يقدم هذا البروتوكول اختبارا فوريا قائم على المعاوقة لقياس قدرة واستمرارية خلايا CAR T على القتل التسلسلي تحت التحفيز المستضد المزمن، مع دمج طريقة غسل الألواح لإعادة استخدام ألواح الفحص بفعالية من حيث التكلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يقدم هذا البروتوكول اختبارا فوريا قائم على المعاوقة لقياس قدرة واستمرارية خلايا CAR T على القتل التسلسلي تحت التحفيز المستضد المزمن، مع دمج طريقة غسل الألواح لإعادة استخدام ألواح الفحص بفعالية من حيث التكلفة.
لقد أحدث علاج الخلايا بمستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR) ثورة في علاج الأورام الدموية الخبيثة المحددة. ومع ذلك، يعاني جزء كبير من المرضى من الانتكاس بسبب فقدان المستضدات أو تقليل تنظيم المستضد أو إرهاق الخلايا التائية. تسلط هذه التحديات الضوء على الحاجة إلى اختبارات وظيفية يمكنها تقييم القدرة على القتل واستمرارية خلايا CAR T تحت التحفيز المستضدي المزمن. اختبارات القتل المتسلسل، التي تقيس قدرة خلايا CAR T على القضاء المتكرر على أهداف الأورام، تقدم رؤى قيمة حول متانة وقوة استجابات خلايا CAR التائية.
هنا، نقدم اختبارا قائما على المقاومة باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA) لقياس القتل المتسلسل الذي تتوسط خلايا T في المختبر. يتم زرع الخلايا الورمية مرارا والسماح لها بالالتصاق بألواح E الخاصة بالاختبار قبل إضافة خلايا CAR T عند نسب محددة من المؤثرين إلى الهدف (E:T). تراقب المنصة باستمرار بقاء خلايا الورم دون تسميات، تلتقط السمية الخلوية الديناميكية بدقة زمنية عالية. تشمل قراءات النواة حركيات مؤشر الخلايا (CI)، ومعدل قتل الخلايا الورمية، والوقت المناسب لإزالة الهدف. يعد الانخفاض التدريجي في قدرة القتل الذي لوحظ عند تكرار الاشتباكات المستهدفة مع الأورام علامة على خلل خلايا CAR T المكتسبة، والذي يسمى غالبا استنزاف الخلايا التائية. معا، تسمح هذه المقاييس بتقييم دقيق لوظيفة خلايا CAR T عند نسب E:T مختلفة وتتيح المقارنة المباشرة بين بنى أو معالجات CAR T المختلفة مع مرور الوقت.
لتعزيز كفاءة التكلفة، طورنا إجراء لغسل الألواح يتيح إعادة استخدام ألواح الفحص الإلكترونية دون المساس بأداء الفحص أو سلامة البيانات. يقلل سير العمل المحسن من تكلفة الفحص مع الحفاظ على المتانة التحليلية. يتيح هذا النهج تقييما ميسورة التكلفة وقابلة للتوسع لوظيفة خلايا CAR التائية، مما يسهل تحسينات في تصميم العلاج الخلوي.
لقد أحدث علاج مستقبل المستضد الكيميري (CAR) للخلايا التائية ثورة في علاج المناعة السرطانية بنجاح سريري ملحوظ عبر العديد من الأورام الدموية الخبيثة مثل سرطان الدم اللمفاوي المزمن، وسرطان الدم اللمفاوي الحاد، واللمفوما الكبيرة من خلايا B، والورم النخاعيالمتعدد 1,2,3,4,5. منذ الموافقات التنظيمية الأولى، توسع عدد منتجات خلايا CAR T والمرضى المعالجين بشكل مستمر6. اعتمادا على المنتج المحدد والمؤشر السريري، تتراوح جرعات التسريب النموذجية من حوالي 2 × 10
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لجهاز E-Plate 96 ويتطلب نظام xCELLigence RTCA. يتم زرع الخلايا الورمية الملتصقة مسبقا خلال الليل للوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي عند إضافة خلايا CAR التائية. اعتمادا على خط خلايا الورم وكثافة البذر، قد يتم تقصير هذه الفترة إلى 6 - 9 ساعات، مما يسمح بإضافة مؤثر في نفس اليوم. إذا تم تنفيذ سير العمل الأخير، يتم تعديل الجدول الزمني اليومي الاسمي الموصوف في البروتوكول، ويجب على المستخدمين تعديل الجدول الزمني وفقا لذلك. يتم الحفاظ على الزراعة المشتركة لمدة 48 ساعة قبل نقل خلايا CAR T إلى خلايا الورم التي تم تلوينها حديثا، مما يتطلب وضعين في لوحة على جهاز xCELLigence وتبديل الدرع وإضافة المؤثرات كل يومين. ي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يؤدي التنفيذ الناجح للبروتوكول إلى نتائج قابلة للتكرار تعتمد على مقاومة تعكس قدرة خلايا الورم على البقاء وسمية خلايا CAR T مع مرور الوقت. تم تقييم نمو الخلايا وسمية الخلايا باستخدام نظام RTCA التجاري. تم التعبير عن البيانات كمؤشر خلوي طبيعي (NCI)، يتم حسابه بقسمة CI في كل نقطة زمنية على CI في زمن تطبيع محدد. يتم تحديد زمن التطبيع مباشرة قبل إضافة خلايا المؤثر. يعرف وقت الوصول إلى الإزالة بأنه الفترة حتى يصل NCI إلى الصفر بعد إضافة المؤثر. يتم حساب NCI بواسطة برنامج RTCA ويمكن تصديره لمزيد من التحليل، بما في ذلك معدل القت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يصف هذا البروتوكول طريقة لتقييم السمية الخلوية التي تسببها خلايا CAR T خلال عدة جولات من التعرض للمستضد باستخدام منصة xCELLigence RTCA. من خلال تمكين القياس الطولي لبقاء خلايا الورم عبر الممانعة، يلتقط هذا النهج الاستجابات السامة للخلايا المتكررة - المعروفة بالقتل التسلسلي - بشكل مستمر وخالي من الملصقات. تم تصميم البروتوكول لمراقبة كيفية تغير وظيفة مؤثر الخلايا التائية مع مرور الوقت استجابة لتحديات خلايا الورم المتتالية، مما يوفر رؤى حول معايير مثل الاستمرارية الوظيفية، والإنزاف المبكر، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
حصلت SK على مكافآت من شركات مثل بليكتونيك، TCR2 Inc.، ميلتني، غالاباغوس، سيماب، نوفارتيس، ريجينيرون، BMS وGSK. SK هو مخترع لعدة براءات اختراع في مجال الأورام المناعية. تلقت SK رسوم ترخيص من TCR2 Inc وCarina Biotech. تلقت SK دعما بحثيا من TCR2 Inc.، وTabby Therapeutics، وCatalym GmbH، وPlectonic GmbH، وArcus Bioscience لأعمال غير مرتبطة بالمخطوطة. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.
حصلت TT، SM، وNTTN على منح من مؤسسة إلس-كرونر فريسينيوس (IOLIN). حصلت NTTN على منح إضافية من مؤسسة فريدريش باور ومنظمة المساعدة الألمانية للسرطان (AvantCAR.de). يحظى MPT بدعم مؤسسة مونيكا كوتزنر والمجلس الأوروبي للبحوث (زمالة MSCA 101106951). تحظى SK بدعم البرنامج الدولي للدكتوراه 'i-Target: الاستهداف المناعي للسرطان' (الممول من شبكة النخبة في بافاريا)، ومركز أبحاث السرطان البافاري (BZKF) (TANGO to S.K.)، والجمعية الألمانية للأبحاث (DFG، رقم المنحة: KO5055-2-1 و KO5055/3-1)، وتحالف أبحاث الميلانوما (رقم المنحة 409510)، وشبكة تدريب ماري سكلودوسكا-كوري لتحسين علاج الخلايا التائية التبنية للسرطان (ممولة من برنامج هو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| BxPC3 | ATCC | CRL-1687 | |
| لوحة E 96 | أجيلينت | 300600910 | |
| برنامج RTCA برو (Basic) | أجيلينت | لا يوجد | الإصدار 2.6.1 |
| xCELLigence RTCA MP - (لوحات متعددة) | أجيلينت | لا يوجد |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.