يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

أوثول يحسن التهاب المفاصل لدى الفئران عبر محور miR-34a/Bcl-2

96 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69624

⸱

مايو 15, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, and Public Experimental Research Center, Xuzhou Medical University, 2Department of Joint Surgery, Shuyang Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

أوستول (OST) هو مركب طبيعي ذو أنشطة دوائية واسعة. تشير هذه الدراسة إلى أن OST يخفف من تأثيرات التهاب المفاصل العظمي للركبة (KOA) عبر محور miR-34a/Bcl-2، كما يظهر في الدراسات الحية والمختبرية على الفئران، ويوفر أفكارا واتجاهات جديدة لطبية البراءات وتطبيقاته السريرية.

الملخص

التهاب المفاصل التنكسي في الركبة (KOA)، المعروف أيضا باسم التهاب المفاصل التضخمي أو التنكسي، هو اضطراب شائع في المفاصل الموسيقية. تشمل استراتيجيات الإدارة السريرية الحالية العلاج الدوائي، والتدخل الطبيعي، والإجراءات الجراحية، والعلاجات الإضافية. بينما يمكن لهذه الطرق أن تخفف من أعراض KOA إلى حد ما، إلا أنها غالبا ما تأتي مع قيود مثل الآثار الجانبية، أو الفعالية المحدودة، أو التدخل الداخلي. أوستول (OST)، مشتق طبيعي من الكومارين، تم دراسته على نطاق واسع لخصائصه الطبية، خاصة في تخفيف آلام المفاصل وتحسين وظائف المفاصل. في هذه الدراسة، تم استخدام اختبار CCK8، والمجهر الإلكتروني الناقل (TEM)، وتلوين H&E، والتحليل الكيميائي الحيوي في المصل لإثبات أن OST يمارس تأثيرات وقائية على الخلايا الغضروفية في المختبر والجسم، دون ملاحظة سمية كبيرة. كشفت التحقيقات اللاحقة باستخدام TEM، وتلوين الأكريدين البرتقالي، وقياس تدفق الخلايا الخلية، والطلاء الغربي أن OST يعزز الالتهام الذاتي ويثبط الموت المبرمج في الخلايا الغضروفية. أشارت دراسات ميكانيكية إضافية من خلال اختبارات qRT-PCR وتحليلات تقرير اللوسيفيراز إلى أن OST يقلل من تنظيم miR-34a، مما يزيد من تعبير Bcl-2 ويثبط الموت المبرمج عبر مسار miR-34a/Bcl-2. باختصار، تشير هذه النتائج إلى أن OST يحمي الخلايا الغضروفية في النماذج الخلوية والحيوانية، مما يخفف من التوتر الناتج عن LPS ويقلل الالتهاب والموت المبرمج في فئران KOA. يساهم انخفاض تنظيم miR-34a والزيادة اللاحقة في تعبير Bcl-2 في تأثيره المضاد للاستماتة. توفر هذه النتائج أساسا نظريا لتطوير الأدوية المعتمدة على براءة اختراع OST وإمكانية ترجمتها السريرية في علاج KOA.

المقدمة

التهاب المفاصل العظمي للركبة (KOA) هو مرض شائع في المفاصل يعرف أيضا باسم التهاب المفاصل الضخم أو الضخم أو التهاب المفاصل الركبة الضخم (KOA). يحدث ذلك بسبب تدهور الغضروف المفصلي وتغيرات في البنية حول المفصل. وفقا للدراسات الوبائية، التهاب المفاصل العظمي في الركبة مرض شائع، خاصة بين كبار السن1. وحدوث ذلك مرتبط ارتباطا وثيقا بالعمر، والوزن، والجينات، وإصابات المفاصل، وما إلى ذلك. يمكن أن تتأثر الوظائف الفسيولوجية أيضا، بما في ذلك حركة المفاصل المحدودة، وضعف قوة العضلات، والمشية غير الطبيعية. حاليا، في علاج التهاب المفاصل العظمي للركبة، تشمل الطرق الشائعة العلاج الدوائي، العلاج الطبيعي، الجراحة، والعلاج المساعد2. غالبا ما تشمل الأدوية المسكنات، وأدوية مضادة للالتهاب غير ستيرويدية، وأدوية التهاب المفاصل المزمن لتقليل الألم والسيطرة على الالتهاب. يشمل العلاج الطبيعي الكمادات الساخنة، والكمادات الباردة، والتدليك، وتمارين إعادة التأهيل المحددة لتحسين وظيفة المفصل الحركية وتقليل الألم. يمكن أن يشمل العلاج الجراحي جراحة المنظار، استبدال المفصل الصناعي، أو إصلاح شكل عظام المفصل لاستعادة بنية المفصل ووظائفها. علاوة على ذلك، تستخدم العلاجات التكميلية مثل الوخز بالإبر، العلاج الطبيعي، والطب الصيني التقليدي على نطاق واسع.

ومع ذلك، رغم أن هذه العلاجات توفر بعض الراحة من الأعراض وحالة التهاب المفاصل العظمي في الركبة، إلا أن هناك قيودا. قد يكون للعلاج الدوائي ردود فعل سلبية ومشاكل اعتماد؛ يتطلب العلاج الطبيعي عملية إعادة تأهيل مستمرة، وتختلف النتائج حسب الاختلاف الفردي؛ العلاج الجراحي محفوف بالمخاطر، وعملية التعافي طويلة وتحتاج إلى دراسة دقيقة؛ وعلى الرغم من أن العلاج المساعد حظي باهتمام وتطبيق واسع، إلا أن هناك دعما علميا محدودا لفعاليته، إلا أن دراسة آلية تنظيم العلاج المساعد تحتاج إلى دراسة عميقة. في العلاج المساعد، تم استخدام الأدوية الصينية التقليدية لعلاج التهاب المفاصل العظمي في الركبة على نطاق واسع في العديد من المجالات وأثبتت فائدتها. لابد أن هناك بعض مكونات الطب الصيني التقليدي التي لم تعرف جيدا بعد، لكنها أثبتت من خلال الممارسة طويلة الأمد ودراسات المتابعة. حاليا، اكتسبت العديد من الطب الصيني خبرة غنية في علاج التهاب المفاصل العظمي للركبة، مثل سيبوتيوم باروميتز3، ليغوستيكوم واليشي فرانشات4، أنجيليكا بوبسينس5، وغيرها. هذه الأعشاب لها تأثيرات مسكنة ومضادة للالتهابات يمكنها تخفيف الألم وتقليل الالتهاب بفعالية.

OST هو مركب يشبه الكومارين يستخدم على نطاق واسع في الطب كمستخلص عشبي طبيعي6. لديها العديد من الأنشطة الدوائية وتدعمها العديد من الدراسات. أظهرت الدراسات أن للسينيديم العديد من الأنشطة الدوائية، بما في ذلك مكافحة الأورام، ومكافحة الالتهابات، وارتفاع سكر الدم، ومكافحة تجمع الصفائح الدموية، والحماية العصبية، وله تأثيرات علاجية محتملةعلى العديد من الأمراض الأخرى. وقد أبلغ أن OST يمكن أن يعزز الاستماتة المبرمجة لخلايا السرطان عن طريق تنظيم الالتام الذاتي، حيث يثبط OST استماتة خلايا سرطان المبيض من خلال الالتهام الذاتي المعتمد على LC3 والبيروبتوز المعتمد على GSDME8؛ تحفز OST خلايا HT-29 الاستماتة عبر إجهاد الشبكة الإندوبلازمية والالتهام الذاتيللخلايا 9; يعزز OST الاستماتة المبرمجة لسرطان القولون والمستقيم من خلال كبح إشارات AMPK/Akt، مما يحفز الالتهام الذاتي الخلوي، ROS، والفيروبوتوز10؛ قد يثبط OST نمو سرطان القولون والمستقيم من خلال تنظيم الالتهام الذاتي ونقل الإشارة التي تعبر عنها الميتوكوندريا11. في الوقت نفسه، يلعب OST دورا خاصا في تخفيف آلام المفاصل وتحسين وظيفة المفاصل، خاصة من خلال تقليل الاستجابة الالتهابية وتخفيف آلام المفاصل. ومكوناته الفعالة يمكن أن تقلل من إفراز المواد الالتهابية وتثبط تدهور غضروف المفاصل الناتج عن التهاب المفاصل. مقارنة بالأدوية الغربية الشائعة، فإن OST أكثر أمانا وله سمية منخفضة، والاستخدام طويل الأمد لن يؤدي إلى مقاومة للأدوية. وقد تم الإبلاغ أن الأوثول يعزز تكوين العظام في الخلايا العظمية من خلال رفع عامل النسخ في الأوستريكس عبر إشارات cAMP/CREB في المختبر وفي الجسم الحي12؛ يثبط OST تطور التهاب المفاصل العظمي في الركبة من خلال تعزيز الالتهام الذاتي المنشط عبر مسار AMPK/ULK113؛ يثبط لاكتون الكنيديوم تمايز الفصول العظمية من خلال مسار الإشارة p38 MAPK وPI3K-Akt وc-Fos/NFATc114؛ يمنع لاكتون الكنيديم فقدان العظام في نموذج الفئران المبيضي من خلال مسار إشارة الإستروجين-α/BMP-2/Smad15؛ تحسين OST هشاشة العظام من خلال زيادة الالتهام الذاتي للخلايا الجذعية الميزنشيمية16. ومع ذلك، أشار الملاحظة والتحليل إلى أن معظم الدراسات بقيت ضمن النمط الظاهري، أو فشلت في كشف آلية تنظيم مسار الإشارات لمشاركة الأدوية على المستوى الجزيئي، وكان هذا أيضا أحد الأسباب التي تجعل المركبات المستخرجة من الطب الصيني التقليدي صعبة القبول على نطاق واسع. لذلك، من المهم جدا استكشاف آلية التنظيم البيولوجي لأوستول على المستوى الجزيئي من أجل طبها الحاصل على براءات الاختراع وتطبيقها السريري.

ال miRNA هو RNA صغير ينظم الوظيفة البيولوجية عن طريق تثبيط تعبير الجينات المستهدفة. العديد من الطب الصيني التقليدي معروف بتأثيره البيولوجي من خلال تنظيم الميكرو RNA. وبالمثل، تم الإبلاغ عن تأثير OST على تعبير الميكرو RNA. أولا، يلعب OST دورا بيولوجيا مضادا للأورام من خلال miRNA. تم الإبلاغ أن OST تثبط تكاثر الخلايا وأدى إلى استماتة الخلايا من خلال تقليل تعبير CPEB2 عبر زيادة تنظيم miR-424 في سرطان بطانة الرحم17؛ يقوم OST بكبح التكاثر ويسرع من موت الخلايا المبرمجة لخلايا الورم الدبقي البشرية من خلال رفع تنظيم miR-16 وخفض MMP-918؛ يظهر OST تأثيرا مضادا للأورام في ورم الشبكية الأرومية من خلال تثبيط مسار PI3K/AKT/mTOR وتنظيم المحور19 hsa_circ_0007534/miR-214-3p. ثانيا، يمكن ل OST أيضا أن يؤثر على العمليات الفسيولوجية لأعضاء الجسم من خلال تنظيم ال miRNA، الذي يخفف OST من إعادة تشكيل الأوعية الدموية الرئوية عن طريق تعديل إعادة برمجة أيض الدهون التي تتوسط miR-22–3p20؛ يحمي OST الفئران من إصابات نقص التروية/إعادة التروية في عضلة القلب من خلال خفض تنظيم miR-30a وتعزيز الالتهام الذاتي21؛ تحمي OST خلايا عضلة القلب H9c2 من الضرر الناتج عن الترازوزوماب من خلال تعزيز الالتهام الذاتي عبر مسار الإشارة p38MAPK/mTOR22. ثالثا، يمكن أن يلعب OST دورا وقائيا عصبيا من خلال miRNA، الذي حفز OST تمايز الخلايا الجذعية العصبية إلى خلايا عصبية في نموذج خلوي مرض الزهايمر عبر زيادة تنظيم miR-9 وأنقذ الضعف الوظيفي لخلايا الحصين العصبية في فئران APP/PS1 المعدلةوراثيا 23؛ يقلل OST من مستويات بيتا أميلويد من خلال زيادة تنظيم miR-107 في مرض الزهايمر 24. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن أن ال miRNA يمكن تنظيمه بواسطة OST لعلاج التهاب المفاصل العظمي في الركبة. أظهرت الأدبيات أن miR-34a يعزز الاستماتة الغضروفية ويسهل تطور التهاب المفاصل العظمي من خلال استهداف DLL1 وتنظيم مسار PI3K/AKT25. ينظم MEG3 الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل تطور التهاب المفاصل العظمي عن طريق تنظيم محور miR-34a/Klotho26؛ يؤدي انخفاض تنظيم miR-34a إلى تعزيز التكاثر وثبط الاستماتة المبرمجة لخلايا الغضروف العظمية لدى الفئران عن طريق تنشيط مسار PI3K/Akt27. إذا، هل يمكن علاج KOA باستخدام OST عبر تنظيم miR-34a؟ لذلك، يفترض أن OST يمكنه علاج التهاب المفاصل العظمي في الركبة عن طريق تنظيم ال miRNA.

باختصار، OST مركب طبيعي ذو أنشطة دوائية واسعةالنطاق 28. في وقت سابق، أكدت مجموعة البحث أن OST يمكن أن يحسن التهاب المفاصل العظمي في الركبة لدى الفئران، لكن نقل الإشارات الخلوية والآليات الجزيئية التي تقوم عليها هذه التأثير البيولوجي لم يتم توضيحها بالكامل. في هذا المقال، ومن خلال دراسة مسارات الإشارة الميكرو المغناطيسية للرنا، والالتهام الذاتي، واستمات الخلايا المبرمجة في طب العصبانات الخارجية، يهدف إلى توضيح آلية OST في علاج التهاب المفاصل العظمي في الركبة وتقديم أفكار واتجاهات جديدة لطبها الحاصل على براءات اختراع وتطبيقاته السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل لجنة رعاية وعلاج الحيوانات المؤسسية في جامعة شوزو الطبية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. نموذج الحيوان

تم شراء ذكور وإناث من جرذان سبرايغ-داولي (SD) البالغين الذين يتراوح وزنهم بين 250–300 جرام من مركز الحيوانات التجريبية في جامعة شوزو الطبية. تم تربية الفئران في غرفة خاصة خالية من الممرضات. اتبعت إجراءات التجارب على الحيوانات، بما في ذلك العلاج والرعاية واختيار النهاية، إرشادات "أبحاث الحيوان: الإبلاغ عن تجارب في الجسم". أجريت تجارب على الحيوانات باستخدام العشوائية. تم تقسيم فئران SD إلى أربع مجموعات (n = 8 لكل مجموعة): المجموعة الطبيعية (بدون جراحة، تغذية طبيعية) (المجموعة الطبيعية)، مجموعة الشامي (جراحة صورية: شق جلدي وعضلي بدون قطع رباط صليبي أمامي [ACLT]، تليها تمزيق محلول ملحي)، مجموعة KOA/NC (جراحة ACLT + تجويف محلول ملحي)، مجموعة KOA/OST (جراحة ACLT + تجويف OST). تم بناء نموذج KOA لركبة الجرذ باستخدام طريقة قطع الأربطة الصليبية الأمامية (ACLT) كما تم وصفهاسابقا 29. تم إعطاء مجموعة المحلول الملحي عبر الجافاج، وتم إعطاء مجموعة OST عبر الجافاج لمدة 4 أسابيع. جرعة OST هي 50 ملغ/كجم من وزن الجسم (مذاب في PEG 400 ومخففة بمحلول ملحي فسيولوجي)، وتكرار الإعطاء هو مرة واحدة يوميا لمدة 4 أسابيع في قسم الفئران. ثم تم إعدام الفئران للتحليل (وفقا لبروتوكولات معتمدة مؤسسيا). كانت الأنسجة إما مجمدة فورا في النيتروجين السائل أو مثبتة في 4٪ بارافورمالديهايد.

2. زراعة الخلايا

تم الحصول على خط الخلايا الغضروفية البشرية (C28/I2) من مجموعة الزراعة الأمريكية (ATCC، ماناساس، فيرجينيا). تم زراعة الخلايا وفقا لإرشادات ATCC واستخدامها خلال 6 أشهر.

ظروف الزراعة: وسط DMEM/F-12 مغذى ب 10٪ مصل أبقار جنيني و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين، يحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطبية بتركيز ثاني أكسيد الكربون 5٪.

العلاجات: تم زرع الخلايا عند 1 ×10 6 خلايا/بئر في صفائح ذات 6 آبار؛ بعد 24 ساعة من الالتصاق، عولجوا ب LPS (1 ميكروغرام/مل) وحده أو ب OST (100 ميكرومولار) لمدة 24 ساعة.

3. اختبارات لجدوى الخلايا

تم حضانة خلايا الغضروفية مع OST أو LPS بتركيزات مختلفة في صفائح 96 بئر. يعكس اختبار CCK8 قدرة الخلايا على الاستمرار من خلال اكتشاف الامتصاص (OD450 نانومتر) باستخدام قارئ الميكروبلايت، مع القيم الأعلى للطاقة الزائدة التي تشير إلى وجود خلايا أكثر قابلية للحياة.

تدرج تركيز الموسيقى التصويرية: 0، 25، 50، 100، 200، 400 ميكرومولار (تم حضانته لمدة 24 ساعة). أظهر اختبار CCK8 >90٪ من الحيوية للخلايا في جميع التركيزات، مما أكد عدم سمية المركب.

تدرج تركيز LPS: 0، 0.1، 0.5، 1، 2 ميكروغرام/مل (تم حضانته لمدة 24 ساعة). كانت مجموعة LPS بحجم 1 ميكروغرام/مل تتمتع بحيوية خلاياي ~50٪ (مقارنة بمجموعة Ctrl)، لذا تم اختيار هذا التركيز للتجارب اللاحقة.

4. تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) وتلوين السافانين O

تم تضمين الأنسجة بالبارافين، وإزالة الشمع، وإعادة ترطيبها، وصبغها بمواد H&E وSafranin O/Fast Green وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ظروف التلوين: تركيز العمل في AO كان 1 ميكروغرام/مل؛ تم حضانة الخلايا عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في الظلام.

الطريقة الكمية: تم حساب معدل إيجابية AVO عن طريق عد الخلايا التي تحتوي على نقاط برتقالية في 5 حقول عشوائية (×تكبير 400) لكل عينة باستخدام برنامج ImageJ. ثم تم التقاط المقاطع تحت مجهر BX43 (تكبير ×400).

5. قياس التدفق الخلوي

تم جمع الخلايا وإعادة تعليقها في محلول Annexin-V FIC/PI لتحليل الاستماتة المبرمجة. ظروف الحضانة: تم إعادة تعليق الخلايا عند 1 ×10 6 خلايا/مل في محلول Annexin-V FIC/PI (KeyGEN) وحضنتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام.

استراتيجية البوابة: التبعثر الأمامي (FSC) مقابل تم استخدام بوابات التبعثر الجانبي (SSC) لاستبعاد حطام الخلايا؛ تم تعريف خلايا Annexin-V FITC⁺/PI⁻ على أنها مبكرة الاستماتة، وخلايا Annexin-V FITC⁺/PI⁺ على أنها متأخرة الاستماتة. مخطط البوابات مدرج في الملف التكميلي 1 (بيانات قياس خلوية التدفق الخام). تم جمع الخلايا بواسطة مقياس تدفق خلوي. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج فلو جو.

6. نقل البلازميدات والمحاكاة

تم الحصول على MiR-34a المقلد (34a-مقلد)، والقلد غير النوعي للتحكم (NC) من مصدر تجاري. تم نقل الخلايا باستخدام البلازميدات باستخدام LipofectamineTM 3000 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

7. صبغة البرتقال الأكريدين

عادة ما كان يتم تقييم التهام الذاتي عن طريق صبغ الأكريدين البرتقالي في الخلايا. بعد معالجة الخلايا ب LPS أو OST بتركيزات محددة لمدة 24 ساعة، تم حضانها ب AO (1 ميكروغرام/مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في الظلام. تم التقاط الصور باستخدام مجهر ليزري كونفوكلي. تم حساب معدل إيجابية AVO عن طريق عد الخلايا التي تحتوي على نقاط برتقالية في 5 حقول عشوائية (×تكبير 400) لكل عينة باستخدام برنامج ImageJ. يتم الإبلاغ عن البيانات كمتوسط ± الديانا من ثلاث تجارب مستقلة.

8. مراقبة المجهر الإلكتروني الناقل

تم تثبيت العينات في 2.5٪ جلوتارالديهيد و1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم، ثم جففت وشطفت وتلقب. بعد البلمرة، تم تقطيع العينات إلى مقاطع بسماكة 70 نانومتر باستخدام ميكروتوم فائق الميكرو. تمت ملاحظة البنية الفائقة للخلايا بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل.

9. الحقن المناعي

تم شراء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر (Abs) ضد Bcl-2 (#68103)، والأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرنب ضد LC3 (#14600-1-AP)، وIL-6 (21865-1-AP)، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر ضد β-أكتين (#66009-1-lg) من Proteintech. تم الحصول على عضلات بطن ثانوية مرتبطة ب IRDye 800CW ماعز (متعدد النسالات) مضاد للأرنب IgG (H+L) أو IRDye 800CW ماعز (متعدد النسالات) مضاد للفأر IgG (H+L) تجاريا. تم تحلل الخلايا في اختبار تحلل كامل للخلية، مفصولا بواسطة الرحلان الكهربائي في الرحلان الكهربائي الهلام بولي أكريلاميد SDS. تم اكتشاف البروتينات باستخدام Abs الأولية وAb الثانوية المقابلة. كان تحميل البروتين 30 ميكروغرام لكل مسار؛ تخفيف الأجسام المضادة الأولية: Bcl-2 (1:1000)، LC3 (1:1500)، β-التوبولين (1:5000); تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية (IRDye 800CW) عند 1:10,000، IL-6 (1:800). ثم تم التقاط أشرطة البروتين بواسطة نظام التصوير بالليزر الكيميائي المعزز. تم قياس نطاقات البروتين بواسطة برنامج ImageJ.

10. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)

تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام كاشف تريزول. تم تصنيع cDNA المستمدة من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة cDNA regent وتحليلها بطرق SYBR Green. تم تصنيع cDNA المستمدة من miRNA باستخدام مجموعة cDNA للسلسلة الأولى miRcute plus miRNA وتم تحليلها بواسطة مجموعة qPCR miRcute plus miRNA. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم حساب تعبير النص المستهدف باستخدام طريقة 2-△△ CT . تم استخدام GADPH وU6 كتحكم في التحميل ل mRNA و miRNA على التوالي. تسلسل البادئات مدرج في الجدول 1.

11. اختبارات مراسل لوسيفيراز

بلازميد مراسل Bcl-2-3′UTR من النوع البري (WT) وبلاسميد مراسل Bcl-2-3′UTR مع بلازميد متحول في موقع ارتباط miR-34a (Mut). تم نقل المراسلين وجهاز miR-34a المقلد معا إلى خلايا غضروفية باستخدام LipofectamineTM 3000. تم جمع الخلايا وتحللها بعد 24 ساعة من النقل. ثم تم قياس شدة اللوسيفراز باستخدام مجموعة اختبار الجين Dou-LumiTM Luciferase Reporter وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

12. اختبارات تحليل المشي

تم استخدام نظام MGT-PR لمراقبة حركات الأطراف الجريئة للفئران في كل مجموعة. قبل الاختبار، سمح للفئران بالتكيف مع بيئة المدرج. تم تسجيل بيانات المشي أثناء المشي الحر، مع تسجيل ثلاث تجارب مشي صالحة متتالية لكل فأر. شملت المعايير المحللة طول الخطوة، مدة التأرجح، والتنسيق بين الأطراف الخلفية اليمنى واليسرى.

13. التحليل الإحصائي

أجريت التجارب على ثلاث نسخ وتكررت بشكل مستقل على الأقل ثلاث مرات. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism 9. تم عرض البيانات كمتوسط ± ديلا. تم تقييم الفروق الإحصائية بواسطة اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (اختبار توكي بعد التاريخ) للمقارنات المتعددة، أو بواسطة اختبار Student t ذي الذيل لمقارنتين تجريبيين بين مجموعتين. تم قبول الفروق على أنها ذات دلالة عند p < 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

خلايا الغضروفية المحمية من OST سواء في المختبر أو في الجسم الحي
كمنتج طبيعي، يتطلب ملف السلامة في OST تحقيقا دقيقا. قامت هذه الدراسة أولا بتقييم سمية الخلايا على الخلايا الغضروفية في المختبر باستخدام اختبار CCK8. أظهرت النتائج أن OST لم يظهر أي سمية تجاه الخلايا الغضروفية حتى عند تركيز 400 ميكرومولار (الشكل 1A). لفحص التأثيرات المضادة للالتهابات ومضادة الاستبرجة لOST على الخلايا الغضروفية، تم تقييم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقبل كل شيء، حمى OST الخلايا الغضروفية من الإجهاد الناتج عن LPS في المختبر ، وخفف الالتهاب واستماتة المبرمجة في فئران KOA في الجسم الحي. ارتبطت هذه التأثيرات الوقائية بانخفاض تنظيم miR-34a وزيادة في تعبير Bcl-2، بما يتوافق مع الدور المقترح لمحور miR-34a/Bcl-2 في التوسط في تأثير OST.

في هذه الدراسة، وجد أن OST يعزز الالتهام الذاتي لخلايا الغضروفية ويقلل من الموت المبرمج في المختبر وفي الجسم الحي. تم تحليل الآليات الجزيئية ذات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب مالي في المصالح لدى المؤلفين.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل مختبر الأدوية الجديدة والطب السريري في جامعة جيانغسو (XZSYSKF2021037). أجريت التجارب الواردة في هذا المقال جزئيا في مركز البحوث التجريبية العامة ومركز الحيوانات المختبرية في جامعة شوزو الطبية. يشكر فوكسينغ دونغ، كيجيا تشانغ، جينشيا كواي، ومين تشانغ على مساعدتهم الحماسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ رباعي أكسيد الأوزميومتقنية رويكسين
2.5٪ جلوتارالديهيدتكنولوجيا تشونغجينغيي
برتقال أكريدينسيغماأمريسكو 0360
حل Annexin-V FITC/PIكي جينKGA107
Bcl-2بروتين تك#68103
مجموعة عد الخلايا-8VICMED39.VC5001L
التوألؤ الكيميائيأوديسي CLX
المجهر الكونفوكاليلايكاستيلاريس 5
DMEM/F-12هايكلون12.SH30023-01
مجموعة اختبار جيني Double-LumiTM Luciferase ReporterبيوتايمRG088
مجموعة الريجنت من فاست كينج cDNAتيانغنKR116-03
مقياس التدفق الخلويBDنشيد FACS الثاني
خط الخلايا الغضروفية البشريةمجموعة ثقافة الأنواع الأمريكيةYTLK280144
LC3بروتين تك#14600-1-AP
ليبوفكتامينTM 3000إنفيتروجينL3000015
الدهون الدهنية السكريةسيغما29.L2880
اختبار التحليلكي جينKGP704-100
قارئ الميكروبليتBioTekالتآزر 2
مجموعة cDNA للسلسلة الأولى من miRcute Plus miRNAتيانغنKR211-02‌
miRcute plus miRNA qPCR kitتيانغنFP411-02
أوستولميدكيم إكسبريسO815127-25 جرام
الرحلان الكهربائي الهلام بالبولي أكريلاميد SDSNCM BiotechP2012
المصلكلارك بيوساينسFB15015
SYBR GreenتيانغنFP217-01‌
المجهر الإلكتروني الناقلFEIتيكناي G2
فائق الصغرليسياUC7
مجهر فلوري قائمأوليمبوسBX43
β-Actinبروتين تك#66009-1-LG

المراجع

  1. Kan, H. S., et al. Non-surgical treatment of knee osteoarthritis. Hong Kong Med J. 25 (2), 127-133 (2019).
  2. Dantas, L. O., Salvini, T. F., McAlindon, T. E. Knee osteoarthritis: Key treatments and implications for physical therapy. Braz J Phys Ther. 25 (2), 135-146 (2021).
  3. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1-15 (2022).
  4. Li, H., et al. Intra-articular injection of a nanosuspension of tetramethylpyrazine dihydroxynaphthalenate for stronger and longer-lasting effects against osteoarthritis. J Biomed Nanotechnol. 17 (6), 1199-1207 (2021).
  5. Qiang, R., et al. Carbon quantum dots derived from herbal medicine as therapeutic nanoagents for rheumatoid arthritis with ultrahigh lubrication and anti-inflammation. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (32), 38653-38664 (2023).
  6. Sun, M., Sun, M., Zhang, J. Osthole: An overview of its sources, biological activities, and modification development. Med Chem Res. 30 (10), 1767-1794 (2021).
  7. Yang, S., et al. Osthole: An up-to-date review of its anticancer potential and mechanisms of action. Front Pharmacol. 13, 945627(2022).
  8. Liang, J., et al. Osthole inhibits ovarian carcinoma cells through LC3-mediated autophagy and GSDME-dependent pyroptosis except for apoptosis. Eur J Pharmacol. 874, 172990(2020).
  9. Zhou, X. H., Kang, J., Zhong, Z. D., Cheng, Y. Osthole induces apoptosis of HT-29 cells via endoplasmic reticulum stress and autophagy. Oncol Lett. 22 (4), 726(2021).
  10. Zhou, X., Kang, J., Zhang, L., Cheng, Y. Osthole inhibits malignant phenotypes and induces ferroptosis in KRAS-mutant colorectal cancer cells via suppressing AMPK/Akt signaling. Cancer Chemother Pharmacol. 92 (2), 119-134 (2023).
  11. Song, J., et al. Osthole impairs mitochondrial metabolism and the autophagic flux in colorectal cancer. Phytomedicine. 125, 155383(2024).
  12. Zhang, Z. R., et al. Osthole enhances osteogenesis in osteoblasts by elevating transcription factor Osterix via cAMP/CREB signaling in vitro and in vivo. Nutrients. 9 (6), 588(2017).
  13. Ma, T., et al. Osthole suppresses knee osteoarthritis development by enhancing autophagy activated via the AMPK/ULK1 pathway. Molecules. 27 (23), 8624(2022).
  14. Liang, J. Y., Wu, W. L., Chen, Y. X., Liu, H. The efficacy and potential mechanism of cnidium lactone to inhibit osteoclast differentiation. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 3087-3093 (2019).
  15. Wang, Z., Bao, H. W., Xu, Y. J. Cnidium lactone prevents bone loss in an ovariectomized rat model through the estrogen-α/BMP-2/Smad signaling pathway. J Cell Biochem. 121 (10), 4567-4576 (2020).
  16. Zheng, X., et al. Osthole improves therapy for osteoporosis through increasing autophagy of mesenchymal stem cells. Exp Anim. 68 (4), 347-355 (2019).
  17. Lu, K., Lin, J., Jiang, J. Osthole inhibits cell proliferation and induces apoptosis through decreasing CPEB2 expression via upregulating miR-424 in endometrial carcinoma. J Recept Signal Transduct. 40 (1), 89-96 (2020).
  18. Lin, K. A. I., et al. Osthole suppresses proliferation and accelerates apoptosis of human glioma cells via upregulation of microRNA-16 and downregulation of MMP-9. Mol Med Rep. 12 (3), 4592-4597 (2015).
  19. Lv, X., et al. Osthole exhibits an anti-tumor effect in retinoblastoma through inhibiting the PI3K/AKT/mTOR pathway via regulating the hsa_circ_0007534/miR-214-3p axis. Pharm Biol. 60 (1), 417-426 (2022).
  20. Niu, Z., et al. Osthole alleviates pulmonary vascular remodeling by modulating microRNA-22-3p mediated lipid metabolic reprogramming. Phytomedicine. 96, 153840(2022).
  21. Lu, W. Osthole down-regulates miR-30a and promotes autophagy to protect rats against myocardial ischemia/reperfusion injury. Turk J Thorac Cardiovasc Surg. 27 (2), 178-184 (2019).
  22. Hou, H., Yang, Y., Chen, R., Guo, Z. Osthole protects H9c2 cardiomyocytes against trastuzumab-induced damage by enhancing autophagy through the p38MAPK/mTOR signaling pathway. Toxicol In Vitro. 93, 105704(2023).
  23. Li, S. H., et al. Osthole stimulated neural stem cells differentiation into neurons in an Alzheimer’s disease cell model via upregulation of microRNA-9 and rescued functional impairment of hippocampal neurons in APP/PS1 transgenic mice. Front Neurosci. 11, 340(2017).
  24. Jiao, Y., et al. Osthole decreases beta amyloid levels through upregulation of miR-107 in Alzheimer’s disease. Neuropharmacology. 108, 332-344 (2016).
  25. Zhang, W., et al. miR-34a enhances chondrocyte apoptosis, senescence and facilitates development of osteoarthritis by targeting DLL1 and regulating PI3K/AKT pathway. Cell Physiol Biochem. 48 (3), 1304-1316 (2018).
  26. Xiong, G., et al. Long non-coding RNA MEG3 regulates the progress of osteoarthritis by regulating the miR-34a/Klotho axis. Ann Transl Med. 10 (8), 454(2022).
  27. Tao, H., Cheng, L., Yang, R. Downregulation of miR-34a promotes proliferation and inhibits apoptosis of rat osteoarthritic cartilage cells by activating PI3K/Akt pathway. Clin Interv Aging. 15, 373-385 (2020).
  28. Zafar, S., et al. Osthole: A multifunctional natural compound with potential anticancer, antioxidant and anti-inflammatory activities. Mini Rev Med Chem. 21 (18), 2747-2763 (2021).
  29. Zhang, H., Zheng, W., Li, D., Zheng, J. miR-146a-5p promotes chondrocyte apoptosis and inhibits autophagy of osteoarthritis by targeting NUMB. Cartilage. 12 (10), 1467S-1477S (2021).
  30. Lu, R., et al. Oroxin B alleviates osteoarthritis through anti-inflammation and inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and enhancement of autophagy. Front Endocrinol. 13, 1060721(2022).
  31. Lv, X., et al. miR-34a-5p was involved in chronic intermittent hypoxia-induced autophagy of human coronary artery endothelial cells via Bcl-2/beclin 1 signal transduction pathway. J Cell Biochem. 120 (11), 18871-18882 (2019).
  32. Ma, L., et al. Knee osteoarthritis therapy: Recent advances in intra-articular drug delivery systems. Drug Des Devel Ther. 16, 1311-1347 (2022).
  33. Zhang, W., et al. GelMA hydrogel as a promising delivery system for osthole in the treatment of rheumatoid arthritis: targeting the miR-1224-3p/AGO1 axis. Int J Mol Sci. 24 (17), 13210(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.