (الصيام، التخدير، التحكم في درجة الحرارة، التدشين المعقم).
2. قم بإجراء شق عنق الرحم والتعرض لتشعب CCA كما ذكر أعلاه.
3. تشريح وكشف الوعاء. لا تدخل الخيط.
4. دع الشرايين تبقى براءة اختراع؛ لا تسببوا في نقص التروية الدماغية.
5. أغلق الشق على طبقات بعد 10 دقائق من التعرض. انقل الحيوان إلى قفص تعافي دافئ للمراقبة.

8. نتائج الأعصاب بعد العملية

1. التقييم عند 24 ساعة و72 ساعة بعد إعادة التروية، مباشرة قبل التضحية لقياس حجم الاحتشاء.
2. اعتاد الحيوان في غرفة هادئة على درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. اجعل محققين مستقلين غير مبالين بتوزيع المجموعات. اجعل كل محقق يسجل النتائج على أوراق منفصلة دون استشارة؛ أي فرق بين التقييمين ≥نقطة واحدة يؤدي إلى إعادة تقييم.
4. المقاييس (حسب ترتيب الإعطاء): أداء تقييم زي-لونغا¹⁷ (الجدول 1)، بيدرسون¹⁸ (الجدول 2)، وغارسيا المعدل¹⁹ (الجدول 3)، وفقا لأحدث البروتوكولات المنشورة لمعايير متسقة.
5. استخدم متوسط المراقبين الاثنين للتحليل الإحصائي. استبعد البيانات من أي حيوان إذا اختلفت متوسط الدرجات بنسبة >10٪ واستبدلها بموضوع جديد.

9. قياس حجم احتشاء الدماغ

1. بعد 24 ساعة و72 ساعة بعد إعادة التروية، قم بتخدير عميق للفئران باستخدام 5٪ من الإيزوفلوران. تأكد من التخدير العميق عن طريق فقدان رد الفعل الصحيح واستجابة ضغط الأصابع، مع تنفس مستقر، قبل المتابعة.
2. قم بإزالة الدماغ بسرعة خلال 90 ثانية من تأكيد التخدير العميق، وشطفه ب PBS البارد جدا، وقطعه إلى شرائح تاجية بقطر 2 مم باستخدام مصفوفة دماغ الفئران المبردة. أثناء التقطيع، التزم بالاحتياطات التالية
   1. حافظ على الإجراء بالكامل على التجميد عند 0–4 درجات مئوية؛ احصد الدماغ خلال 90 ثانية ووضعه مسطحا في مصفوفة مبردة مسبقا.
   2. استخدم شفرة حادة لعمل قطع واحدة ونظيفة لمقاطع تاجية دقيقة بقطر 2 مم، مع جمع كل شريحة بترتيب الروسترو-ذيلي إلى PBS بارد كالثلج.
   3. نظف المصفوفة والشفرة فورا بإيثانول بنسبة 75٪ بين الحيوانات لمنع التلوث المتبادل.
3. بعد تسخين 2٪ من محاولة الحمل إلى 37 درجة مئوية، اغمر الشرائح بالكامل وحضنها في الظلام لمدة 20 دقيقة، مع حركتها بلطف كل 5 دقائق على 20 دقيقة.
4. أوقف التفاعل فورا عن طريق الشطف ثلاث مرات ب PBS بدرجة حرارة 4 °C. ثم تثبيتها في 4٪ بارافورمالديهايد عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
5. عند 300 نقطة في البوصة، قم بتصوير جانبي كل شريحة مرة واحدة.
   1. استخدم إضاءة ثابتة على خلفية بيضاء لإزالة الظلال والانعكاسات.
   2. الشرائح المسطحة بدون تداخل، وأضف شريط مقياس وعلامة تعريف في كل إطار. أمسك الكاميرا بشكل عمودي على الأقسام وحافظ على البعد البؤري وتوازن اللون الأبيض ثابتين طوال الوقت.
6. قم بقياس حجم النوبة باستخدام ImageJ.
   1. استيراد صورة 300 dpi (بتنسيق RGB) وتحويلها إلى تدرج رمادي 8-بت (صورة > النوع > 8-بت).
   2. طبق عتبة أوتسو التلقائية (الصورة > ضبط > العتبة التلقائية > اختيار أوتسو) لفصل النسيج الحادي (الأبيض) عن الأنسجة الصالحة (الأحمر).
   3. استخدم أداة الاختيار الحرة لتحديد حدود نصف الكرة الأرضية من نفس الجانب.
   4. قس المساحة (تحليل > قياس) وسجل عدد البكسلات.
   5. احسب حجم الفتحة: Σ (مساحة الانسداد × سمك الشريحة [2 مم]) × (حجم نصف الكرة المقابل/حجم نصف الكرة المقابل)، معبرا عنه كنسبة مئوية من نصف الكرة المقابل.

10. التحليل الإحصائي

1. قدم البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD) أو متوسط [نطاق رباعي] حسب الحاجة.
2. قم بإجراء مقارنات بين المجموعات باستخدام اختبار t الطالب غير المقترن أو اختبار مان-ويتني U للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي.
3. اضبط الدلالة الإحصائية عند P < 0.05. قم بإجراء جميع التحليلات باستخدام برنامج تحليل إحصائي مناسب.

النتائج

تم تخصيص الحيوانات عشوائيا إلى مجموعات بقاء بعد إعادة التروية لمدة 24 ساعة (n = 10) أو 72 ساعة (n = 10) لصبغ TTC النهائي. خضع 4 فئران إضافية لعلاج MCAO لكنها توفيت قبل نقطة النهاية المجدولة (معدل الوفيات 12.5٪). تكونت مجموعة SHAM من n = 6. وبالتالي، بلغ إجمالي عدد الحيوانات المستخدمة 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

خضعت الفئران لعملية MCAO لمدة 60 دقيقة لتحفيز نقص التروية الدماغي (الشكل 1). بدأ إعادة التروية عن طريق إزالة الخيط داخل اللمعة وتحرير الرباط القريب عند ECA. من بين 24 فأر من MCAO، مات 3 خلال 72 ساعة؛ أظهر أحدهما احتشاءا واسعا عند الوفاة بعد الوفاة خلال 24 ساعة، بينما توفي الآخر لأسباب غير محددة خلال 72 ساعة. تم استبعاد فأرين إضافيين بسبب فشل النمذجة (لم تستوفي درجات الأعصاب المعايير، ولم يظهر التلوين في محاولة الحمل أنه لا يوجد انفاركت). وبالتالي، بلغ معدل الوفيات عند 72 ساعة 12.50٪. عرفنا نجاح إنشاء النموذج بأنه البقاء لمدة 24 ساعة بالإضافة إلى درجة لونغا من 1 إلى 3، وبلغ معدل النمذجة الناجح 87.50٪.

تم تقييم الوظائف العصبية بعد 24 ساعة و72 ساعة بعد بداية السكتة الدماغية (قبل قياس حجم الاحتشاء). تم استخدام ثلاثة من أكثر المقاييس استخداما التي تم الإبلاغ عنها في الأدبيات—زي-لونغا، بيدرسون، وغارسيا المعدلة—لتقديم تقييم شامل (الشكل 2). عند 24 ساعة، حصلت الفئران (n = 20) على 2.02 ± 0.41 على مقياس زيا-لونغا، و2.80 ± 0.41 على مقياس بيدرسون، و8.15 ± 1.18 على مقياس غارسيا المعدل؛ وظلت هذه الفجوات واضحة عند 72 ساعة (زي-لونغا: 1.65 ± 0.59؛ بيدرسون: 1.93 ± 0.38; غارسيا المعدلة: 11:00 ± 1.34). حجم الاحتماء، المعبر عنه كنسبة من نصف الجانب المقابل، كان 37.61 ± 2.81٪ بعد 24 ساعة من MCAO وانخفض إلى 28.32 ± 4.18٪ عند 72 ساعة.

الشكل 1: مخطط تخطيطي لفسيولوجيا الشريان العنقي الدماغي الأيسر والانسداد في الشريان الدماغي الأوسط في الفأر. مخطط تخطيطي ل (أ) تشريح الشريان الدماغي العنقي، (ب) قبل الإدخال، (ج) بعد الإدخال، و(د) تماسك الخيط في الشريان الجناحية الحنكية. CCA: الشريان السباتي الشائع؛ ICA: الشريان السباتي الداخلي؛ ECA: الشريان السباتي الخارجي؛ PPA: الشريان الجناحية الحنكية؛ MCA: الشريان الدماغي الأوسط. "المثلث الأسود": موقع الشق؛ الخط الأزرق: الخيط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: قياس حجم الاحتشاء والتقييم السلوكي العصبي بعد انسداد الشريان الدماغي في الفئران. (أ) تلوين مناطق الدماغ بهدف الحمل. (ب) حجم الاحتشالية عند 72 ساعة أصغر من 24 ساعة. (C,D) درجات زي-لونغا ودرجات بيدرسون عند 72 ساعة أقل من تلك عند 24 ساعة. (ه) درجات غارسيا المعدلة عند 72 ساعة أعلى من تلك عند 24 ساعة. ****P < 0.0001، ***P < 0.001، **P < 0.01. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

التجلي	النقاط / النقاط
لا يوجد عجز عصبي	0
الطرف الأمامي المقابل انثني ومقرب أثناء تعليق الذيل (عجز عصبي طفيف)	1
الدوران التلقائي نحو الجانب المقابل أثناء الزحف (عجز عصبي متوسط)	2
السقوط إلى الجانب المقابل عند الوقوف أو المشي	3
(عجز عصبي شديد)
لا حركة عفوية مصحوبة بضعف الوعي	4

الجدول 1: نتيجة زيا-لونغا^.

التجلي	النقاط/النقاط
أمسك ذيل الحيوان وارفعه بحيث يكون الجثة معلقة على ارتفاع 10 سم فوق المقعد. في الفئران العادية، تبقى كلا الطرفين الأماميين ممدودتين نحو الأرض. قد تظهر الفئران التي تعاني من عجز عصبي السلوكيات التالية:
لا يوجد عجز عصبي	0
يتم ثني الطرف الأمامي الجزئي ومثبتا بالقرب من البطن، بينما يمتد الطرف غير المصاب نحو المقعد	1
بالإضافة إلى السلوك الموضح في الجزء الأول، تقل مقاومة الدفع الجانبي نحو الجانب الشحكي بشكل ملحوظ عندما يوضع الحيوان مستلقيا على المقعد	2
بالإضافة إلى السلوكيات الموصوفة في الجزئين 1 و2، يدور الحيوان نحو الجانب البارتيكي أثناء المشي	3

الجدول 2: تقييم بيدرسون^.

العنصر	التجلي	النقاط/النقاط
أ) الحركة العفوية	النشاط الطبيعي	3
(راقب نشاط الفأر في قفصه المنزلي لمدة 5 دقائق)	تعاني من إعاقة بسيطة	2
	إعاقة متوسطة	1
	لا حركة عفوية	0
ب) حركة الأطراف المتماثلة	الوضعية المتماثلة	3
	الوضعية غير المتماثلة	2
	شلل نصفي	1
ج) تمدد الطرف الأمامي	متماثل	3
(أمسك الذيل وجلب الأطراف الأمامية نحو حافة الطاولة؛ لاحظ تمديد الكف الأمامي)	غير متماثل قليلا	2
	غير متماثل بشكل ملحوظ	1
	شلل نصفي	0
د) القدرة على القبضة والتسلق	يتسلق بقوة مع قبضة قوية	3
	لوحظ عجز أحادي الجانب	2
	غير قادر على التسلق أو الدوران	1
ه) الانعكاس اللمسي الثنائي على الجسم	متماثل على كلا الجانبين	3
	استجابة بطيئة من جهة واحدة	2
	لا يوجد رد من جانب واحد	1
و) استجابة لمس الاهتزازات الثنائية	متماثل	3
	غير متماثل	2
	لا يوجد رد	1

الجدول 3: معدل نتيجة غارسيا. المجموع النقاط: 0–18 نقطة؛ تشير الدرجات الأعلى إلى تحسين الوظائف العصبية.

المناقشة

من المهم توضيح أن الهدف الأساسي من هذه الدراسة كان التوحيد المنهجي وليس الاكتشاف البيولوجي. يعد تطوير بروتوكول MCAO موحد حيويا لتقليل التنوع بين المختبرات وتعزيز قابلية التكرار في أبحاث السكتة الدماغية الإقفاري. يعزز هذا البروتوكول الشفافية الإجرائية من خلال تدابير مراقبة جودة صارمة ويعالج النواقص التقنية الشائعة في نمذجة MCAO، بما في ذلك إدخال الخيوط الموحد، وتنظيم درجة الحرارة، والمعالجة النسيجة.

بينما يمثل الانخفاض الملحوظ في حجم الاحتشاء من 24 ساعة إلى 72 ساعة والتعافي العصبي الجزئي ظواهر فسيولوجية مرضية متوقعة في MCAO العابر، تكمن مساهمة هذه الدراسة في إثبات الموثوقية الزمنية لهذه النقاط النهائية باستخدام إجراء موحد صارم. من خلال توفير إطار تقني مفصل تدريجي، يضمن هذا البروتوكول أن الدراسات الميكانيكية المستقبلية — سواء كانت تحقق في سلاسل التهاب الأعصاب أو مسارات الاستماتة أو التدخلات العلاجية — مبنية على بيانات أساسية قابلة للتكرار وقابلة للمقارنة. نضع هذا العمل صراحة كمورد تقني يتوافق مع نطاق JoVE، موفرا أساسا لأبحاث ما قبل السريرية الموحدة للسكتات الدماغية بدلا من تطوير الرؤى الميكانيكية.

تعد عدة خطوات في هذا البروتوكول ضرورية بشكل خاص لضمان استمرار نقص التروية وإعادة تروية الدم. أولا، التقدم بدقة لخط الانسداد حتى يشعر بمقاومة طفيفة أمر ضروري لتحقيق MCAO قابل للتكرار، حيث يمكن أن يؤدي انحراف بسيط في عمق الإدخال إلى انسداد غير كامل أو نزيف تحت عنكبوتية^20,21. ثانيا، الحفاظ على درجة حرارة جسم طبيعية صارمة أثناء العملية (37 ± 0.5 درجة مئوية) وإدارة درجة الحرارة بعد العملية أمر حاسم، لأن انخفاض أو ارتفاع درجة حرارة الجسم يمكن أن يغير بشكل كبير منطقة الاحتشاء والنتيجة العصبية^12,22. ثالثا، إزالة الدماغ بسرعة خلال 90 ثانية وتبريد حمام الثلج يمكن أن يقلل من التحلل الذاتي ويحافظ على سلامة الأنسجة، مما يضمن دقة التلوين وتحليل الحجم²³. إذا أمكن تنفيذ هذه الخطوات بشكل متسق، فإنها ستحسن بشكل كبير دقة النماذج وقابلية المقارنة بين الدراسات.

لقد حسننا طريقة MCAO التقليدية لتعزيز قابليتها للتكرار وسهولة الاستخدام. أدى استخدام قوالب شرائح الدماغ المبردة مسبقا وبروتوكولات التقطيع الموحدة إلى تقليل الأخطاء البشرية وقطع القطع. بالإضافة إلى ذلك، أدى اعتماد تقييم الوظائف العصبية المكون من ثلاثة مقاييس (زي-لونغا، بيدرسون، وغارسيا المعدل) من قبل باحثين مبصرين إلى زيادة متانة وحساسية التقييم الوظيفي 17,18,19. من خلال إجراءات التشغيل القياسية التفصيلية التي تغطي كل مرحلة من مراحل البرنامج، يساعد في تحديد المشاكل الشائعة مثل خلل الخيط، إعادة التروية المبكرة، أو انخفاض حرارة الجسم بعد العملية. تشمل إرشادات استكشاف المشكلات للمضاعفات الشائعة ما يلي: (1) خط انسداد غير مناسب (دخول PPA)، معروف بعدم وجود مقاومة عند 10–12 مم وتحسن عصبي فوري—إذا واجه، يسحب الخيط فورا، يدير رأس الحيوان 30° نحو الجانب المقابل، ثم يتقدم بزاوية متوسطة طفيفة نحو قاعدة الجمجمة؛ (2) إعادة تروية مبكرة، يدل على تحسن عصبي مفاجئ أثناء الإسداد—تأكد من تثبيت سدادة السيليكون بإحكام عند جذع ECA، والتحقق من تطابق قطر الخيط مع حجم الشريان (0.35–0.40 مم للفئران التي تزن 240–270 جم)، وفكر في استخدام خيط أطول (زيادة طبقة السيليكون بمقدار 0.5 مم) إذا استمر الإزاحة؛ و(3) انخفاض حرارة الجسم بعد العملية (درجة حرارة المستقيم <36ºC)—رفع درجة حرارة وسادة التسخين إلى 38 °م، وضع مصباح حراري على ارتفاع 30 سم فوق الحيوان، وإعطاء محلول ملحي دافئ معقم (0.5 مل، داخل الصفاق، 37ºC).

على الرغم من هذه التطورات، فإن هذا البروتوكول له عدة قيود. أولا، تتطلب التقنية منحنى تعلم كبير (10–15 عملية جراحية) لتحقيق معدلات نجاح ثابتة، وقد تؤثر التغيرات الفردية في تشريح الأوعية الدموية للفئران على وضع الخيط^21,24. ثانيا، يعتمد البروتوكول الحالي على التحقق اللاحق (التقييم العصبي والتلوين المبكر لمحاولة الحمل) بدلا من مراقبة تدفق الدم الدماغي أثناء العملية (LDF أو LSCI)، مما يحد من مراقبة الجودة أثناء الجراحة ويمنع الاستبعاد المبكر للحيوانات التي تعاني من انسداد غير مكتمل²⁵. ثالثا، اقتصر التحقق على الذكور الصغار من فئران سبراج-داولي، مما قيد التعميم على الإناث والحيوانات المسنة والنماذج المصاحبة^26,27. يجب أن تتضمن الدراسات المستقبلية ما يلي: (1) كلا الجنسين لمعالجة الجنس كمتغير بيولوجي؛ (2) فئران مسنة (12–18 شهرا) تعاني من أمراض دموية مصاحبة؛ و(3) مراقبة CBF في الوقت الحقيقي لتعزيز قابلية التكرار في دراسات التدخل الدوائي.

تكتسب هذه الطريقة قيمة خاصة في الفحص قبل السريري للأدوية، حيث أن اتساق وأهمية نتائجها في الترجمة أمر بالغ الأهمية. البروتوكول الموحد الموضح في هذا المقال يحمل وعدا كبيرا لتعزيز صرامة وقابلية تكرار أبحاث السكتة الدماغية الإقفاري. تشمل التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول: (1) الفحص قبل السريري للعوامل الواقية العصبية التي تعطى خلال نافذة إعادة التروية؛ (2) الدراسات الميكانيكية لإصابة نقص التروية والتروية باستخدام نقاط الزمن 24 ساعة و72 ساعة؛ (3) دراسة اللدونة العصبية بعد السكتة الدماغية والتعافي الوظيفي؛ و(4) التحقق من صحة الأهداف العلاجية بالاقتران مع التدخلات الوراثية أو الدوائية. من خلال تقديم إجراءات عملية مفصلة ومدعومة بالفيديو، هدفنا هو تسهيل تبني هذه الطريقة على نطاق واسع في المختبرات بمستويات مهنية مختلفة، مما يساهم في نهاية المطاف في أبحاث ما قبل السريرية أكثر موثوقية وذات صلة سريرية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2% TTC staining solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/bottle, ≥98 % purity
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL ready-to-use
Absorbable suture	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 teeth, 12 cm
Dumont curved forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm length, 0.05 mm fine tip
Feedback heating pad	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0.3 °C closed loop
ImageJ	National Institutes of Health	version 1.53k
Iris scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Curved tip, 10 cm
Micro-vascular clips	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1.5 cm curved clip
Non-absorbable silk	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Black silk thread
PASS software	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	version 15.0	Sample size calculation software
Rat brain matrix	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	2 mm coronal slots
Silicone-coated nylon filament	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0.35 mm OD, 30 mm silicone tip, EO-sterile
Small-animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Isoflurane vaporizer, induction chamber & mask included
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	version 26.0	Statistical analysis software
Vannas micro-scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Curved tip, 8 cm