يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصوير ثنائي الفوتون داخل الحيوية لشكل المحاور الحسية باللمس في جلد الفأر

840 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69589

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه الدراسة نهج تصوير فوتوني في الجسم الحي ، لرؤية هياكل نهايات محاور المستقبل الميكانيكية منخفضة العتبة (LTMR) في جلد مخلب الفئران الأمامي. باستخدام تصوير متكرر وعالي الدقة للمحاور العصبية الفردية، توفر هذه الطريقة منصة جديدة لدراسة بنية ووظيفة الدائرة الحسية الجلدية أثناء التطور وفي البالغين.

الملخص

المستقبلات الميكانيكية منخفضة العتبة (LTMRs) هي خلايا عصبية حسية جسدية تكتشف محفزات اللمس الضوئي غير الضارة مثل الاهتزاز، انحراف الشعر، والضغط. تشكل هذه النواحي طرفيات محورية محددة بأنواع فرعية في الأطراف وتسقط محاور محورية مركزية نحو الحبل الشوكي لنقل المعلومات اللمسية. الفهم الحالي لتطوير وتنظيم LTMR يأتي من أنسجة ثابتة لا يمكنها الكشف عن العمليات الديناميكية والزمنية للأسلاك المحورية وإعادة التشكيل. هنا، يتم تقديم طريقة تصوير بفوتونين لتصوير شكل المحاور العصبية LTMR في مخلب الفأر الأمامي أثناء التطور وعند البالغين. يمكن للمجهر ذو الفوتونين تحقيق تصوير عالي الدقة داخل الجلد السليم، مما يتيح التصوير المتكرر لنفس الأطراف المحورية عبر نقاط زمنية ما بعد الولادة. يمكن دمج التصوير بفوتونين مع أدوات جينية جديدة للفئران لكشف تطور المحاور العصبية مع خصوصية النوع الفرعي. يتيح التصوير المزمن لحالات LTMR دراسات حول تجميع وإصلاح الدوائر بعد الإصابة. توفر هذه الأساليب نظاما في الجسم الحي يوفر رؤى جديدة حول الآليات الخلوية التي تنظم تطور وتجدد المحاور الحسية الجسدية.

المقدمة

اللمس هو أول حاسة تتطور وتلعب دورا مركزيا في كيفية تجربة الكائنات الحية واستجابتها للعالم المادي. يتم اكتشاف اللمس بواسطة مستقبلات ميكانيكية منخفضة العتبة (LTMRs)، وهي أنواع فرعية من خلايا العقدة الجذرية الظهرية (DRG) التي تكتشف المحفزات الميكانيكية غير الضارة، بما في ذلك الانبعاجات، والاهتزاز، وانحراف الشعر 1,2. ال LTMRs هي أحادية القطب الكاذبة وتمتد المحاور الطرفية إلى الأنسجة الطرفية لتشكيل أطراف خاصة بأنواع فرعية. تنقل محاورها المركزية المعلومات اللمسية إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال تكوين اتصالات مشبكية مع خلايا عصبية الحبل الشوكي3. ومع ذلك، فإن كيفية إنشاء وصيانة دوائر اللمس غير مفهومة بشكل جيد.

الدراسات التأسيسية السابقة على القطط خلال الستينيات والسبعينيات حددت لأول مرة هذه المستقبلات الميكانيكية المميزة وظيفيا وخصائص استجابتها في الجلد المشعر. تصنف الأنواع الفرعية LTMR حسب شكلها الفريد، وسرعة التوصيل، وخصائص الاستجابة2. الأنواع الفرعية الرئيسية لLTMR هي Aβ التكيف السريع (RA) والتكيف البطيء (SA) LTMRs، Aδ-LTMRs، وC-LTMRs 2,6,7. تشكل Aβ RA-LTMRs وAδ-LTMRs وC-LTMRs مجمعات رمحية طولية حول بصيلات الشعر2. تشكل Aδ-LTMRs نهايات رمحية مستقطبة حول بصيلات الشعر على الجانب الذيلي، وهي ميزة ضرورية لاستجاباتها الانتقائية للاتجاه على انحراف الشعر7. النهايات المحولية في المجمعات الرمحية مصطفة بشكل وثيق مع أعمدة الشعر وتغلفها عمليات شبيهة بالأصابع من خلايا شوان الطرفية، التي توفر دعما غذائيا وتؤثر على الشكل المحوري 8,9,10. في الجلد الشفاف، تنتهي محاور Aβ RA-LTMRs في كوربسولات ميسنر، وهي هياكل بيضاوية الشكل تقع داخل الحليمات الجلدية ومضبوطة على الحركة عبر الجلد 2,11.

تنظيم أطراف المحور LTMR يتم تنظيمه بواسطة كل من البرامج الجوهرية والإشارات المعتمدة على الجلد خلال التطور12,13. عند التلف، يرتبط خلل LTMR بحالات مرضية مثل الألودينيا الميكانيكية12,14. ومع ذلك، لا تزال آليات تطوير وصيانة LTMR في الجلد السليم غير واضحة. الكثير مما هو معروف عن تطورها ينبع من الأنسجة الثابتة، التي لا تستطيع التقاط العمليات الديناميكية التي قد تحدث في الجسم الحي 6,15,16,17,18. على سبيل المثال، تظهر Aβ RA-LTMRs وAδ-LTMRs تعصيبات نشطة حول بصيلات الشعر والتقليم المحوري خلال التطور المبكر بعد الولادة19. لا يزال كيف يتم تحقيق تعصيب بصيلات الشعر وصيانتها في الجسم الحي غير معروف.

المجهر الليزر الماسح بفوتونين، وهو تقنية تصوير متقدمة تسمح بتصور البنى الموسومة بالفلورسنت داخل الأنسجة الحية، مكن من التصوير عالي الدقة في الجسم الحي للعمليات الفسيولوجية الديناميكية 20,21. خلال التصوير بفوتونين، تثير نبضات قصيرة من الضوء تحت الأحمر القريب الفلورات فقط عند المستوى البؤري، مما يحصر الإشارة في حجم صغير ويقلل من التألق خارج البؤرة21,22. يقلل هذا الحبس بشكل كبير من السمية الضوئية ويسمح بتصوير ثلاثي الأبعاد ومحليا للهياكل 20,23,24. علاوة على ذلك، فإن الأطوال الموجية الأطول للإثارة المستخدمة في المجهر ذو الفوتونتين تتشتت أقل داخل الأنسجة، مما يسمح باختراق أعمق وضوضاء أقل في البيئات المعقدة 20,25,26. على سبيل المثال، كشف التصوير بفوتونين عن مرونة تشبكية هيكلية وأنشطة عصبية في خلايا القرن الظهري للحبل الشوكي 27,28,29. بالإضافة إلى ذلك، كشف التصوير المزمن بفوتونتين في الجسم الحي لبصيلات الشعر عن رؤى حول توازنها في جلد أذن الفأر23. لذا، فإن المجهر ذو الفوتونين مناسب جدا لدراسة هياكل التصوير طويل الأمد في الجلد في الجسم الحي، خاصة عند الحاجة إلى تصوير متكرر طويل الأمد لتتبع التغيرات التطورية والمزمنة.

عند اقترانها بخطوط فئران معدلة وراثيا تعبر عن المراسلين الفلوريين، يمكن لمجهر الفوتونين أن يكشف عن شكل الخلايا العصبية في الجلد3. في الجهاز الحسي الجسدي، يعبر عن البروتين الفلوري الأصفر (YFP) المعبر عنه تحت سيطرة محفز thy1 (Thy1-YFP)30 بشكل انتقائي على مركبات Aβ-LTMR الرمحية في الجلد المشعر وجسيمات مايسنر في الجلد المشعل30,31. في فئران Thy1-YFP، تكون المحاور العصبية الموسومة إيجابية لبروتين الميالين الأساسي والخيوط العصبية، وهي علامات لمحورات Aβ الميالينية 30,31. بالإضافة إلى ذلك، يقوم TrkBCreER، الذي يحفز فيه جين TrkB (كيناز مستقبل تروبوميوزين B) بتصنيف Aδ-LTMRs بشكل انتقائي أثناء التطور7. في الجلد، المجهر ذو الفوتونين هو الأكثر فعالية لتصوير الميكروسوب طويل الأمد في الفئران المخدرة، حيث تؤثر حركة الفأر على التقاط الصور عالية الدقة. يستغرق الأمر وقتا لرؤية البروتينات الفلورية عند الأطراف المحورية بعد التعبير الناتج عن CreER، ويجب تحديد الحد الأدنى لفترة الانتظار لكل خط معدل. بشكل عام، يمكن تطبيق هذه المنهجية على تصور الميكروفون طويل الأمد عبر الفئران في جميع مراحل النمو وعند البالغين.

يشرح هذا البروتوكول إجراءات استخدام المجهر ذو الفوتونين لدراسة شكل محاور التصوير الطويل الأمد في الجلد المشعر واللامع للفئران النامية والبالغة بدقة عالية. يتضمن البروتوكول عدة نصائح لتصوير عالي الدقة وتصوير مزمن مثالي. يتيح هذا النهج التكاملي دراسة الآليات الخلوية التي تحرك تجميع ولدونة محاور اللمس الحسية في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للوائح رعاية المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) في جامعة فاندربيلت. لأجل سلامة المجربين، تم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام معاطف مختبر، وقفازات معقمة، وأقنعة. تم تعقيم جميع الأدوات جيدا قبل الاستخدام، وتم تنظيف جميع الأسطح التجريبية بنسبة 70٪ إيثانول قبل وبعد كل تجربة. كانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من المراهقين البالغة من كلا الجنسين، وكانت مشتقة من سلالات Thy1-YFP وTrkBCreER وAi140. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد الأدوات

  1. شغل الليزر. امنح الليزر وقتا كافيا ليسخن. في هذا العمل، تم استخدام ليزر Chameleon Discovery NX، الذي تبلغ مدة نبضه 100 فيمتوثانية (fs) ومعدل تكرار 80 ± 0.5 ميغاهرتز (MHz).
  2. شغل المجهر ذو الفوتونين وافتح برنامج التحكم والاكتساب على الكمبيوتر.
  3. شغل وسادة التدفئة واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء التخدير.

2. تحضير التخدير والمخدر الأمامي للتصوير

  1. لتحفيز التخدير، ضع الفأر في غرفة الحث واضبط النظام على 3.5٪ إيزوفلوران حتى يفقد الفأر رد فعل الاستقامة ويظهر تنفسا سلسا ومنتظما (وفقا لبروتوكولات معتمدة مؤسسيا). يستخدم هواء الغرفة كناقل ويجب ضبطه على 1.0 لتر في الدقيقة (L/min).
  2. ضع الفأرة على وسادة التسخين على منصة التصوير وقلل الإيزوفلوران إلى 1.5٪ والأكسجين إلى 0.5 لتر/دقيقة. يجب أن يتم توصيل الإيزوفلوران عبر مخروط الأنف. بالنسبة للفئران التي تقل عن اليوم العشرين بعد الولادة، يتم ضبط الإيزوفلوران على 2-4٪ للحفاظ على التخدير. راقب عمق التخدير كل 10 دقائق من خلال تقييم فقدان ردود الفعل على الدواسة والجرح، ومعدل وعمق التنفس، وقوة العضلات بشكل عام.
  3. لتقليل التشوهات الحركية أثناء التصوير، بما في ذلك الحركة المرتبطة بالتنفس، يجب وضع الفأر على مرحلة منفصلة عن الكف. في هذا البروتوكول، يستند جسم الفأر على منصة مجاورة مباشرة لمنصة التصوير التي تم تثبيت الكف عليها، ولكن دون لمسها.
  4. ضع مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التصوير.
  5. ضعي كريم إزالة الشعر بلطف على الكف باستخدام قطعة قطن لإزالة الشعر. بعد تركه على الجلد لدقيقة، أزل الكريم، ثم نظف مخلب الفأر بنسبة 70٪ إيثانول وماء.
  6. قم بتمديد الجلد بلطف لتثبيت سطح الجلد. باستخدام إبرة معقمة بوزن 30G وحبر أسود، اخترق الجلد والوشم بلطف باستخدام نقطتين متجاورتين على جانبي منطقة الصورة المقصودة. تأكد من أن النقاط متباعدة بحوالي 2 مليمتر (مم) عن بعضها البعض. بعد الانتهاء من الوشم، تخلص من الإبرة بشكل صحيح في حاوية حادة.
  7. على شريحة المجهر الزجاجي، ضع أربع نقاط من شحم التفريغ على الزوايا وضع قطعة صغيرة من الطين (مثل طين DAS لتقويم الهواء) بسماكة تقارب 1 مم في منتصف الشريحة. ضع الشريحة تحت العدسة الموضوعية ووسط كف الفأر مباشرة على قطعة الطين (الشكل 1A,B). لف كف الفأر بلطف على السلايد لتسويته وضغطه على الطين. ضع غطاء غطاء بحجم 22 مم × 60 مم بعناية فوق الكف لتثبيت السلايد. اضبط زاوية جلد الفأر بوضع ضغط خفيف على كل زاوية من زوايا غطاء الغطاء حتى يصبح سطح الغطاء والجلد موازيين لمستوى التصوير. استخدام القوة اللطيفة أثناء التصوير يساعد في منع احتمال إصابة الجلد.
  8. لتصوير الجلد اللامع، ضع الشريحة تحت العدسة الموضوعية ومركز كف الفأرة على الشريحة كما هو موضح في الخطوة 2.7. استخدم الملقط لتدوير الكف بحيث يكون الجلد الشفاف مواجها للأعلى. استخدم الطرف المسطح من الملقط لضغط الكف بلطف على الطين. بمجرد أن تصبح الكف مستوية، ضع غطاء الغطاء العلوي واضغط للأسفل كما هو موضح في الخطوة 2.7.

3. تصوير المجهر بفوتونتين لمورفولوجيا LTMR

ملاحظة: يمكن تعديل المعايير التالية بناء على التجربة المحددة. في هذه التجربة، تم استخدام عدسة موضوعية بغمر مائي بزاوية 20x بفتحة عدسة رقمية 1 ومسافة عمل 2.00 مم. تصف الخطوات 3.1-3.6 المعاملات المحددة المستخدمة لمخلب فأر Thy1-YFP الأمامية اليمنى، والتي يمكن أن تكون دليلا مرجعيا.

  1. ضع قطرة ماء مقطر على غطاء الغطاء مباشرة فوق كف الفأر.
  2. خفض العدسة الموضوعية حتى يتكون عمود ماء.
  3. بمجرد أن تكون العدسة الموضوعية مركزة فوق مخلب الفأرة، أغلق صندوق المجهر واستخدم شاشة LED للتركيز على العينة عبر وحدات تحكم X وY وZ. تعرض شاشة LED صورة حية مضاءة بضوء LED المدمج في المجهر.
    ملاحظة: يستخدم وضع LED للتأكد من أن العدسة الموضوعية مركزة على مجال الاهتمام قبل التحول إلى وضع الفوتونين. تظهر صورة LED ميزات سطحية مثل الأوعية الدموية وبصيلات الشعر، وتعمل كدليل بصري للمحاذاة والاستهداف. تظهر الوشوم على كف الفأر كبقع سوداء على شاشة LED. باستخدام هذه المعالم، ابحث عن المنطقة بين البقع السوداء وركز عليها. هذا يضمن تصوير نفس منطقة مخلب الفأر بشكل متكرر.
  4. بمجرد العثور على العينة، أطفئ شاشة LED. لإجراء تصوير بفوتونين من الأنسجة، قم بتحويل المجهر من إعداد المرآة إلى إعداد ثنائي اللون عن طريق قلب رافعة في الجانب العلوي الأيمن من المجهر.
  5. أغلق ستائر التعتيم وشغل الكاشف لرؤية YFP.
  6. باستخدام Prairie View، افتح الغالق، وحول البرنامج إلى وضع التصوير. لتصوير Thy1-YFP، قم بتشغيل الليزر القابل للضبط عند 960 نانومتر (نانومتر) إلى كسب 700-800. عند تصوير GFP، اضبط الليزر القابل للضبط على 920 نانومتر.
    1. بالنسبة للفئران في اليوم العاشر بعد الولادة أو أقل، اضبط قوة الليزر الأولية على 50، مع زيادة حتى يتم الوصول إلى شدة الإشارة المطلوبة. تقلل هذه القدرة الأولية من الليزر من اختراق الضوء وخطر تلف الضوء. بعد ضبط طول موجة الليزر، والكسب، والقوة، ابدأ بالمسح.
      ملاحظة: لالتقاط صورة عالية الدقة بمجال رؤية 1.00x أو صورة لكريات مايسنر بأطراف أصابع غير شفافة، ينصح باستخدام حجم صورة 1024 × 1024 مع مجال رؤية تصوير 601.9 ميكرومتر × 601.9 ميكرومتر، وحجم بكسل 0.588 ميكرومتر × 0.588 ميكرومتر. لتصوير النهايات الرمحية حول بصيلات الشعر، ينصح بالحصول على حجم صورة 1024 × 1024 عند تقريب 8.00x، ومجال رؤية تصوير 75.2 ميكرومتر × 75.2 ميكرومتر، وحجم بكسل 0.147 ميكرومتر × 0.147 ميكرومتر. من المهم ملاحظة أن مجال رؤية الصورة وحجم البكسل يتغيران مع إعداد التكبير.
  7. استخدم وحدات التحكم X وY وZ لإيجاد مجال التصوير، وضبط التكبير حسب الحاجة، وابدأ في التقاط الصور. عادة ما يتم الحصول على صورة مثالية في موقع بداية على بعد حوالي 10-20 ميكرومتر تحت سطح الجلد.
    ملاحظة: عادة ما يكون حجم خطوة الصورة عالية الدقة للجلد المشعر 1 ميكرومتر أو 2 ميكرومتر مع حوالي 40-120 شريحة. وفي الوقت نفسه، عادة ما يكون حجم خطوة الصورة عالية الدقة للجلد اللامع يتراوح بين 2 ميكرومتر إلى 4 ميكرومتر مع حوالي 80-100 شريحة. ينتج عن ذلك نطاق z نموذجي يتراوح بين 100-250 ميكرومتر، وأقصى عمق تصوير إجمالي يبلغ حوالي 300 ميكرومتر.
  8. سيتم تحديد مدة جلسة التصوير إلى 25 دقيقة لتقليل مدة التعرض للأيزوفلوران وتقليل خطر الآثار الجانبية المرتبطة بالتخدير على. يتم امتصاص الأيزوفلوران الزائد بواسطة علبة فلتر الفحم المخدر، والتي يمكن التخلص منها في القمامة العادية.

4. الرعاية بعد العملية

  1. أزل كف الفأر من الشريحة الزجاجية وأعد الفأر إلى قفص الاسترداد.
  2. حافظ على قفص الفأر دافئا على وسادة تسخين حتى يتعافى الفأر تماما من التخدير.
  3. ضع الفأر مرة أخرى في قفصه المنزلي، وراقبه لمدة 30 دقيقة إضافية لضمان اندماجه مع رفاقه في القفص.

5. التصوير المزمن في الجسم الحي لمورفولوجيا التصوير طويل الأمد

  1. ضع الفأرة تحت المجهر ذو الفوتونتين باتباع الخطوات 2.4-3.3.
  2. باستخدام شاشة LED، حدد نقاط الحبر من جلسة التصوير السابقة. وجه الشاشة بين النقاط لضمان التقاط المنطقة المطلوبة. أثناء وضع المسح على المجهر، تحقق من العلامات مثل الأعصاب الكبيرة أو أنماط بصيلات الشعر، لضمان تحديد نفس المنطقة.
  3. بمجرد العثور على منطقة التصوير، اتبع الخطوات 3.4-3.6 لمواصلة التصوير.
  4. تحقق من جودة وشدة الصور، بالإضافة إلى شكل المحاور العصبية الرئيسية، التي يتم الحصول عليها من خلال إثارة الفوتونتين لمنطقة الجلد. تأكد من أن حقول الصور قابلة للمقارنة مع تلك التي تم التقاطها خلال جلسة التصوير السابقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذا العمل، تم استخدام المجهر ذو الفوتونين لرؤية هياكل المحوريات Aβ RA-LTMR وAδ-LTMR في الجلد أثناء النمو وعند البالغين. النهايات الرمحية الناضجة، التي تظهر في الفئران في اليوم العشرين بعد الولادة فما فوق، تكون مكتملة النمو19,32. تم تصوير التنظيم العام لنهايات المحاور العصبية في الجلد المشعر للفئران البالغة، كما هو موضح في الإسقاط القصوى للشدة (الشكل 2A). يمكن عرض عمق وشكل هذه الأطراف المحاور العصبية باستخدام إعادة بناء ثلاثية الأب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تظهر هذه الدراسة استخدام المجهر ذو الفوتونين لفحص شكل الميكروفون طويل الأمد في الجلد السليم للفئران حديثة الولادة والبالغين. يتغلب هذا النهج الطولي على قيود تثبيت الأنسجة ويتيح الملاحظة الفورية لهياكل المحورية في الأنسجة السليمة. تتوافق أشكال المحور المحوري Aβ RA-LTMR وAδ-LTMR التي تم رؤيتها من خلال تصوير فوتونين مع الملاحظات من الأنسجة المثبتة في PFAالسابقة 2,6,7,19,33,34.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يذكرون أي إفصاحات ذات صلة.

شكر وتقدير

نود أن نشكر الدكتورة هانا إيلام، الدكتورة سنيغدا موكيرجي، راشيل لاريفي، والدكتورة تيجي ج. فاداكان على كل دعمهم ومساعدتهم طوال هذا البحث. نشكر رايان مايكل نيورا على مساعدته في إعداد نظام الإيزوفلوران. يدعم هذا العمل زمالة هانا غراي في معهد هوارد هيوز الطبي (منحة# GT17518).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عدسة 20x Objective & ndash; سوبر NA 1.0أوليمبوس1-U2B965إعداد المجهر ذو الفوتونتين
غطاء 22x60VWR16004-330إعداد المجهر ذو الفوتونتين
طين النمذجة بالتقسية الهوائيةDASإعداد المجهر ذو الفوتونتين
مضخة هواء تخدير (HF)، 110 فولتشركة RWD لايف ساينس إنك.R510-30نظام الإيزوفلوران
قناع التخدير المركزيشركة RWD لايف ساينس إنك.R510-Mنظام الإيزوفلوران
غرفة التخدير التحفيزي – الفأر والجرذشركة RWD لايف ساينس إنك.V105نظام الإيزوفلوران
محقق بروكر ألتيما بالإضافة إلى المجهر الماسح بالليزربروكر نانو، إنك. إعداد المجهر ذو الفوتونتين
إبر الفراشةفيشر ساينتيفك1484041إعداد المجهر ذو الفوتونتين
كاميرا Chameleon Discovery NX مع TPC: Dualمتماسك1385777إعداد المجهر ذو الفوتونتين
قناع مخروطي مع أنابيب للفئران حديثة الولادةشركة RWD لايف ساينس إنك.68680نظام الإيزوفلوران
مرشحات انبعاث مزدوجة (et525/70m و et595/50m) و t565lpxr  مقسم الشعاع ثنائي اللوننيكونINVP-01إعداد المجهر ذو الفوتونتين
مجموعة مرشح الفلورة ET-GFP ET470/40x و ET252/50m؛ ديكرويك T495LPXR نيكون518065إعداد المجهر ذو الفوتونتين
الإيثانولمختبرات ديكون المحدودةإعداد المجهر ذو الفوتونتين
لوحة تسخين الأشعة تحت الحمراء البعيدة مع وحدة تحكم (تيار متردد)كنت ساينتفيكRT-0515إعداد المجهر ذو الفوتونتين
كواشف GaAsp (2) فوتونكس هاماماتسو  HED-UP-2 إعداد المجهر ذو الفوتونتين
عبوات فلتر الغازشركة RWD لايف ساينس إنك.R510-31-6نظام الإيزوفلوران
شحم الفراغ العاليسيغما ألدريتشZ273554نظام التصوير
إيزوفلوران، USP (250 مل)العناية المركزة بيرامال6679-017-25نظام الإيزوفلوران
صندوق الغطاء الليزر تيكو تكنولوجينظام التصوير
الفئران: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/Jجاكس27214
الفئران: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/Jجاكس30220
الفئران: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/Jنهر تشارلز3709
كريم مزيل الشعر نايرأمازون28001إعداد المجهر ذو الفوتونتين
ملفات البيانات الخامزينودو10.5281/zenodo.17370834
حامل صلب مع حامل إدخال مستطيل كبيرثورلابزMP15Mإعداد المجهر ذو الفوتونتين
منصة عمليات تخدير الصغيرةشركة RWD لايف ساينس إنك.R510-PGLنظام الإيزوفلوران
مرهم العين المهدئبوش + لومبإعداد المجهر ذو الفوتونتين
شرائح المجهر سوبرفروست بلسفيشر ساينتيفك12-550-15إعداد المجهر ذو الفوتونتين

المراجع

  1. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  2. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  3. Meltzer, S., Santiago, C., Sharma, N., Ginty, D. D. The cellular and molecular basis of somatosensory neuron development. Neuron. 109 (23), 3736-3757 (2021).
  4. Burgess, P. R., Petit, D., Warren, R. M. Receptor types in cat hairy skin supplied by myelinated fibers. J Neurophysiol. 31 (6), 833-848 (1968).
  5. Iggo, A., Muir, A. R. The structure and function of a slowly adapting touch corpuscle in hairy skin. J Physiol. 200 (3), 763-796 (1969).
  6. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
  7. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  8. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  9. Handler, A., et al. Three-dimensional reconstructions of mechanosensory end organs suggest a unifying mechanism underlying dynamic, light touch. Neuron. 111 (20), 3211-3229 (2023).
  10. Yamamoto, T. The fine structure of the palisade-type sensory endings in relation to hair follicles. J Electron Microsc (Tokyo). 15 (3), 158-166 (1966).
  11. Cauna, N., Ross, L. L. The fine structure of Meissner's touch corpuscles of human fingers. J Biophys Biochem Cytol. 8 (2), 467-482 (1960).
  12. Olson, W., Dong, P., Fleming, M., Luo, W. The specification and wiring of mammalian cutaneous low-threshold mechanoreceptors. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (3), 389-404 (2016).
  13. Koutsioumpa, C., et al. Skin-type-dependent development of murine mechanosensory neurons. Dev Cell. 58 (20), 2032-2047 (2023).
  14. Duan, B., Cheng, L., Ma, Q. Spinal circuits transmitting mechanical pain and itch. Neurosci Bull. 34 (1), 186-193 (2018).
  15. Botchkarev, V. A., Eichmüller, S., Johansson, O., Paus, R. Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin. J Comp Neurol. 386 (3), 379-395 (1997).
  16. Peters, E. M. J., et al. Developmental timing of hair follicle and dorsal skin innervation in mice. J Comp Neurol. 448 (1), 28-52 (2002).
  17. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3 (4), 389-395 (2003).
  18. Liu, Q., et al. Molecular genetic visualization of a rare subset of unmyelinated sensory neurons that may detect gentle touch. Nat Neurosci. 10 (8), 946-948 (2007).
  19. Meltzer, S., et al. A role for axon-glial interactions and Netrin-G1 signaling in the formation of low-threshold mechanoreceptor end organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (43), e2210421119(2022).
  20. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  21. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  22. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  23. Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nat Protoc. 10 (7), 1116-1130 (2015).
  24. Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus. J Vis Exp. (185), e64104(2022).
  25. Rompolas, P., Mesa, K. R., Greco, V. Spatial organization within a niche as a determinant of stem-cell fate. Nature. 502 (7472), 513-518 (2013).
  26. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 23 (12), 3139-3149 (2006).
  27. Ahanonu, B., Crowther, A., Kania, A., Rosa-Casillas, M., Basbaum, A. I. Long-term optical imaging of the spinal cord in awake behaving mice. Nat Methods. 21 (12), 2363-2375 (2024).
  28. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760(2012).
  29. Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T., Ito, S. In vivo two-photon imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model. Eur J Neurosci. 41 (7), 989-997 (2015).
  30. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  31. Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 88 (10), 582-595 (2012).
  32. Luo, W., Enomoto, H., Rice, F. L., Milbrandt, J., Ginty, D. D. Molecular identification of rapidly adapting mechanoreceptors and their developmental dependence on Ret signaling. Neuron. 64 (6), 841-856 (2009).
  33. Neubarth, N. L., et al. Meissner corpuscles and their spatially intermingled afferents underlie gentle touch perception. Science. 368 (6497), eabb2751(2020).
  34. Bai, L., et al. Genetic Identification of an Expansive Mechanoreceptor Sensitive to Skin Stroking. Cell. 163 (7), 1783-1795 (2015).
  35. Griffin, J. W., Thompson, W. J. Biology and pathology of nonmyelinating Schwann cells. Glia. 56 (14), 1518-1531 (2008).
  36. Tsai, P. F., Chou, F. P., Yu, T. S., Lee, H. J., Chiu, C. T. Depilatory creams increase the number of hair follicles, and dermal fibroblasts expressing interleukin-6, tumor necrosis factor-α, and tumor necrosis factor-β in mouse skin. Korean J Physiol Pharmacol. 25 (6), 497-506 (2021).
  37. Bourane, S., et al. Low-threshold mechanoreceptor subtypes selectively express MafA and are specified by Ret signaling. Neuron. 64 (6), 857-870 (2009).
  38. Jung, Y., Ng, J. H., Keating, C. P., Senthil-Kumar, P., Zhao, J. Comprehensive evaluation of peripheral nerve regeneration in the acute healing phase using tissue clearing and optical microscopy in a rodent model. PLoS One. 9 (4), e94054(2014).
  39. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606 (7912), 137-145 (2022).
  40. Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Exp Dermatol. 26 (5), 379-383 (2017).
  41. Meleshina, A. V., et al. Multimodal label-free imaging of living dermal equivalents including dermal papilla cells. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 84(2018).
  42. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصوير ثنائي الفوتون داخل الحيوية لشكل المحاور الحسية باللمس في جلد الفأر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.