Method Article

عزل وقياس mRNA المحوري باستخدام إدخالات الغشاء المسامي وRTddPCR

DOI:

10.3791/69601

⸱

February 6th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة طريقة قوية لعزل mRNA المحوري باستخدام إدخالات غشاء مسامي، مما يمكن الفصل الكلي بين الخلايا العصبية والعصبية وتنقية الحمض النووي الريبي. بالاقتران مع RTddPCR، يسمح هذا النهج بالقياس المطلق للنسخ منخفضة النسخ، مما يسهل دراسات نقل mRNA والترجمة المحلية ذات حساسية عالية وقابلية تكرار وتطبيق تجريبي واسع.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الديناميكيات المكانية لتحديد موقع وترجمة mRNA داخل الخلايا العصبية ضرورية لآليات مختلفة لوظيفة الخلايا العصبية، بما في ذلك الاتصال العصبي، واللدونة المشبكية، والاستجابة للإصابة. نظرا للقطبية الشديدة للخلايا العصبية، تعتمد العديد من هذه الوظائف على قدرة المحاور العصبية على ترجمة نسخ محددة محليا. ومع ذلك، لا يزال قياس هذه التجمعات من الحمض النووي الريبي تحت الخلوي تحديا تقنيا. هنا، نصف نهجا قابلا للتكرار للحصول على أقسام جسدية ومحورية منفصلة من خلايا القوارض المزروعة ولقياس تعبير mRNA الخاص بكل قسم. تم زراعة الخلايا العصبية الجنينية أو البالغة للقوارض الأولية على إدخالات تحتوي على غشاء مسامي بحجم 1-3 ميكرومتر. هذه الأغشية تسمح فقط بالمحاور، مما يسمح بالفصل الفيزيائي بين الأقسام الجسدية والمحورية. ثم تم عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية بالكامل والكسور الغنية بالمحاور بشكل منفصل، والتي استخدمت لاحقا في اختبار تفاعل تفاعلي مع قطرات النسخ العكسي (RTddPCR) مع بادئات جينية محددة. يقدم هذا النظام مقارنة كمية مطلقة بين الأقسام تحت الخلية، مما يتيح الكشف عالي الحساسية للنسخ الموضعية. يقيس هذا النهج وفرة الحمض النووي الريبي المستقر ويسهل فحص التغيرات العصبية العصبية مع مرور الوقت استجابة للعوامل العصبية التغذية أو الإجهاد أو نماذج الإصابة. يقلل الجمع بين التقسيم الفيزيائي وتحليل RTddPCR من التلوث المتبادل ويعطي أرقام نسخ دقيقة للنسخ النادرة، مما يوفر حساسية عالية، وقابلية للتكرار، واكتشاف mRNA منخفض العدد الذي يتحكم في نمو المحاور وتجددها. تعمل هذه الطريقة أيضا مع الاختبارات اللاحقة، مثل قياس تخليق البروتين، ودراسة استقرار الحمض النووي الريبي، وإجراء تجارب الاضطراب باستخدام siRNA أو أدوية تحجب بروتينات معينة. ومن المهم أن هذه التقنية يمكن تكييفها لأنواع عصبية فرعية مختلفة، أو مراحل تطور، أو نماذج إصابة. بشكل عام، يعد هذا النهج طريقة مرنة وحساسة وقابلة للتكرار لدراسة الأساس الجزيئي لتحديد موقع mRNA المحوري وكيف يؤثر على وظيفة الخلايا العصبية وآليات الأمراض.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية هي واحدة من أكثر الخلايا تعقيدا واستقطابا في علم الأحياء. لديها عمليات طويلة قد تصل أحيانا لمسافات تتجاوز مترا. هذا القطب يعقد التواصل الخلوي وتوازن البروتينات بطرق مختلفة. نهج متقن لتلبية هذه المتطلبات هو نقل mRNA إلى أقسام بعيدة مثل المحاور العصبية والتغصن، مما يسهل ترجمتها بطريقة منظمة استجابة للإشارات المحلية 1,2,3. تمكن الترجمة المحلية المحاور العصبية من تصنيع البروتينات بطريقة مكانية وزمانية. تعد هذه العملية ضرورية لتطور المحور، واللدونة المشبكية، والتجدد بعد الإصابة، والاستجابة للمحفزات التطورية وخارج الخلية 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

القدرة على تحليل وظائف mRNA الموضعي في المحاور العصبية ضرورية لفهم أدوارها في كل من الوظائف العصبية الطبيعية وفي سياق الفيزيولوجيا المرضية. تم ربط خلل تنظيم ترجمة mRNA المحوري بأمراض تنكسية عصبيةمختلفة 16، مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS)17،18،19، ضمور عضلات الشوك (SMA)20،21، ومرض الزهايمر (AD)22. يعتمد تجدد المحاور بعد الضرر بشكل كبير على الترجمة السريعة والدقيقة لبروتينات الهيكل الخلوي، والجزيئات الإشارية، والمستقبلات 3,23,24,25,26,27,28. على الرغم من هذه المفاهيم الجديدة، لا يزال التخصص يواجه تحديات في قياس والتقاط مجموعات mRNA الخاصة بالمحاور العصبية بشكل فعال.

أحد تحديات علم النسخ المحوري هو جعل ال SOMA والمحاور العصبية تفصل بشكل نظيف. نظرا لأن معظم ال mRNA غنية بالسوما، حتى كميات صغيرة من التلوث من جسم الخلية يمكن أن تؤثر على النتائج عند تقييم محتوى المحاور العصبية لنوع معين من mRNA. توفر التقنيات التقليدية، بما في ذلك الحجرات الميكروفلويدية29، 30، 31، 32 أو غرف كامبينوت33، نموا محوريا اتجاها وفصلا واضحا بين القسمين، لكن العائد المحوري قد يكون منخفضا جدا للدراسات الكيميائية الحيوية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي الجماعي (RNA-seq)، أو التقرب المناعي المشترك للرنا يليه تسلسل الحمض النووي الريبي، أو تفاعل بوليمراز المتسلسل الكمي (qPCR). رغم فائدتهما في RNA-seq وqPCR، غالبا ما يفتقران إلى الحساسية اللازمة لتحديد النسخ منخفضة النسخ بدقة في المحاور العصفورية، مما يؤدي إلى تقدير خاطئ للأنواع ذات الأهمية الفسيولوجية.

لمعالجة هذه التحديات، استخدمنا نحن وآخرون إدخالات غشية منفذة للفصل الفيزيائي بين المحاور العصبيةوالسوماتا 34، 35، 36، 37، 38، 39، 40، 41. تسمح هذه الإدخالات بتطوير الخلايا العصبية على سطح دقيق المسام، ويمكن للمحاور العصبية أن تمتد إلى الحجرة السفلية من خلالها، لكن ليس السوما. هذه البنية الأساسية والفعالة تتيح زراعة عدد هائل من الخلايا العصبية مع فصل فيزيائي واضح بين السوما والمحاور العصبية. تعد الطريقة المعتمدة على الغشاء مهمة لأنها تتجنب المشاكل التقنية التي تأتي مع الأجهزة الميكروفلويدية وتوفر كميات كبيرة من المادة المحورية التي يمكن استخدامها في الدراسات الجزيئية والكيميائية الحيوية. نظام الإدخال سهل الاستخدام أيضا لحالات مثل الإصابات الميكانيكية، مما يجعله مفيدا في العديد من البيئات التجريبية المتعلقة بالإصلاح العصبي. الطريقة الموضحة هنا تحسن إنتاجية ونقاء الخلايا العصبية بشكل أكبر من خلال تحسين ظروف الزراعة، وتعديل خصائص مسام الغشاء، ودمج التحقق المعتمد على التحقق الرقمي من قطرات الرسم العكسي (RTddPCR) لعينات RNA محورية منخفضة الإنتاجية.

من المهم أيضا التأكد من أن الكسور المحورية نقية. نستخرج المحاور العصبية من الحجرة السفلية فقط بعد إزالة أي مادة جسدية متبقية من السطح العلوي بعناية. يظهر التحقق من صحة البادئات إثراء قويا للعلامات المحورية وعدم وجود علامات جسدية أو لا تذكر. يعزز التأكيد الجزيئي هذا التمييز: تكسر المحور العصبي غنية ب mRNA محوري معترف به مثل Gap43، وتعبير أقل ل Actγ42. هذا يوضح أن نظام الإدخال يصنع عينات محورية تحتوي على محتوى ضئيل من السوما، وهي جيدة لمزيد من الفحص.

بعد عزل الكسور المحورية المحورية المخصية، تكمن العقبة التالية في قياس mRNA الموجودة بأعداد نسخ منخفضة جدا. المادة المبتدئة القليلة من الكسور المحورية ووجود mRNA ذات عدد نسخ منخفض في المحاور تدفع حدود حساسية PCR الكمي التقليدي للنسخ العكسي (RT-qPCR)، الذي يستخدم منحنيات قياسية للتكميم. علاوة على ذلك، لا يوفر RT-qPCR أرقام النسخ المطلقة لنص معين. أما RTddPCR، فيفصل عينات cDNA إلى آلاف القطرات، مما يساعد في الحصول على عدد دقيق من النسخ باستخدام إحصائيات بواسون. وهذا يجعل من الممكن العثور على النسخ بشكل موثوق حتى لو كانت هناك نسخ قليلة فقط من النسخ في نانوغرام واحد من إجمالي RNA 5,6,7,43.

في هذه المخطوطة، نقدم نهجا مبسطا يشمل طرقا لزراعة خلايا عصبية مختلفة من القوارض البالغة أو الجنينية على الإدخالات، وعزل الحمض النووي الريبي من الأقسام العصبية الكاملة مقابل الأقسام المحورية المحورية، وفحص نقاء المحور، والقياس المطلق المعتمد على RTddPCR لنسخ mRNA. يمكن استخدام هذه الطرق لتحديد مستويات mRNA المحددة، التي تتركز في المحاور تحت الظروف القاعدية، وكيف تتغير أثناء القطع المحوري أو استجابة لتحفيز عوامل النمو أو الإشارات السامة العصبية. من خلال دمج هذه الطريقة مع التفاعلات المناعية المشتركة للبروتين، يمكن أيضا تقييم ديناميكيات مركبات البروتينات النووية الريبية (RNP) في المحاور العصفورية. على سبيل المثال، استخدمنا هذه الطريقة بشكل مكثف لدراسة الحمض النووي الريبي المتعدد (mRNAs)، التي توجد في حبيبات البروتين 1 (G3BP1) التفاعلية مع البروتين النشط بإزاز Ras GTPase المحوري. G3BP1 هو مكون أساسي في حبيبات الإجهاد44، وقد أظهرت دراساتنا السابقة أنه يعيق تخليق البروتين المحوري ويؤدي إلى تثبيته بدوره على تجدد المحاور العصبية5 لكل من PNS وCNS. علاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة دور اختلال تنظيم الترجمة المحوري في مختلف الحالات الفسيولوجية المرضية، بما في ذلك ALS، وSMA، وAD.

هدف هذه الدراسة هو إنشاء واختبار طريقة لقياس mRNA المحوري تكون حساسة، قابلة للتكرار، وقابلة للتوسع. من خلال دمج الثقافات المقسمة القائمة على الإدراج مع القياس القياسي القائم على RTddPCR، نوفر للمجال حلا للمشاكل المستمرة في الترجمة المحورية. لن تمكن هذه المنهجية فقط من اكتشافات أساسية حول الترجمة المحلية، بل ستؤسس أيضا أساسا للتحقيقات الترجمية التي تركز على التدخلات العلاجية في إصلاح الأعصاب والتنكس العصبي.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الإدخالات لزرع الخلايا

  1. ضع الفتحات ذات الحجم المناسب في صفيحة ذات 6 آبار.
    ملاحظة: استخدم حجم مسام 1 ميكرومتر لفصل المحاور العصبية عن السوما وحجم مسام 3 ميكرومتر لفصل جميع الأعصاب (المحاور والتغصن) عن السوما.
  2. أضف 100 ميكروغرام/مل بولي-إل-ليسين (PLL) إلى صفيحة الستة آبار بحيث تلامس أسفل الإدخالات، وإلى أعلى الإدخالات (2 مل/بئر و1 مل/إدخال).
  3. حضن الحوض طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  4. اغسل الآبار (أسفل الفتحات) وأعلى الفتحات بماء فائق نقي معقم - 4 غسلات × 5 دقائق.
  5. بالنسبة لعصبات العقدة الجذرية الظهرية (DRG) فقط، أضف 5 ميكروغرام/مل لامينين (2 مل/بئر و1 مل/إدخال) وحضانة لمدة ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. تأكد من أن الجزء العلوي والسفلي من الإدخال مغطيان بشكل متساو.
  6. اغسل بمحلول ملحي معقم مع فوسفات (PBS) (درجة حموضة 7.4) يحتوي على 100 U/mL بنسلين/ستريبتوميسين - غسلتان × 5 دقائق.
  7. تابع التشريح وزرع حوالي 1 × 106 خلايا/إدخال، للخلايا العصبية القشريةالجنينية 5، الحصين45، والخلايا العصبية الأساسية في الدماغ الأمامي31,32. بالنسبة لأقراص DRG البالغة للفئران، استخدم لوحة 6-8 DRGs/الإدخال 5,7 (الشكل 1).

2. جمع الكسور تحت الخلوية العصبية من إدخالات ذات 6 آبار

  1. أليكوت 250 ميكرولتر من ترايزول في كل أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل لكل إدخال وبئر/إدخال واحد من صفيحة ذات 6 آبار. احتفظ بالأمر جانبا.
  2. في صفيحة أخرى ذات 6 آبار، أضف 2 مل/بئر من PBS المعقم. يجب أن يكون عدد الآبار/الصفائح متناسبا مع عدد الإدخالات.
  3. يتم سحب وسائط الزراعة من أعلى وأسفل الإدخال ونقل الإدخال إلى صفيحة ذات 6 آبار تحتوي على PBS.
  4. باستخدام الملقط، ضع الإدخال بلطف وأضف 2 مل من PBS فوق الإدخال. استنشق الوسائط من أعلى وأسفل الإدخال وكرر العملية. في المجمل، اغسلها مرتين ب PBS واتركها في PBS جديدة (1 مل و2 مل في أعلى وأسفل الإدخال على التوالي).
  5. عزل الجزء الكامل من الخلايا العصبية
    1. باستخدام مكشطة خلايا معقمة، قم بكشط الجزء الكامل من العصبون (أعلى الإدخال). اضغط ضغطا كافيا فقط لتبدأ الخلايا في الانفصال، لكن الغشاء لا ينكسر (الشكل 1).
    2. اجمع العصبون بالكامل من الإدخال وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    3. قم بجهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 10000-15000 جرام لمدة دقيقتين.
    4. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الليزات في 250 ميكرولتر من تريزول.
    5. ضع علامة على هذا الأنبوب كجزء كامل من الخلايا العصبية.
    6. تابع جمع كسور العصابات.
  6. عزل جزء العصبيات
    1. خذ مسحة قطنية معقمة، وباستخدام أحد الطرفين، تحرك بنمط متعرج من الأعلى إلى الأسفل ببطء شديد على جانب الخلايا العصبية بأكمله. قم بتدوير الإدخال 90 درجة وكرر العملية مع الطرف الآخر من المسحة (إذا كنت تستخدم مسحة ذات وجهين، أو استخدم مسحة جديدة لقطعة واحدة من الوجه). تخلص من هذه المسحة (الشكل 1).
    2. استخدم مسحة جديدة وحرك في دوائر متحدة المركز، بدءا من منتصف الإدخال وإلى الخارج. تأكد أيضا من تنظيف الجدران (المحيط).
    3. اقلب إدخال الغشاء (جانب العصابة مواجها للأعلى) واقطع الغشاء باستخدام شفرة مشرط معقمة جديدة أثناء تثبيتها بالملقط. تأكد من ترك ~2-3 مم في المحيط.
    4. ضع الغشاء المقطوع في لوحة ذات 6 آبار تحتوي على تريزول بحيث يكون جانب العصبيون مواجها للأسفل. تأكد من أن الباب مغمور.
    5. اجمع ترايزول الذي يحتوي على ليزات العصبون من صفيحة الستة آبار وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
  7. بالنسبة لكل من العصبون العصبي الكامل والمحللات العصبية، يرجى البدء في عزل الحمض النووي الريبي أو حفظ المحللات عند -80 درجة مئوية لمعالجتها لاحقا.

3. عزل وقياس الحمض النووي الريبي

  1. عزل الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: بالنسبة لهذا الجزء، اعمل دائما في بيئة خالية من RNase مع أدوات بلاستيكية ومعقمة وقفازات مخصصة.
    1. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من تريزول، ثم اهز بقوة لمدة 15 ثانية، ثم حضن لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ليتم فصلها إلى طبقات: عضوية، وبين الطور، ومائية (تحتوي على RNA).
    2. انقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد، متجنبا الطور الداخلي. لترسيب الحمض النووي الريبي، أضف حجما واحدا من الإيزوبروبانول وامزجه بلطف. حضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (أو لفترة أطول عند -20 درجة مئوية لزيادة الإنتاجية) لترسيب RNA. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لتسخين RNA.
    3. تخلص من المادة الفائقة واغسل الحبيبة ب 1 مل من الإيثانول 75٪. دوامة وطرد مركزي لفترة وجيزة عند 7,500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. إذابة RNA: قم بإزالة غسول الإيثانول بعناية وجفف الحبيبة بالهواء لمدة 5-10 دقائق، لتجنب الجفاف التام. أعد تعليق الحبيبة في حجم صغير من الماء الخالي من RNase أو 1x من محلول Tris-EDTA (TE)، مع حضانها عند 55-60 درجة مئوية للذوبان الكامل. خزن الحمض النووي الريبي المنقى عند -80 درجة مئوية.
  2. قياس كمية الحمض النووي الريبي باستخدام اختبار ريبو جرين
    ملاحظة: اختبار RiboGreen (أدناه) يستخدم صبغة فلورية مخصصة للأحماض النووية، مما يوفر حساسية وخصوصية أعلى وقدرة على اكتشاف الحمض النووي الريبي السليم مقارنة بطرق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. فكر في علاج DNase إذا كان تلوث الحمض النووي يمثل مشكلة.
    1. جهز 1x TE buffer، وتخفيف 20x TE المخزن المقدم 20 مرة بماء خال من RNase. حضر حلول عمل ريبو جرين واحم الصبغة الحساسة للضوء باستخدام ورق الألمنيوم. قم بتخفيف الصبغة المركزة بمقدار 1:200 في 1x TE للاختبار عالي النطاق (10 ng/mL-1 μg/mL)، أو 1:2000 في 1x TE للاختبار منخفض النطاق (2.5 ng/mL-50 ng/mL). إعداد معايير RNA عن طريق تخفيف تسلسلي لمعيار RNA الخاص بالمجموعة ب 1x TE لتغطية نطاق العينة المتوقع. شغل المعايير بثلاث نسخ.
    2. تحضير العينات عن طريق تخفيف عينات RNA في 1x TE لتناسب النطاق الديناميكي للاختبار. شغل العينات بثلاث نسخ.
    3. أضف كميات متساوية من محلول العمل RiboGreen ومعيار RNA أو عينة (مثلا 100 ميكرولتر لكل منهما). حضن لمدة 2-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، محميا من الضوء. قس الفلورة باستخدام الإعدادات المناسبة (الإثارة ~500 نانومتر، الانبعاث ~525 نانومتر). قس واطرح قراءة فارغة للكاشف (1x صبغة TE + ريبو جرين).
    4. تحليل وقياس الكم: رسم منحنى قياسي باستخدام قيم الفلورة للمعايير مقابل تركيزاتها. استخدم هذا المنحنى لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي في العينات (الشكل 2).

4. تخليق cDNA

  1. قم بإذابة جميع المكونات على الجليد. اخلط كل أنبوب بلطف عن طريق التحريك والدوران للأسفل لفترة وجيزة قبل الاستخدام. في أنبوب PCR على الجليد، اجمع المكونات التالية لكل تفاعل:
    خليط RT Master (5x): 4 ميكرولتر
    عينة RNA: متغير (حتى 1 ميكروغرام RNA كلي)
    الماء الخالي من النوكلياز: حتى 20 ميكرولتر من الحجم الكلي
    ملاحظة: بالنسبة للتحكم بدون قالب (NTC)، استبدل عينة RNA بماء خال من النوكليز.
  2. اخلط الأنابيب بلطف ولف لجمع المحتويات في الأسفل وشغل برنامج الدراجة الحرارية.
    التلدين بالبرايمر: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين
    تخليق cDNA: 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق
    تعطيل الحرارة: 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة

5. تصميم والتحقق من المبادئ

ملاحظة: تصميم بادئات RTddPCR يتبع عادة نفس مبادئ qPCR الكمي، لكنه يتطلب اهتماما إضافيا لضمان فصل واضح بين القطرات الموجبة والسالبة. استخدم أدوات تصميم البرايمر من NEB أو IDT أو ThermoFisher لتسهيل هذه العملية. يعرف اختبار RTddPCR الناجح بخصوصية عالية وتضخيم قوي، مما يولد فصلا واضحا بين القطرات المضخمة (الإيجابية) وغير المضخمة (السلبية). تم استخدام معرفات الوصول التالية ل NCBI RefSeq لتصميم بادئات PCR:

التمثيل: NM_001127449.1
الهجوم 1: CAGTCTAACAGGGTGGGAAG
العكس 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
طول المضخم: 98
الهجوم 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
الرجوع إلى الخلف 2: GACTTTCCCCCCCTGTTAGAC
طول المضخم: 118

Gap43: NM_017195.3
الهجوم 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
الرجوع 1: GACTCCTCAGAACGGAAC
طول المضخم: 122
الهجوم 2: CAGTCATCTTGGGAATTTTCTTGC
الوجه الخلفي 2: CATTGCACACACACTTGG
طول المضخم: 116

  1. صمم برايمر بطول موصى به من 18-30 زوج قاعدة ومحتوى GC بين 40-60٪. تأكد من أن درجة الانصهار (Tm) تنخفض بين 55-65 درجة مئوية، وأن يكون البرايمران الأمامي والخلفي ضمن 2-5 °م من بعضهما البعض. أضف مشبك GC، وقاعدة أو قاعدتين G أو C ضمن آخر خمس قواعد في نهاية 3 أقدام لتعزيز خصوصية الربط، مع تجنب الفترات الطويلة من G أو C.
  2. التحقق من خصوصية البادئية باستخدام أدوات المحاذاة مثل أداة البحث المحلية الأساسية للمحاذاة (BLAST) التابعة للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) لضمان ارتباط البادئات فقط بالتسلسل المستهدف المقصود. المضخمات التصميمية تتراوح بين 50-200 زوج قاعدة، مع ~100 زوج قاعدة كأفضل الحالات، حيث تضخم المنتجات الأقصر بكفاءة أكبر مع بقائها قابلة للتمييز عن الدايمر-الأساسي.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، عادة ما يتم تضخيم منتجات PCR القصيرة بكفاءة أعلى من المنتجات الأطول في RT-ddPCR.
  3. قلل من الدايمرات البرايمرية عن طريق تصميم بادئات تحتوي على 50-60٪ من GC، وتجنب الهياكل الثانوية، والتكامل بطول 3'. أثناء التحقق من صحة البرايمر، استخدم الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز، واستخدم دائما نظام التحكم بدون قالب لتقييم الديمرات البرايمر.
  4. تجنب تصميم البادئات في مناطق من القالب ذات احتمالية عالية لتكوين هياكل ثانوية، لأن ذلك قد يؤثر على كفاءة التضخيم.

6. RTddPCR

ملاحظة: استخدم نظام QX200 ddPCR (Bio-Rad) لإجراء RTddPCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وكما وصف سابقا Das وآخرون (2022)43، مع بعض التعديلات الطفيفة لتحسين قابلية تكرار الاختبار.

  1. جهز تفاعلات RTddPCR باستخدام خليط عالمي جاهز للاستخدام ddPCR وبادئات خاصة بالهدف باستخدام cDNA مناسب.
  2. توليد القطرات باستخدام مولد القطرات.
  3. اقرأ فلورة النهاية باستخدام قارئ القطرات، وحلل البيانات باستخدام البرنامج المدمج.
  4. استخدم تدابير مراقبة الجودة التالية لضمان القياس الدقيق وتكوين القطرات القابل للتكرار:
    1. شغل مجموعات البرايمر بشكل ثابت في نفس الصف أو العمود لتقليل تأثيرات اللوحة.
    2. جهز خلطات رئيسية لتقليل التوصيل بكميات صغيرة.
    3. استخدم الماصات بمعدل تدفق منخفض لمنع الفقاعات واستخدام الماصات متعددة القنوات لتوزيع عينات بشكل منتظم.
    4. أمسك الألواح بلطف بعد توليد القطرات وأغلق فورا لمنع التبخر.
    5. جهز جميع التفاعلات على الجليد وتجنب دورات التجمد والذوبان المتكررة للمواد الكيميائية.
    6. أضف ضوابط بدون قوالب لكل مبرايمر مخصص لمراقبة التلوث.
    7. استبعد الآبار التي تحتوي على أقل من 10,000 قطرة مقبولة من التحليل.
    8. قم بإجراء نسخ تقنية لجميع العينات لضمان قابلية التكرار.
  5. فحص مخططات سعة فلورة القطرات يدويا للتحقق من دقة العتبة التلقائية.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلتصق الخلايا العصبية القشرية الجنينية الأولية، وخلايا الحصين، وBFCNs المغطاة بإدخالات مغطاة ب PLL بحجم 1 ميكرومتر بقوة وتمدد الأعصاب عبر الغشاء لمدة 5-7 أيام في المختبر (DIV). بحلول 11 DIV، تظهر الثقافات شبكات كثيفة. بالنسبة لجرذان البالغين في DRG، يساعد إضافة طبقة من اللامينين إلى إدخالات 3 ميكرومتر المغطاة ب PLL في تحقيق امتداد محوري مماثل بمقدار 5 DIV. تؤكد هذه الملاحظات قدرة الإدخالات على دعم النمو العصبي طويل الأمد وتوفير مادة محورية كافية لاستخراج الحمض النووي الريبي في المرحلة اللاحقة. في حال الحاجة إلى التكبير، ندمج عدة إدخالات لتوفير المادة الكافية.

استخراج ترايزول من الإدخالات الفردية ينتج كمية كافية من RNA للنسخ العكسي وبعد ذلك ddPCR. يؤكد قياس ريبوجرين نتائج RNA متسقة من كسور الخلايا العصبية الكاملة (212.85 نانوغرام/إدخال) ونتائج أقل من كسور العصبون (42.75 نانوغرام/إدخال) (الشكل 2). عادة ما نحصل على ~5-7 أرعا RNA من كامل جزء الخلية العصبية مقابل الجزء الغني بالعصبون.

يتم التحقق من صحة جميع البادئات قبل تجارب RTddPCR. لكل نسخة مستهدفة، يتم طلب واختبار مجموعتين على الأقل من البادئات باستخدام PCR التقليدي على cDNA المولدة من نفس العينات العصبية. يتم اختيار زوج البرايمر الذي ينتج أقوى وأقدر نطاق محدد ل RTddPCR (الشكل 3A). على سبيل المثال، اخترنا مجموعة البادئات 1 ل Gap43. في حالات النتائج الغامضة، مثل تلك التي تم الحصول عليها في Actγ، نقوم بإجراء PCR تدرج لتحسين درجات حرارة التلدين (الشكل 3B). وهذا يضمن أن البادئات المثبتة جيدا فقط هي التي تستخدم للقياس المطلق، مما يقلل من احتمالية وجود تشوهات في فصل القطرات.

تقوم عملية الكشط وأخذ المسحات بفصل الحجزاء الجسدية والعصب بشكل موثوق. يظهر الحمض النووي الريبي المعزول من كسور العصبون بأكملها إثراء النصوص مثل Actγ46، 47، 48، 49 (الشكل 4). على النقيض من ذلك، تنتج كسور المحاور العصبية RNA إجمالي أقل بشكل ملحوظ، بما يتوافق مع حجمها المحدود، لكنها تظهر إثراء في النسخ المعروفة بأنها تتركز في العمليات البعيدة، مثل Gap43 (الشكل 4). يشير الحد الأدنى من الكشف المتقاطع للنسخ المقيدة بسوما إلى نقاء عالي في المقاطعات عندما يتم التعامل مع الإدخالات بعناية وطلاء بكثافة مثالية.

تتميز النتائج الإيجابية ب: (1) مورفولوجيا عصبية سليمة مع امتداد محوري واضح، (2) فصل نظيف للأقسام دون تمزق الغشاء، (3) بادئات معتمدة تنتج فصلا واضحا بين القطرات الموجبة والسالبة، و(4) إشارات RTddPCR قوية لنسخ المحور. تؤدي التجارب غير المثالية إلى انخفاض عائد RNA، والتلوث المتقاطع الذي تظهره علامات SOMA في كسور العصبية، أو تشوهات RTddPCR مثل زيادة "المطر" في القطرات بسبب تبسيط البرايمر. غالبا ما ترتبط هذه المشاكل بتلف الغشاء المدخل، أو ضغط الكشط المفرط، أو تحسين درجة حرارة التلدين المبكر غير الكافي.

الشكل 1
الشكل 1: نظرة عامة على عزل الحمض النووي الريبي الخاص بكل قسم باستخدام إدخالات الغشاء. تم زراعة خلايا القوارض على إدخالات نصف نفاذة بحجم مسام يتراوح بين 1-3 ميكرومتر، مما يسمح بتمدد العصب مع تقييد السوما. لتحضير الخلايا العصبية بالكامل، تم كشط الخلايا من الحجرة العلوية باستخدام مكشطة خلايا معقمة، ثم تم تزييفها في TRIzol لعزل الحمض النووي الريبي، وتخليق cDNA، وRTddPCR. تمت إزالة الحطام الخلوي المتبقي من الغشاء المضاف باستخدام مسحة قطنية معقمة. لتحضير العصبية، تم قلب الغشاء المدمج الذي يحتوي الآن فقط على الأعصاب وقطعه بشفرة مشرط، وغمره مباشرة في تريزول، تليها عزل الحمض النووي الريبي، وتخليق cDNA، وRTddPCR. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: منحنى تركيز RNA القياسي باستخدام اختبار RiboGreen. (أ) تم قياس شدة الفلورة باستخدام اختبار قياس كمية RNA من RiboGreen عبر سلسلة من معايير التخفيف RNA. كشف تحليل الانحدار الخطي عن ارتباط قوي بين تركيز الحمض النووي الريبي وإشارة الفلورة (R² = 0.9956). القيمة القريبة من واحد تظهر خطية وموثوقية ممتازة لاختبار ريبوجرين لقياس دقيق للحمض النووي الريبي. (B) باستخدام المعادلة (y=19.738x + 14.905) للميل الحاصل في A، تم حساب إجمالي RNA لكل جزء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: التحقق من صحة البرايمر بواسطة PCR والرحلان الكهربائي بجل الأغاروز. (أ) تم حل منتجات تضخيم PCR باستخدام cDNA ل Actγ و Gap43 على هلام أجاروز بنسبة 2٪ لتقييم خصوصية البرايمر. لكل جين، تم اختبار مجموعتين مستقلتين من البرايمر (المجموعة 1 والمجموعة 2). تظهر علامات حجم الحمض النووي (السلالم) في المسارات المجاورة مع تحديد الأوزان الجزيئية (10 كيلوبايت، 0.5 كيلوبايت، 0.1 كيلوبايت). تؤكد النطاقات الفردية المميزة بالحجم المتوقع نجاحا في التضخيم وخصوصية مجموعات البادئات المختارة. (ب) تم إجراء تضخيم PCR باستخدام مجموعة بادئات Actγ 2 عبر تدرج درجة حرارة (55-65 °م) لتحديد درجة حرارة التلدين المثالية. تم حل المنتجات المضخمة على جل أغاروز بنسبة 2٪ بجانب سلم حمض نووي (المسار 2، الأحجام المحددة). لوحظت نطاقات فردية متسقة بالحجم المتوقع عبر النطاق المختبر، حيث تم اكتشاف أقوى تضخيم عند 55 درجة مئوية، مما يشير إلى أنها درجة الحرارة المثلى لهذه المجموعة التمهيدية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4
الشكل 4: تحليل RTddPCR للنسخ المختارة وقياس نسخ mRNA. (A,B) مخططات سعة أحادية البعد تمثيلية تظهر فصل القطرات ل (A) Actγ، و(B) Gap43. كل نقطة تمثل قطرة واحدة، حيث تشير القطرات الزرقاء إلى تضخيم إيجابي وقطرات رمادية تشير إلى تضخيم سلبي. يمثل المحور Y السعة، ويمثل المحور X موقع البئر في لوحة ddPCR. يؤكد الفصل الواضح بين القطرات الموجبة (الزرقاء) والسالبة (الرمادية) الكشف القوي للنصوص المستهدفة باستخدام مجموعات البادئات المشار إليها. (ج) جدول يلخص عدد النسخ/μL والنسخ لكل ng من إجمالي RNA لنسخ Actγ وGap43 في كسور الخلايا العصبية والعصبية الكاملة. تم الحصول على تقديرات عدد النسخ من القياس المطلق باستخدام عدد قطرات ddPCR (الموضحة في اللوحات A و B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك عدة خطوات ضرورية لإمكانية التكرار. يجب أن يكون الطلاء المدمج موحدا لتعزيز التصاق الخلايا العصبية؛ الطلاء غير الكامل يؤدي إلى نمو ضعيف للعصبية/المحور. كثافة طلاء الخلايا مهمة بنفس القدر، لأن الكثافة الزائدة تزيد من التداخل التغصني، بينما الطلاء المتناثر ينتج RNA محوري غير كاف. يجب تنفيذ تسلسل الكشط والمسح بدقة: الضغط المنخفض يترك تلوثا جسديا، بينما الضغط الزائد قد يتسبب في تلف الإدخال.

يمثل التحقق من صحة البادئية خطوة حاسمة أخرى. تشغيل مجموعتين مستقلتين من البرايمر لكل نسخة يسمح باختيار الزوج الأكثر موثوقية، بينما يمكن لاختبار PCR التدرج أن يحسن درجات حرارة التلدين. تقلل هذه الممارسة من تكوين البرايمر-دايمر، وتزيد من وضوح القطرات، وتضمن قابلية التكرار الكمية عبر النسخ البيولوجية. بينما يحقق هذا النهج نقاء طبقي عالي، لا يمكن استبعاد التلوث النذري من المادة الجسدية بالكامل. إنتاجية الحمض النووي الريبي المحوري منخفضة بطبيعتها، مما يحد من نطاق التحليلات التي تتطلب مدخلات عالية، مثل تسلسل النسخ الكامل للنسخ. من القيود الحرجة لهذه الطريقة عدم قدرتها على معالجة تحديد موقع النسخ داخل المحاور البعيدة مقابل القريبة. على الرغم من الإبلاغ عن امتدادات الدبقية أو البطانة عبر مسام الغشاء تحت ظروف معينة، إلا أن نظام الزراعة لدينا يقلل من هذا الاحتمال. في زراعة DRG البالغة، فإن إضافة السيتوزين β-D-أرابينوفورانوسيد (Ara-C)5,7 واستخدام الأوساط الخالية من المصل لزراعة الخلايا العصبية الأخرى (القشرية، الحصينية، وBFCNs) تقييد بشكل فعال من تكاثر الخلايا الدبقية والبطانة. بالإضافة إلى ذلك، فإن أغشية البولي كربونات الصلبة أو البولي إيثيلين تيريفثالات (PC/PET) المستخدمة هنا غير مرنة وغير تسمح بهجرة الخلايا النشطة. علاوة على ذلك، نستخدم إدخالات بحجم مسام 3 ميكرومتر لزراعة DRG للسماح بمرور المحاور العصبية ذات القطر الكبير. على النقيض من ذلك، في الثقافات القشرية أو BFCN، نستخدم إدخالات بحجم 1 ميكرومتر، مما يحد أكثر من هجرة الدبقية. تميز هذه الخصائص إعدادنا عن الأجهزة الدقيقة المبنية على PDMS التي تدعم هجرة البطانة عبر مسام مرنة. تماشيا مع التقارير السابقة34، 35، 36، 40، يؤكد التحقق الجزيئي في هذه الدراسة إثراء قوي للنصوص المحورية (مثل Gap43) واكتشاف ضئيل للعلامات الجسدية (مثل Actγ)، مما يدعم خصوصية الخلايا العصبية للمادة التي تعبر الغشاء. وبما أن القيد الفيزيائي لا يلغي هجرة الدبقية بالكامل، يجب على الباحثين أيضا استخدام Gfap كعلامة سلبية.

مقارنة بأجهزة الميكروفلويديك، نظام الإدخال أبسط، وأكثر قابلية للتوسع، ومتوافق مع سير عمل الزراعة الروتينية. يتجنب المعدات المتخصصة مع إمكانية الفصل القابل للتكرار بين المحاور العصبية والسوما. من خلال ربط الإدخالات مع RTddPCR، توفر هذه الطريقة إمكانية الوصول والحساسية العالية، مما يتيح القياس المطلق للنسخ التي غالبا ما تكون أقل من عتبات كشف qPCR. هذا البروتوكول مناسب جدا لاستكشاف التغيرات في تحديد موقع النص المحوري، وتقييم الترجمة المحلية استجابة للمحفزات التنموية أو السامة العصبية أو الإصابات، وكذلك دراسة عيوب نقل الحمض النووي الريبي المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية أو اضطرابات النمو العصبي. قد تشمل التحسينات المستقبلية RTddPCR متعدد الإرسالات لقياس متزامن لعدة mRNAs، أو التكامل مع طرق تسلسل RNA منخفضة الإدخال لتوسيع تغطية النسخ. بالإضافة إلى ذلك، قد يوسع تكييف هذا النظام مع الخلايا العصبية المشتقة من iPSC البشرية تطبيقاته ليشمل نمذجة الأمراض والدراسات التجديدية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمتلك PKS براءات اختراع أمريكية لاستخدام الببتيد النفاذي الخلوي G3BP1 لتجديد المحاور العصبية والتنكس العصبي. المؤلفون الآخرون يصرحون بعدم وجود تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من مركز ميركين لاعتلال الأعصاب الطرفية وتجديد الأعصاب (إلى بي.كيه.إس.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
إدخالات زراعة الخلايا للوحة ذات 6 آبار، 1.0  μ حجم المسام، معقمكورنينغ353102المواد الاستهلاكية
إدخالات زراعة الخلايا لصفيحة ذات 6 آبار، 3.0  μ حجم المسام، معقمسيلتريت230603المواد الاستهلاكية
رافع الخلايا ذو الشفرة الضيقةVWR76036-006المواد الاستهلاكية
ألواح زراعة الأنسجة CELLSTAR 6-WellVWR82050-842المواد الاستهلاكية
صفائح ddPCR 96-Well  بيو-رادي12001925المواد الاستهلاكية
زيت قارئ قطرات ddPCR  بيو-رادي1863004المواد الكيميائية
خرطوشات DG8 لمولد قطرات QX200/QX100بيو-رادي1864008المواد الاستهلاكية
اللامينينجيبكو/فيشر ساينتيفك23017-015المواد الكيميائية
مجموعة LunaScript RT SuperMixNEBE3010Lالمواد الكيميائية
ألواح دقيقة لنظام الفلورة، 96-بئر، أسودثيرمو فيشرM33089المواد الاستهلاكية
ختم حرارة لوحة PCR، ورق ألمنيوم، قابل للثقببيو-رادي1814040المواد الاستهلاكية
بولي-ليسينسيغماP1274المواد الكيميائية
PTC Tempo 96 Thermal Cyclerبيو-رادي12015382المعدات
برمجيات كوانتاسوفتبيو-رادبرنامج تحليل بيانات PCR
كاشف RiboGreen الكمي ومجموعة اختبار RNAثيرمو فيشرR11490المواد الكيميائية
QX200 ddPCR EvaGreen Supermixبيو-رادي1864034المواد الكيميائية
زيت تولد قطرات QX200 لجهاز EvaGreenبيو-رادي1864005المواد الكيميائية
مولد قطرات QX200بيو-رادي17005227المعدات
قارئ قطرات QX200بيو-رادي17005228المعدات
واشع تريزولإنفيتروجين15-596-026المواد الكيميائية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrawal, M., Welshhans, K. Local translation across neural development: A focus on radial glial cells, axons, and synaptogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 717170(2021).
  2. Dalla Costa, I., et al. The functional organization of axonal mRNA transport and translation. Nat. Rev. Neurosci. 22 (2), 77-91 (2021).
  3. Sahoo, P. K., Smith, D. S., Perrone-Bizzozero, N., Twiss, J. L. Axonal mRNA transport and translation at a glance. J. Cell Sci. 131 (8), (2018).
  4. Alber, S., et al. PTBP1 regulates injury responses and sensory pathways in adult peripheral neurons. Sci Adv. 9 (30), eadi0286(2023).
  5. Sahoo, P. K., et al. Disruption of G3BP1 granules promotes mammalian CNS and PNS axon regeneration. Proc Natl Acad Sci. 122 (9), e2411811122(2025).
  6. Sahoo, P. K., et al. A Ca2+-dependent switch activates axonal casein kinase 2α; translation and drives G3BP1 granule disassembly for axon regeneration. Curr Biol. 30 (24), 4882-4895.e6 (2020).
  7. Sahoo, P. K., et al. Axonal G3BP1 stress granule protein limits axonal mRNA translation and nerve regeneration. Nat Commun. 9 (1), 3358(2018).
  8. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359 (6382), 1416-1421 (2018).
  9. Van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  10. Zahavi, E. E., et al. Repeat-element RNAs integrate a neuronal growth circuit. Cell. 188 (16), 4350-4365.e22 (2025).
  11. Rajgor, D., Welle, T. M., Smith, K. R. The coordination of local translation, membranous organelle trafficking, and synaptic plasticity in neurons. Front Cell Dev Biol. 9, 711446(2021).
  12. Oliveira, M. M., Klann, E. A deep dive into local mRNA translation in neurons. Proc Natl Acad Sci. 118 (45), e2117116118(2021).
  13. Sun, C., et al. The prevalence and specificity of local protein synthesis during neuronal synaptic plasticity. Sci Adv. 7 (38), eabj0790(2021).
  14. Castillo, P. E., Jung, H., Klann, E., Riccio, A. Presynaptic protein synthesis in brain function and disease. J Neurosci. 43 (45), 7483-7488 (2023).
  15. Younts, T. J., et al. Presynaptic protein synthesis is required for long-term plasticity of GABA release. Neuron. 92 (2), 479-492 (2016).
  16. Nagano, S., Araki, T. Axonal transport and local translation of mRNA in neurodegenerative diseases. Front Mol Neurosci. 14, 697973(2021).
  17. Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nat Commun. 12 (1), 6914(2021).
  18. Bar Avi, O., Perlson, E. Navigating the pathways: Tar-DNA-binding-protein-43 aggregation, axonal transport, and local synthesis in amyotrophic lateral sclerosis pathology. Neural Regen. Res. 20 (10), 2921-2922 (2025).
  19. Ionescu, A., Altman, T., Perlson, E. Looking for answers far away from the soma-the (un)known axonal functions of TDP-43, and their contribution to early NMJ disruption in ALS. Mol. Neurodegener. 18 (1), 35(2023).
  20. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: The role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  21. Rehorst, W. A., et al. Muscle regulates mTOR dependent axonal local translation in motor neurons via CTRP3 secretion: Implications for a neuromuscular disorder, spinal muscular atrophy. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 154(2019).
  22. Twiss, J. L., Buchanan, C. N. Regulation of subcellular protein synthesis for restoring neural connectivity. Int J Mol Sci. 26 (15), 7283(2025).
  23. Gomes, C., et al. Axonal localization of neuritin/cpg15 mRNA is limited by competition for HuD binding. J Cell Sci. 130 (21), 3650-3662 (2017).
  24. Lee, S. J., et al. hnRNPs interacting with mRNA localization motifs define axonal RNA regulons. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2091-2106 (2018).
  25. Lee, S. J., et al. Selective axonal translation of the mRNA isoform encoding prenylated cdc42 supports axon growth. J Cell Sci. 134 (7), jcs251967(2021).
  26. Merianda, T. T., et al. Axonal amphoterin mRNA is regulated by translational control and enhances axon outgrowth. J Neurosci. 35 (14), 5693-5706 (2015).
  27. Patel, P., et al. Intra-axonal translation of Khsrp mRNA slows axon regeneration by destabilizing localized mRNAs. Nucleic Acids Res. 50 (10), 5772-5792 (2022).
  28. Smith, T. P., Sahoo, P. K., Kar, A. N., Twiss, J. L. Intra-axonal mechanisms driving axon regeneration. Brain Res. 1740, 146864(2020).
  29. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).
  30. Ionescu, A., Perlson, E. Microfluidic neuromuscular co-culture system for tracking cell-to-cell transfer and axonal transport of labeled proteins. Methods Mol Biol. 2431, 145-161 (2022).
  31. Dasgupta, S., et al. Cortical brain injury causes retrograde degeneration of afferent basal forebrain cholinergic neurons via the p75NTR. eNeuro. 10 (8), (2023).
  32. Dasgupta, S., Pandya, M. A., Friedman, W. J. Microfluidic cultures of basal forebrain cholinergic neurons for assessing retrograde cell death by live imaging. Bio-protoc. 15 (1), e5149(2025).
  33. Bi, J., Tsai, N. -P., Lin, Y. -P., Loh, H. H., Wei, L. -N. Axonal mRNA transport and localized translational regulation of κ-opioid receptor in primary neurons of dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci. 103 (52), 19919-19924 (2006).
  34. Hirai, T., et al. Aberrant plasticity of peripheral sensory axons in a painful neuropathy. Sci Rep. 7 (1), 3407(2017).
  35. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  36. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat Cell Biol. 10 (2), 149-159 (2008).
  37. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  38. Brown, K. C., et al. An experimental protocol for the Boyden chamber invasion assay with absorbance readout. Bio Protoc. 14 (15), e5040(2024).
  39. Willis, D. E., Twiss, J. L. Profiling axonal mRNA transport. Methods Mol Biol. 714, 335-352 (2011).
  40. Zheng, J. -Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21 (23), 9291-9303 (2001).
  41. Shigeoka, T., et al. On-site ribosome remodeling by locally synthesized ribosomal proteins in axons. Cell Rep. 29 (11), 3605-3619.e10 (2019).
  42. Sun, Y., Joyce, P. A. Application of droplet digital PCR to determine copy number of endogenous genes and transgenes in sugarcane. Plant Cell Rep. 36 (11), 1775-1783 (2017).
  43. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of circular RNAs using digital droplet PCR. J Vis Exp. (187), e64464(2022).
  44. Desai, M., Gulati, K., Agrawal, M., Ghumra, S., Sahoo, P. K. Stress granules: Guardians of cellular health and triggers of disease. Neural Regener Res. 21 (2), 588-597 (2026).
  45. Agrawal, M., et al. Restoring DSCAM expression rescues neuronal morphology and axon guidance deficits in Down syndrome. bioRxiv. , (2025).
  46. Bassell, G. J., et al. Sorting of β-actin mRNA and protein to neurites and growth cones in culture. J Neurosci. 18 (1), 251-265 (1998).
  47. Moradi, M., et al. Differential roles of α-, β-, and γ-actin in axon growth and collateral branch formation in motoneurons. J Cell Biol. 216 (3), 793-814 (2017).
  48. Willis, D. E., et al. Extracellular stimuli specifically regulate localized levels of individual neuronal mRNAs. J Cell Biol. 178 (6), 965-980 (2007).
  49. Zhang, H. L., et al. Neurotrophin-induced transport of a β-actin mRNP complex increases β-actin levels and stimulates growth cone motility. Neuron. 31 (2), 261-275 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axonal mRNA IsolationPorous Membrane InsertsDroplet Digital PCRNeuronal CompartmentalizationRNA QuantificationLocal Protein SynthesisNeurite FractionGrowth Cone AnalysisRNA LocalizationSynaptic Plasticity

Related Articles