مقالة منهجية

تغذية دم القراد عبر غشاء صناعي على غرفة مطبوعة ثلاثية الأبعاد في أبحاث القراد المعتمدة على إكسوديد

796 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69606

⸱

مارس 20, 2026

 , 
1Department of Entomology, University of Arizona, 2Department of Entomology, Kansas State University

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه الطريقة تطوير نظام تغذية دم للقراد في المختبر ، يدمج غرفة مطبوعة ثلاثية الأبعاد وغشاء سيليكون مصنع في المختبر. يتيح النظام تغذية القراد بشكل اصطناعي، مما يسمح بأخذ عينات سهلة في مراحل التغذية المختلفة واستخدام كميات دم منخفضة، مما يوفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة قراد الإكسوديد.

الملخص

يقدم هذا العمل بروتوكولا مفصلا لنظام تغذية القراد من خلال غشاء سيليكون صناعي باستخدام غرفة مطبوعة ثلاثية الأبعاد مصنوعة من راتنج فوتوبوليمر عالي الدقة. تشمل الطريقة تصميم غرفة التغذية، وتحضير غشاء السيليكون، وتجميع النظام، وتحسين الظروف لتغذية القراد. القراد هو أحد الناقلات الرئيسية للأمراض في الولايات المتحدة وحول العالم. تعد أبحاث القراد ضرورية لتطوير استراتيجيات فعالة للوقاية وتقليل حدوث الأمراض المنقولة عن طريق القراد. باعتبارها طفيليات خارجية دموية إلزامية، يجب على القراد أن يتغذى على الدم للبقاء وبالتالي نقل الأمراض، مما يجعل تغذية الدم عملية أساسية عند التحقيق في تفاعلات الناقل والممرض، وانتقال الممرضات، والبيولوجيا والفسيولوجيا والشكل التشريحي للقراد. تم استخدام وتحسين أنظمة تغذية القراد المزودة بغشاء سيليكون على نطاق واسع خلال العقود الماضية. ومع ذلك، فإن العديد من الأنظمة الحالية مصممة لنوع قراد واحد، أو مرحلة حياة، أو مجموعة محددة من الظروف. تم استخدام نظام تغذية القراد الموصوف في هذا البروتوكول بنجاح للحصول على عينات مغذية جزئيا ومنتفخة بالكامل من عدة أنواع من أهم أنواع ناقلات القطاق في الولايات المتحدة، بما في ذلك Amblyomma americanum، A. maculatum، Ixodes ssharpularis، وRhipicephalus sanguineus البالغين. أظهر النظام نجاحا في بدء تغذية البالغين Dermacentor variabilis واليرقة A. americanum، مع أعلى معدلات تغذية >لوحظت في البالغين A. americanum. وبالتالي، فإن غرفة التغذية التي تم تطويرها في هذه الدراسة قابلة للتكيف مع حجم منخفض من الدم المختلف، حتى 100 ميكرولتر، وهو أمر حاسم في انتقال الممرضات والدراسات السموية. سهل الغطاء الشفاف ذو الارتفاع المنخفض للحجرة مراقبة القراد خلال مدة تغذية القراد.

المقدمة

القراد هو طفيليات خارجية إلزامية تتغذى على الدم ويمكنها حمل ونقل مجموعة واسعة من مسببات الأمراض، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والطفيليات التي تسبب الأمراض للحيوانات والبشر حول العالم 1,2,3,4. باعتبارها الناقلة الأولى للأمراض في الولايات المتحدة، والثانية بعد البعوض في بقية العالم2،3،5، يمكن لعدة أنواع من القراد نقل الأمراض المرتبطة بالممرضات، بينما تعرف أنواع أخرى أيضا بأنها تسبب أمراضا غير معدية مثل متلازمة ألفا-غال (AGS، المعروفة أيضا بحساسية اللحوم الحمراء)، والتي تم الإبلاغ عنها بشكل متزايد حول العالم في السنوات الأخيرة6. 7، 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16. تعد الأبحاث التي تهدف إلى فهم بيولوجيا القراد، وعلم وظائف الأعضاء، وعلم الوراثة، وكفاءة الناقلات ضرورية لتطوير استراتيجيات لتقليل العبء الاقتصادي والصحي العام لكل من الأمراض المنقولة بالقراد المعدية وغير المعدية. دراسة تفاعلات القراد والمضيف غالبا ما تتطلب قرادا مغذيا جزئيا أو متورما بالكامل لمعالجة أسئلة بحثية محددة. يمكن تحقيق ذلك من خلال تغذية الحيوانات الحية، مما يسمح للقراد بإكمال دورة حياتها الكاملة17. بينما يعد استخدام الحيوانات الحية لتغذية القراد فعالا للغاية في تطوير وصيانة مستعمرات القراد18,19، إلا أنه قد يكون تحديا في التنفيذ وقد لا ينطبق على كل فرضية بحثية بسبب قيود توفر المضيف وتنظيمات المنشأة. والأهم من ذلك، أن التنفيذ الناجح لأنظمة تغذية القراد في المختبر يساعد في تقليل استخدام الحيوانات الحية، وهو هدف مهم في البحث ضمن إطار "بديل استخدام الحيوانات (3Rs)" (استبدال، تقليل، تحسين)20.

هناك العديد من المزايا لاستخدام أنظمة تغذية القراد الغشائية الصناعية في الأبحاث، مما يوفر فرصا واسعة لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة العلمية. يمكن تلخيص هذه المجموعات بشكل عام في ثلاث مجموعات؛ (1) تقييم التأثير على تباين دم المضيف وتفاعلات الناقل بين العائل، باستخدام مصادر دم مختلفة، مثل إنتاج ألفا-غال القراد أثناء التغذية21، (2) تقييم سمية المبيدات من خلال توصيل المركبات بالدم22 واستعادة المركبات المفرزة بالقراد أثناء تغذية الدم23، (3) تقييم كفاءة الناقلات من خلال توصيل مسببات الأمراض عن طريق الاكتساب الطبيعي أثناء تغذية الدم24، 25، 26، 27، من بين آخرين. علاوة على ذلك، تسمح طبيعة نظام التغذية الغشائي الاصطناعي باختبار واسع النطاق لمختلف العلاجات والتمركزات دون إدخال اختلافات متعلقة بالمضيف، ولكن على نطاق صغير وحجم صغير، مما يقلل الحاجة إلى الحيوانات الحية.

تم استخدام أنظمة تغذية القراد عبر الأغشية الصناعية على نطاق واسع في الأبحاث ولدعم تربية مستعمرات القراد 19,28,29، مما أتاح في بعض الحالات إكمال دورة حياة القراد الطويلة 30,31. تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات لتحسين أنظمة تغذية القراد وموادها لأنواع مختلفة من القراد32، 33، 34. ومع ذلك، من المعروف جيدا أن تغذية القراد في المختبر يمكن أن تكون متغيرة للغاية حسب ظروف النظام، والمواد المستخدمة، والأهم من ذلك، أنواع القراد والمراحل34. علاوة على ذلك، تعتمد العديد من الأنظمة على كميات كبيرة من الدم، مثل أنظمة التدفق المستمر27، وهي فعالة للغاية لكنها قد تكون مكلفة بسبب حجم الدم الكبير المطلوب. يوضح هذا البروتوكول نظام تغذية صناعي للقراد بالغشاء ثبت نجاحه في مراحل البالغة لخمسة أنواع مختلفة من أمراض القراد في الولايات المتحدة. يشمل ذلك أمبليوما أمريكانوم، أ. ماكولاتوم، إكسوديس سكابولاريس، ريبيسيفالوس سانغوينيوس، وديرماسنتور فاريابيليس.

البروتوكول

أجريت تجارب تغذية القراد باستخدام دم البقر المزيل تجاريا (مختبرات هيموستات، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) ودم الإنسان المزيل (بيوڤت، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، الذي يجمع ويعالج الدم وفقا لبروتوكولات وإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) ومجلس مراجعة المؤسسات (IRB). لم تستخدم أي حيوانات فقارية حية لتغذية القراد في هذه الدراسة. جميع القراد المستخدم في هذا البروتوكول تم شراؤه من منشأة تربية القراد بجامعة ولاية أوكلاهوما. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. غرف تغذية القراد

  1. صمم الغرف باستخدام برنامج تصميم ثلاثي الأبعاد مجاني لتناسب طبق بتري بحجم 35 مم × 10 مم. أحجام الأجزاء المطبوعة (الشكل 1A) هي كالتالي: جسم الحجرة (الجزء الأول) 25 مم (قطر داخلي) × 20 مم (ارتفاع)، بسماكة جدار 3 مم عند القاعدة و6 مم سمك الجدار عند حلقة الغطاء العلوي (الجزء الثاني)، 30 مم (القطر الداخلي) × 5 مم (ارتفاع) و3.5 مم سماكة الجدار، والحلقة الخارجية (الجزء الثالث)، 31 مم (القطر الداخلي) × 5 مم (ارتفاع) و3 مم سماكة الجدار.
    ملاحظة: تحتوي حلقة الغطاء على أربعة فتحات دائرية بقطر 3 مم × 2 مم (ارتفاع) في الأعلى لوضع المغناطيس. يوجد أيضا فتحات بنفس الحجم في أعلى الحجرة لتثبيت المغناطيسات (الشكل 1B). يجب حفظ تصميم النموذج ثلاثي الأبعاد كملف .stl ، وهو أكثر صيغ الطباعة ثلاثية الأبعاد شيوعا. سيتم توفير ملفات تحتوي على التصميم ثلاثي الأبعاد المستخدم في هذا البروتوكول عند الطلب.
  2. غرف الطباعة باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد LCD 14K بحجم 10 إنش مع راتنجات فوتوبوليمر رمادية أو بيضاء (الشكل 1A) أو أي طابعة ثلاثية الأبعاد عالية الدقة تطبع نماذج ثلاثية الأبعاد من ملف .stl.
    ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول خدمات الطباعة والراتنجات الخاصة بجامعة أريزونا. استخدام راتنجات عالية الدقة يضمن إنشاء غرف مفصلة ومتينة.
  3. باستخدام القفازات، تأكد من عدم وجود بقايا راتنج على الأجزاء قبل التجميع عن طريق الغسيل، وإذا لزم الأمر، صنفرة ناعمة بورق صنفرة ناعم (180 إلى 200 حبيبة). تأكد من أن الجزء السفلي المسطح للجزء الأول (الشكل 1A) ناعم. يضمن ذلك التصاق غشاء السيليكون بشكل صحيح، مما يقلل من خطر التسرب.
  4. عرض جميع القطع الجافة لأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق لضمان بلمرة الراتنج بالكامل.
    ملاحظة: معظم خدمات الطباعة ثلاثية الأبعاد التي تستخدم راتنجات سامة للطباعة تستخدم الضوء فوق البنفسجي لمعالجة الراتنج (تقسية النماذج وإزالة سمية الراتنج); ومع ذلك، يبقى أحيانا "غير ملتفي تماما". النموذج غير المعالج بالكامل سيظل لزجا قليلا عند اللمس وقد يحمل راتنج غير مستقطب، والذي قد يكون ساما أو يسبب تهيجا عند التعامل معه. التعرض الإضافي للأشعة فوق البنفسجية سيضمن تصلب الراتنج بالكامل.
  5. لصق المغناطيسات الدائرية بحجم 3 مم × 2 مم على الشقوق في أعلى الحجرات وحلقات الغطاء باستخدام غراء إيبوكسي شفاف. اتركه ليجف طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية/الحد الأدنى 16 ساعة). تأكد من أن أقطاب المغناطيسات في اتجاه واحد لتتناسب مع جذب الأقطاب على المغناطيسات في الجزء العلوي من حلقة الغطاء (الشكل 1A، الجزء الثاني).
  6. قم بتجميع جميع القطع للنموذج لضمان التوافق الصحيح لجميع المكونات، كما هو موضح في الشكل 1A–C.

2. تحضير الغشاء

  1. ضع قطعة من الغلاف البلاستيكي بحجم 30 سم × 30 سم على سطح نظيف وتأكد من خلوها من التجاعيد عن طريق شدها على سطح مستو وتثبيت الحواف بشريط لاصق (الشكل 2Ai).
  2. ضع 4–5 أوراق واحدة من ورق تنظيف العدسات فوق قطعة ممتدة من البلاستيك/التغليف بمسافة 5 سم (الشكل 2Aii).
  3. جهز غشية السيليكون باستخدام المكونات والكميات الموضحة أدناه.
    ملاحظة: الكميات كافية لتحضير 4–5 أغشية (7 سم × 12 سم)، كل منها يتسع لما يصل إلى 5–6 غرف تغذية، ليصبح المجموع 20–30 غرفة.
  4. جهز خليط السيليكون بخلط 15 جراما من سد السيليكون الشفاف (صلابة 20–25 شور A) وإضافة 4.5 جرام من زيت السيليكون (30٪ من إجمالي السيليكون)، و2.9 جرام من الهيكسان (19.3٪ من إجمالي السيليكون). ضع المكونات في قارب بلاستيكي وزن وامزج بلطف باستخدام ملعقة (الشكل 2Aiii).
    ملاحظة: تأكد من تكون الفقاعات بأقل قدر ممكن من خلط المكونات بلطف.
  5. ضع 2–3 جرام من خليط السيليكون على الحافة الصغيرة لورق العدسة لتثبيتها على الغلاف البلاستيكي. اترك 5–10 ثوان حتى يتسرب السيليكون عبر ورق العدسة (الشكل 2Aiv).
  6. انشر خليط السيليكون بشكل متساو على ورقة العدسة باستخدام أداة ذات حافة مستقيمة، مثل الغطاء أو المسطرة أو الملعقة. تأكد من أن الجسم المستخدم يغطي كامل مساحة ورق العدسة (الشكل 2Av). هذا يضمن تغطية السيليكون في ضربة واحدة، مما يمنع تموجات الغشاء على حافة الجسم.
  7. تأكد من استخدام كل خليط السيليكون في الغشاء عن طريق إعادة أداة النشر إلى وضعية البداية للنشر. نظرا لأن بعض خليط السيليكون سيبقى على أداة الانتشار، فإن إعادة الأداة لتجمعها سيضمن استخدام كل السيليكون لتجنب الفجوات (الشكل 2Avi).
    ملاحظة: يجب أن يبدو الغشاء شفافا بشكل موحد دون تموجات (الشكل 2B).
  8. تحضير أغشية بسماكات مختلفة في البداية بإضافة خليط سيليكوني أكثر أو أقل، حيث لا يمكن قياس السماكة حتى تجف الأغشية.
  9. دع الأغشية تجف في الهواء طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية/الحد الأدنى 16 ساعة).
  10. قياس سمك الغشاء باستخدام أداة قياس رقمية خارجية ميكرومتر. تستخدم سماكات أغشية مختلفة لأنواع الراقصة البالغة المختلفة، تتراوح من أجزاء الفم القصيرة (سمك الغشاء 70 ميكرومتر) إلى أجزاء الفم الأطول (سمك الغشاء 200 ميكرومتر).
  11. قم بإزالة جميع الأجزاء من الغرف التي تم تجميعها مسبقا ووضع غراء السيليكون على الحافة السفلية للغرف. لوضع الغراء بدقة، استخدم حقنة سعة 1 مل واملأها بغراء السيليكون (الشكل 2Ci).
  12. ضع رأس ماصة بسعة 200 ميكرولتر على طرف الحقنة (بدلا من الإبرة) لتطبيق الغراء (الشكل 2Cii) وثبته في نهاية الحقنة، كما هو الحال مع رأس الإبرة (الشكل 2Ciii). سيسمح ذلك بتطبيق الغراء الناعم على الحافة السفلية لكل غرفة (الشكل 2Civ).
  13. ضع الحجرة فوق الغشاء (الشكل 1، الجزء الأول) مع جسم مثقل لضمان الاستقرار. اتركه طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية/الحد الأدنى 16 ساعة) (الشكل 2D,E).
    ملاحظة: استخدم أي جسم مسطح الوزن. استخدم هذا البروتوكول قطعة أكريليك وزنها 2.5 كجم (الشكل 2E).
  14. اقطع فائض الغشاء من الحجرات باستخدام مقص منحني (الشكل 3A).
  15. قبل استخدام الحجرة لتغذية القراد، قم بإزالة أي غلاف بلاستيكي متبق (حيث يتم تجهيز الغشاء (الخطوة 2.1) (الشكل 3B).
  16. تجميع أجزاء الحجرة معا، وأضف طبق بتري بمقاس 35 مم × 10 مم في الأسفل، واستخدم أغطية الصحون كأغطية للغرف عن طريق قلبها ووضعها بين المغناطيسات (الشكل 3C,D).
    ملاحظة: استخدم الأغطية مقلوبة، لأن حلقة حامل الغطاء تناسب الغطاء تماما إذا كانت مقلوبة (انظر وصف الأجزاء في الشكل 3C,D).
  17. انقع غشاء الحجرة في ماء مقطر باستخدام الجزء السفلي من أطباق بتري بحجم 35 مم × 10 مم. دع الغشاء يجلس في الماء طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية/الحد الأدنى 16 ساعة). وبما أن الغشاء في البداية كاره للماء، فإن نقعه في الماء قبل إضافة الدم يساعد في تقليل تكون الفقاعات المحبوسة.
    ملاحظة: غياب الفقاعات يؤكد أن الرهاب المائي قد أزيل.

3. تغذية القراد وتحضير الدم

  1. قم بعمل 2–3 فتحات تنفس صغيرة في أغطية كل غرفة (من أطباق بتري 35 مم × 10 مم) (الجزء الرابع في الشكل 1A) المذكور في الخطوة 2.16 (الشكل 3E). استخدم مشرط معدني ساخن أو ملعقة معدنية رفيعة لثقب فتحات التنفس في الغطاء.
    ملاحظة: تسمح فتحات التنفس بامتصاص الرطوبة داخل غلاف الحجرة.
  2. قم بإضافة كبريتات جنتاميسين إلى الدم بتركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام/مل. أضف المضادات الحيوية فقط إلى الدم المخصص للاستخدام خلال أسبوع وخزنها عند 4 درجات مئوية. حافظ على دم البقر (أو أي دم حيوان آخر) عند 4 درجات مئوية قبل وبعد إضافة المضادات الحيوية.
  3. ضع 2–3 مل من الدم في طبق بتري نظيف بحجم 35 مم × 10 مم، ثم ضع الحجرة عليه. قم بضبط ارتفاع الحجرة لزيادة أو تقليل كمية الدم المستخدمة في كل حجرة عن طريق تدوير حلقة الضبط (الجزء الثالث من الشكل 1A). اضبط ارتفاع الحجرة، مع ترك مسافة 1–2 مم من أسفل طبق بتري إلى الغشاء. انظر الأسهم الأرجوانية في الشكل 4A للمرجعية.
    ملاحظة: تصميم حلقة التعديل في الغرف يسمح بالتحكم في حجم الدم المستخدم. أي أن المساحة الأكبر بين أسفل طبق بتري والغشاء ستتطلب حجما أكبر لملء المساحة.
  4. ضع القراد غير المطعم داخل الغرف بأعداد متساوية من الذكور والإناث. تأكد من أن كلا الجنسين موجودان دائما في الحجرة، لأن ذلك قد يؤثر على معدلات التغذية (يظهر الشكل 4B وجود 4 ذكور و4 إناث من A. americanum البالغة داخل الحجرة). يتم استخدام حد أقصى من 10 إلى 15 علامة في كل حجرة (للمرحلة البالغة) لتسهيل التعامل معها.
    ملاحظة: عند العمل مع المراحل غير الناضجة، يكون عدد القراد أعلى (20–50 حورية في كل غرفة، غير معروضة في هذا البروتوكول).
  5. ضع الغرف في حمامات جافة مغطاة عند درجة حرارة 37 °م ± 1 °م مع مصدر رطوبة (أي أكواب ماء) يحافظ على رطوبة نسبية تبلغ 63٪ ± 2٪ (الشكل 4C) خلال فترة ضوئية 12:12 ساعة من الضوء إلى الظلام.
    ملاحظة: قد تختلف هذه المتطلبات حسب نوع القراد وظروف المختبر؛ جرب إعدادات رطوبة أخرى إذا لزم الأمر وقيم أفضل إعداد للمختبر.

4. استبدال الدم والغرف

  1. حضر زجاجتين من الرش، مع المحاليل المستخدمة لغسل الغشاء بين تغيرات الدم. في زجاجة واحدة، أضف محلول نيستاتين بنسبة 0.005٪ في ماء مقطر؛ في الزجاجة الثانية، أضف الماء المقطر.
  2. بعد 12–16 ساعة، حضر أطباق بترى جديدة بدم طازج وضعها في حمام جاف عند 37 درجة مئوية قبل وضع الحجرة.
  3. أثناء تسخين الدم الطازج، أزل الحجرة من الدم المستخدم وشطف الجزء السفلي من الغشاء بالماء المقطر لمدة 3–5 ثوان، ثم بمحلول نيستاتين بنسبة 0.005٪ لمدة 3–5 ثوان لمنع التلوث الفطري. اشطف الغشاء مرة أخرى بالماء المقطر لإزالة أي بقايا من النيستاتين.
    ملاحظة: تستغرق هذه العملية أقل من 5 دقائق ولا تؤثر على تغذية القراد الملتصق بالغشاء على السطح العلوي.
  4. تخلص من كل الدم المستخدم والماء الشطف في وعاء يحتوي على محلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.5٪ (10٪ مبيض). يتم التخلص من فضلات الدم وفقا لبروتوكول السلامة المؤسسية.
  5. بعد الشطف، ضع الحجرة في طبق بتوري الجديد بالدم.
    ملاحظة: استخدم الغرف لمدة تصل إلى 2-3 أشهر قبل الغسيل، بشرط عدم وجود تلوث أو تسربات. تصبح الغرف والأغشية متسخة ومعرضة لخطر التلوث بعد 3 أشهر من الاستخدام دون غسيل. وهذا يؤدي إلى انخفاض معدلات تغذية القراد. أعد استخدام الغرف لمدة تصل إلى سنة ونصف (~10 دورات غسيل).
  6. أعد استخدام الغرف بوضعها في محلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.5٪ (مبيض 10٪) لمدة تصل إلى 30 دقيقة، ثم اغسلها بصابون الصحون. لا تعريض الغرف للمبيض لفترات طويلة (>30 دقيقة)، لأن الرائحة تقلل من معدلات الالتصاق وقد تضعف سلامة الراتنج مع مرور الوقت.
    ملاحظة: التعرض المطول للمبيض يجعل الحجرة مرنة عند البلل وهشة عند الجفاف، مما يؤدي إلى الكسر. هذا يجعل الحجرة لا تدوم أكثر من 4–5 دورات غسيل بناء على الملاحظات المتكررة. الاستخدام المستمر لنفس الحجرة دون غسل (حتى 3 أشهر) يؤدي إلى تثبيت القراد بشكل أسرع (1–3 أيام بعد وضعها في الحجرة) مقارنة بالحجرة التي تم غسلها حديثا (غالبا ما تستغرق >7 أيام للتثبيت). ويرجع ذلك على الأرجح إلى رائحة الفضلات وفرمونات التجمع الأخرى من القراد الذي يتغذى في الحجرة، والتي يمكن أن تحفز تغذية القراد35,36.

النتائج

سمك الغشاء لكل نوع من القراد.
لوحظت أعلى معدلات تغذية القراد عند مواصفات سمك الأغشية التالية لكل نوع من أنواع القراد البالغة: Amblyomma americanum 100–200 ميكرومتر؛ A. maculatum 100–250 ميكرومتر; Rhipicephalus sanguineus 70–100 ميكرومتر؛ Ixodes scapularis <150 ميكرومتر، Dermacentor variabilis <150 ميكرومتر. تم الحفاظ على جميع أنواع القراد تحت نفس ظروف الرطوبة ودرجة الحرارة أثناء التغذية (63٪ رطوبة نسبية و37 درجة مئوية) (الجدول 1).

القراد ومصادر الدم المستخدمة في هذا البروتوكول
تم الحصول على جميع القرادات من منشأة تربية القراد بجامعة ولاية أوكلاهوما وحافظت على رطوبة نسبية >90٪ عند 20 درجة مئوية، تحت فترة ضوئية فاتحة وظلامية تبلغ 12:12 ساعة. تم تغذية جميع القراد على دم البقر أو الإنسان المضاف للصدمة كجزء من مشروع بحثي يحقق في مستويات ألفا-غال (αGal) في أنواع مختلفة من القراد. قارنت هذه الدراسة تأثيرات التغذية على مصادر دم مختلفة ضمن مشروع أوسع لمتلازمة ألفا-غال (AGS) أجرته مجموعة البحث. تم تشريح معظم عينات القراد الموصوفة هنا قبل الانتخيم الكامل لإجراء تحليلات كمية αGal في القراد الذي تم تغذيته جزئيا (2–5 أيام من التغذية). فقط مجموعة فرعية من قراد أمبليوما أمريكانوم (تلك غير المطلوبة لقياس الألفاديغال) سمح لها بالتغذي حتى الاكتمال. على الرغم من أن المقارنات التفصيلية بين معدلات تغذية القراد التي تتغذى عليها الأبقار وبشرها غير معروضة هنا، إلا أنه من الجدير بالذكر أن الانتفاخ الكامل (أي نجاح التغذية) تحقق بشكل أكبر في القراد الذي تغذى على دم البقر. من بين القراد التي سمح لها بالبقاء في المغذيات لفترات طويلة (n = 35)، وصل 15 منها إلى انتفاخ كامل، مما يمثل معدل نجاح تغذية 42.8٪. من بين هؤلاء، تم تغذي 9 على دم البقر و6 على دم الإنسان (60٪ أرضوا من الأبقار مقابل 40٪ من البشر).

معدلات تغذية القراد مقابل معدلات نجاح تغذية القراد
تم تحديد معدلات تغذية القراد في هذه الدراسة بناء على اكتساب القراد الذي تم تغذيته جزئيا (2–5 أيام من التغذية)، بينما تم تعريف نجاح التغذية بأنه الانتفاخ الكامل، والذي يشار إليه عادة بتغير لون الألوسكوتوم للأنثى (البيانات متوفرة فقط ل Amblyomma americanum). تم تعريف معدلات تغذية الذكور بأنها تغذية مستمرة لأكثر من يومين (2–5 أيام). تم حساب معدلات التغذية العامة من خلال دمج بيانات القراد التي تتغذى على دماء البقر والبشر وحساب نسب القراد التي تحقق 2-5 أيام من التغذية أو الانتفاخ الكامل من القراد الموضوع في الحجرات. تم النظر في القراد الذي لم يلتصق أو مات بعد <يومين من الالتصاق لحساب معدلات التغذية. على الرغم من عدم تقديم بيانات كمية حول تأثير مصدر الدم على معدلات تغذية القراد، تشير هذه الأدلة الرصدية إلى أن معدلات التعلق والتغذية لا تختلف بشكل كبير بين دم البقر ودم الإنسان خلال فترة التغذية التي تستمر من 2 إلى 5 أيام. لوحظ استثناء لمرض Rhipicephalus sanguineus، الذي أظهر معدلات تغذية أقل على دم الإنسان بين اليومين 3 و5 مقارنة بدم البقر. يتم تلخيص معدلات تغذية جميع أنواع القراد التي حققت تغذية جزئية واكتئاب كامل باستخدام هذا النظام الصناعي لتغذية القراد في الجدول 1.

تصنيف وزن ومرحلة التغذية للأنثى أمبليوما أمريكنوم
تم تصنيف الإناث المغذية جزئيا من A. americanum بناء على أيام التغذية كما يلي: (1) غير مغذية، (2) 2–3 أيام مغذية جزئيا، (3) 4–5 أيام مغذية جزئيا، و(4) منتفخة (الشكل 5). شملت مرحلة التغذية المنتفخة القراد عند بداية مرحلة الانتخم السريع (بأوزان تتراوح بين 48.9 ملغ إلى 109 ملغ) والقراد المنتفخ بالكامل (بأوزان تتراوح بين 272.7 ملغ إلى 348.7 ملغ).

figure-results-1
الشكل 1: غرفة تغذية القراد - نموذج ثلاثي الأبعاد وتجميع مطبوع مع غشاء. نموذج ثلاثي الأبعاد مفجر وغرفة تجميع نهائية تعرض مكونات فردية: (1) جسم الحجرة (غلاف القراد)، (2) حلقة حامل الغطاء، (3) حلقة تعديل الارتفاع، (4) غطاء طبق بتري 40 مم × 10 مم، و(v) قاع طبق بتري 40 مم × 10 مم مع دم (A). تجميع النموذج المطبوع ثلاثي الأبعاد وأحجام الأجزاء الفردية المعروضة بالمم (B). حجرة مجمعة مطبوعة براتنج رمادي بدقة 8K (C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحضير غشاء السيليكون ومجموعة الحجرة. (1) غلاف بلاستيكي بطول 30 سم × 30 سم مثبت بشريط لاصق، لضمان عدم ظهور تجاعيد، (2) أوراق ورق تنظيف العدسات فردية موضوعة على الغلاف بمسافة حوالي 5 سم، (3) خلط لطيف لمكونات السيليكون باستخدام الملعقة بحركات دائرية، (4) كل ورقة عدسة مثبتة بتطبيق 1–2 جرام من خليط السيليكون على حوافها، (5) توزيع خليط السيليكون بشكل متساو عبر ورق العدسة باستخدام أداة مستقيمة الحافة أكبر من الورق (تظهر الصورة حافة غطاء زجاجي)، (6) لاحظ تقليل كمية خليط السيليكون أثناء الفرد، ثم يعاد السيليكون المحتجز على الأداة ويعاد توزيعه لضمان تغطية موحدة (A). الأغشية المنتشرة بشكل صحيح لم تظهر فقاعات أو فجوات هوائية (B). تحضير الحقنة لتطبيق الغراء: (1) حقنة بسعة 1 مل مملوءة بالغراء السيليكون، (2) رأس ماصة بسعة 200 ميكرولتر مثبت في طرف الحقنة، (3) رأس الماصة مثبت في مكانه لضمان إغلاق مقاوم للتسرب، و(4) وضع الغراء على الحافة السفلية للجزء الأول (C). توضع الحجرة على الغشاء الجاف (D)، ويتم وضع جسم ثقيل (كتلة أكريليك سميكة تزن 2.5 كجم؛ سهم أرجواني) في الأعلى لضمان التصاق قوي (E). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: الخطوات النهائية في تحضير الحجرة والغشاء قبل الاستخدام. تقليم حواف الغشاء المحيط بالغرفة باستخدام مقص صغير منحني (A)، إزالة الغلاف البلاستيكي قبل استخدام الحجرة (B)، تركيب النموذج النهائي (C)، وضع الحجرة في طبق Petri بحجم 40 مم × 10 سم يحتوي على الماء، واستخدام طبق Petri lid كغطاء للغرفة (D) (الأرقام i-v تشير إلى الأجزاء المحددة في الشكل 1A)، وأغطية الحجرات التي تظهر فتحات التنفس (تشير إليها برؤوس سهام أرجوانية) (E). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: إعداد تغذية الدم ومكان القراد. توضع الحجرة في طبق مملوء بالدم، مع تمييز حلقة ضبط الارتفاع (سهام أرجوانية) (A). منظر داخلي لغرفة التخزين التي تحتوي على عدد متساو من القراد الذكور والإناث (B). غرف القراد موضوعة في حمامات جافة مع مصدر رطوبة، تحافظ على رطوبة نسبية 63٪ ± 2٪ ودرجة حرارة 37 °م ± 1 °م. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تغير حجم ووزن أمبليوما أمريكانوم أثناء التغذية. يتم عرض حجم القراد غير المغذى ومتوسط وزن القراد الذي تم تغذيته جزئيا. تمثل الصور أمثلة نموذجية تتوافق مع متوسط الوزن المسجل في كل فترة تغذية. يعرض الجدول المرافق متوسط الأوزان، والانحرافات المعيارية، وعدد القراد المحلل، والوسيط، والرباعيات 1 و3 لكل نقطة زمنية تغذية. أظهرت القراد التي تم إطعامها لمدة 2–3 أيام نطاقا من وزن من 7.4 ملغ (كحد أدنى) إلى 19.2 ملغ (كحد أقصى). تراوحت القراد الذي تم إطعامه لمدة 4–5 أيام من 20.6 ملغ إلى 44.8 ملغ. كان وزن القراد عند بداية مرحلة الانتفاق السريع والنفاد الكامل بين 48.9 ملغ و348.7 ملغ. صورة للإناث الملحقة ب A. americanum الأنثى التي تم تغذيتها 4-5 أيام (رأس سهم أصفر)، وأنثى منتفخة بالكامل (رأس سهم أرجواني). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أنواع القراد وجنسهاعدد القراد التي تم إطعامها/ إجمالي القرادات الموضوعة في الحجرات (عدد القرادات الميتة)معدل التغذية (القراد ملتصق من 2 إلى 5 أيام)متوسط الوزن (ملغ) (SD)سمك الغشاء المستخدم (ميكرومتر)
إناث A. americanum85/97 (12)87.60%37.3 (54.40)*100 - 200
الذكور A. americanum19/22 (2)86.30%لم يتم التسجيل100 - 200
إناث A. maculatum45/66 (21)68.20%122.4 (141.65)100 - 250
ذكور A. maculatum36/47 (11)76.60%لم يتم التسجيللم يتم التسجيل
إناث R. sanguineus34/60 (26)56.60%لم يتم التسجيل70 - 100
إناث I. sacute ularis15/23 (8)65.20%لم يتم التسجيل<150
*معدل نجاح التغذية الذي تم تقييمه في مجموعة فرعية من قراد Aa البالغ الذي يغذى الأبقار هو (n=35) 42.8٪

الجدول 1: معدلات تغذية القراد ومتوسط الأوزان.

الشكل الإضافي 1: تغذية منخفضة الحجم (100 ميكرولتر) للقراد الفردي المرتبط بالفعل بموقع الحجرة ثلاثية الأبعاد. أنبوب PCR صغير متصل بأسفل الغشاء الصناعي بغراء السيليكون مملوء ب 100 ميكرولتر من الدم. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تعد أنظمة تغذية القراد الصناعية باستخدام أغشية أدوات فعالة للغاية لأبحاث القراد، وتستخدم على نطاق واسع في العديد من المختبرات البحثية كبدائل قابلة للتطبيق لتغذية الحيوانات الحية28,29. تكمن القيمة الأساسية لهذه الأنظمة في قدرتها على إيصال أو استعادة عوامل مختلفة عبر وجبة الدم، بما في ذلك مسببات الأمراض، والمبيدات الأكراية، والمركبات المشتقة من القراد، والجزيئات المعدلة الأخرى 22,23,25,27. يمكن أن يسهل تحسين أنظمة التغذية الأغشائية الصناعية تطوير تربية مستعمرات قراد مستدامة، مما يقلل الاعتماد على الحيوانات الحية.

نظام تغذية القراد في المختبر الموضح في هذا البروتوكول كان ناجحا بشكل خاص مع البالغين أمبليوما أمريكنوم وإيكوسيدس سكابولاريس. تعرف معدلات نجاح تغذية القراد بأنها نسبة (أو نسبة) القراد التي تكمل التغذية بنجاح إلى الانتفاخ الكامل. ومع ذلك، فإن القراد الذي يغذى جزئيا (عادة بعد 3–4 أيام من بدء التغذية) غالبا ما يكون كافيا لمعالجة فرضيات تجريبية محددة لمعظم مختبرات أبحاث القراد التي تدرس بيولوجيا أو فسيولوجيا القراد. في هذا البروتوكول الصناعي لنظام التغذية الغشائية، ولمعالجة أهداف بحثية محددة في مشروع ألفا-غال (αGal)، استخدم مصطلح "معدل تغذية القراد" للإشارة إلى اكتساب القراد الذي تم تغذيته جزئيا (2–5 أيام من التغذية) و"نجاح تغذية القراد" للإشارة إلى الانتفاخ الكامل في A. americanum. أعلى معدلات التغذية كانت لدى إناث A. americanum (87.6٪)، تليها ذكور A. americanum (86.3٪)، وإناث A. maculatum (68.2٪)، وذكور A. maculatum (76.6٪)، وإناث I. scapularis (65.2٪)، وإناث R. sanguineus (56.6٪)، بينما بلغت نسبة نجاح التغذية في A. americanum 42.8٪ (الجدول 1). تم تصنيف الإناث المغذية جزئيا من A. americanum بناء على أيام التغذية في 4 فئات (مراحل التغذية)، مع تعديل من المنشورات السابقة كما يلي:(1) غير مغذية، (2) 2–3 أيام مغذية جزئيا، (3) 4–5 أيام مغذية جزئيا، و(4) متورمة (الشكل 5). شملت مرحلة التغذية المنتفخة القراد عند بداية مرحلة الانتخم السريع (بأوزان تتراوح بين 48.9 ملغ إلى 109 ملغ) والقراد المنتفخ بالكامل (بأوزان تتراوح بين 272.7 ملغ و348.7 ملغ) (الشكل 5). مكن هذا النظام الصناعي لتغذية القراد من عدة دراسات ضمن نفس مجموعة البحث والمتعاونين من خلال السماح بتوليد قراد مطعم جزئيا على دم البقر، والذي استخدم لاحقا لإصابة الفئران واختبار فرضية انتقال متلازمة ألفا-غال (AGS)، وهي حساسية من اللحوم الحمراء الناتجة عن لدغات القراد، ولدراسة N-glycomics11,21, 37. مكنت سهولة الإعداد الفردي من استخدام مصادر دم مختلفة، كما أن الغطاء الشفاف وارتفاع الحجرة الصغير ساعدا في تصور القراد خلال فترة التغذية تحت ميكروسكوب مجسم مع مسافة عمل كافية.

التعديلات الحديثة في الرطوبة (من حمام مائي، 90٪ رطوبة نسبية، إلى حمام جاف، 63٪ ± 2٪ رطوبة نسبية)، ودرجة الحرارة (من 37 درجة مئوية إلى 35 درجة مئوية ثم العودة إلى 37 درجة مئوية)، وسماكة الأغشية (الجدول 1) مكنت من تغذية ناجحة لأنواع مختلفة من القراد. بينما تعتبر درجة الحرارة والرطوبة النسبية (RH) متغيرات مهمة يجب التحكم بها في تغذية القراد في المختبر، فإن سمك الغشاء وقوته عاملان حاسمان يضمنان نجاح التغذية عبر أنواع القراد المختلفة33,38. من الضروري أن نأخذ في الاعتبار أن القراد ذو أجزاء الفم القصيرة، مثل Rhipicephalus sanguineus وDermacentor variabilis، سيحتاج إلى أغشية أرق من تلك ذات الأجزاء الفموية الطويلة39، مثل Amblyomma spp وIxodes spp. أعلى معدلات تغذية القراد كانت في Amblyomma americanum وA. maculatum بسماكة غشاء تتراوح بين 100–200 ميكرومتر؛ Rhipicephalus sanguineus بسماكة بين 70–100 ميكرومتر؛ Ixodes skabolaris بسماكة <150 ميكرومتر، وDermacentor variabilis <150 ميكرومتر (الجدول 1). عامل رئيسي يجب ملاحظته في تغذية القراد الغشائي الصناعي هو أن تقلبات معدلات التغذية لا تزال تحدث. في هذا النظام، يؤدي التغير الطفيف في درجة الحرارة، أي من 37 درجة مئوية إلى 35 درجة مئوية ثم العودة إلى 37 درجة مئوية بعد بضعة أيام، إلى زيادة أو استعادة معدلات تغذية القراد. علاوة على ذلك، فإن التحول من حمام جاف إلى حمام مائي يعطي نتائج مماثلة لأنواع Amblyomma و Ixodes ssharpularis، ومع ذلك، لم يلاحظ هذا التأثير في Rhipicephalus sanguineus، الذي يتغذى بشكل أكثر فعالية عند 63٪ ± 2٪ رطوبة نسبية في الحمامات الجافة.

أظهرت أنظمة تغذية العقد الصناعية الأخرى، مثل تلك التي تم تكييفها من نظام التدفق المستمر المكون من خمسة أجزاء طورها Ueti, M. وآخرون (USDA-ARS) والتي تم تعديلها لاحقا لأنواع إضافية من القراد بواسطة ياماساكي، وY. وآخرون، كفاءة عالية، حيث أظهرت معدلات نجاح تغذية عالية ومتسقة27,40. ومع ذلك، فإن الدراسات التي تتطلب وصولا متكررا إلى النظام لتشريح القراد الذي يتم إطعامه جزئيا تجعل هذه التركيبات أقل ملاءمة، حيث أن فتح وإغلاق غرفة القراد المتكرر قد يكون مرهقا. تتميز غرفة الطباعة ثلاثية الأبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول بغطاء مغناطيسي مؤكد القفل وأطباق بترى فردية، مما يسمح بسهولة التعامل مع القراد والفحص البصري لتغذية القراد دون إزعاج الإعداد. يسمح الغطاء الشفاف بالمراقبة البصرية دون اضطراب ويثبت بأمان في الحجرة عبر مغناطيسات مدمجة، على عكس أنظمة تغذية القراد الأكثر شيوعا، مثل تلك المحسنة في التصميم الأصلي من كروبر وغيرين22،29، حيث لا يمكن الرؤية الفردية دون إزالة غرفة التغذية من الدم لأن جميع وحدات التغذية مدمجة في صفيحة واحدة وحيث تستخدم الطرق لمنع هروب القراد لا تسمح بالتصور. علاوة على ذلك، يمكن تحسين هذا النظام في المختبر لتغذية القراد لتوفير كميات دم أصغر وخاصة بالموقع. على سبيل المثال، بمجرد تثبيت الإناث في مواقع تغذية محددة، يمكن استبدال طبق البتري السفلي بخزانات صغيرة، مثل الجزء العلوي من أنبوب PCR بسعة 100 ميكرولتر، يحتوي على أقل من 100 ميكرولتر من الدم موضوعا مباشرة تحت منطقة التثبيت (الشكل التكميلي 1). سيمكن هذا النهج منخفض التغذية من إجراء دراسات مفصلة حول اكتساب ونقل مسببات الأمراض، بالإضافة إلى إجراء تحقيقات حول تأثيرات سموم القراد والأجسام المضادة المشتقة من المضيف. وقد ثبت نجاح هذا البروتوكول في الحصول على قراد مغذى جزئيا من أنواع القراد البالغة المختلفة. لأغراض هذه الدراسة، لم يتم تقييم معدلات وضع البيض ومعدلات التضخم الكامل في هذا البروتوكول؛ ومع ذلك، يتم إجراء المزيد من التحسين بهدف الحصول على نسل القراد، وهو ما يمكن تحقيقه باستخدام Amblyomma americanum وIxodes scapularis بناء على الملاحظات الأولية. ربما تكون أكثر ميزات هذا النظام ابتكارا هي مرونته في التلاعبات التجريبية الصغيرة النطاق، مما يتيح تنوعا مسيطرا على المعالجات والظروف البيئية، مع دعم تطبيقات تربية المستعمرات.

تغذية القراد في المختبر هي أداة قيمة للباحثين الذين يدرسون علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاء والكفاءة في الناقلات. ومع ذلك، فإن تغذية القراد الغشائي الصناعي مهمة تستغرق وقتا طويلا وتتطلب جهدا. يتميز هذا البروتوكول بغرفة مطبوعة ثلاثية الأبعاد مع نظام قفل مؤكد وغشاء بسيط مصنوع في المختبر، ويوفر إعدادا بسيطا بمجرد طباعة الغرف وتجهيز الأغشية، مما يسمح بالاستخدام الممتد. بالإضافة إلى ذلك، من خلال ضبط سمك الغشاء، يمكن تكييف النظام بفعالية مع أنواع القراد المختلفة. يمكن لتحسين الأكثر، بما في ذلك حجم الحجرة وسماكة الغشاء، أن يمكن تطبيقه عبر مراحل حياة القراد المختلفة.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية جوهرية تتعلق بالبحث الموصوف في هذه الورقة.

شكر وتقدير

يرغب المؤلفون في الشكر على العمل الدؤوب لطلاب وعمال المرحلة الجامعية، كارا جولدن، سيدني إنغام، وأوميمة جدو نجمة، الذين ساعدوا في تغذية القراد وتركيب غرفة وغشاء القراد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حقنة لوير-لوك بحجم 1 ملBD309628نصيحة لوير-لوك
سيليكون شفاف متقدم جنرال إلكتريك2810435سد سيليكون شفاف. يشكل هذا السد حاجزا غير منفذ للماء بعد التصلب.
غراء الإيبوكسي الشفافجي بي ويلد-كلير‎ B009EU5ZM0رقم منتج أمازون
لفافة الطعام الشفافة (ختم التشكيلة)سعيدCLO00020
دم البقر المزيلمختبرات هيموستاتDBB100
دم الإنسان المثبت في إزالة الصدماتBioIVT
الملاعق ذات الاستخدام الواحدشركة ليفغو، إنك.17211رقم منتج أمازون
حاضنات الحمامات الجافةأوناي لاب العلميHB120-Sرقم منتج أمازون. يتم قلب كتلة التسخين للحصول على سطح مستو.
ملح كبريتات الجنتاميسينميليبور سيغماG3632-5G
ورق تنظيف العدساتتيفنEK1546027T
رؤوس الميكروبايبت، 200 ومو؛ L Biotix uTIP63300057للحقنة. أداة تطبيق سد السيليكون
قفازات النيتريلالإلهامكوبالت-أوه جيرقم منتج أمازون
نيستاتينكواشف فيشر الحيويةBP2949-5
طبق بتيري 35 مم × 10 ممفالكون351008
طابعة راتنج Phrozen Sonic MEGA 8K V2فروزنB0F9NBXVVTحجم التصنيع 320 × 175 × 300 مم. يمكن شراؤه من أمازون إذا كان الطباعة الداخلية مفضلة
برو 8K فوتوبوليمر   راتنج أكوا رماديفروزنمن خلال جامعة أريزوناانكماش منخفض. جودة عالية وعالية نماذج ثلاثية الأبعاد معقدة للغاية بدقة 8K.
مغناطيسات دائرية 3 مم × 2 ممميلوسB08NZTN426رقم منتج أمازون
بوليمر ضوئي RPG راتنج دخان أبيضفروزنمن خلال جامعة أريزوناجودة عالية وعالية نماذج ثلاثية الأبعاد معقدة للغاية: مرونة رائعة مع انحناءة مذهلة.
زيت السيليكونميليبور سيغما378321-250 مل
تصميم البرمجيات ثلاثية الأبعاد المجانية من تينكيركادتينكيركادلا يوجدhttps://www.tinkercad.com
قوارب الوزن (سعة 100 مل)بورا بونتاMDO-AZOC-1030

المراجع

  1. De La Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front Biosci. 13, 6938-6946 (2008).
  2. Gubler, D. J. In vector biology, ecology and control. Atkinson, P. W. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 39-62 (2010).
  3. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. In biology of ticks. 1, Oxford University Press. Cary. 3-17 (2013).
  4. A global brief on vector-borne diseases. , World Health Organization. 1-54 (2014).
  5. Mullen, G. R., Durden, L. A. In medical and veterinary entomology. , Academic Press. Amsterdam. 517-558 (2002).
  6. Choudhary, S. K., et al. Tick salivary gland extract induces alpha-gal syndrome in alpha-gal deficient mice. Immun Inflamm Dis. 9 (3), 984-990 (2021).
  7. Van Nunen, S. A., O'Connor, L. R., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. Med J Aust. 190 (9), 510-511 (2009).
  8. Fischer, J., et al. Spatial distribution of alpha-gal in Ixodes ricinus – A histological study. Ticks Tick Borne Dis. 11 (5), 101506(2020).
  9. Hamsten, C., et al. Identification of galactose-α-1,3-galactose in the gastrointestinal tract of the tick Ixodes ricinus; possible relationship with red meat allergy. Allergy. 68 (4), 549-552 (2013).
  10. Chinuki, Y., Ishiwata, K., Yamaji, K., Takahashi, H., Morita, E. Haemaphysalis longicornis tick bites are a possible cause of red meat allergy in Japan. Allergy. 71 (3), 421-425 (2016).
  11. Maldonado-Ruiz, L. P., Boorgula, G. D., Kim, D., Fleming, S. D., Park, Y. Tick intrastadial feeding and its role on IgE production in the murine model of alpha-gal syndrome: The tick “transmission” hypothesis. Front Immunol. 13, 1-11 (2022).
  12. Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-α-1,3-galactose. J Allergy Clin Immunol. 123 (2), 426-433 (2009).
  13. Commins, S. P., Jerath, M. R., Cox, K., Erickson, L. D., Platts-Mills, T. Delayed anaphylaxis to alpha-gal, an oligosaccharide in mammalian meat. Allergol Int. 65 (1), 16-20 (2016).
  14. Crispell, G., et al. Discovery of alpha-gal-containing antigens in North American tick species believed to induce red meat allergy. Front Immunol. 10, 1056(2019).
  15. Park, Y., et al. Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccines. 8 (1), 95(2020).
  16. Sharma, S. R., Karim, S. Tick saliva and the alpha-gal syndrome: Finding a needle in a haystack. Front Cell Infect Microbiol. 11, 680264(2021).
  17. Sonenshine, D. E. In biology of ticks. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Vol 1, New York. 51-66 (1991).
  18. Narasimhan, S., et al. Laboratory management of mammalian hosts for Ixodes scapularis host–pathogen interaction studies. Comp Med. 74 (4), 235-245 (2024).
  19. Allan, S. A. Tick rearing and in vitro. feeding. Biology of ticks. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. , Oxford University Press. New York. 445-473 (2013).
  20. Costa-Da-Silva, A. L., Carvalho, D. O., Kojin, B. B., Capurro, M. L. Implementation of artificial feeders in hematophagous arthropod research cooperates with the vertebrate animal use replacement, reduction and refinement (3Rs) principle. J Clin Res Bioeth. 5 (2), 1-3 (2014).
  21. Maldonado-Ruiz, L. P., et al. High levels of alpha-gal with large variation in the salivary glands of lone star ticks fed on human blood. Sci Rep. 13 (1), 21409(2023).
  22. Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro. feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Manag Sci. 63 (1), 17-22 (2007).
  23. Stone, B. F., Commins, M. A., Kemp, D. H. Artificial feeding of the Australian paralysis tick, Ixodes holocyclus, and collection of paralysing toxin. Int J Parasitol. 13 (5), 447-454 (1983).
  24. Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: a tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
  25. Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae.) by membrane feeding. J Med Entomol. 53 (2), 409-415 (2015).
  26. Vimonish, R., et al. Isolation of infectious Theileria parva sporozoites secreted by infected Rhipicephalus appendiculatus ticks into an in vitro. tick feeding system. Parasit Vectors. 14 (1), 616(2021).
  27. Vimonish, R., et al. Quantitative analysis of Anaplasma marginale acquisition and transmission by Dermacentor andersoni fed in vitro. Sci Rep. 10 (1), 470(2020).
  28. Kröber, T., Guerin, P. The tick blood meal: From a living animal or from a silicone membrane. Altex. 24, 39-41 (2007).
  29. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
  30. Waladde, S. M., Ochieng, S. A., Gichuhi, P. M. Artificial-membrane feeding of the ixodid tick, Rhipicephalus appendiculatus, to repletion. Exp Appl Acarol. 11 (4), 297-306 (1991).
  31. Khoo, B., Cull, B., Oliver, J. D. Tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis. J Vis Exp. (189), e64553(2022).
  32. Krull, C., Böhme, B., Clausen, P. H., Nijhof, A. M. Optimization of an artificial tick feeding assay for Dermacentor reticulatus. Parasit Vectors. 10 (1), 60(2017).
  33. Garcia Guizzo, M., et al. Optimizing tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis. Sci Rep. 13 (1), 16170(2023).
  34. Rochlin, I., et al. Optimization of artificial membrane feeding system for lone star ticks, Amblyomma americanum (Acari: Ixodidae), and experimental infection with Rickettsia amblyommatis (Rickettsiales: Rickettsiaceae). J Med Entomol. 61 (2), 442-453 (2023).
  35. Barré, N., Garris, G., Lorvelec, O. Field sampling of the tick Amblyomma variegatum (Acari: Ixodidae.) on pastures in Guadeloupe: Attraction of CO and/or tick pheromones and conditions of use. Exp Appl Acarol. 21 (2), 95-108 (1997).
  36. Norval, R., Peter, T., Sonenshine, D., Burridge, M. Responses of the ticks Amblyomma hebraeum and A. variegatum. to known or potential components of the aggregation-attachment pheromone. III Aggregation. Exp Appl Acarol. 16 (3), 237-245 (1992).
  37. Park, Y., et al. Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccines. 8 (1), 1-18 (2020).
  38. Trentelman, J. J., Kleuskens, J. A., Van De Crommert, J., Schetters, T. P. A new method for in vitro feeding of Rhipicephalus australis (formerly Rhipicephalus microplus.) larvae: A valuable tool for tick vaccine development. Parasit Vectors. 10 (1), 153(2017).
  39. Kemp, D. H., Stone, B. F., Binnington, K. C. In physiology of ticks. Obenchain, F. D., Galun, R. , Pergamon. 119-168 (1982).
  40. Yamasaki, Y., Singh, P., Vimonish, R., Ueti, M., Bankhead, T. Development and application of an in vitro. tick feeding system to identify Ixodes tick environment-induced genes of the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi. Pathogens. 13 (6), 1-13 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تغذية دم القراد عبر غشاء صناعي على غرفة مطبوعة ثلاثية الأبعاد في أبحاث القراد المعتمدة على إكسوديد
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.