تقدم هذه الدراسة نهج تصوير فوتوني في الجسم الحي ، لرؤية هياكل نهايات محاور المستقبل الميكانيكية منخفضة العتبة (LTMR) في جلد مخلب الفئران الأمامي. باستخدام تصوير متكرر وعالي الدقة للمحاور العصبية الفردية، توفر هذه الطريقة منصة جديدة لدراسة بنية ووظيفة الدائرة الحسية الجلدية أثناء التطور وفي البالغين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير ثنائي الفوتون داخل الحيوية لشكل المحاور الحسية باللمس في جلد الفأر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المستقبلات الميكانيكية منخفضة العتبة (LTMRs) هي خلايا عصبية حسية جسدية تكتشف محفزات اللمس الضوئي غير الضارة مثل الاهتزاز، انحراف الشعر، والضغط. تشكل هذه النواحي طرفيات محورية محددة بأنواع فرعية في الأطراف وتسقط محاور محورية مركزية نحو الحبل الشوكي لنقل المعلومات اللمسية. الفهم الحالي لتطوير وتنظيم LTMR يأتي من أنسجة ثابتة لا يمكنها الكشف عن العمليات الديناميكية والزمنية للأسلاك المحورية وإعادة التشكيل. هنا، يتم تقديم طريقة تصوير بفوتونين لتصوير شكل المحاور العصبية LTMR في مخلب الفأر الأمامي أثناء التطور وعند البالغين. يمكن للمجهر ذو الفوتونين تحقيق تصوير عالي الدقة داخل الجلد السليم، مما يتيح التصوير المتكرر لنفس الأطراف المحورية عبر نقاط زمنية ما بعد الولادة. يمكن دمج التصوير بفوتونين مع أدوات جينية جديدة للفئران لكشف تطور المحاور العصبية مع خصوصية النوع الفرعي. يتيح التصوير المزمن لحالات LTMR دراسات حول تجميع وإصلاح الدوائر بعد الإصابة. توفر هذه الأساليب نظاما في الجسم الحي يوفر رؤى جديدة حول الآليات الخلوية التي تنظم تطور وتجدد المحاور الحسية الجسدية.
المقدمة
اللمس هو أول حاسة تتطور وتلعب دورا مركزيا في كيفية تجربة الكائنات الحية واستجابتها للعالم المادي. يتم اكتشاف اللمس بواسطة مستقبلات ميكانيكية منخفضة العتبة (LTMRs)، وهي أنواع فرعية من خلايا العقدة الجذرية الظهرية (DRG) التي تكتشف المحفزات الميكانيكية غير الضارة، بما في ذلك الانبعاجات، والاهتزاز، وانحراف الشعر 1,2. ال LTMRs هي أحادية القطب الكاذبة وتمتد المحاور الطرفية إلى الأنسجة الطرفية لتشكيل أطراف خاصة بأنواع فرعية. تنقل محاورها المركزية المعلومات اللمسية إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال تكوين اتصالات مشبكية مع خلايا عصبية الحبل الشوكي3. ومع ذلك، فإن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للوائح رعاية المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) في جامعة فاندربيلت. لأجل سلامة المجربين، تم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام معاطف مختبر، وقفازات معقمة، وأقنعة. تم تعقيم جميع الأدوات جيدا قبل الاستخدام، وتم تنظيف جميع الأسطح التجريبية بنسبة 70٪ إيثانول قبل وبعد كل تجربة. كانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من المراهقين البالغة من كلا الجنسين، وكانت مشتقة من سلالات Thy1-YFP وTrkBCreER وAi140. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. إعداد الأدوات
- شغ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا العمل، تم استخدام المجهر ذو الفوتونين لرؤية هياكل المحوريات Aβ RA-LTMR وAδ-LTMR في الجلد أثناء النمو وعند البالغين. النهايات الرمحية الناضجة، التي تظهر في الفئران في اليوم العشرين بعد الولادة فما فوق، تكون مكتملة النمو19,32. تم تصوير التنظيم العام لنهايات المحاور العصبية في الجلد المشعر للفئران البالغة، كما هو موضح في الإسقاط القصوى للشدة (الشكل 2A). يمكن عرض عمق وشكل هذه الأطراف المحاور العصبية باستخدام إعادة بناء ثلاثية الأب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تظهر هذه الدراسة استخدام المجهر ذو الفوتونين لفحص شكل الميكروفون طويل الأمد في الجلد السليم للفئران حديثة الولادة والبالغين. يتغلب هذا النهج الطولي على قيود تثبيت الأنسجة ويتيح الملاحظة الفورية لهياكل المحورية في الأنسجة السليمة. تتوافق أشكال المحور المحوري Aβ RA-LTMR وAδ-LTMR التي تم رؤيتها من خلال تصوير فوتونين مع الملاحظات من الأنسجة المثبتة في PFAالسابقة 2,6,7,19,33,34.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون لا يذكرون أي إفصاحات ذات صلة.
شكر وتقدير
نود أن نشكر الدكتورة هانا إيلام، الدكتورة سنيغدا موكيرجي، راشيل لاريفي، والدكتورة تيجي ج. فاداكان على كل دعمهم ومساعدتهم طوال هذا البحث. نشكر رايان مايكل نيورا على مساعدته في إعداد نظام الإيزوفلوران. يدعم هذا العمل زمالة هانا غراي في معهد هوارد هيوز الطبي (منحة# GT17518).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| عدسة 20x Objective & ndash; سوبر NA 1.0 | أوليمبوس | 1-U2B965 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| غطاء 22x60 | VWR | 16004-330 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| طين النمذجة بالتقسية الهوائية | DAS | إعداد المجهر ذو الفوتونتين | |
| مضخة هواء تخدير (HF)، 110 فولت | شركة RWD لايف ساينس إنك. | R510-30 | نظام الإيزوفلوران |
| قناع التخدير المركزي | شركة RWD لايف ساينس إنك. | R510-M | نظام الإيزوفلوران |
| غرفة التخدير التحفيزي – الفأر والجرذ | شركة RWD لايف ساينس إنك. | V105 | نظام الإيزوفلوران |
| محقق بروكر ألتيما بالإضافة إلى المجهر الماسح بالليزر | بروكر نانو، إنك. | إعداد المجهر ذو الفوتونتين | |
| إبر الفراشة | فيشر ساينتيفك | 1484041 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| كاميرا Chameleon Discovery NX مع TPC: Dual | متماسك | 1385777 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| قناع مخروطي مع أنابيب للفئران حديثة الولادة | شركة RWD لايف ساينس إنك. | 68680 | نظام الإيزوفلوران |
| مرشحات انبعاث مزدوجة (et525/70m و et595/50m) و t565lpxr مقسم الشعاع ثنائي اللون | نيكون | INVP-01 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| مجموعة مرشح الفلورة ET-GFP ET470/40x و ET252/50m؛ ديكرويك T495LPXR | نيكون | 518065 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| الإيثانول | مختبرات ديكون المحدودة | إعداد المجهر ذو الفوتونتين | |
| لوحة تسخين الأشعة تحت الحمراء البعيدة مع وحدة تحكم (تيار متردد) | كنت ساينتفيك | RT-0515 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| كواشف GaAsp (2) | فوتونكس هاماماتسو | HED-UP-2 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| عبوات فلتر الغاز | شركة RWD لايف ساينس إنك. | R510-31-6 | نظام الإيزوفلوران |
| شحم الفراغ العالي | سيغما ألدريتش | Z273554 | نظام التصوير |
| إيزوفلوران، USP (250 مل) | العناية المركزة بيرامال | 6679-017-25 | نظام الإيزوفلوران |
| صندوق الغطاء الليزر | تيكو تكنولوجي | نظام التصوير | |
| الفئران: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/J | جاكس | 27214 | |
| الفئران: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/J | جاكس | 30220 | |
| الفئران: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | نهر تشارلز | 3709 | |
| كريم مزيل الشعر ناير | أمازون | 28001 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| ملفات البيانات الخام | زينودو | 10.5281/zenodo.17370834 | |
| حامل صلب مع حامل إدخال مستطيل كبير | ثورلابز | MP15M | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
| منصة عمليات تخدير الصغيرة | شركة RWD لايف ساينس إنك. | R510-PGL | نظام الإيزوفلوران |
| مرهم العين المهدئ | بوش + لومب | إعداد المجهر ذو الفوتونتين | |
| شرائح المجهر سوبرفروست بلس | فيشر ساينتيفك | 12-550-15 | إعداد المجهر ذو الفوتونتين |
المراجع
- Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
- Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
- Meltzer, S., Santiago, C., Sharma, N., Ginty, D. D.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
