مقالة منهجية

إجراءات تحديد مثبطات دخول فيروس SARS-CoV-2 كمضادات فيروسات محتملة باستخدام الفيروسات الزائفة القائمة على MLV

DOI:

10.3791/69628

⸱

فبراير 27, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Biología Celular y Molecular de enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT AIP), 2Maestría en Ciencias Biomédicas, Universidad de Panama, 3Sistema Nacional de Investigación (SNI), SENACYT

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة المنهجية لتوليد جسيمات شبه نوعية SARS-CoV-2 باستخدام نظام تقرير لوسيفيراز واستخدامها لتحديد مثبطات الدخول. يتم عرض هذه البروتوكولات باستخدام مثبطين مختلفين للدخول، وهما بروتين اندماج ACE2-Fc البشري المؤتلف، ومركب الجزيئات الصغيرة أربيدول.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس SARS-CoV-2 هو ممرض ناشئ وحيواني الحيوان، تسبب في عبء هائل من الأمراض والوفيات حول العالم منذ ظهوره في عام 2019. تظل المنصات الآمنة والمتاحة لتقييم دخول الفيروسات والمركبات المضادة للفيروسات المحتملة ضرورية لاكتشاف الأدوية المستمر ضد المتحورات الناشئة. تصف هذه المقالة بروتوكولا محسنا للغاية لتوليد جسيمات زائفة تعتمد على فيروس سرطان الدم في الفئران (MLV) تعبر عن بروتين SARS-CoV-2 الشوكي وتحمل جين تقرير لوسيفيراز، مما يمكن من دراسة دخول الفيروس في ظروف السلامة البيولوجية المستوى 2. تفصل الطرق الموصوفة استخدام خطوط الخلايا المحسنة، وكفاءة النقل العالية باستخدام كواشف فعالة من حيث التكلفة، وإنتاج فيروسات زائفة فعالة للغاية، ومعايرة العدوى لتحديد الحد الأدنى من الإدخال الفيروسي لاختبارات الفحص. تظهر النتائج الممثلة نشاطا قويا في اللوسيفيراز في الخلايا المصابة مقارنة بمجموعة الضوابط غير المصابة، بينما تؤكد الفيروسات الضابطة بدون شوكة وVSV-G-pseudoالفيروسات الزائفة خصوصية الاختبار. علاوة على ذلك، يدعم النظام فحص المركبات من خلال قياس التأثيرات المثبطة على دخول الفيروس وتقييم سمية الخلايا باستخدام اختبار قابلية العيش في MTT. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول القابل للتكرار والتوسع منصة موثوقة لفحص مثبطات دخول الفيروس الجديدة على مستوى متوسط إلى عالي، مما يساهم في تحديد المرشحين المضادين للفيروسات وتطوير الأبحاث حول آليات دخول فيروس SARS-CoV-2.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى ظهور فيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الشديدة 2 (SARS-CoV-2) في أواخر عام 2019 إلى جائحة عالمية أدت إلى ملايين الوفيات حول العالم، ولا تزال تشكل تهديدا من خلال متحورات جديدة مع زيادة في قابلية الانتقال وإمكانية الهروب من المناعة1. باعتباره فيروس RNA مغلف من عائلة كورونافيريداي، يستخدم SARS-CoV-2 بروتين الجليكوبروتين الثلاثي الشوكي (S) للتوسط في دخول خلايا المضيف عن طريق الارتباط بمستقبل إنزيم محول الأنجيوتنسين 2 (ACE2) والخضوع لتنشيط البروتيولي بواسطة TMPRSS2 وبروتيازات مضيفة أخرى 2,3. بينما تم تطوير عدة خيارات علاجية لإدارة أعراض كوفيد-19، فإن التطور المستمر والتطور السريع للمتغيرات الفيروسية يبرز الحاجة الملحة لأنظمة آمنة وقابلة للتوسع لدراسة دخول الفيروسات وتقييم مركبات مضادة للفيروسات جديدة تستهدف هذه الخطوة المبكرة من العدوى4.

لا يزال فيروس SARS-CoV-2 مصنفا كعامل سلامة حيوية من المستوى3 5 في بعض المناطق بسبب إمكاناته العالية للانتقال. لذلك، أي مهمة مختبرية مكررة تتطلب منشأة BSL-3 عالية الاحتواء، مما يعيق قدرة معظم المختبرات في الميدان على إجراء أبحاث علمية مع هذا الفيروس. الأنظمة المعتمدة على الفيروسات الزائفة النمطية، المعروفة أيضا باسم الفيروسات الزائفة (PVs)، تقدم بديلا عمليا يسمح بدراسات دخول الفيروسات في مختبرات السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2)، مما يوسع إمكانية الوصول للجهود البحثية العالمية6. الجسيمات شبه النوعية التي تحمل بروتين شوكة SARS-CoV-2 غير متكاثرة، مما يجعلها بديلا آمنا لتقييم دخول الفيروس وفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة7. يمكن هندسة هذه الجسيمات لتحمل جين لوسيفيراز أو جين مراسل فلوري، مما يتيح الكشف السريع والكمي للعدوى عن طريق قياس إشارة المراسل في الخلايا المصابة. تم استخدام أنظمة تعتمد على فيروس سرطان الدم الفأري (MLV) أو العمود الفقري لفيروس العدسة على نطاق واسع لدراسة دخول فيروس SARS-CoV، MERS-CoV، SARS-CoV-2، فيروس إيبولا، وغيرها: 8,9,10,11.

في هذه البروتوكولات، نصف توليد الخلايا الكهسولية المعتمدة على MLV باستخدام نظام ثلاثي البلازميدات، استنادا إلى العمل الذي أبلغ عنه ميليت وويتاكر8. تشمل البلازميدات المستخدمة بلازميد تغليف يشفد جينات النواة MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol)، وناقل نقل يشفر جين المراسل لوسيفيراز (pTG-Luc)، وبلازميد يعبر عن بروتين السكري الشوكي SARS-CoV-2 المقابل للمتحور الأصلي Wuhan-Hu-1. بالإضافة إلى ذلك، يتم توليد الفيروسات الزائفة أيضا باستخدام بروتين G من فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) لاستخدامه لاحقا كفحص مضاد للضربات المحتملة. تنتج الفيروسات الزائفة في خلايا مشتقة من HEK293 وتستخدم لإصابة الخلايا شديدة الحساسية التي تعبر بشكل مستقر عن hACE2 و TMPRSS2. يتم تقييم كفاءة النقل أولا باستخدام بلازميد يعبر عن بروتين فلوري أخضر (GFP). ثم، باستخدام ظروف النقل المحسنة، يتم توليد PVs عن طريق التحويل المشترك لهذه البلازميدات الثلاثة، تليها معايرة الفيروسات الناتجة. باستخدام الكمية المناسبة من الPVs، يتم إجراء اختبار في صفائح بسعة 96 بئر لفحص المركبات القادرة على تثبيط دخول الفيروسات. يستخدم هذا البروتوكول البولي إيثيلينمين المتفرع (PEI) كمادة فعالة من حيث التكلفة، مما يتيح تنفيذ الإجراءات بشكل أسهل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نقل عالي الكفاءة للخلايا المشتقة من HEK293T باستخدام البولي إيثيلينامين المتفرع (PEI)

ملاحظة: قم بجميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام تقنية المعقمة القياسية وإجراءات BSL-2. استخدم الخلايا المشتقة من HEK293T لنقل وتوليد الفيروسات الزائفة النمطية. في هذه الطريقة يتم نقل الخلايا إلى 6 ألواح آبار معالجة بزراعة الخلايا. تم إعداد حل مخزون PEI كما وصف سابقا يانغ وزملاؤه (2017)12. قبل المضي قدما في عملية النقل الثلاثي لتوليد الفيروس الزائف، ينصح بتحسين أفضل نسبة DNA بين PEI-بلازميد لضمان كفاءة نقل عالية (أكثر من 70-80٪). يجب أن يتم هذا التحسين عن طريق تحويل البلازميد البلازمي الذي يعبر عن بروتين فلوري أخضر (GFP) ثم فحص نسبة الخلايا الفلورية باستخدام مجهر الفلورة. لهذا التحسين، حافظ على ثابت الحمض النووي للبلازميدات عند 2.5 ميكروغرام لكل بئر واختبار عدة كميات من PEI في نطاق 1-20 ميكرولتر. فيما يلي أفضل الظروف لهذه الكميات من الخلايا وPEI، والتي تتكون من 5 ميكرولتر من محلول مخزون PEI (1 ملغ/مل) و2.5 ميكروغرام من البلازميد المعب ل GFP لكل بئر في صفيحة ذات 6 آبار.

  1. بذور 7.5 ×10 خلايا مشتقة من HEK293 لكل بئر في صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 6 آبار، في حجم إجمالي 2 مل لكل بئر من وسط كامل (DMEM-C: وسط النسر المعدل من دولبيكو مع 10٪ مصل أبقار جنيني غير منشط بالحرارة (FBS)، 20 مللي مولار 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازين إيثان سولفونيك حمض HEPES)، 100 وحدة دولية/مل بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتومايسين) قبل 24 ساعة من النقل.
    ملاحظة: عند زرع الخلايا، تجنب تحريك لوحة زراعة الأنسجة بحركات دائرية، لأن ذلك قد يسبب تجمع الخلايا في مركز الآبار، مما يؤدي إلى توزيع غير منتظم للخلايا وبالتالي تقليل كفاءة النقل. صفيحة واحدة ذات 6 آبار تكفي لتجربة واحدة، بما في ذلك بئر واحد كجهاز تحكم خلوي (غير مترجم)، وبقية اللوحة لاختبار عدة نسب من DNA بلازميد PEI.
  2. حضن الخلايا عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ خلال الليل. في اليوم التالي، تأكد من أن الخلايا متلاقية بنسبة 50-60٪ تقريبا.
  3. في يوم النقل، جهز مجمعات الحمض النووي PEI-بلازميد في أنابيب طرد مركزية دقيقة معقمة بحجم 1.5 مل.
    1. لكل بئر، جهز أنبوب محلول PEI يحتوي على 5 ميكرولتر من مخزون PEI (1 ملغ/مل) في 50 ميكرولتر من وسط مصل مختزل، وأنبوب محلول DNA يحتوي على 2.5 ميكروغرام من البلازميد المعب ل GFP، في 50 ميكرولتر من نفس الوسط.
    2. إذا كان من المقرر تحويل عدة آبار، يمكن توسيع الحلول وفقا لذلك. اخلط كل أنبوب لفترة وجيزة بواسطة دوامة وادور للأسفل لمدة 5 ثوان. حضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق.
  4. خلال فترة الحضانة، قم بإزالة الوسط بعناية من كل بئر في صفيحة الستة آبار، لتجنب تعطيل طبقة الخلية الأحادية. استبدلها بعناية ب 1 مل/بئر من وسط النقل الكامل (DMEM-T، نفس DMEM-C، لكن بدون مضادات حيوية).
  5. جهز مركب النقل. بعد الحضانة التي تستمر 10 دقائق، أضف 50 ميكرولتر من أنبوب محلول الحمض النووي إلى أنبوب محلول PEI. اخلط بسرعة عن طريق الحفر على الأنابيب لأعلى وأسفل ست مرات واحتضن الحقن عند RT لمدة 3 دقائق بالضبط. فورا أضف مركب باتجاه السقوط إلى الخلايا في كل بئر مقابل.
  6. أغلق حدود الصفيحة بطبقة بارا فيلم وطرد مركزي بقوة 1000 × g لمدة 30 دقيقة عند RT، بدون فرامل، باستخدام دوار متحرك ودلو لوحة.
  7. بعد الطرد المركزي، أزل البارافيلم بلطف وحضن الصفيحة عند حرارة 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 ساعات.
  8. بعد الحضانة، أزل وسط النقل بلطف من كل بئر واستبداله ببطء ب 2 مل من DMEM-C المسخن مسبقا لكل بئر.
  9. حضن الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 48 ساعة.
  10. تقييم كفاءة النقل بواسطة تعبير GFP باستخدام المجهر الفلوري. يجب أن يكون تردد الخلايا الفلورية أعلى من 70-80٪ (الشكل 1). وهذا أمر حاسم لكفاءة الطريقة التالية في القسم 2.

2. توليد جسيمات شبه فيروسات شبه نمطية من نوع SARS-CoV-2 وVSV-G

ملاحظة: تستخدم هذه الطريقة نفس إجراء القسم 1، باستثناء أنه بدلا من استخدام بلازميد GFP، سيتم نقل الخلايا مع البلازميدات الثلاثة المطلوبة لتوليد فيروسات زائفة النمط، باستخدام أفضل ظروف النقل لضمان كفاءة عالية في النقل. يستخدم البروتوكول أيضا خلايا مشتقة من HEK293T في صفائح ذات 6 آبار، وهي كافية للشروط الثلاثة التالية: أ) الخلايا غير المنقولة (بئر واحد)، ب) الخلايا التي تم نقلها فقط باستخدام بلازميد تعبئة MLV وناقل نقل مقارن اللوسيفيراز (بئر واحد؛ فيروسات زائفة بدون شوكة) وج) الخلايا التي تم نقلها بهذين البلازميدين والبلازميد المعبر عن الأشواك لتوليد فيروسات شبه نوعية SARS-CoV-2 (أربعة آبار). البلازميد الذي يعبر عن الأشواك المستخدم هنا يرمز لارتفاع سلالة ووهان SARS-CoV-2، ويحتوي على تعديلات تسلسلية للسماح بتقديم فعال للبروتين في PVs. سيكون الفيروس الزائف بدون شوكة مطلوبا كوسيلة تحكم لاحقا أثناء العدوى، للتحقق من دخول الخلايا المسموح به المعتمد على الشوكة. وبالمثل، يتم توليد VSV-G-PVs باستخدام نفس التصميم التجريبي ليستخدم لاحقا كفحص مضاد للمركبات المثبطة المحتملة. إذا كان هناك حاجة إلى حجم أكبر من الفيروس الكاذب، يمكن توسيع البروتوكول إلى لوحين بسعة 6 آبار، وهو أمر قد يكون عمليا أيضا لخطوة الطرد المركزي في الصفائح.

  1. في اليوم السابق للنقل، قم بزرع الخلايا المشتقة من HEK293T في لوحين من 6 آبار، كما هو موضح في القسم 1. استخدم لوحة واحدة لتوليد الألواح السائدة الفائقة والأخرى لوحدات VSV-G-PV.
  2. في يوم النقل، حضر خلطات النقل كما هو موضح في الجدول 1، بعد الخطوة 1.3.
    ملاحظة: تم إعداد حل PEI كما تم الإبلاغ سابقافي 12. تم الحصول على البلازميدات pCMV-MLVgagpol وpTG-Luc من Millet وWhittaker8. تم الحصول على البلازميد pVSV-G من Gee وآخرون 202013. يجب تجهيز جميع البلازميدات مسبقا كتحضيرات عالية الجودة، خالية من السموم الداخلية. يوصى باستخدام مجموعات ماكسيبريب المتوفرة تجاريا، مع خطوة أخيرة من الترشيح المعقم عبر فلتر حقنة منخفض الارتباط بحجم 0.2 ميكرومتر.
  3. اخلط كل أنبوب كما هو موضح في القسم 1 وحضن الأنبوب عند RT لمدة 10 دقائق.
  4. خلال هذه الحضانة، أزل الوسط بعناية من كل بئر في صفائح الستة آبار، لتجنب تعطيل طبقة الخلية الأحادية. استبدل ببطء ب 1 مل من وسط DMEM-T المسخن مسبقا لكل بئر، لضمان أن الوسط يمر على طول جدار البئر وليس مباشرة على الخلايا.
  5. تحضير مجمعات النقل كما هو موضح في القسم 1 ونقل الخلايا باستخدام البروتوكول المذكور سابقا.
  6. بعد فترة الحضانة التي تستمر 48 ساعة بعد التحويل، اجمع المواد الفوقية، وانقلها إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة بقطر 50 مل، ثم قم بالطرد المركزي بحرارة 290 x g لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع الفائق الخالي من الخلايا وقم بتصفيته باستخدام وحدة فلتر زجاجة علوية معقمة بفلوريد بولي فينيليدين (PVDF) (PVDF). جهز مقاسات بسعة 1 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: الجسيمات الزائفة المستقرة عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان للحفاظ على العدوى.
بالنسبة لفيروس SARS-CoV-2 المرتفع (لكل بئر)بالنسبة لأنظمة VSV-G-PVs (لكل بئر)للبئر الزجاجي بدون مسامير (لكل بئر)
حل جزيرة الأمير إدوارد:
PEI (1 ملغ/مل)15 ميكرولتر5 ميكرولتر5 ميكرولتر
وسط مصل مخفض45 ميكرولتر45 ميكرولتر45 ميكرولتر
محلول DNA البلازميدي:2
pCMV-MLVgagpol0.79 ميكروغرام0.79 ميكروغرام0.79 ميكروغرام
pTG-luc0.92 ميكروغرام0.92 ميكروغرام0.92 ميكروغرام
pUNO1-spike0.79 ميكروغرام--
pVSV-G-0.79 ميكروغرام-
وسط مصل مخفضحتى 50 ميكرولترحتى 50 ميكرولترإلى 50 ميكرولتر

الجدول 1: تحضير خلطات النقل لتوليد الخلايا الزجاجية الزائدة.

3. معايرة الجسيمات الزائفة SARS-CoV-2 وVSV-G

ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للتأكد من أن الجسيمات النمطية الزائفة المنتجة معدية ولتحديد الحد الأدنى للحجم الفعال المطلوب للتطبيقات اللاحقة مثل الفحص المركب. يجب إجراء المعايرة لكل دفعة جديدة من الفيروس الكاذب. لهذا الغرض، تصاب الخلايا المعرضة بشدة للعدوى بخلايا SARS-CoV-2 (HSI) بكميات متناقصة من الفيروسات الزائفة. يتم مراقبة دخول الفيروسات الزائفة، الذي يتم توسيطه تفاعل ACE2 بين الإنسان والسبايك، أو بواسطة VSV-G مع مستقبلات خلوية أخرى، بعد 72 ساعة من خلال اكتشاف نشاط اللوسيفيراز في اختبار التضيء.

  1. في اليوم السابق للتحويل، زرع 2.5 ×10 4 خلايا HSI في كل بئر في صفيحة زراعة نسيج مكونة من 96 بئرا، في 50 ميكرولتر من الوسط الكامل (DMEM-C). جهز ثلاثة آبار لكل كمية من الفيروس الكاذب للاختبار، ويشمل آبار للعدوى، وكذلك مع الفيروسات الزائفة بدون شوكة، وللخلايا غير المصابة. حضن الطبق عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل.
  2. في يوم التحويل، قم بإذابة قطعة واحدة من كل دفعة من الفيروس الكاذب للاختبار على الثلج وخلطها بلطف عن طريق العكس. أضف أيضا أليكوت واحد للتحكم بدون شوك. أضف مباشرة إلى كل بئر عدة كميات من تحضير الفيروس الزائف (100، 50، 25، 12.5، 6.2، 3.1، 1.5، و0.8 ميكرولتر). اضبط حجم جميع الآبار إلى 150 ميكرولتر باستخدام DMEM-C.
  3. أغلق اللوحة بطبقة بارا فيلم وجهاز طرد مركزي عند 2500 × جرام لمدة 45 دقيقة عند RT، بدون فرامل.
  4. قم بإزالة ختم البارافيلم وحضن اللوح لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  5. بعد الحضانة، استعد لاختبار اللوسيفيراز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يذوب ركيزة اللوسيفيراز (مخزن عند -80 درجة مئوية) و5x محلول تحلل لوسيفيراز (مخزن عند -20 درجة مئوية) ويتوازن عند RT (10-15 دقيقة).
  6. قم بتخفيف محلول تحليل اللوسيفيراز إلى 1x باستخدام ماء معقم. حضر على الأقل 3 مل.
  7. استنشق ببطء وبعناية وتخلص من المادة الفوقية لكل بئر باستخدام مناصقة متعددة القنوات.
  8. أضف 30 ميكرولتر من مخزن التحليل 1x إلى كل بئر باستخدام ماصنة متعددة القنوات. ضع اللوح في هز الصفائح لمدة 10 دقائق عند 150 دورة في الدقيقة، عند RT. تحقق من التحلل الكامل تحت مجهر مقلوب (يجب أن تكون جميع الخلايا متحللة وغير قابلة للتمييز عند الفحص البصري).
    ملاحظة: جهز قارئ الميكروبلوح مسبقا لإجراء كشف التلميع فور إضافة الركيزة لضمان الاتساق وتجنب تلاشي الإشارة.
  9. انقل الليسيات إلى صفيحة بيضاء معتمة ب 96 بئر.
  10. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة اللوسيفيراز إلى كل بئر وامزج لفترة وجيزة بتحريك الصفيحة بحركة دائرية. ضع اللوح في جهاز قياس الضوء وقيس التلميع.
  11. حلل البيانات التي تم الحصول عليها.
    1. تحقق من أن أدوات التحكم تعطي القيم المتوقعة للتلميع. تأكد من أن الخلايا غير المصابة تعطي قيم إضاءة خلفية منخفضة جدا.
      ملاحظة: يجب أن تعطي الخلايا المصابة بفيروس شبه فاقد شوكة قيما على مستوى الخلايا غير المصابة، ويجب أن تظهر الخلايا المصابة بكميات متناقصة من الفيروس الكاذب الذي يظهر في الشعاع قيم عالية من التلميع المعتمدة على الجرعة (الشكل 2). قيم التلميع الناتجة عن VSV-G-PVs عادة ما تكون أعلى بكثير من قيم الإضاءة الشوكية، حوالي مرتبة أو مرتين من الحجم.
    2. في الفحوصات اللاحقة، اختر كمية الفيروس الكاذب التي تولد إشارة لا تقل عن مئة إلى ألف ضعف إشارة الخلايا غير المصابة.

4. فحص المركبات للكشف عن تثبيط دخول الفيروسات الكاذبة باستخدام سبايك-PVs

  1. بذور 2.5 ×10 4 خلايا HSI لكل بئر في 50 ميكرولتر من الوسط الكامل (DMEM-C) في صفيحة مكونة من 96 بئرا، كما هو موضح في القسم 3. حضن الليلة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    1. فكر في تصميم لوحة يتضمن الأعمدة من 1 إلى 11 للمركبات بالإضافة إلى الفيروس الزائف، والعمود 12 للضبط. في العمود 12، خصص أربعة آبار للسيطرة على الفيروسات (الفيروس الكاذب فقط) وأربعة آبار للخلايا غير المصابة وغير المعالجة.
  2. في اليوم التالي، جهز تخفيفات متسلسلة (1:3) من المركبات لاختبارها، بدءا من 50 ميكرومولار (التركيزات النهائية أثناء العدوى: 50، 16.6، 5.5، 1.8، 0.6، 0.2، و0.06 ميكرومول)، في DMEM-C يحتوي على 0.5٪ DMSO.
    1. لأجل الراحة، يتم تحضير التخفيفات في صفيحة تخفيف منفصلة بسعة 96 بئر، حيث يتم أولا إجراء التخفيف التسلسلي ثم نقل (50 ميكرولتر) إلى اللوح الذي يحتوي على الخلايا.
    2. إذا كان عدد المركبات كبيرا جدا، في حدود المئات أو أكثر، قلل هذه السلسلة الأولى من التخفيف إلى حوالي 4 نقاط، باستخدام بئر واحد لكل نقطة تخفيف، وفكر في الفحص المسبق. ثم إعادة اختبار الضربات المحتملة باستخدام تخفيف تسلسلي من 7 نقاط، بنسبة 1:3، مع ثلاث نسخ، بدءا من نفس تركيز 50 ميكرومتر.
  3. بمجرد أن تصبح مخففات المركبات جاهزة، يتم استنشاق وسط الخلايا بلطف باستخدام ماصة متعددة القنوات وإضافة 50 ميكرولتر من مخففات المركبات إلى الآبار المقابلة. الحضانة لمدة ساعة واحدة عند حرارة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة للعناصر في العمود 12، أضف DMEM-C فقط.
  4. دون إزالة المركبات، أضف إلى كل بئر كمية محددة مسبقا من فيروس شبه النوع SARS-CoV-2، في حجم 50 ميكرولتر من وسط كامل، يحتوي على المركبات بنفس التركيزات. أغلق الألواح بطبقة بارافيلم.
  5. قم بعمل الطرد المركزي على اللوح عند 2500 × جرام لمدة 45 دقيقة عند RT بدون فرامل، ثم أزل الفيلم الباراميل وحضانه عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 72 ساعة.
  6. تابع القياس القياسي للعدوى المعتمد على اللوسيفيراز كما هو موضح في القسم 3.
  7. قم بتحليل البيانات.
    1. تصدير قيم الإضاءة إلى جدول بيانات لتنسيق البيانات للاستيراد لاحقا إلى برامج تحليل البيانات والرسوم البيانية.
    2. أعد مخططات شرطية ترسم متوسط كل نقطة تركيز، بما في ذلك الخطأ القياسي للشريط المتوسط. كما رسم القيم المستخلصة من الإيجابيات (PVs فقط) والسلبية (الخلايا غير المصابة).
      ملاحظة: تعتبر نتائج الاختبار صحيحة إذا كان 1) الخلايا غير المصابة تظهر قيما منخفضة جدا، 2) أظهرت ضوابط PVs قيما عالية، 3) أظهر التحكم الإيجابي في التثبيط (أي الأربيدول أو hACE2-Fc) تثبيط العدوى، بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 3A، B).
    3. ثم راقب القيم الناتجة عن المركبات غير المعروفة لتقييم ما إذا كان هناك تثبيط وإذا كان هناك تأثير يعتمد على الجرعة. إذا كان الأمر كذلك، فيجب إخضاع هذه المركبات لمزيد من التحليلات التأكيدية.
      ملاحظة: لمزيد من التأكيد على الضربات المحتملة، اتبع الخطوات التالية. أولا، أعد اختبار المركبات المحتملة كما هو مقترح في الخطوة 4.2. إذا تم تأكيد تأثير استجابة الجرعة، فعليك إجراء فحص مضاد باستخدام نفس سلسلة التخفيف ولكن مع إصابة VSV-G-PVs. هذا الاختبار مهم للتحقق مما إذا كان تثبيط الدخول محددا لتفاعل السنبلة مع ACE2، وليس بسبب تداخل في أي مرحلة أخرى لاحقة أثناء إنتاج اللوسيفيراز في الخلايا المصابة (الشكل 3A، B). هنا، لا ينبغي أن يظهر المركب الإيجابي نشاطا مثبطا ضد VSV-G-PVs. إذا كان هذا هو الحال، فيجب اختبار نفس سلسلة التركيزات من حيث السمية الخلوية باستخدام اختبار بقاء الخلايا (اختبار MTT، الموضح في القسم 5). باختصار، يجب أن يظهر المركب المحتمل للإصابة تثبيط SARS-CoV-2-spike-PVs، ولا يوجد تثبيط أو أقل لVSV-G-PVs، ولا يوجد تثبيط أو على الأقل أضعف بكثير لفعالية الخلايا. تعديل منحنى الجرعة-الاستجابة باستخدام بيانات التلميع سيسمح بتقدير تركيز التثبيط نصف الحد الأقصى (IC50) لتثبيط الPVs، وتركيز نصف أقصى أقصى للسمية الخلوية (CC50) من اختبار القابلية للحياة. تستخدم نسبة CC50 / IC50 لحساب مؤشر الانتقائية (SI)، وهو مؤشر مهم على الفائدة المحتملة للمركب الموجب. لتحليل منحنيات الجرعة-الاستجابة وتقدير IC50 وCC50 ، تم وصف إجراءات مفصلة جدا14.

5. اختبار بقاء الخلايا المعتمد على MTT

  1. زرع 2.5 ×10 خلايا HSI في كل بئر في 50 ميكرولتر من DMEM-C في صفيحة مكونة من 96 بئر. حضن الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تأكد من أن الخلايا تتقاطع حوالي 50٪ في اليوم التالي. جهز ما يكفي من الآبار، مع الأخذ في الاعتبار جميع تركيزات المركب المختلفة لتقييمها، والخلايا غير المعالجة، والآبار الفارغة التي تحتوي فقط على وسط بثلاث نسخ. اختبر المركبات المحتملة للضرب عند نفس التركيزات التي تم تقييمها في اختبار تثبيط دخول PV.
  2. بعد الحضانة، قم بإزالة الوسط بعناية واستبداله ب 100 ميكرولتر من الوسط الكامل الذي يحتوي على تركيزات مختلفة من المركب لتقييم بنسبة 0.5٪ DMSO.
  3. قم بطرد مركزي لللوحة على حرارة 2,500 × جرام لمدة 45 دقيقة عند RT بدون فرامل، ثم احتضن اللوحة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂. تتضمن هذه الخطوة للتعامل مع الخلايا تماما كما تم في القسم السابق، باستثناء إضافة الخلايا الزجاجية.
  4. حضر محلول MTT بقوة 0.5 ملغ/مل باستخدام DMEM. قم بالتعقيم بالترشيح عبر 0.2 ميكرومتر واحتفظ به في الظلام.
    ملاحظة: بروميد 3-(4,5-ثنائي ميثيل-2-ثيازوليل)-2,5-ديفينيل-2H-تيترازوليوم بروميد (MTT) حساس للضوء. يجب أن تبقى مجمدة في الظلام.
  5. قم بإزالة الوسط بعناية من كل بئر واستبدله بمحلول MTT بسعة 100 ميكرولتر. حضن لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  6. خلال هذه الحضانة، حضر محلول ذوبان يحتوي على 40 ملليمولار HCl في كحول الأيزوبروبيل.
  7. قم بإزالة محلول MTT بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات، دون الإزعاج ببلورات الفورمازان في قاع كل بئر.
  8. أضف 100 ميكرولتر من محلول الذوبان إلى كل بئر. لف اللوحة بورق الألمنيوم وضعها على هزاز الألواح بسرعة 150 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
  9. امتصاص قياسي عند 570 نانومتر و630 نانومتر.
  10. قم بتحليل البيانات.
    1. باستخدام القيم الخام للكثافة الضوئية، اطرح القيم التي تم الحصول عليها عند 630 نانومتر من تلك التي تم الحصول عليها عند 570 نانومتر لكل بئر. ثم قم بمتوسط القيم المصححة لآبار الخلايا غير المعالجة. اعتبر هذه الخلايا غير المعالجة قابلة للحياة بنسبة 100٪.
    2. ثم يتم تطبيع قيم الخلايا المعالجة مقابل آبار الخلايا غير المعالجة، باستخدام الصيغة:
      الجدوى (٪) = figure-protocol-1
  11. نسب قابلية الاستمرار كأشرطة تمثل متوسط الرسم تتكرر ±± الخطأ المعياري للمتوسط. إجراء تحليل إحصائي إضافي لمقارنة المجموعات باستخدام إجراءات مطبقة في برنامج تحليل البيانات والرسوم البيانية، ومقارنة الصلاحيات عند تركيزات مختلفة مع التحكم في الخلايا غير المعالجة.
  12. قارن متوسطات كل نقطة تركيز مع تلك الخاصة بالخلايا المعالجة ب DMSO فقط باستخدام اختبار كروسكال-واليس غير المعلمي مع اختبار دان بعد الاختبار (تعتبر الفروقات ذات دلالة عند قيم p < 0.05). لرسم منحنى الجرعة-الاستجابة وتقدير CC50 من قيم الجرعة الزائدة، تحقق من الإجراءات المبلغ عنهاوكانت 14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الإبلاغ عن عدة طرق نقل لتوليد PVs، بما في ذلك فوسفات الكالسيوم15، والطرق القائمة على الدهون16، وPEI، الخطية والفرعية. تظهر هذه المقالة أن نقل الخلايا المشتقة من HEK293T ذات PEI المتفرع يسمح بنقل عالي الكفاءة (الشكل 1)، وهو عادة ما يقارن بطرق النقل باستخدام عوامل النقل الدهونية المتوفرة تجاريا (البيانات غير معروضة). تظهر النتائج التمثيلية التي تتوافق مع الكمية المثلى من PEI الموجودة في ظروفنا، والتي تمثل 5 مي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الإبلاغ عن هذه المرونة في نظام MLV في توليد الأنماط الزائفة لفيروسات أخرى من قبل فيروسات مهمة أخرى، مثل فيروس إيبولا18، ميرس-كوفي8، سارس-كوفيروس19، فيروس لا كروس20، هانتافيروس20، فيروس فيسنا21، أرينافيروس22، فيروس الإنفلونزا23، وغيرها. كانت هذه الأنماط الزائفة مفيدة جدا لمجموعة من التطبيقات التي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر النظام الوطني للتحقيقات (SNI) والسكرتارية الوطنية للعثور على العلوم والابتكار (SENACYT، بنما) على الدعم المالي بموجب عقد SENACYT رقم 031-2022 وعقد SNI رقم 050-2023. نحن أيضا ممتنون جدا للدكتور غاري ويتاكر على تبرعه بالبلازميدات pCMV-MLVgagpol وpTG-Luc.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 & m مرشحات الحقن منخفضة الارتباط بالبروتين ثيرمو ساينتفيك720-1320مرشحات الحقنة (0.2 μ m، 13 مم، PES، معقم)
0.25٪ محلول تريبسين-إيدتا 1Xجيبكو25200-056تريبسين-إيدتا (0.25٪)، فينول أحمر
0.45 وميكرو؛ وحدات ترشيح PVDF ذات غطاء زجاجي أفانتور514-1045أنظمة التفريغ بغطاء الزجاجة (PVDF، 250 مل، 50 مم، 0.45 وميكرو؛ m)
أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة بسعة 1.5 ملإبندورف30123611قفل الآمنة  الأنابيب
محلول ستربتوميسين بمقدار 100 X بنسلينكورنينغ30-002-CIمحلول البنسلين-ستريبتوميسين، 100x
5 X تحليل لوسيفراز مخزن تحلل بروميغاE2650جزء من نظام اختبار بروميغا برايت-غلو لوسيفراز
أنابيب مخروطية معقمة بسعة 50 ملكورنينغ 352070أنبوب الطرد المركزي PP عالي الوضوح 50 مل، قاع مخروطي، معقم
ألواح زراعة الأنسجة ذات الستة آبارثيرمو ساينتفيك140675أطباق متعددة معالجة بثقافة الخلايا
ألواح زراعة الأنسجة ذات 96 بئرثيرمو ساينتفيك168055Nunc&Trade؛ MicroWell & trade؛ 96-بئر، معالجة بدلتا نونكلون، صفيحة دقيقة ذات قاع مسطح
هيدروكلوريد أربيدولسيغما-ألدرتشSML0860
بولي إيثيلينمين المتفرع، 25 كيلو دالتونسيغما-ألدرتش408727
مجهر الليزر الكونفوكالي   (FV 3000)شركة أوليمبوس.SKU: FV3000
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)سيغما-ألدرتشD8418
DMEM (وسط النسر المعدل من دولبيكو) مع: ارتفاع الجلوكوز، إل-جلوتامين، الفينول الأحمر، الصوديوم بيروفيت)جيبكو11995-065
مصل الأبقار الجنيني (FBS)جيبكو26140-079معطل الحرارة (56&درام؛ C، 30 دقيقة)
الخلايا المشتقة من HEK293T (خط الخلايا Lenti-X 293T)نبذة تاكارا632180نسخة فرعية قابلة للنقل العالية من سلالة خلايا HEK293 وتدعم مستويات عالية من التعبير عن البروتين الفيروسي
مخزن HEPESجيبكو15630-080
الخلايا شديدة الحساسية للعدوى (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) خط خلوي)موارد BEINR-55293تم تعديل HEK293T خط الخلية للتعبير المستقر عن ACE2 و TMPRSS2
حمض الهيدروكلوريك&nb;سيغما-ألدرتشH1758-500ML
مجهر التباين الطور المقلوب شركة أوليمبوس SKU: 2404040005
إيزوبوبانولسيغما-ألدرتشI9516-500ML
ركيزة اللوسيفرازبروميغاE2650جزء من نظام اختبار لوسيفراز المشرق
قارئ الميكروبليت مع كشف الإضاءةأجيلينت بايوتيكBTH1MG
MTT [3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-إيل)-2,5-ديفينيل تيترازوليوم بروميد]سيغما-ألدرتشM2128
ألواح بيضاء معتمة ذات 96 بئركورنينغ3917الميكرولوح المعالجة بالبوليسترين TC ذات القاع المسطح الأبيض الصلب بسعة 96 بئر
بارافيلمبيميسPM999
بلازميد pcDNA3-EGFPأدجين13031كان pcDNA3-EGFP هدية من دوغ جولينبوك (بلازميد أدجين # 13031؛ http://n2t.net/addgene:13031 ؛ RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol بلازميد--تبرع بلطف من قبل الدكتور غاري ويتاكر
محلول ملحي مخبأ بالفوسفات بدون Ca2+ و Mg2+ (PBS)كورنينغ21-040-CVمحلول ملحي مخزن بالفوسفات، 1X بدون كالسيوم ومغنيسيوم
نظام Promega PureYield للبلازميد ماكسيبريببروميغاA2393
بلازميد pTG-Luc--تبرع بلطف من قبل الدكتور غاري ويتاكر
بلازميد pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (ووهان)إنفيفوجينP1-Spike
بلازميد pVSV-Gأدجين138479كان pVSV-G هدية من أكيتسو هوتا (بلازميد أدجين # 138479 ؛ http://n2t.net/addgene:138479 ؛ RRID:Addgene_138479)
بروتين اندماج الإنسان المؤتلف ACE2-FcإنفيفوجينFC-Hace2
وسط مصل مخفض (Opti-MEM)جيبكو31985-070وسيط مصل مخفض من أوبتي-مم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., et al. SARS-CoV-2 and emerging variants: Unmasking structure, function, infection, and immune escape mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 869832(2022).
  2. Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (1), 3-20 (2022).
  3. Le, K., Kannappan, S., Kim, T., Lee, J. H., Lee, H. -R., Kim, K. K. Structural understanding of SARS-CoV-2 virus entry to host cells. Front Mol Biosci. 10, 1288686(2023).
  4. Ayoub, P. G., et al. Improved SARS-CoV-2 spike glycoproteins for pseudotyping lentiviral vectors. Front Virol. 1, 793320(2021).
  5. Lippi, G., et al. Biosafety measures for preventing infection from COVID-19 in clinical laboratories:IFCC Taskforce Recommendations. Clin Chem Lab Med. 58 (7), 1053-1062 (2020).
  6. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  7. Rizatdinova, S. N., Ershova, A. E., Astrakhantseva, I. V. Pseudotyped viruses: A useful platform for pre-clinical studies conducted in a BSL-2 laboratory setting. Biomolecules. 15 (1), 135(2025).
  8. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Murine leukemia virus (MLV)-based coronavirus spike-pseudotyped particle production and infection. Bio Protoc. 6 (23), e2035(2016).
  9. Millet, J. K., et al. Production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting. J Vis Exp. (145), e59010(2019).
  10. Eichler, M., Aksi, E., Pfeilschifter, J., Imre, G. Application of pseudotyped virus particles to monitor Ebola virus and SARS-CoV-2 viral entry in human cell lines. STAR Protoc. 2 (4), 100818(2021).
  11. Thomas, J., et al. Development of a pseudo-typed virus particle based method to determine the efficacy of virucidal agents. Sci Rep. 14 (1), 2174(2024).
  12. Yang, S., Zhou, X., Li, R., Fu, X., Sun, P. Optimized PEI-based transfection method for transient transfection and lentiviral production:PEI-based transfection for lentiviral production. Curr Protoc Chem Biol. 9 (3), 147-157 (2017).
  13. Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nat Commun. 11 (1), 1334(2020).
  14. Ferrara, F., Temperton, N. Pseudotype neutralization assays:From laboratory bench to data analysis. Methods Protoc. 1 (1), 8(2018).
  15. Soneoka, Y., et al. A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 23 (4), 628-633 (1995).
  16. Chen, Y., Miller, W. M., Aiyar, A. Transduction efficiency of pantropic retroviral vectors is controlled by the envelope plasmid to vector plasmid ratio. Biotechnol Prog. 21 (1), 274-282 (2005).
  17. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  18. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses:Identification of receptor-deficient cell lines. J Virol. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  19. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. J Virol. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  20. Ma, M., Kersten, D. B., Kamrud, K. I., Wool-Lewis, R. J., Schmaljohn, C., González-Scarano, F. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan bunyaviruses:A system for analysis of cell tropism. Virus Res. 64 (1), 23-32 (1999).
  21. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. J Virol. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  22. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  23. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. J Virol Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  24. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).
  25. Sholukh, A. M., et al. Evaluation of cell-based and surrogate SARS-CoV-2 neutralization assays. J Clin Microbiol. 59 (10), e0052721(2021).
  26. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiol Res. 258, 126993(2022).
  27. Johnson, M. C., et al. Optimized pseudotyping conditions for the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. J Virol. 94 (21), e01062-e01120 (2020).
  28. Xiaojie, S., Yu, L., Lei, Y., Guang, Y., Min, Q. Neutralizing antibodies targeting SARS-CoV-2 spike protein. Stem Cell Res. 50, 102125(2021).
  29. Cao, L., et al. De novo design of picomolar SARS-CoV-2 miniprotein inhibitors. Science. 370 (6515), 426-431 (2020).
  30. Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913.e7 (2020).
  31. Ahmad, I., Pawara, R., Surana, S., Patel, H. The repurposed ACE2 inhibitors:SARS-CoV-2 entry blockers of COVID-19. Top Curr Chem. 379 (6), 40(2021).
  32. Alqaaf, M., et al. Discovering natural products as potential inhibitors of SARS-CoV-2 spike proteins. Sci Rep. 15 (1), 200(2025).
  33. Chan, C. C. -Y., et al. Identification of novel small-molecule inhibitors of SARS-CoV-2 by chemical genetics. Acta Pharm Sin B. 14 (9), 4028-4044 (2024).
  34. Lei, C., et al. Neutralization of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus by recombinant ACE2-Ig. Nat Commun. 11 (1), 2070(2020).
  35. Wang, X., et al. The anti-influenza virus drug, arbidol is an efficient inhibitor of SARS-CoV-2 in vitro. Cell Discov. 6 (1), 28(2020).
  36. Kang, Y., Shi, Y., Xu, S. Arbidol:The current demand, strategies, and antiviral mechanisms. Immun Inflamm Dis. 11 (8), e984(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MLV

مقالات ذات صلة