مقالة منهجية

اختبار القتل المتسلسل باستخدام قياس قابلية بقاء الخلايا الورمية بناء على المقاومة الطولية - طريقة مفيدة لتقييم أداء الخلايا التائية

DOI:

10.3791/69623

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, LMU University Hospital, 2Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, LMU University Hospital, 3German Cancer Consortium (DKTK), Partner Site Munich, a partnership between the DKFZ and the University Hospital of the LMU, 4German Center for Lung Research (DZL), 5Einheit für Klinische Pharmakologie (EKLiP), Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health Neuherberg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول اختبارا فوريا قائم على المعاوقة لقياس قدرة واستمرارية خلايا CAR T على القتل التسلسلي تحت التحفيز المستضد المزمن، مع دمج طريقة غسل الألواح لإعادة استخدام ألواح الفحص بفعالية من حيث التكلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أحدث علاج الخلايا بمستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR) ثورة في علاج الأورام الدموية الخبيثة المحددة. ومع ذلك، يعاني جزء كبير من المرضى من الانتكاس بسبب فقدان المستضدات أو تقليل تنظيم المستضد أو إرهاق الخلايا التائية. تسلط هذه التحديات الضوء على الحاجة إلى اختبارات وظيفية يمكنها تقييم القدرة على القتل واستمرارية خلايا CAR T تحت التحفيز المستضدي المزمن. اختبارات القتل المتسلسل، التي تقيس قدرة خلايا CAR T على القضاء المتكرر على أهداف الأورام، تقدم رؤى قيمة حول متانة وقوة استجابات خلايا CAR التائية.

هنا، نقدم اختبارا قائما على المقاومة باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA) لقياس القتل المتسلسل الذي تتوسط خلايا T في المختبر. يتم زرع الخلايا الورمية مرارا والسماح لها بالالتصاق بألواح E الخاصة بالاختبار قبل إضافة خلايا CAR T عند نسب محددة من المؤثرين إلى الهدف (E:T). تراقب المنصة باستمرار بقاء خلايا الورم دون تسميات، تلتقط السمية الخلوية الديناميكية بدقة زمنية عالية. تشمل قراءات النواة حركيات مؤشر الخلايا (CI)، ومعدل قتل الخلايا الورمية، والوقت المناسب لإزالة الهدف. يعد الانخفاض التدريجي في قدرة القتل الذي لوحظ عند تكرار الاشتباكات المستهدفة مع الأورام علامة على خلل خلايا CAR T المكتسبة، والذي يسمى غالبا استنزاف الخلايا التائية. معا، تسمح هذه المقاييس بتقييم دقيق لوظيفة خلايا CAR T عند نسب E:T مختلفة وتتيح المقارنة المباشرة بين بنى أو معالجات CAR T المختلفة مع مرور الوقت.

لتعزيز كفاءة التكلفة، طورنا إجراء لغسل الألواح يتيح إعادة استخدام ألواح الفحص الإلكترونية دون المساس بأداء الفحص أو سلامة البيانات. يقلل سير العمل المحسن من تكلفة الفحص مع الحفاظ على المتانة التحليلية. يتيح هذا النهج تقييما ميسورة التكلفة وقابلة للتوسع لوظيفة خلايا CAR التائية، مما يسهل تحسينات في تصميم العلاج الخلوي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أحدث علاج مستقبل المستضد الكيميري (CAR) للخلايا التائية ثورة في علاج المناعة السرطانية بنجاح سريري ملحوظ عبر العديد من الأورام الدموية الخبيثة مثل سرطان الدم اللمفاوي المزمن، وسرطان الدم اللمفاوي الحاد، واللمفوما الكبيرة من خلايا B، والورم النخاعيالمتعدد 1,2,3,4,5. منذ الموافقات التنظيمية الأولى، توسع عدد منتجات خلايا CAR T والمرضى المعالجين بشكل مستمر6. اعتمادا على المنتج المحدد والمؤشر السريري، تتراوح جرعات التسريب النموذجية من حوالي 2 × 10إلى 5× 10 خلايا CAR+ T لكلمريض،7. الجرعات العالية من التسريب ضرورية لتحقيق تطهير فعال للأورام والسيطرة طويلة الأمد على الأمراض، لكنها مرتبطة بتحديات سريرية وعملية. قد تزيد الأعداد الكبيرة من الخلايا من خطر الآثار الجانبية الخطيرة مثل متلازمة إطلاق السيتوكينات (CRS) ومتلازمة السمية العصبية المرتبطة بالخلايا المناعية (ICANS)، وكلاهماقد يعتمد على الجرعة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تصنيع أعداد كافية من خلايا CAR T الوظيفية يمثل تحديا من المرضى المعالجين مسبقا بشدة أو يعانون من نقص لمفاو، وقد تكون العملية مرهقة لوجستيا ومكلفة لمراكز العلاج9.

على الرغم من هذه التحديات، تحقق علاجات خلايا CAR T الموجهة للCD19 معدلات شفاء كامل تتراوح بين 70٪-90٪ في المرضى الذين يعانون من أورام خبيثة بائية انتكسية أو مقاومة للعلاج، مما يظهر تأثيرا سريريا تحويليا 10,11,12. ومع ذلك، يواجه علاج خلايا CAR T تحديات ذات صلة تحد من فعاليته على المدى الطويل. تشمل العقبات الرئيسية فقدان أو انخفاض تنظيم المستضدات، وعدم كفاية استمرارية خلايا CAR T المستمرة، والإرهاق الوظيفي9. يعد إرهاق خلايا CAR T - الذي يتميز بانخفاض القدرة على التكاثر، وضعف النشاط المضاد للأورام، وضعف الاستمرارية - سببا حيويا لعدم الاستجابة والانتكاس13. تأتي خلايا CAR T المستنفدة مع انخفاض في وظيفة التأثير، واستمرار التعبير عن مستقبلات مثبطة، وإنتاج خلل في السيتوكينات بسبب التعرض المزمن للمستضدات والبيئات الدقيقة الوقائية للأورام14. أظهرت الدراسات السريرية أن فقدان استمرارية خلايا CAR T الوظيفية مرتبط بزيادة خطر الانتكاس 11,15,16,17. نظرا لأن النشاط المطول في الجسم الحي يبدو مؤشرا رئيسيا على نجاح العلاج، فإن فهم متانة وقدرة القتل المستمرة لمنتجات خلايا CAR T هو هدف مهم في كل من الأبحاث قبل السريرية والترجمية. ومن الأمور ذات الاهتمام الخاص قدرة خلايا CAR T على التعرف على خلايا الورم وتحليلها بشكل متكرر على مدى فترات طويلة - ما يسمى ب "القتل المتسلسل" - حيث توفر هذه الخاصية مقياسا وظيفيا للاستمرارية والمقاومة ضد الاستنزاف18.

توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لإجراء اختبارات القتل التسلسلي باستخدام منصة مقاومة تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA) من xCELLigence، بما في ذلك إجراء غسيل اختياري يتيح إعادة استخدام ألواح الاختبار، المعروفة أيضا باسم ألواح E، مما يحسن الكفاءة من حيث التكلفة دون التأثير على أداء الاختبار. ينبع مبرر تطوير مثل هذا البروتوكول من القيود في اختبارات السمية الخلوية التقليدية، التي عادة ما تقدم فقط قراءات ثابتة من نقاط النهاية. تتطلب الطرق الشائعة، مثل إطلاق الكروميوم-51، أو اختبارات إنزيم اللاكتات للهيدروجيناز (LDH)، أو اختبارات القابلية المعتمدة على قياس تدفق التوميترية، ملصقات، وتتطلب سير عمل يتطلب جهدا كبيرا، وتقتصر على نقاط زمنية محددة18,19. والأهم من ذلك، أنهم لا يستطيعون بسهولة التقاط حركيات القتل الديناميكي خلال التحفيز المطول أو التعرض المتكرر للمستضدات، وهو وضع مرتبط مباشرة باستمرارية خلايا CAR T والإرهاق الوظيفي18.

تعالج منصة xCELLigence RTCA هذه الفجوات من خلال توفير مراقبة حركية في الوقت الحقيقي وبدون علامات على مدى بقاء الخلايا المستهدفة عبر مقاومةكهربائية 20. تزرع الخلايا المستهدفة للورم الملتصقة على صفائح E مغطاة بأقطاب دقيقة ذهبية، حيث يزيد ارتباطها وتكاثرها من المقاومة المقاسة، والتي تم الإبلاغ عنها كمؤشر الخلية (CI)21. عند القتل الذي يصنع بواسطة CAR T، تقتل خلايا الهدف وتنفصل، مما يؤدي إلى انخفاض سريع في مقاومة20. يتيح هذا القراءة الفورية تقييما مستمرا للسمية الخلوية على مدى ساعات أو أيام دون الحاجة لأي ملصقات أو مواد إضافية22. خلايا CAR T غير الالتصقة، لا تساهم في إشارة المعاوقة، مما يسمح بفصل دقيق بين قراءات المؤثر والهدف23. نظرا لأن البيانات تسجل باستمرار، يمكن للباحثين إجراء بروتوكولات تحفيز متعددة الجولات حيث يتم نقل خلايا CAR T بشكل متكرر وتعرضها لخلايا الورم المستهدفة الجديدة، مما يسمح بقياس كيفية تطور قدرة القتل على مر الزمنبشكل مباشر 24. هذا يحاكي اللقاءات المتكررة للمستضد التي تمر بها خلايا CAR T في الجسم الحي ، ويوفر قراءة وظيفية لقدراتها السامة للخلايا.

هذا الاختبار القائم على المقاومة مناسب تماما للباحثين الذين يقيمون وظيفة خلايا CAR T في البيئات ما قبل السريرية، بما في ذلك تحسين البناء، والمقارنات الوظيفية، واختبار القوة. يتطلب هذا البروتوكول نظام xCELLigence RTCA واستخدام E-Plate 96. على الرغم من تطبيقه بشكل واسع على نماذج الأورام الملتصقة، إلا أنه غير مناسب مباشرة لزراعة التعليق بدون استراتيجيات تثبيت أو ربط. نظرا لأن قياسات المعاوقة وحدها تعكس فقط التزام الخلايا المستهدفة وقابليتها للبقاء على قيد الحياة، يوصى بالتحليلات التكميلية مثل قياس خلوية التدفق أو اختبارات السيتوكينات لتوصيف تنشيط خلايا CAR T بالكامل، وتكاثرها، وديناميكيات الإنزاف. يتضمن البروتوكول خطوات محددة تسمح بجمع الخلايا والفائقات لهذه القراءات الإضافية، مما يتيح تقييما أكثر شمولا لوظيفة خلايا CAR T العليا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لجهاز E-Plate 96 ويتطلب نظام xCELLigence RTCA. يتم زرع الخلايا الورمية الملتصقة مسبقا خلال الليل للوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي عند إضافة خلايا CAR التائية. اعتمادا على خط خلايا الورم وكثافة البذر، قد يتم تقصير هذه الفترة إلى 6 - 9 ساعات، مما يسمح بإضافة مؤثر في نفس اليوم. إذا تم تنفيذ سير العمل الأخير، يتم تعديل الجدول الزمني اليومي الاسمي الموصوف في البروتوكول، ويجب على المستخدمين تعديل الجدول الزمني وفقا لذلك. يتم الحفاظ على الزراعة المشتركة لمدة 48 ساعة قبل نقل خلايا CAR T إلى خلايا الورم التي تم تلوينها حديثا، مما يتطلب وضعين في لوحة على جهاز xCELLigence وتبديل الدرع وإضافة المؤثرات كل يومين. يجب توليد خلايا CAR T وفقا لمعايير التشغيل القياسية المؤسسية أو البروتوكولات المعتمدة. باختصار، يتم عزل خلايا الدم التائية الطرفية وفقا لمعايير أخلاقية معتمدة، وتحويلها تحت ظروف السلامة البيولوجية المناسبة، وتقييم كفاءة النقل وقابلية الانتقال من خلال قياس تدفق الخلايا أو اختبارات مراقبة الجودة المكافئة. لا ينبغي إجراء اختبارات xCELLigence عندما تكون كفاءة تحويل CAR أقل من 20٪، حيث أن انخفاض الكفاءة قد يؤدي إلى زيادة القتل الخلفي وغير المحدد بواسطة الخلايا غير المحولة، مما قد يشوه منحنيات نمو الورم. يجب أن تتم جميع مناولات الخلايا تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق طبقي. يمكن استخدام الوسائط وفقا لمعايير المختبر أو حسب توصية المورد. ما لم يذكر خلاف ذلك، يتم حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بينما تم تحسينها لخلايا CAR T العليا، يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضا على خلايا مؤثرة تعتمد على التعليق والأهداف الملتصقة.

1. التحضير والتخلص (اليوم الأول)

  1. تحضير الطبق
    1. أضف 50 ميكرولتر من وسط الورم إلى قاع كل بئر من صفيحة E 96.
      ملاحظة: كن حذرا من خدش قاع البئر لأن ذلك قد يسبب ضررا لللوحة.
    2. ضع لوحة E في الحاضنة، ووضعها في نفس فتحة الآلة لاستخدامها في القياسات.
    3. حضن لوحة E لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتصل إلى درجة حرارة الفحص ودرجة الحموضة المناسبة.
  2. إعداد الآلات الموسيقية
    1. في الوقت نفسه، شغل RTCA Software Pro (الإصدار 2.6.1) واختر مسار ملف لحفظ التجربة.
    2. أدخل اسم التجربة في حقل "مشغل RTCA" واحفظ.
    3. اختر الآبار التي سيتم قياسها.
    4. قم بتعيين أسماء الخلايا تحت تبويب الخلايا وأنواع العلاجات تحت تبويب العلاج .
  3. جدول القياس
    1. حدد الجدول بالخطوات التالية:
      اسم الخطوة = فارغ ؛ الضربات = 1 ; الفترة = 1 ؛ المدة = 0:00
      اسم الخطوة = خلايا الورم ؛ الضربات = 250-300 ; الفاصل = 15 دقيقة؛ المدة = الحد الأدنى 24 ساعة
      اسم الخطوة = العلاج ؛ الضربات = حتى 2500 ; الفترة = 5 دقائق؛ المدة = الحد الأدنى 72 ساعة
    2. اضغط على تطبيق وتأكد من عدم اختيار التلقائي لأي خطوة.
  4. خطوة الفراغ
    1. بعد حضانة لوحة E التي تستمر 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، اضغط على زر PLAY/RUN لبدء الخطوة الفارغة.
    2. انتظر حتى يضع البرنامج علامة على الخطوة المنتهية (حوالي دقيقة إلى دقيقتين).
    3. افتح الغلاف وأزل لوحة E فقط عندما تكون جاهزا للمضي قدما في بذر الخلايا.

2. الجولة الأولى: بذر خلايا الورم (اليوم الأول)

  1. زرع الخلايا الورمية
    1. جهز معلقا لخلايا الورم في 50 ميكرولتر من الوسط المناسب لكل بئر.
    2. أزل صفيحة E من الحاضنة وزرع الخلايا على شكل ثلاث نسخ.
  2. قياس البداية
    1. أعد لوحة E فورا إلى الجهاز وأغلق المهد.
    2. انتظر من 5 إلى 10 دقائق قبل القياس الأول لتوازن درجة حرارة صفيحة E ودرجة الحموضة، ثم اضغط على زر PLAY/RUN لبدء القياس (الخطوة 2 من الجدول = خلايا الورم).
    3. حضن صفيحة E طوال الليل للسماح بالتصاق الخلية. راقب مؤشر الخلايا غير الطبيعي. عندما يدخل CI مرحلة النمو اللوغاريتمية، انتقل إلى الخطوة التالية. تعتمد هذه المرحلة على خط الخلايا المستخدم ويمكن أن تتأثر بعدد الخلايا المبذرة. تم زرع خلايا BxPC3 (ATCC CRL-1687) عند 20,000 خلية في كل بئر، مع نمو لوغاريتيم عادة بعد 6-18 ساعة.

3. الجولة الأولى: علاج خلايا T في CAR (اليوم الثاني)

  1. تحضير وزرع الخلايا التائية
    1. تحضير العدد المطلوب من خلايا CAR T في 100 ميكرولتر/بئر في وسط خلية T البشرية بدون سيتوكينات تمدد (مثل IL-2، IL-7، IL-15، إلخ).
      ملاحظة: يتم قياس كفاءة تحويل CAR مرة واحدة في بداية التجربة. يتم تحديد نسبة المؤثر إلى الهدف (E:T) المطلوبة وفقا لعدد خلايا CAR⁺ T نسبة إلى الخلايا الورمية التي تم تغطيتها في البداية. على سبيل المثال، بالنسبة لنسبة E:T 1:1 مع 50٪ خلايا تائية CAR⁺ و20,000 خلية ورم BxPC3، يجب تغطية 40,000 خلايا تائية إجمالية. لذا تشير نسبة E:T إلى الحالة الأولية في بداية اختبار القتل المتسلسل؛ ما لم تجرى قياسات إضافية، تبقى التغيرات في E:T خلال الجولات اللاحقة غير معروفة. تعتبر التغيرات في تكاثر أو بقاء الخلايا التائية مع مرور الوقت، وبالتالي في نسبة E:T، جزءا من قراءة القتل المتسلسل. إذا تم تقسيم خلايا T بين جولات، يتم إعادة حساب E:T بشكل نسبي (على سبيل المثال، تقسيم 1:1 بعد الجولة الثالثة يقلل من نسبة E:T الأولية 2:1 إلى 1:1 للجولة الرابعة). إذا كانت ديناميكيات E:T بين الجولات محل اهتمام، يمكن طلاء آبار إضافية اختيارية لقياسات متوسطة لنسبة CAR ٪ أو دالة المؤثر. إزالة حبيبات تحفيز خلايا T المضادة ل CD3/CD28 عن طريق الفصل المغناطيسي يمكن أن تساعد في تقليل القتل غير المحدد. ينصح أيضا باستخدام الخلايا التائية في مرحلة النمو اللوغاريتمي (عادة بين 5 و20 يوما بعد التحفيز) وتوسيع الخلايا باستخدام السيتوكينات قبل يومين على الأقل من الاختبار، بدلا من اليوم الذي قبله.
    2. ضبط كفاءة تحويل CAR عبر مجموعات التجربة إلى أدنى نسبة شائعة عن طريق الخلط مع خلايا T غير المحولة، بناء على تحليل كفاءة التحويل.
      ملاحظة: إذا كانت جميع المجموعات متساوية في كفاءة التحويل، فلا حاجة لتعديل. إذا اختلفت نسب CAR⁺، يتم حساب عدد خلايا T في اللوحة بحيث تبدأ كل مجموعة بالعدد الفعال نفسه من خلايا CAR⁺ وخلايا CAR. يتم ذلك عن طريق ضرب عدد خلايا CAR⁺ المرغوب (بناء على نسبة E:T وزرع الورم) في 100 وقسمته على نسبة CAR⁺ المقاسة لكل مجموعة، ثم إضافة خلايا T غير المحولة إذا لزم الأمر لمطابقة إجمالي أعداد خلايا T. على سبيل المثال، إذا كان لدى مجموعة واحدة 50٪ خلايا تائية CAR⁺، يتم طلاء 40,000 خلية T (20,000 CAR⁺ + 20,000 CAR-)، بينما المجموعة التي تحتوي على خلايا T بنسبة 60٪ من CAR⁺ ستقوم بطلاء 33,333 خلية T لتوفير 20,000 خلية CAR⁺، مع إضافة 6,667 خلية T غير محولة لتتناسب مع إجمالي عدد خلايا T للمجموعة الأولى (المجموع 40,000).
    3. اختياريا، إذا كان من المقرر دراسة السيتوكين أو العلاج المركب، أضف 20 ميكرولتر من محلول يتكون من وسط خلية تائية بشري والسيتوكين أو المركب المطلوب بتركيز 11 ضعف التركيز النهائي المقصود. يضاف هذا الحجم فوق الكمية القياسية البالغة 200 ميكرولتر الموجودة بالفعل في كل بئر (50 ميكرولتر للبذر، 50 ميكرولتر لبذر خلايا الورم، وحتى 100 ميكرولتر لإضافة الخلايا التائية). وفقا للشركة المصنعة، يدعم E-Plate 96 حجما قصوى يبلغ 243 ميكرولتر ± 5 ميكرولتر لكل بئر، مما يجعل الحجم الإجمالي 220 ميكرولتر مقبولا لهذه المعالجات الاختيارية.
  2. زرع وقياس الخلايا التائية
    1. قم بإزالة لوحة E عن طريق فتح الحامل فقط عندما تكون جاهزة لإضافة خلايا T.
    2. أعدت البذرة خلايا T مباشرة إلى خلايا الورم.
    3. اقفل الحامل داخل جهاز القياس وأوقف الخطوة الثانية في برنامج RTCA.
      ملاحظة: إذا لم يتم إلغاء الخطوة 2، سيستمر النظام في قياس الخطوة السابقة ويتوقف فقط عند اكتمال تلك الخطوة، مما يؤدي إلى فقدان نقاط البيانات.
    4. انتظر حتى يتم وضع علامة على الخطوة 2 ب "انتهى".
    5. انقر على زر تشغيل/هرب لبدء الخطوة 3 (العلاج) وأكد التعليمات بالنقر على موافق.
      ملاحظة: السماح بفترة توازن تتراوح بين 15-30 دقيقة بعد المعالجة (مثلا، بعد البذر أو نقل الخلايا) قبل بدء خطوة القياس التالية (قبل الخطوة 3.2.5) يساعد في تقليل الانحراف الأولي الناتج عن تقلبات درجة الحرارة أو الرقم الهيدروجيني في منحنيات النمو.

4. الجولة الثانية: بذر الخلايا الورمية (اليوم الثالث)

  1. جهز لوحة كهربائية جديدة xCELLigence بسعة 96 بئر كما هو موضح في الخطوات 1.1 و1.4.
  2. بذور خلايا أورام طازجة كما هو موضح في الخطوة 2.
  3. حضن صفيحة E طوال الليل للسماح بالتصاق الخلية.

5. الجولة الثانية: نقل خلية CAR T إلى لوحة E الثانية (اليوم الرابع)

  1. انقل محتويات كل بئر إلى بئر متناظر من صفيحة U-bottom ببئر 96 باستخدام ماصة متعددة القنوات. كن حذرا من لمس الأقطاب الكهربائية في أسفل لوحة E.
  2. الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 400 × جرام لمدة 5 دقائق.
  3. استنشق المادة الفائقة بعناية واحتفظ بها لإجراء اختبار المقاومة المناعية المرتبطة بالإنزيمات (ELISA) إذا لزم الأمر.
  4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من وسط جديد بدون سيتوكينات التوسع.
    ملاحظة (اختياري): يمكن الآن تقسيم الخلايا التائية (مثلا، 50 ميكرولتر = 1:2) واستخدامها لمزيد من التحليل، مثل قياس تدفق الخلية. تقسيم الخلايا التائية يتكيف مع تكاثرها أثناء اختبار قتل xCELLigence. يساعد ذلك على تقليل عدد الدورات المطلوبة حتى يظهر الإرهاق. يوصى باختبار تقسيم النسب بين 2 و4.
  5. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من الخلايا التائية إلى صفيحة E الورمية الثانية (50 ميكرولتر إذا كانت الانقسام بنسبة 1:2)، مما يضمن تجديد كامل الوسيط وإذا كان ذلك ينطبق على السيتوكين/المركب.

   

6. استمرار اختبار القتل المتسلسل (الأيام 5 - 10 وما بعدها)

  1. كرر الخطوتين 4 و5 للحصول على جولات إضافية من القتل حسب الحاجة بفواصل زمنية مدتها 48 ساعة.
  2. راقب نشاط القتل واستمرارية الخلايا التائية في كل مرحلة باستخدام قراءات xCELLigence والاختبارات الإضافية مثل ELISA أو قياس تدفق الخلية.

7. جمع البيانات والتعامل مع اللوحة الإلكترونية

  1. بعد مدة القياس المطلوبة، اضغط STOP في البرنامج.
  2. تصدير البيانات التي تم تطبيعها إلى نقطة الزمن لإضافة الخلايا المؤثرة وغير المتوسطة لتمكين رسم متوسط ± SEM بدقة في برامج التحليل (R، GraphPad Prism، إلخ). صدر مجموعة البيانات المتوسطة إذا رغبت.
  3. افتح وأزل لوحة E. أطلق التجربة في البرنامج.
  4. تنظيف أو تخزين لوحة E في الحاضنة لإجراء تحليلات إضافية (مثل المادة الفائقة لتحليل ELISA أو حصاد الخلايا لقياس تدفق الخلية).

8. اختياري: غسل الألواح الإلكترونية لإعادة الاستخدام

ملاحظة: تسمح هذه الخطوة الاختيارية بإعادة استخدام ألواح xCELLigence الإلكترونية لتقليل تكاليف التجارب. يوصى بإعادة الاستخدام فقط إذا بقيت الخصائص الكهربائية للصفيحة الكهربائية مستقرة عبر التجارب وحتى تقع الآبار الفردية ضمن النطاق الأساسي المقبول. اتبع جميع إجراءات السلامة، خاصة عند التعامل مع هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). افحص الألواح الإلكترونية بصريا بعد الغسيل لاكتشاف الأعطال المحتملة في الأقطاب الكهربائية.

  1. تخلص من جميع محتويات لوحة E دون لمس أسفل اللوح.
  2. اغسل كل بئر ثلاث مرات بماء منزوع الأيونات بسعة 200 ميكرولتر.
  3. أضف 200 ميكرولتر من 0.1 مليون نيوم أوهرود إلى كل بئر.
    تحذير: NaOH يسبب التآكل. تأكد من اتباع إرشادات السلامة المحلية. ارتد القفازات والمعطف ونظارات السلامة. أتعامل مع 1 متر NaOH في خزانة أمان. تخلص من فضلات NaOH في الحوض مع تدفق الماء لضمان التخفيف المناسب. لا تخلط الأحماض المركزة والقواعد أبدا. لا تضف الماء إلى الحمض؛ فقط حمض الماء.
  4. حضن لوحة E في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  5. اغسل كل بئر ثلاث مرات على الأقل بماء منزوع الأيونات، لضمان إزالة كل بقايا NaOH.
  6. جفف لوحة E بالنقر عليها برفق على منديل، ثم تجفيفها بالهواء.
  7. قم بتعقيم لوحة E تحت ضوء UV داخل خزانة السلامة البيولوجية لمدة ساعة واحدة على الأقل أو جهاز إشعاع UV.
    ملاحظة: ضع لوحة E بحيث تواجه الآبار مباشرة للأعلى مباشرة. ضوء الأشعة فوق البنفسجية لا يخترق قاع الآبار البلاستيكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤدي التنفيذ الناجح للبروتوكول إلى نتائج قابلة للتكرار تعتمد على مقاومة تعكس قدرة خلايا الورم على البقاء وسمية خلايا CAR T مع مرور الوقت. تم تقييم نمو الخلايا وسمية الخلايا باستخدام نظام RTCA التجاري. تم التعبير عن البيانات كمؤشر خلوي طبيعي (NCI)، يتم حسابه بقسمة CI في كل نقطة زمنية على CI في زمن تطبيع محدد. يتم تحديد زمن التطبيع مباشرة قبل إضافة خلايا المؤثر. يعرف وقت الوصول إلى الإزالة بأنه الفترة حتى يصل NCI إلى الصفر بعد إضافة المؤثر. يتم حساب NCI بواسطة برنامج RTCA ويمكن تصديره لمزيد من التحليل، بما في ذلك معدل القت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة لتقييم السمية الخلوية التي تسببها خلايا CAR T خلال عدة جولات من التعرض للمستضد باستخدام منصة xCELLigence RTCA. من خلال تمكين القياس الطولي لبقاء خلايا الورم عبر الممانعة، يلتقط هذا النهج الاستجابات السامة للخلايا المتكررة - المعروفة بالقتل التسلسلي - بشكل مستمر وخالي من الملصقات. تم تصميم البروتوكول لمراقبة كيفية تغير وظيفة مؤثر الخلايا التائية مع مرور الوقت استجابة لتحديات خلايا الورم المتتالية، مما يوفر رؤى حول معايير مثل الاستمرارية الوظيفية، والإنزاف المبكر، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصلت SK على مكافآت من شركات مثل بليكتونيك، TCR2 Inc.، ميلتني، غالاباغوس، سيماب، نوفارتيس، ريجينيرون، BMS وGSK. SK هو مخترع لعدة براءات اختراع في مجال الأورام المناعية. تلقت SK رسوم ترخيص من TCR2 Inc وCarina Biotech. تلقت SK دعما بحثيا من TCR2 Inc.، وTabby Therapeutics، وCatalym GmbH، وPlectonic GmbH، وArcus Bioscience لأعمال غير مرتبطة بالمخطوطة. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصلت TT، SM، وNTTN على منح من مؤسسة إلس-كرونر فريسينيوس (IOLIN). حصلت NTTN على منح إضافية من مؤسسة فريدريش باور ومنظمة المساعدة الألمانية للسرطان (AvantCAR.de). يحظى MPT بدعم مؤسسة مونيكا كوتزنر والمجلس الأوروبي للبحوث (زمالة MSCA 101106951). تحظى SK بدعم البرنامج الدولي للدكتوراه 'i-Target: الاستهداف المناعي للسرطان' (الممول من شبكة النخبة في بافاريا)، ومركز أبحاث السرطان البافاري (BZKF) (TANGO to S.K.)، والجمعية الألمانية للأبحاث (DFG، رقم المنحة: KO5055-2-1 و KO5055/3-1)، وتحالف أبحاث الميلانوما (رقم المنحة 409510)، وشبكة تدريب ماري سكلودوسكا-كوري لتحسين علاج الخلايا التائية التبنية للسرطان (ممولة من برنامج هورايزن 2020 للاتحاد الأوروبي؛ منحة 955575)، شبكة ماري سكلودوفسكا-كوري التدريبية لتتبع والتحكم في الخلايا المناعية العلاجية في السرطان (بتمويل من برنامج هورايزن للاتحاد الأوروبي، منحة 101168810)، مؤسسة إلسي كرونر-فريسينيوس (IOLIN)، منظمة المساعدة الألمانية للسرطان (AvantCAR.de)، مؤسسة فيلهلم ساندر، مؤسسة إرنست يونغ، الاستراتيجية المؤسسية LMUممتاز من جامعة LMU ميونخ (ضمن إطار مبادرة التميز الألماني)، مبادرة Go-Bio-Initiative، جائزة m4 من وزارة بافاريا للشؤون الاقتصادية، وزارة البناء والمشاريع الاتحادية، برنامج يوروستار، المجلس الأوروبي للأبحاث (756017 المنحة الأولى، 101100460 منحة PoC وCoG 101124203)، من قبل SFB-TRR 338/1 2021-452881907، مؤسسة فريتز-بندر، مؤسسة خوسيه كاريراس الألمانية لوكامي، مؤسسة هيكتور، مؤسسة البحوث البافارية (BAYCELLATOR)، مؤسسة مونيكا-كوتزنر، مؤسسة برونو وهيلين يوستر (360° CAR)، مؤسسة الدكتور رورينسكي ومؤسسة بريجيت والدكتور كونستانزه فيغنر

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BxPC3ATCCCRL-1687
لوحة E 96أجيلينت 300600910
برنامج RTCA برو (Basic) أجيلينت لا يوجدالإصدار 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (لوحات متعددة)أجيلينت لا يوجد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Brudno, J. N., et al. T cells genetically modified to express an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of poor-prognosis relapsed multiple myeloma. J Clin Oncol. 36 (22), 2267-2280 (2018).
  5. Gauthier, J., et al. Phase 1 study of CD19 CAR T-cell therapy harboring a fully human scFv in CAR-naïve adult patients with B-ALL. Blood Adv. 9 (8), 1861-1872 (2025).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of CAR T-cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10 (12), e005678(2022).
  8. Foster, M., et al. Cross-study safety analysis of risk factors in CAR T-cell clinical trials: An FDA database pilot project. Mol Ther Oncolytics. 27, 182-194 (2022).
  9. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  10. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B-cell ALL patients. J Clin Invest. 126 (6), 2123-2138 (2016).
  11. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  12. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  13. Zugasti, I., et al. cell therapy for cancer: Current challenges and future directions. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 210(2025).
  14. Tao, Z., et al. Impact of T-cell characteristics on CAR-T cell therapy in hematological malignancies. Blood Cancer J. 14 (1), 213(2024).
  15. Wittibschlager, V., et al. T-cell persistence correlates with improved outcome in patients with B-cell lymphoma. Int J Mol Sci. 24 (6), 5688(2023).
  16. Myers, R. M., et al. Humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR) T cells in CAR-naive and CAR-exposed children and young adults with relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 39 (27), 3044-3055 (2021).
  17. Gardner, R. A., et al. Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults. Blood. 129 (25), 3322-3331 (2017).
  18. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  19. Peper, J. K., et al. An impedance-based cytotoxicity assay for real-time and label-free assessment of T-cell-mediated killing of adherent cells. J Immunol Methods. 405, 192-198 (2014).
  20. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLoS One. 13 (3), e0193498(2018).
  21. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol In Vitro. 20 (6), 995-1004 (2006).
  22. Lee, E. H. J., et al. Antigen-dependent IL-12 signaling in CAR T cells promotes regional to systemic disease targeting. Nat Commun. 14 (1), 4737(2023).
  23. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Evaluation of CAR-T cell cytotoxicity: Real-time impedance-based analysis. Methods Cell Biol. 167, 81-98 (2022).
  24. Sahoo, P., et al. Mathematical deconvolution of CAR T-cell proliferation and exhaustion from real-time killing assay data. J R Soc Interface. 17 (162), 20190734(2020).
  25. Li, N., Zhang, W. Calculation principles of Agilent xCELLigence RTCA software. , Agilent Technologies. (2022).
  26. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. J Vis Exp. (157), e60400(2020).
  27. Brezinger-Dayan, K., et al. Impact of cryopreservation on CAR T production and clinical response. Front Oncol. 12, 1024362(2022).
  28. Foulke, J. G., et al. Optimizing ex vivo CAR-T-cell-mediated cytotoxicity assay through multimodality imaging. Cancers (Basel). 16 (14), (2024).
  29. Cadinanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33 (5), 2291-2309 (2025).
  30. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-Plate cell sensor arrays in the xCELLigence real-time cell analyzer. Biotechniques. 61 (3), 117-122 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CAR T

مقالات ذات صلة