مقالة منهجية

عزل خلايا الظهارة الحنخيية من النوع الثاني من رئات الفئران الوليدية واليافعة والبالغة القادرة على التكيف مع بيئات التجارب المعدية

771 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69581

⸱

ديسمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول طريقة تعتمد على قياس تدفق الخلايا لعزل الخلايا الطهارية السنخية من النوع الثاني (AECII) الحية من رئة الفئران الوليدية أو الصغار أو البالغين (المصابة أو غير المصابة). يتيح هذا النهج الدراسات الجزيئية و/أو الوظيفية اللاحقة ل AECII من تحديد أدوارها أثناء التهاب الرئة والعدوى.

الملخص

تساهم خلايا الظهارة الحويخية من النوع الثاني (AECII) بشكل حاسم في تنظيم المناعة في الرئة، وبالتالي فهي عناصر رئيسية تنظم توازن الرئة. تجعل هذه الوظائف AECII ذات صلة خاصة في سياق العدوى بفيروسات الجهاز التنفسي، التي تستهدف الظهارة السفلية في مجرى الهواء وتعطل سلامة الحويصل. نماذج الفئران قبل السريرية هي أدوات حيوية لتوضيح أدوار AECII في سياق التهاب الرئة و/أو العدوى. يقدم هذا البروتوكول خط أنابيب مفصل وقابل للتكرار لعزل AECII القابل للحياة والنقي للغاية من رئة الفأر في مراحل حديثي الولادة والأحداث والبالغين. تجمع المنهجية بين التفكك الميكانيكي، والهضم الإنزيمي، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) اللاحقة لإنتاج تجمعات AECII غنية للغاية ثبت ملاءمتها للتحليلات الجزيئية والوظيفية في المراحل اللاحقة. بالنسبة للتطبيقات التي تشمل الفيروسات الممرضة، يتضمن البروتوكول خطوة تثبيت اختيارية للبارافورمالديهايد (PFA)، مما يتيح التعامل الآمن في ظروف أمان حيوية أقل دون المساس بسلامة الحمض النووي الريبي. مع استعادة خلايا مثالية عبر مراحل النمو، مما ينتج حتى 1.0 ×10 6 خلايا AECII لكل رئة بالغة، يدعم هذا البروتوكول الدراسات ما قبل السريرية حول، مثل مسببات الأمراض الفيروسية، وظيفة الظهارة، والقدرة التجديدية.

المقدمة

نظرا لأدوارها المتعددة في تطور الرئة، وعلم وظائف الأعضاء، والمناعة، وعمليات الإصلاح، تساهم الخلايا الظهارية من النوع الثاني السنخي (AECII) بشكل حيوي في الحفاظ على التوازن الداخلي وإعادة تأسيس التوازن بعد إصابة الرئة. نظرا لأن AECII هي الأهداف الخلوية الأساسية لفيروسات الجائحة مثل فيروس الإنفلونزا A (IAV) أو SARS-CoV-2، فقد كان مصيرها ووظائفها تحت أضواء أبحاث بيولوجيا العدوى. في هذا السياق، أفادت دراسات سابقة أن الإشارات الداخلية (مثل الحالة الجينية 1، العمر 2,3) وكذلك الإشارات الخارجية (مثل المنبهات الميكروبية4) لها تأثير كبير على الأنماط الظاهرية ل AECII واستجابتها للمحفزات البيئية مثل مسببات الأمراض المحمولة جوا. ومن الجدير بالذكر أن الالتهاب الرئوي يترك تغييرات مستمرة في الحالة الترانسكريبتومية، والبروتيومية، والحالة فوق الجينية ل AECII 5,6. تسلط التفاعلات الخلوية المعقدة ل AECII داخل الرئة، بالإضافة إلى مساهمة عوامل حيوية وغير حيوية مختلفة في بيولوجيا AECII، الضوء على أهمية النماذج الحية المناسبة التي تسمح بفحص هذه الخلايا بمزيد من التفصيل.

يمثل FACS التقنية الذهبية الحالية لإثراء وتنقية الخلايا الأولية من أنسجة الإنسان، حيث يمكن تنفيذ الاختيار متعدد المعايير (أو الاستبعاد) في نفس الوقت، ويمثل الطريقة الوحيدة التي يمكن من خلالها دمج الخصائص الجوهرية للخلايا مثل الحجم، الحبيبات، أو التألق الذاتي بشكل موثوق في سير عمل الاختيار/الاستبعاد. حتى الآن، توفر بعض البروتوكولات المنشورة منهجيات لعزل AECII للفئران الأولية المعتمدة على FACS. أبلغ سينها ولويل عن طريقة لعزل AECII من الفئران البالغة تتميز بسير عمل مماثل في معالجة الأنسجة وتدفق القياس الخلوي، وشملت إثراء AECII قبل FACS عن طريق الاستنزاف المغناطيسي القائم على الخرزاتعلى الخلايا غير المستهدفة. يصف بروتوكول آخر استخدام عزل الخلايا الرئوية الموجبة ل EpCAM باستخدام الخرزات المغناطيسية أو استخدام فئران معدلة وراثيا تسمح بعزل AECII المعتمد على FACS بناء على تحديد خلايا SPC الإيجابية (GFP+) باستخدام نموذج فأر مبلغة شرطي8. بينما يحدد تعبير SPC بشكل موثوق AECII في رئة الفئران، فإن هذه المنهجية قابلة للتطبيق فقط مع سلالة مخصصة للمراسل الفئران، وبالتالي تمنع عزل AECII عن، مثل الفئران البرية. ومن المهم أنه رغم الإبلاغ عن إنتاجية ونقاء مماثلة ل AECII، لم توفر أي من هذه البروتوكولات تكيفات لعزل AECII عن المضيفين حديثي الولادة أو اليافعين أو المصابين.

لهذا الغرض، يتضمن البروتوكول الحالي مجموعة من سير العمل المعدلة لعزل AECII النقي والقابل للحياة من الفئران باستخدام الهضم الإنزيمي بالدمج مع FACS. تعتمد هذه المنهجية المتطورة على بروتوكول عزل AECII9 المطور سابقا قائم على FACS، وتحتوي على تحسينات مهمة تحسن نقاء AECII من خلال إضافة علامات تحديد واستبعاد إضافية. ومن المهم أن هذا البروتوكول المحدث يتميز بالاسترجاع من AECII عبر استراتيجيات الفرز "الملمسة" و"غير الممسوسة". علاوة على ذلك، نظرا لأن تطور الرئة بعد الولادة مرتبط بتغيرات كبيرة في تركيب الخلايا وإعادة تنظيم الهيكل، يشمل هذا البروتوكول تعديلات لتحسين استرجاع AECII من رئتي حديثي الولادة واليافعين والبالغين. يتيح ذلك فحص بيولوجيا AECII أثناء التكاثر، على سبيل المثال، في سياق نضج الرئة أو دراسات بيولوجيا العدوى. يمكن استخدام هذا النهج للحصول على AECII صالح للزراعة خارج الجسم والإصابة لاحقا بفيروس الالتهاب الداخلي الداخلي. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن هذا البروتوكول إجراء تثبيت باستخدام المادة الكيميائية المثبتة بارافورمالديهايد (PFA). تستدعي هذه الخطوة تعطيل مسببات الأمراض التنفسية المختلفة (مثل SARS-CoV-2، IAV) في معلقات خلايا الرئة، مما يسمح بدوره بمعالجة العينات لاحقا (بما في ذلك عزل AECII المعتمد على FACS) في منشآت ذات احتياطات احتواء حيوي أقل. بينما يمنع التثبيت القائم على PFA الزراعة اللاحقة من AECII خارج الجسم للدراسات الوظيفية، فإنه يسمح باسترجاع كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي السليم لتحليل AECII بتقنية النسخ النصي لتوضيح أدوارها البيولوجية في سياق الالتهابات التنفسية.

البروتوكول

تم تربية جميع وإيواؤها في منشأة بمركز هيلمهولتز لأبحاث العدوى تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة (SPF) ووفقا للإرشادات الوطنية والمؤسسية. تم إجراء القتل الرحيم للفئران الساذجة لعزل AECII لاحقا وفقا للإرشادات الوطنية من جمعية علوم المختبرية (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). تم استخدام الفئران الذكور التي كانت ذات خلفية جينية C57BL/6 في عمر يومين (حديثي الولادة)، أو 3 أسابيع (اليافع)، أو 8-12 أسبوعا (بالغين). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير رئة الفأر

  1. التضحية بالفأر (البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا التالية):
    1. للفئران البالغة والصغيرة : أعط جرعة زائدة من التخدير (مثل الكيتامين/الزيلزين) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
    2. للفئران حديثي الولادة : اقطع الرأس.
      ملاحظة: تجنب خلع عنق الرحم لدى الفئران البالغة واليافعة، حيث يمكن أن يتسبب هذا الإجراء في تلف القصبة الهوائية.
  2. قم بتعقيم فراء الفأر ب 70٪ (v/v) من الإيثانول.
    تحذير: سائل قابل للاشتعال. مهيج العين. ابتعد عن الحرارة. حافظ على إغلاق الحاوية بإحكام، وقم بعمل شق في منتصف البطن لكشف الأعضاء الداخلية.
  3. قم بإزالة الجلد والبريتونيوم بعناية.
  4. قم بإخراج الدم من الفأر عن طريق قطع كل من الأوردة الودادية والوريد الأجوف، مما يسمح بتصريف الدم من الجسم.
  5. قم بإزالة الحجاب الحاجز بعناية لتكشف القلب والرئتين.
    ملاحظة: احرص على عدم إصابة الرئتين. ثقب نسيج الرئة سيعرقل بشكل كبير كفاءة الهضم اللاحق بواسطة الإنزيمات لأنسجة الرئة.
  6. افتح القفص الصدري باستخدام المقص.
  7. أدخل قنية في البطين الأيمن من القلب وادهن محلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS) حتى يتم إزالة الدم المتبقي من الرئة ويصبح نسيج الرئة شاحبا:
    1. للفئران البالغة : استخدم قنية بوزن 26 جالون واثق الرئة بجرعة 10 مل من PBS.
    2. للفئران حديثي الولادة : استخدم قنية بوزن 30 جرام واثقب الرئة بجرعة 1 مل من PBS.
      ملاحظة: لا تقم بحقن رئة الفئران الصغيرة لتجنب تمزق البنية السنخية بسبب الضغط الزائد في الأوعية الدموية الرئوية. قد يكون التدخيم أقل فعالية في الرئتين الملتهبتين، وقد يكون تغير لون أنسجة الرئة أقل وضوحا. إذا لزم الأمر، يمكن إجراء غسل القصبات الهوائية قبل الخطوة التالية في الفئران البالغة والصغيرة.

2. الهضم الإنزيمي لأنسجة الرئة

  1. الفئران البالغة والصغيرة:
    1. كشف القصبة الهوائية عن طريق إزالة الغدد اللعابية والعضلات المحيطة.
    2. أدخل قنية 22 جيلون داخلية في القصبة الهوائية، وأزل الإبرة، وانقل القسطرة البلاستيكية نحو الرئتين.
    3. اربط قطعة خيط حول القصبة الهوائية والقسطرة بإحكام لتثبيتها في مكانها.
    4. جهز نسيج الرئة عن طريق غرس الفوضى.
      تحذير: قد يسبب أعراض حساسية أو ربو أو صعوبات في التنفس إذا تم استنشاقه. تجنب التنفس بالغبار. ارتد واقيات تنفسية. تخلص من المحتويات/الحاوية في مصنع التخلص من النفايات المعتمد.) من خلال القسطرة التي تدخل في القصبة الهوائية:
      1. للفئران البالغة : أدخل 2 مل من التوزيع الخارجي.
      2. للفئران الصغيرة : أدخل 500 ميكرولتر من الديباس.
        ملاحظة: استخدم حقنة باتصال لوير انزلاق لتسهيل تبادل الحقن بين الخطوات 2.1.4 و2.1.5. لضمان الهضم الإنزيمي الفعال لنسيج الرئة، من الضروري ضمان امتلاء إنزيمي كامل لمساحات الشعب الهوائية.
    5. استبدل الحقنة وكرر ذلك مع أجاروز منخفض الذوبان (1٪ (بضغط/ضغط)، 45 درجة مئوية) للحفاظ على البنية أثناء المعالجة.
      1. للفئران البالغة : استخدم 500 ميكرولتر من الأجاروز منخفض الذوبان.
      2. للفئران الصغيرة: استخدم 200 ميكرولتر من الأجاروز منخفض الذوبان.
        ملاحظة: لتجنب ارتداد السوائل، اترك الحقنة متصلة.
        ملاحظة: قبل الاستخدام: قم بإذابة الأجاروز منخفضة الذوبان باستخدام الحرارة (95 درجة مئوية)، واترك محلول الأغاروز يبرد حتى 45 درجة مئوية، مثلا في كتلة حرارية.
    6. غط الرئة بورق مناديل مختبر وأضف ثلجا للسماح للأجاروز بالتصلب لمدة دقيقتين.
    7. أزل الثلج، وورق المناديل، والحقنة، والقسطرة.
    8. اربط الخيط لإغلاق القصبة الهوائية للحفاظ على الإنزيم في المجاري التنفسية السفلية.
    9. أزل القلب والغدة الزعترية.
    10. اقطع القصبة الهوائية فوق الخيط وأزل الرئة السليمة من الصدر.
    11. انقل الرئة إلى أنبوب بسعة 15 مل يحتوي على الديسباس المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) وحضن نسيج الرئة في حالة تفاضل لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).
      1. للفئران البالغة : حضن الرئة في فاصل 2 مل.
      2. للفئران الصغيرة : حضن الرئة في فاصل 1.5 مل.
  2. فئران حديثي الولادة
    1. اجمع وفرم فصوص الرئة المفردة باستخدام مقص ناعم في غطاء أنبوب بحجم 2 مل.
    2. أضف 500 ميكرولتر ديبس، أغلق الغطاء، وقلب الأنبوب لضمان تغطية الأنسجة بالكامل بالديسبايس.
    3. حضن نسيج الرئة في حالة متفرقة على درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

3. تحضير نسيج الرئة

  1. للفئران البالغة والصغيرة:
    1. قم بإزالة الرئة من الفراغ وتشريح فصوص الرئة من جذع القصبات.
    2. ضع فصوص الرئة في طبق بتري (قطر: 8.5 سم) يحتوي على 7 مل DMEM + HEPES، و1 ميكروغرام/مل (التركيز النهائي) لأجسام مضادة لمنع CD16/32 و100 ميكرولتر DNAse (تركيز نهائي ~600 وحدة كونيتز).
      تحذير: قد يسبب أعراض حساسية أو ربو أو صعوبات في التنفس إذا تم استنشاقه. تجنب التنفس بالغبار. ارتد واقيات تنفسية. تخلص من المحتويات/الحاويات في محطة التخلص من النفايات المعتمدة.
    3. تفكك نسيج الرئة باستخدام الملقط.
      ملاحظة: لضمان الهضم الإنزيمي الفعال لأنسجة الرئة، من الضروري التأكد من تفكك الأنسجة الميكانيكية بشكل كامل.
    4. حضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التأرجح الخفيف عند 200 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: يمكن تخزين تعليق الخلية عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية، إذا لزم الأمر.
  2. بالنسبة للفئران حديثي الولادة:
    1. انقل الديباس، بما في ذلك النسيج المهضم، إلى طبق بتري (قطر: 5.4 سم) يحتوي على 3 مل DMEM + HEPES، و1 ميكروغرام/مل (التركيز النهائي) لأجسام مضادة لمنع CD16/32 و100 ميكرولتر DNAse (تركيز نهائي ~ 600 وحدة كونيتز).
    2. حضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التأرجح الخفيف عند 200 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: يمكن تخزين تعليق الخلية عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية، إذا لزم الأمر.
  3. تابع لجميع الفئات العمرية:
    1. قم بترشيح تعليق الخلية عبر سلسلة من مصافي خلايا النايلون ذات حجم مسام متناقص (100 ميكرومتر - 70 ميكرومتر - 40 ميكرومتر) لإزالة الحطام والركامات الكبيرة.
    2. اشطف مصفاتي الخلايا والأنابيب بعناية لتقليل فقدان الآن. في حال تجميع العينات، يمكن تمرير تعليق الخلايا للفئران من نفس المجموعة عبر نفس المصفاة.
      ملاحظة: في حال حدوث انسداد، غير مصفاة الخلايا.
    3. اعتمادا على الحجم، انقل تعليق الخلية المفلتر إلى أنبوب أو أكثر بسعة 15 مل وقم بعمل نظام الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة عند 140 × جرام عند 4 درجات مئوية.
    4. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن تحلل كريات الدم الحمراء (ACK buffer).
      1. للفئران البالغة والصغيرة : استخدم 2 مل من محلول تحلل كريات الدم الحمراء وحضن لمدة دقيقتين.
      2. للفئران حديثة الولادة : استخدم 3 مل من محلول تحلل كريات الدم الحمراء وقم بالحضانة لمدة 3 دقائق.
    5. أوقف تحلل كريات الدم الحمراء بملء أنبوب 15 مل ب DMEM + HEPES + 10٪ (v/v) FBS وجهاز طرد مركزي مرة أخرى لمدة 12 دقيقة عند 140 × جرام عند 4 درجات مئوية.

4. تلوين الأجسام المضادة لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة

  1. أعد تعليق الخلايا في محلول صبغ للأجسام المضادة يحتوي على مضاد F4/80، مضاد CD93، مضاد CD11c، مضاد CD19، مضاد CD31، مضاد CD11b، مضاد CD16/32، مضاد CD45، مضاد CD24 ومضاد CD326 مرتبط بالفلوروكروم تم إعداده في DMEM + HEPES + 10٪ (v/v) FBS.
    ملاحظة: للحصول على أفضل نتائج صبغ، استخدم فقط الأجسام المضادة المعدلة مسبقا. إذا كان من الضروري عدم لمس AECII لفرز الخلايا، فلا تدرج مضاد CD326 في محلول صبغ الأجسام المضادة.
    1. للفئران البالغة : استخدم محلول الأجسام المضادة بسعة 600 ميكرولتر لكل رئة.
    2. للفئران الصغيرة: استخدم محلول الأجسام المضادة 400 ميكرولتر لكل رئة.
    3. للفئران حديثة الولادة : استخدم محلول الأجسام المضادة 200 ميكرولتر لكل رئة.
  2. حضن تعليق الخلية بالأجسام المضادة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  3. بعد الحضانة، اغسل الخلايا بملء الأنبوب ب DMEM + HEPES + 10٪ (v/v) FBS.
  4. الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة عند 140 × جرام عند 4 درجات مئوية.
  5. أعد تعليق الخلايا DMEM + HEPES + 10٪ (v/v) FBS:
    1. للفئران البالغة : أعد تعليق الجرعة في 300 ميكرولتر لكل رئة.
    2. للفئران الصغيرة: أعد تعليق الجرعة في 200 ميكرولتر لكل رئة.
    3. للفئران حديثة الولادة : أعد تعليق 100 ميكرولتر لكل رئة.

5. تصنيف AECII

ملاحظة: تحضير الأجهزة: قم بتركيب فوهة بحجم 100 ميكرومتر لفرز AECII باستخدام جهاز FACS.

  1. قبل الفرز مباشرة، يتم ترشيح الخلايا عبر مصفاة خلية بحجم 50 ميكرومتر. اشطف مصفاة الخلايا ب DMEM مع HEPES و10٪ (v/v) FBS لمنع فقدان الخلايا بشكل مفرط:
    1. الفئران البالغة : اشطف مصفاة الخلية ب 300 ميكرولتر لكل رئة.
    2. الفئران الصغيرة: اشطف مصفاة الخلايا ب 200 ميكرولتر لكل رئة.
    3. الفئران الوليدة: شطف مصفاة الخلايا ب 100 ميكرولتر لكل رئة.
  2. أعد تعليق الخلايا عن طريق الدوامة مباشرة قبل الفرز.
  3. بوابة ل AECII من خلال تحديد الأحداث التي I) لديها تشتت جانبي مرتفع (SSChigh)، II) تكون سلبية للفلوروكروم من السلالة، وIII) إيجابية لفلوروكروم CD326 مرتبط بالجسم المضاد المضاد ل CD326.
    ملاحظة: استخدم فلوروكروم ذات مؤشرات سطوع عالية إلى عالية جدا (مثل APC، PE، وBV785) لتسهيل التمييز بين غير AECII وAECII. بالنسبة لنهج الفرز غير الملمس (باستثناء مضاد CD326 في محلول التلوين)، يتم تحديد AECII كخلايا سلبية النسب،وعالية من SSC، وخلاياإيجابية/عالية من التألق الذاتي. يمكن تحديد التألق الذاتي ل AECII في كواشف الضوء الأخضر، مثل كواشف FITC أو GFP.
  4. استبعد الدوبلت أو التجمعات باستخدام ارتفاع التشتت الأمامي مقابل المنطقة (FSC-H مقابل FSC-A) وارتفاع التشتت الجانبي مقابل المنطقة (SSC-H مقابل SSC-A).
  5. اجمع الخلايا المصنفة في أنبوب يحتوي على DMEM مدعوم ب HEPES و10٪ (v/v) FBS وجهاز طرد مركزي لمزيد من التحليل أو الزرعة.

6. عزل RNA من AECII الثابت ب PFA (اختياري)

ملاحظة: في حال تم عزل AECII من فئران مصابة، مثل مسببات الأمراض الفيروسية التنفسية، يجب إجراء عزل AECII في ظروف BSL2 أو BSL3، حسب الممرض. إذا لم يكن لدى المجرب إمكانية فرز الخلايا في ظروف السلامة المناسبة، يمكن تثبيت AECII المعزولة باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه باستخدام PFA بعد تلوين الأجسام المضادة. تؤدي هذه الخطوة إلى تعطيل مسببات الأمراض10,11، وبالتالي يمكن أن يتم فرز AECII السيتومتري اللاحق في ظروف BSL1. على الرغم من أن الخلايا لم تعد تستخدم في الاختبارات الوظيفية بسبب عملية التثبيت، إلا أنها مناسبة للتحليلات الجزيئية.

  1. لتعطيل الفيروسات، قم بتثبيت معلقات خلية واحدة موسومة بالأجسام المضادة في 500 ميكرولتر من 4٪ (مع حمض PFA).
    تحذير: مادة صلبة قابلة للاشتعال. ضارة إذا تم ابتلاعه أو استنشاقه. يسبب تهيج الجلد وأضرارا خطيرة في العين. قد يسبب رد فعل تحسسي في الجلد، وتهيجا في التنفس، وسرطانا. يشتبه في تسببها في عيوب جينية. ابتعد عن الحرارة. إذا تم ابتلاعها: اتصل بمركز سموم أو طبيب إذا شعرت بتوعك. إذا تم الاستنشاق: أخرج الشخص إلى الهواء النقي واجعله مرتاحا للتنفس. اتصل بمركز سموم أو طبيب إذا شعرت بتوعك. إذا كانت في العينين: اشطفها بحذر بالماء لعدة دقائق. قم بإزالة العدسات اللاصقة إذا كانت موجودة وسهلة الاستخدام. استمر في الشطف. إذا تعرضت للخطر أو قلقت: احصل على نصيحة طبية/اهتمام.
    ملاحظة: وفقا لإرشادات 3R، تم استخدام AECII من فئران غير مصابة في هذه الدراسة. تم تثبيت AECII لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب اختبار مدة التثبيت بشكل فردي لكل ممرض يشكل خطرا محتملا على البشر والبيئة. يتطلب الفرز اللاحق في ظروف S1 التحقق المسبق في مختبر BSL2 أو BSL3 من عدم وجود فيروس قابل للتكرار بعد تثبيت PFA.
  2. بعد التثبيت، اغسل الخلايا باستخدام DMEM وجهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة بقوة 140 × جرام.
  3. أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر DMEM + HEPES + 10٪ (v/v) FBS ومرر تعليق الخلية عبر مصفاة خلوية بحجم 100 ميكرومتر.
  4. شطف مصفاة الخلية بوسط FBS إضافي بسعة 300 ميكرولتر DMEM + HEPES + 10٪ (v/v) لمنع فقدان الخلايا المفرط.
  5. فرز الخلايا كما هو موضح في الخطوة 5. "فرز AECII".
    ملاحظة: بعد التحقق التجريبي الإلزامي من أن أي فيروس تم تعطيله بالعلاج ب 4٪ (بدون نسبة PFA)، يمكن فرز AECII في ظروف BSL1.
  6. لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثابتة ب PFA، استخدم مجموعة RNeasy FFPE.
    تحذير: تحتوي هذه المجموعة على مواد كيميائية خطيرة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة. انتبه إلى ورقة بيانات السلامة المرفقة، مع التعديلات التالية:
    1. بعد الفرز، قم بعمل الطرد المركزي للخلايا لمدة 15 دقيقة عند 140 × جرام عند 4 درجات مئوية.
    2. أعد تعليق الخلايا في محلول مؤقت PKD بسعة 150 ميكرولتر ثم انقله إلى أنبوب بسعة 1.5 مل.
    3. أضف 10 ميكرولتر من بروتيناز K وحضانة عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها الحضانة عند 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 15 دقيقة، حسب عدد الخلايا (انظر الجدول 1).
  7. استمر في عملية عزل RNA وفقا للبروتوكول، بما في ذلك معالجة DNase، وخطوات الغسيل، والاستلقاء النهائي في مياه خالية من RNase بسعة 30 ميكرولتر.

النتائج

يمثل البروتوكول الموضح هنا طريقة محسنة ومفصلة لعزل وتحليل AECII من أنسجة رئة الفئران في مراحل تطورية مختلفة، بدءا من حديثي الولادة إلى الفئران الصغيرة والبالغة. تتضمن المنهجية تفكك ميكانيكي وإنزيمي للرئة، مع سير عمل محسن لفرز الخلايا الخلوية في تدفق القياس، باستخدام بروتوكولات مخصصة مناسبة لمعالجة عينات من المصابة لإجراء فرز التدفق لاحقا تحت ظروف BSL1.

كشفت البيانات التجريبية عن فعالية عالية لهذا الإجراء العزلي (الملخص في الشكل 1) في إنتاج تجمعات AECII قابلة للحياة ونقية للغاية (>95٪) من AECII. أدى فرز التدفق إلى توليد مجموعات من AECII نقية، مع تحليل ما بعد الفرز الذي أكد صحة الخصوصية التقارب 100٪ للعلامات الخلوية المثبتة (الشكل 2). أظهر قياس عينات الخلايا بعد الفرز إنتاجية عالية تتراوح بين 0.15 × 10.6 AECII صالحة من رئة حديثي الولادة و1.0 × 106 خلايا من عينات بالغة لكل تحضير كامل للرئة (الشكل 3A). حافظت AECII المعزولة على الشكل الخلوي النموذجي (الشكل 3B) وسلامة الخلايا طوال عملية العزل (الشكل 3C). بالإضافة إلى ذلك، تم تأكيد تطبيق البروتوكول للدراسات الوظيفية من خلال عدوى خارج الجسم الناجح باستخدام فيروس IAV متكيف مع الفأر (H1N1، السلالة A/Puerto Rico/8/34) الذي يعبر عن بروتين mCherry reporter (IAV-mCherry12)، مع إثبات قدرة الخلايا على دعم تكاثر الفيروس (الشكل 4).

لدعم سير العمل التجريبي الذي يتطلب تثبيت العينة، يتضمن البروتوكول نهجا متخصصا لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام تثبيت PFA. أظهر الفحص الدقيق لجودة الحمض النووي الريبي من AECII الثابت ب PFA في نقاط زمنية مختلفة للمعالجة أن الحمض النووي الريبي عالي الجودة القابل للتحليل الجزيئي في المراحل النهائية يمكن استخراجه بشكل موثوق من عينات ثابتة (الجدول 1). أظهرت جودة الحمض النووي الريبي المستخرج علاقة مباشرة مع مدة المعالجة الحرارية عند 80 درجة مئوية أثناء عملية الاستخلاص، مما قدم إرشادات تحسين واضحة بناء على الاحتياجات التجريبية المحددة (الجدول 1، الشكل 5). أظهر التحقق من ذلك عبر تحليل PCR العكسي الكمي (qRT-PCR) تضخيم ناجحا لكل من جينات التدبير المنزلي (البروتين الريبوزومي S9، Rps9) والعلامات الخاصة ب AECII (بروتين السطحي C، Sftpc) باستخدام عينات مثبتة ب PFA وتحضيرات ضابطة جديدة (الشكل 6).

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل التخطيطي لعزل AECII من رئة الفئران حديثي الولادة واليافعين والبالغين باستخدام هضم الأنسجة الإنزيمية وفرز الخلايا الخلوية المتدفقة. يوضح الرسم البياني المعالجة المنهجية لرئة الفئران من فئات عمرية مختلفة. يتبع القتل الرحيم للفئران واستخراج الرئة عملية هضم إنزيمية متعددة الخطوات مع تفتيش الأنسجة. بعد التعطيل الميكانيكي، يتم تنقية الخلايا عبر سلسلة من خطوات الترشيح مع تقليل حجم المسام. وبالتالي، يتم تحلل كريات الدم الحمراء. يتم تحقيق الإثراء النوعي ل AECII من خلال الانتقاء السلبي باستخدام وسم الأجسام المضادة ضد العلامات المكونة للدم (CD45، CD11b، CD11c، F4/80، CD19، CD16/32)، وعلامة البطانة CD31، وعلامة الصفائح الدموية CD93، ومؤشر خلايا الظهارة القصبية CD24، والاختيار الإيجابي لخلايا الظهارة باستخدام وسم الأجسام المضادة ضد CD326 والفرز الخلوي اللاحق بناء علىارتفاع SSC المميز ملف تعريف ل AECII الحبيبي. يتيح هذا البروتوكول عزل AECII الأولية عالية النقية (≥ 95٪)، والقابلة للحياة، للتحليلات الوظيفية والجزيئية في المراحل النهائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: استراتيجية البوابة التمثيلية المستخدمة لعزل AECII عن الفئران البالغة. (أ) تم صبغ معلقات الخلايا المفردة في الرئة بالأجسام المضادة ضد المستضدات التالية: F4/80، CD93، CD11c (مرتبط ب APC)، وCD19، CD31، CD11b، CD16/32، CD45، CD24 (مرتبط ب PE)، وCD326 (مرتبط ب BV785). (ب) إعادة التحليل (أ) لتحليل النقاء. تم إعادة تحليل AECII المرتبة لتأكيد نقاء 97.2٪ ل AECII. (ج) صور مجهرية فلورية تمثيلية ل AECII بعد الفرز. تم صبغ النوى بمادة DAPI (زرقاء). تم إجراء التلوين داخل الخلايا باستخدام جسم مضاد أولي مضاد SPC (النوع: أرنب)، وتم التلوين الثانوي باستخدام IgG مضاد للأرانب الماعزي مقترنا بأليكسا 594 (أحمر). تم صبغ AECII ب DAPI والأجسام المضادة الثانوية فقط، وكانت الخلايا الطحالية الملونة بالأجسام المضادة الأولية والثانوية بدور الضوابط ذات الصلة، مما يشير إلى ارتباط محدد بمضاد SPC وكذلك مضاد الأرانب Alexa 594. أشرطة المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: الإنتاج، الشكل والحيوية، والحيوية ل AECII بعد فرز الخلايا المنشط بالفلورة. (أ) إجمالي عدد AECII القابل للحياة لكل رئة تم الحصول عليه من الفئران حديثة الولادة واليافعة والبالغة. (ب) صورة مجهرية ضوئية لمرحلة الفرز بعد AECII. شريط المقياس: 75 ميكرومتر. (C) قابلية AECII لوحظت من خلال تلوين التربان الأزرق بعد الفرز. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: عدوى خارج الجسم الحي لمرض AECII تم فرزه مع IAV-mCherry. تم زراعة خلايا AECII المعزولة من الفئران البالغة خارج الجسم في صفائح زراعة الأنسجة المغطاة بالماتريجيل طوال الليل للسماح بالالتصاق. بعد ذلك، أصيبت الخلايا بعدوى IAV-mCherry (تعدد العدوى 2) لمدة 8 ساعات. لوحظ زيادة زمنية في شدة إشارة mCherry. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: سلامة الحمض النووي الريبي من 4٪ من ال AECII الثابت PFA. ملفات RNA التمثيلية ل PFA ثبتت وفرزت AICII بعد عزل RNA باستخدام مجموعة Qiagen FFPE RNeasy مع تعديلات. تمثل القمم المحددة ل 18S و28S rRNA، إلى جانب رقم جودة RNA (RQN)، سلامة وجودة RNA للRNA المعزول السليم من AECII الثابت PFA. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: منحنيات التضخيم لجين تنظيف المنزل في Rps9 والجين الخاص ب AECII Sftpc من السيطرة (غير المعالجة) و4٪ من PFA ثابت AECII. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عينةوقت الحضانة عند 80 درجة مئوية28S/18SRQNRNA conct. [ng/μ]
التحكم 0.5x106-2105.8
Control 1x106-1.91012.3
PFA ثابت 0,5x106526.45.5
PFA ثابت 0,5x106101.98.13.7
PFA ثابت 0,5x106151.88.22.76
PFA ثابت 1 x106528.26.26
PFA ثابت 1 x106101.18.45.12
PFA ثابت 1 x106150.98.55

الجدول 1: جودة الحمض النووي الريبي المعزول من 4٪ من PFA ثابت AECII - تأثير أوقات تثبيت مختلفة. تم عزل الحمض النووي الريبي من AECII وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (مجموعة FFPE RNeasy) مع تعديلات موضحة في الخطوة 6. تم حضن الخلايا الثابتة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية إما لمدة 5 دقائق أو 10 أو 15 دقيقة لسحب الحمض النووي الريبي من العينة. تم تحديد سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل الشظايا من شركة Agilent

المناقشة

يوفر البروتوكول المحسن الموضح هنا نهجا موثوقا وقابلا للتكرار لعزل وتحليل AECII من نسيج رئة الفئران في أعمار حديثي الولادة والأحداث والبالغين. علاوة على ذلك، يوفر خطوة تثبيت اختيارية ل PFA قبل الفرز، مما يسمح بفرز AECII من الفئران تحت ظروف BSL1، حتى لو كانت قد أصيبت سابقا بمسببات أمراض تنفسية. من خلال الجمع بين التعرض الدقيق للرئة والتروية، يليه إدخال الإنزيمات داخل القصبة الهوائية والأجاروز منخفض الذوبان في الرئة، يتم الحفاظ على بنية الأنسجة، مما يمكن من استعادة معلقات عالية الجودة أحادية الخلية للتحليل لاحقا. أدى إضافة الفرز الخلوي المتدفق على خصائص التشتت الجانبي، والتحديد السلبي للسلالة، والاختيار الإيجابي لخلايا CD326 الإيجابية إلى تجمعات نقية بشكل ملحوظ من AECII. يعد هذا النقاء ذا أهمية خاصة لضمان أن تمثل الاختبارات الجزيئية والوظيفية في المراحل اللاحقة علم بيولوجيا AECII الجوهري وألا تخلط في ذلك بأنواع الخلايا الملوثة، مما يعزز قابلية تفسير دراسات التعبير الجيني وتفاعل الفيروس والمضيف.

يتميز البروتوكول المذكور أعلاه باستبعاد غير AECII باستخدام مجموعة واسعة من الأجسام المضادة الموسومة بالفلورية الموجهة ضد المستضدات البيضاء وغير الكريات البيضاء والانتقاء الإيجابي اللاحق ل AECII عبر خصائص التشتت الجانبي والتعبير عن جزيء الخلايا الظهارية CD326. بينما أظهر أن هذه المنهجية أدت إلى تجمعات AECII نقية للغاية (باستخدام SPC، وهو علامة AECII المميزة)، إلا أن نقاء التجمعات المكتسبة لم يكن بالإمكان تأكيدها إلا باستخدام التلوين داخل الخلايا بعد الفرز حتى الآن. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لعزل AECII من الرئتين المصابتين بفيروس SARS-CoV-2 والإنفلونزا، حيث تستهدف AECII بشكل أساسي الفيروس وتظهر تكيفات خلوية مميزة1. ومع ذلك، قد لا تكون هذه الطريقة مناسبة لعزل AECII في الفأر في سياق دراسات بيولوجيا سرطان الرئة، حيث يتم التعبير عن EpCAM (CD326) أيضا بواسطة خلايا سرطان الرئة في الفئران والبشر13. لهذه الدراسات، قد يوفر استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات فلورية تحت التحكم النسخي من محفز SPC نهجا أكثر ملاءمة لعزل AECII الأولي بشكل موثوق.

يظهر إنتاج 0.15 × 106 AECII قابل للحياة لكل رئة حديثة الولادة، وحتى 1.0 × 106 خلايا لكل رئة بالغة كفاءة وقابلية التوسع للبروتوكول. العقبة الرئيسية أمام العزل الناجح لكميات AECII الكبيرة هي الهضم الإنزيمي غير الفعال والتفكك الميكانيكي لأنسجة الرئة. لذا، من الضروري ضمان ملء كامل للفراغات الحويصلية بالإنزيم في الخطوة 2.1.4، وإجراء تفكك الأنسجة الميكانيكية بعناية في الخطوة 3.1.3. يؤدي الهضم الإنزيمي الفعال إلى تعليق خلوي عكر مع مساهمة قليلة من التجمعات المرئية التي يمكن عادة تفكيكها باستخدام مكبس في خطوات الترشيح التالية. عادة ما تنشأ التجمعات الأكبر التي لا يمكن تمريرها عبر مصفاة الخلية نتيجة لضعف الهضم الإنزيمي. لاحظ أنه لا ينصح بإطالة أوقات الهضم الإنزيمي، لأن ذلك قد يؤثر سلبا على التلوين المناعي اللاحق14 وبالتالي دقة عزل AECII المعتمد على FACS.

إلى جانب كفاءة تفكك الأنسجة الإنزيمي والميكانيكي، قد يؤثر الخلفية الجينية على إنتاج AECII. لهذا البروتوكول، تم استخدام فئران على خلفية C57BL/6. تماشيا مع الفروقات المبلغ عنها في التطور15،المناعي 16، والفسيولوجي 17,18,19 حسب السلالة، من الممكن أن يؤدي استخدام سلالات فئران مختبرية أخرى (مثل BALB/c، DBA) إلى نتائج مختلفة في AECII. علاوة على ذلك، يمكن تقليل عائد AECII من رئتين ملتهبتين (معدية أو غير معدية) بشكل كبير. قد يكون ذلك نتيجة موت الخلايا غير المباشر (الالتهابي) أو المباشر (بوساطة الممرض) لخلايا AECII التي تمثل أهدافا رئيسية مثل IAV20,21 وSARS-CoV-2 22,23,24.

الحفاظ على سلامة الخلايا أثناء التفكك الميكانيكي، والهضم الإنزيمي، وفرز التدفق هو أمر أساسي إضافي للتحليلات الجزيئية و/أو الوظيفية في المراحل اللاحقة. لذلك، تم تقييم فعالية AECII ووظائف الخلايا بعد الفرز. كان AECII قادرين على الالتصاق بمادة الماتريجيل والحفاظ على شكل جسم غني بالصفيح المميز لمدة لا تقل عن 24 ساعة، مما يدل على الكفاءة الوظيفية بعد العزل والملاءمة للزراعة خارج الجسم ( بما في ذلك نماذج العدوى).

إن العدوى الفعالة ل AECII المصنف بفيروس IAV-mCherryreporter 12 وملاحظة تكرار قوي للفيروس تؤكد صحة هذا النظام كمنصة قوية لتوضيح الاستجابات المضادة للفيروسات الظهارية الجوهرية. نظرا لأن AECII تنظم العمليات الرئيسية المشاركة في تخليق المواد السطحية السطحية، وتجديد السنيخ، والمناعة الفطرية25,26، فإن القدرة على فحص حركيات تكرار الأشعة السطحية الاستجابية واستجابات النسخ المضيفة في مجموعات AECII المنقاة ستوفر رؤى لا يمكن الحصول عليها في تحضيرات الخلايا المختلطة.

ابتكار رئيسي في هذا البروتوكول هو تضمين إجراء تثبيت، يسمح بالتحليل جنبا إلى جنب للعينات الجديدة وغير المنشطة. تحافظ عمليات تثبيت PFA واستخراج RNA المعدلة من FFPE على سلامة الحمض النووي الريبي إلى حد متوافق مع التحليلات التحويلية اللاحقة، كما يتضح من نجاح عملية PCR العكسي الكمي (qPCR).

قد تؤثر أوقات تثبيت PFA على جودة التلوين وبالتالي على استعادة AECII بواسطة FACS. علاوة على ذلك، يتأثر إنتاج وجودة الحمض النووي الريبي عادة بعمليات التثبيت. اعتمادا على نموذج العدوى في الجسم الحي المستخدم، يجب أخذ هذه الجوانب في الاعتبار عند تصميم التجارب. يوصى بتجنب وقت تثبيت طويل وبدلا من ذلك تحسين مدة علاج PFA بحيث يتم استخدام الحد الأدنى من الوقت اللازم، وقد ثبت تجريبيا أنه يضمن تعطيل الفيروس المعني.

يعد تقييم وفرة الحمض النووي الريبوزومي (rRNA) باستخدام أداة ميكروفلويدكس بديلا لتقدير جودة mRNA في العينات البيولوجية. يسمح بروتوكول التثبيت والعزل الريبي الموضح ل AECII بعزل الحمض النووي الريبي السليم بجودة كافية لتحليلات النسخ اللاحقة، كما يتضح من نسب 28S/18S rRNA >1 وقيم رقم جودة RNA (RQN) >8. من المهم ملاحظة أن خطوة الحضانة عند 80 درجة مئوية تقلل بشكل حاسم من إنتاج وجودة الحمض النووي الريبي. يمكن تطبيق تكييف أوقات المعالجة الحرارية اختياريا لزيادة إنتاجية وجودة الحمض النووي الريبي في التطبيقات اللاحقة.

توفر هذه التحسينات المنهجية مجتمعة مجموعة أدوات شاملة لدراسة بيولوجيا AECII في سياق الصحة والأمراض المعدية والتطور (من حديثي الولادة إلى البالغين). تسمح الإنتاجية العالية والنقاوة ل AECII المعزولة بهذا النهج بتحليل متعدد الأوميك، بما في ذلك اختبارات النسخ والبروتيوم، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين، بالإضافة إلى الفحوصات الوظيفية (مثل العدوى خارج الحي ) لتحليل الآليات ذات الصلة ب AECII في الجسم الحي.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

يرغب المؤلفان في شكر تاتيانا هيرش وفريدريكه كروز على مساعدتهما الفنية المتخصصة، وليزا هونيك وجوستين سموت على مناقشاتهما المفيدة، ويوشيهيرو كاواكا على توفير فيروس IAV-mCherry للمراسل. تم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة أبحاث ألمانيا (DFG) - TRR 359 - رقم المشروع 491676693 (إلى D.B. و J.H.)، ومبادرة COVIPA (KA1-Co-02، جمعية هيلمهولتز؛ إلى D.B.)، ومنحة من مؤسسة البحوث الألمانية (BO 7036/1-1؛ إلى J.D.B.). نشكر الدعم من صندوق النشر المفتوح لكلية الطب بجامعة أوتو فون غيريكه في ماغديبورغ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مخزن ACK--8.29 جرام NH4Cl، 1 جرام KHCO3، 200 وميكرو؛ L من 0. 5 M EDTA، أضف 1000 مل Milli-Q، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 إلى 7.4
CD11b مضاد للفأرةالعلوم الحيوية الإلكترونية12-0112-83نسخة مستنسخة M1/70؛ PE مقترنة
مضاد الفأرة CD11cالأسطورة الحيوية117310نسخة مستنسخة N418؛ ناقلة مدرعة مدرعة مزدوجة
مضاد الفأرة CD16/32بكالوريوس العلوم الحيوية553141نسخة 93؛ تطهر
مضاد الفأرة CD16/32بكالوريوس العلوم الحيوية561727نسخة 2.4G2؛ PE مقترنة
القرص المضاد للفأرة CD19الأسطورة الحيوية115508نسخة 6D5؛ PE مقترنة
مضاد الفأرة CD24الأسطورة الحيوية101808نسخة مستنسخة M1/69؛ PE مقترنة
CD31 مضاد للفأرةالأسطورة الحيوية102408نسخة 390؛ PE مقترنة
مضاد الفأرة CD326الأسطورة الحيوية118245نسخة مستنسخة G8.8؛ BV785 مرتبطة
CD45 مضاد للفأرةبكالوريوس العلوم الحيوية553081نسخة 30-F11؛ PE مقترنة
CD93 مضاد للفأرةالعلوم الحيوية الإلكترونية17-5892-82نسخة مستنسخة AA4-1؛ ناقلة مدرعة مدرعة مزدوجة
مضاد الفأرة F4/80الأسطورة الحيوية123116نسخة مستنسخة BM8؛ ناقلة مدرعة مدرعة مزدوجة
مضاد الفأر SPC أبكامab211326أنواع المضيف: أرنب؛ النسخة: EPR19839؛ تطهر
آريا-فيوجنبكالوريوس العلوم الحيويةفرز الخلايا
أريا-II SORPبكالوريوس العلوم الحيويةفرز الخلايا
لوح البيوزيم أغاروزالحيوي8401011٪ (بدون خسارة) في H2O
مصفاة خلوية (100 وميكرو؛ M، 70 وميكرو؛ M، 40 وميكرو؛ m)بي دي فالكون352360, 352350, 352340
CellTrics (50 وميكرو؛ m)سيسميكس04-004-2327
ديوكسي ريبونوكلياز I من البنكرياس البقري، 2000 وحدة كونتز/قارورةسيغما-ألدرتشD4263محتوى مذاب حديثا من قارورة واحدة في 330 وميكرو؛ ل DMEM
ديسباز، 100 مل (5000 وحدة كازينوليتك)كورنينغ354235قم بالترشيح المعقم (حجم المسام 0.22 وميكرو؛ م)، وتحضير 4 مل من الأليكوت في أنابيب 15 مل، وتخزينها عند -20 ودرجة حرارة؛ C
DMEMجيبكو31885-049منخفض الجلوكوز، مع البيروفيت، يضيف HEPES (التركيز النهائي 25 ملمولار)
فرقة FACSبكالوريوس العلوم الحيويةبرامج الفرز
فلوجوبرنامج تقييم بيانات FACS
الماعز المضاد للأرنبأليكسا 594 مرتبطة
قنية داخلية Introcan 22Gبراون4252098B
مجموعة RNeasy FFPEتشياغن73504
سيمفوني الموسم السادس SEبكالوريوس العلوم الحيويةفرز الخلايا

المراجع

  1. Stegemann-Koniszewski, S., et al. Alveolar type II epithelial cells contribute to the anti-influenza A virus response in the lung by integrating pathogen- and microenvironment-derived signals. mBio. 7 (3), (2016).
  2. Kumova, O. K., et al. Severity of neonatal influenza infection is driven by type I interferon and oxidative stress. Mucosal Immunol. 15 (6), 1309-1320 (2022).
  3. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single-cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 10 (1), 963(2019).
  4. Cleaver, J. O., et al. Lung epithelial cells are essential effectors of inducible resistance to pneumonia. Mucosal Immunol. 7 (1), 78-88 (2014).
  5. Boehme, J. D., et al. Epigenetic changes and serotype-specific responses of alveolar type II epithelial cells to Streptococcus pneumoniae in resolving influenza A virus infection. Cell Commun Signal. 23 (1), 278(2025).
  6. Worrell, J. C., et al. Lung structural cells are altered by influenza virus leading to rapid immune protection following re-challenge. Nat Commun. 16 (1), 7061(2025).
  7. Sinha, M., Lowell, C. A. Isolation of highly pure primary mouse alveolar epithelial type II cells by flow cytometric cell sorting. Bio Protoc. 6 (22), (2016).
  8. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells to study type II to type I cell differentiation. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  9. Gereke, M., et al. Flow cytometric isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells for functional and molecular studies. J Vis Exp. (70), e4322(2012).
  10. Avelin, V., Sissonen, S., Julkunen, I., Österlund, P. Inactivation efficacy of H5N1 avian influenza virus by commonly used sample preparation reagents for safe laboratory practices. J Virol Methods. 304, 114527(2022).
  11. Jureka, A. S., Silvas, J. A., Basler, C. F. Propagation, inactivation, and safety testing of SARS-CoV-2. Viruses. 12 (6), (2020).
  12. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nat Commun. 6, 6600(2015).
  13. Hanssen, A., Loges, S., Pantel, K., Wikman, H. Detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 5, 207(2015).
  14. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  15. Soutiere, S. E., Mitzner, W. Comparison of postnatal lung growth and development between C3H/HeJ and C57BL/6J mice. J Appl Physiol. 100 (5), 1577-1583 (2006).
  16. Alberts, R., et al. Gene expression changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12 (4), 309-318 (2010).
  17. Kida, K., Fujino, Y., Thurlbeck, W. M. A comparison of lung structure in male DBA and C57 black mice and their F1 offspring. Am Rev Respir Dis. 139 (5), 1238-1243 (1989).
  18. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  19. Soutiere, S. E., Tankersley, C. G., Mitzner, W. Differences in alveolar size in inbred mouse strains. Respir Physiol Neurobiol. 140 (3), 283-291 (2004).
  20. Koerner, I., Matrosovich, M. N., Haller, O., Staeheli, P., Kochs, G. Altered receptor specificity and fusion activity of the haemagglutinin contribute to high virulence of a mouse-adapted influenza A virus. J Gen Virol. 93 (Pt 5), 970-979 (2012).
  21. Weinheimer, V. K., et al. Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung. J Infect Dis. 206 (11), 1685-1694 (2012).
  22. Youk, J., et al. Three-dimensional human alveolar stem cell culture models reveal infection response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 27 (6), 905-919.e10 (2020).
  23. Ziegler, C. G. K., et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell. 181 (5), 1016-1035.e19 (2020).
  24. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904.e8 (2020).
  25. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: Defender of the alveolus revisited. Respiratory Res. 2 (1), 33(2001).
  26. Mason, R. J. Biology of alveolar type II cells. Respirology. 11 (Suppl), S12-S15 (2006).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

C RT PCR
عزل خلايا الظهارة الحنخيية من النوع الثاني من رئات الفئران الوليدية واليافعة والبالغة القادرة على التكيف مع بيئات التجارب المعدية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.