يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

دراسة التحلل السكري في الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية باستخدام اختبار التدفق خارج الخلوي

253 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69638

⸱

أبريل 10, 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة لإجراء اختبار إجهاد تحلل السكر لقياس إعادة برمجة الأيض في الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للفأر. بعد العزل والتحفيز الالتهابي، يتم قياس معدل الحماض خارج الخلية (ECAR) باستخدام مواد معدلة حديثا مع الرقم الهيدروجيني، تليها تطبيع البروتين لتمكين تقييم دقيق وقابل للتكرار لتغيرات الجليكوليت.

الملخص

الخلايا الدبقية الدقيقة، وهي الخلايا البلعمية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي، تغير برامجها الأيضية ديناميكيا استجابة للإشارات الفسيولوجية والمرضية. فهم هذه التحولات الأيضية أمر بالغ الأهمية لتوضيح أدوارها في الالتهاب. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا لتقييم الملف التحليل السكري للدبقية الصغيرة الأولية المعزولة من قشرة دماغ الفئران الوليدية باستخدام اختبار إجهاد التحلل السكري على محلل تدفق خارج الخلية. يتيح هذا الاختبار القياس اللحظي ل ECAR، وهو مؤشر على النشاط الجليكوليتسي المرتبط بانخفاض الحموضة، مثل اللاكتات. يتضمن نهجنا علاج الخلايا الدبقية الصغيرة المزروعة تحت ظروف مختلفة لدراسة كيفية تغير المسارات الأيضية استجابة لمحفزات مختلفة، بما في ذلك المحفزات الالتهابية. بشكل فريد، يعد مختبرنا محاليل جديدة من كواشف مختلفة، بما في ذلك الجلوكوز، الأوليغوميسين، و2-ديوكسيجلوكوز (2DG)، لاستهداف الجوانب المختلفة من المسار، مع ضبط دقيق لدرجة الحموضة لكل كاشف لضمان الدقة التجريبية وقابلية التكرار. توفر هذه الطريقة منصة قوية للتحقيق في تحلل السكر في الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية وتوفر رؤى حول حالتها الوظيفية في ظل الظروف الالتهابية أو المرتبطة بالأمراض.

المقدمة

تغير الخلايا في الجهاز العصبي المركزي طريقة إنتاجها للطاقة استجابة للظروف الطبيعية والمرضية 1,2. من بين المسارات الأيضية الرئيسية، التحلل السكري والفسفرة التأكسدية (OXPHOS) هما المساران الرئيسيتان اللتان تنظم وظائف خلايا المناعة - حيث تخضع إما لأداء استجابة قوية وفورية للحالات الالتهابية والمضادة للالتهابات، على التوالي 3,4. لذا، يمكن لخلايا المناعة التبديل بين المسارات الأيضية استجابة للإشارات الالتهابية والحالات الوظيفية5. الخلايا الدبقية الدقيقة، مثل نظيراتها النخاعية، مرتبطة أيضيا بوظائفها وتتكيف بسرعة مع مسارات مختلفة كوقود أيضي بديل، مما يدل على مرونة أيضية 6,7. تخضع الخلايا الدبقية الصغيرة لإعادة برمجة أيضية سريعة أثناء الالتهاب، حيث يعمل تحلل السكر المحسن كعلامة أيضية رئيسية للحالات الالتهابية8. لذا، تسمح الاختبارات التي تحدد الاعتماد الخلوي على نمط أيضي بالتحقيق في حالتها الوظيفية تحت ظروف مختلفة. في البروتوكول الحالي، نهدف إلى تحديد ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية تعتمد على زيادة تحلل السكر أثناء الحالات الالتهابية. لهذا، نقوم بإجراء اختبارات إجهاد التحلل الجليكولي بشكل روتيني. بينما تم استخدام محلل Seahorse XFe24 (محلل التدفق خارج الخلوي) على نطاق واسع لقياس ECAR في خطوط الخلايا الخالدة والخلايا المتحولة، فإن الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية تطرح تحديات تقنية فريدة، بما في ذلك محدودية إنتاجية الخلايا، وخصائص الالتصاق المتغيرة، والحساسية العالية لظروف الزراعة، مما قد يربك القياسات الأيضية. علاوة على ذلك، يوفر قياسا فوريا ل ECAR، مما يتيح تقييما دقيقا لتحلل السكر المدفوع باللاكتات في عدة نقاط زمنية، وهو ما لا يمكن التقاطه بواسطة اختبارات اللاكتات النهائية فقط. تم اعتماد التنميط الأيضي القائم على التدفق خارج الخلوي على نطاق واسع في أبحاث الأيض لتوصيف الطاقة الحيوية للخلايا، مما يجعل هذا البروتوكول مناسبا جدا للدراسات التي تبحث في التحولات الأيضية في الخلايا أثناء التفعيل، أو نمذجة الأمراض، أو اختبار المخدرات. يمكن للقراء تحديد مدى ملاءمتهم بناء على حاجتهم لقياسات الجليكوليتية الديناميكية عالية الدقة داخل الخلايا الأولية.

يتم استقلاب الجلوكوز إلى بيروفات عبر التحلل السكري ثم يتحول إما إلى لاكتات في السيتوبلازم أو إلى ثاني أكسيد الكربون والماء في الميتوكوندريا. يؤدي تحويل الجلوكوز إلى اللاكتات إلى إطلاق البروتونات في الفضاء خارج الخلية، مما يؤدي إلى تحمض الوسط. يقوم محلل التدفق خارج الخلوي بقياس هذا التحمض ب ECAR9. في اختبار إجهاد التحلل السكري، يتم حضن الخلايا أولا في وسط خال من الجلوكوز والبيروفات، ويتم تسجيل ECAR الأساسي لديها. الحقنة الأولى توفر كمية مشبعة من الجلوكوز، والتي تقوم الخلايا باستقلاب الخلايا عبر التحلل السكري إلى البيروفات، مما ينتج ATP وNADH والماء والبروتونات. زيادة إطلاق البروتونات ترفع من ارتفاع ECAR، مما يعكس 'تحلل السكر'. بعد ذلك، يضاف الأوليغوميسين لتثبيط تخليق ATP في الميتوكوندريا، مما يجبر الخلايا على الاعتماد فقط على التحلل السكري. يزيد هذا التغير في تدرج البروتون من زيادة ECAR ويتم قياسه كأقصى قدرة جليكوليزية للخلية. وأخيرا، يتم تقديم 2DG، وهو نظير للجلوكوز. يثبط الهيكسوكيناز بشكل تنافسي، ويمنع تحلل السكر ويقلل من ECAR. هذا الانخفاض يؤكد أن ECAR السابق كان يعتمد على التحلل السكري. الفرق بين أقصى قدرة جليكوليكية ومستوى التحلل السكري يحدد الاحتياطي الجليكوليكي. يمثل ECAR الأولي قبل إضافة الجلوكوز تحمض غير جليكوليكية من عمليات خلاوية أخرى (الشكل 1).

أجرينا اختبار إجهاد تحلل السكر باستخدام محلل التدفق خارج الخلية. تم تصدير قيم ECAR الخام إلى إكسل للتحليل. لكل حالة، حددنا نقاط الزمن المقابلة ل ECAR القاعدي (قبل إضافة الجلوكوز)، التحلل السكري (بعد حقن الجلوكوز)، والقدرة التحليلية للجلوكوز (بعد علاج الأوليغوميسين). تم متوسط قيم ECAR من النقاط الزمنية ذات الصلة داخل كل طور وعبر النسخ التقنية الأربعة، وتم حساب التحلل السكري كزيادة في ECAR بعد إضافة الجلوكوز. تم حساب السعة الجليكوليكية كزيادة في ECAR بعد إضافة الأوليغوميسين. تم حساب احتياطي التحلل السكري كانخفاض في ECAR بعد حقن 2DG. ثم استخدمت هذه القيم المتوسطة لمقارنة الاستجابات الأيضية بين المجموعات.

من ناحية أخرى، لتقييم معدل استهلاك الأكسجين (OCR) وتقييم وظائف الميتوكوندريا، يعد اختبار الإجهاد الميتوكوندري (Agilent) هو النهج القياسي، الذي يقيس معايير مثل التنفس القاعدي، والتنفس المرتبط ب ATP، وتسرب البروتونات، والتنفس الأقصى، وسعة التنفس الفائدة، والتنفس غير الميتوكوندري. يتم الحصول على هذه القياسات عن طريق حقن مثبطات ميتوكوندرية محددة بشكل متسلسل، مثل الأوليغوميسين (مثبط ATP سينثاز)، FCCP (سيانيد الكربونيل-4 (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون)، وهو مفكك يدفع أقصى تنفس ممكن، وروتينون/أنتي ميسين A (مثبطات معقدة I/III)، مما يسمح بتقييم كمي لصحة الميتوكوندريا والطاقة الحيوية 10,11,12,13. لذا تجرى اختبارات ECAR وفحوصات OCR تحت ظروف مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوانات، وحصلت على موافقة لجنة رعاية الحيوانات في جامعة ميموريال في نيوفاوندلاند بموجب البروتوكول رقم 22-01-DK.

1. التحضيرات قبل بدء التجارب

  1. جهز محلول التشريح بإضافة 10 مللي مولار HEPES إلى 1x HBSS بدون Ca2+ وMg 2+.
  2. تحضير محلول هضم (لكل 2–3 أدمغة) بدمج 1 مل من 2.5٪ تريبسين (10 أضعاف المخزون، غير مخفف)، 2 مل من محلول التشريح، و200 ميكرولتر DNase I (1 ملغ/مل).
  3. حضر وسط دبقية مختلط عن طريق إضافة DMEM ب 10٪ FBS، و1x جلوتامكس، و1x مضاد حيوي/مضاد للفطريات.
  4. حضر وسط ميكروغليا عن طريق إضافة DMEM ب 10٪ FBS، و1x جلوتامكس، و1x MEM NEAA، و1x بيروفات الصوديوم، و1x بنسلين/ستربتومايسين.

2. الطلاء لثقافات الدبقيات المختلطة (الشكل 2A)

  1. في اليوم الأول:
    1. اجمع جراء اليوم التالي (P0)-P2 من فئران C57BL/6C واستخرج القشور باستخدام مجهر ستيريو، وإزالة السحايا. ثم قم بتشريح القشرة إلى قطع صغيرة في محلول تشريح ونقلها إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. دع الأنسجة تستقر في أسفل الأنبوب.
    2. قم بتفريغ محلول التشريح واستبداله ب 3 مل من محلول الهضم لكل 2–3 أدمغة. قم بالتثبيط بلطف باستخدام ماصة مصلية بحجم 2 مل لتفكيك الأنسجة.
    3. ضع الأنابيب على دوار داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية، وامزج الأنابيب باستخدام ماصة مصلية بسعة 2 مل كل 8 دقائق ليصبح المجموع حوالي 24 دقيقة.
    4. بعد هضم الأنسجة، قم بطرد مركزي الخلايا بحرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسط الدبقية المختلط.
    5. باستخدام إبرة 18 جيلون في حقنة 5 مل، قم بتثبيث الخلايا ثم مررها عبر مصفاة خلايا نايلون بمقاس 70 ميكرومتر. قم بجهاز الطرد المركزي للخلايا المجمعة مرة أخرى عند 300 x g لمدة 5 دقائق عند RT.
    6. أعد تعليق الحبيبة في 1 مل من وسط الدبقية المختلط في البداية وقم بالتثبيث عدة مرات لإزالة تكتل الخلايا، ثم أعد تعليقها بحجم أعلى، لتكوين ما يصل إلى 12 مل في كل قارورة T75 (ينصح بوجود 2–3 قشورات دماغية لكل قارورة)
      ملاحظة: لا يلزم تغليف القارورة بمادة بولي-دي-لايسين أو أي مادة أخرى من المواد الكيميائية.
  2. في اليوم الثاني، غير الوسائط بالكامل وأضف الوسائط المختلطة الطازجة للدبقية الإنجليزية.
  3. في اليوم الثالث، استبدل حوالي ثلثي الوسائط بوسط دبقي مختلط طازج. اترك الخلايا تنمو لمدة سبعة أيام إضافية، أي بإجمالي 10 أيام.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن ملاحظة طبقة من الخلايا النجمية.
  4. في اليوم السادس، استبدل ثلثي الوسائط بوسط دبقي جديد مختلط. أكد وجود طبقة من الخلايا النجمية المتلاطمة.

3. الحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية النقية (الشكل 2A)

ملاحظة: حوالي اليوم العاشر، تظهر خلايا صغيرة مستديرة تطفو فوق طبقة الخلايا النجمية؛ هذه هي في الغالب الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 2B).

  1. حرك القارورة بسرعة 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. اجمع الوسط الكامل الذي يحتوي على الخلايا العائمة في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 300 × جرام لمدة 10 دقائق.
  2. أعد تعليق الحبيبة في وسط الخلايا الدبقية الدقيقة ووضع حوالي 250,000 خلية في كل بئر في صفائح زراعة الخلايا الدقيقة لمحلل التدفق خارج الخلية.
    ملاحظة: يتم الحصول على حوالي 3–4 ملايين خلية لكل مل من ثلاث قوارير T75؛ طلاء ألواح زراعة الخلايا بمادة بولي-دي-ليسين أو كواشف أخرى ليس شرطا.
  3. حضن الصفيحة الصغيرة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 30–45 دقيقة. بعد ذلك، غير الوسط مرة أخرى للحصول على مزرعة ميكروبليا نقية وإزالة أي خلايا قليلة التجودد قد لا تزال عائمة. الخلايا جاهزة للعلاج في اليوم التالي مباشرة (الشكل 2C).
  4. استبعد الآبار الأربعة المخصصة كعناصر تحكم 'خلفية' من بذر الخلايا: واحدة في كل صف (الشكل 3C). تتلقى هذه الآبار وسائط التحليل.
    ملاحظة: املأ الآبار غير المستخدمة بماء معقم أو PBS لمنع تبخر الوسط، وقم بتغليف الخلايا بنمط عشوائي بدلا من صفوف أو أعمدة ثابتة لتقليل التغير القائم على الصفائح.

4. علاج الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية باستخدام محفزات التهابية

  1. في اليوم الحادي عشر، عالج الخلايا ب 100 نانوغرام/مل من الدهون البوليسكاريدية (LPS) لمدة 24 ساعة. قم بتوزيع الآبار العشوائية والمخابرة المعالجة ب LPS لاستبعاد أي تأثيرات موضعية.
    ملاحظة: قد تختلف مدة العلاج حسب الظروف التجريبية وتحتاج إلى تحسين مسبق.

5. التحضير لاختبار التدفق خارج الخلوي قبل يوم واحد من بدء التجربة

  1. في اليوم الحادي عشر، أضف 1 مل من المخزن المعاير إلى لوحة المعايرة (بصيغة 24 بئرا؛ مجموعة اختبار التدفق خارج الخلوي) في جميع الآبار. حافظ على الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: تتكون لوحة المعايرة من 4 آبار حقن. في اختبار إجهاد التحلل السكري، يضاف الجلوكوز إلى المنفذ A، ويضاف الأوليغوميسين إلى المنفذ B، ويحقن 2DG في المنفذ C (راجع الشكل 4A).
  2. تحضير محاليل الجلوكوز ومخزون 2DG
    1. الجلوكوز – إذابة 90 ملغ من الجلوكوز في 2 مل من وسط تحليل التدفق خارج الخلوي (جدول المواد). في البداية، قم بالذوبان في حوالي 1.9 مل بحيث عند تعديل الرقم الهيدروجيني في اليوم التالي ب 1N NaOH، لا يتجاوز الحجم النهائي 2 مل، وهو أمر حاسم للحفاظ على المولارية.
    2. 2DG – إذابة 328 ملغ في 2 مل من وسط تحليل التدفق خارج الخلية.
      ملاحظة: خزن كل من الجلوكوز و2DG عند 4 درجات مئوية طوال الليل
  3. أليكوت 30-40 مل من وسائط الفحص في أنبوب مخروطي 50 مل وتخزينه عند 4 درجات مئوية لإجراء الفحوصات في اليوم التالي.

6. اختبار التدفق خارج الخلوي (اليوم 12)

  1. في اليوم الثاني عشر، قم بتسخين الجلوكوز المكون مسبقا، 2DG، ووسائط الاختبار المكونة على درجة حرارة 37 درجة مئوية. اضبط درجة الحموضة للجلوكوز و2DG، وكذلك وسط الاختبار المقتبس، إلى 7.4 بإضافة 1N NaOH بزيادات (مثلا 5 ميكرولتر، ثم 10 ميكرولتر).
  2. دوامة لفترة وجيزة لخلط منتظم حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى فوق 7.
    ملاحظة: ينصح باستخدام شرائط مؤشر الحموضة لمراقبة درجة الحموضة بشكل متسق.
  3. أضف 2 ميكرولتر من محلول المخزون من أوليغوميسين 10 ملليمولار في 2 مل من وسط الفحص المعدل حسب الرقم الهيدروجيني.
    1. تحضير محلول المخزون من أوليغوميسين 10 ملليمول: يعيد تشكيل قارورة أوليغوميسين بمقدار 10 ملغ في 1 مل من DMSO المعقم، مع تركيز 10 ملغ/مل، وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.
  4. أخرج الخلايا من الحاضنة (من الخطوة 4) واجمع الوسائط في أنابيب طرد مركزي دقيقة بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
  5. اجمع المادة الفائقة (تخلص من الحبيبات للتخلص من الخلايا/الحطام) وخزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لقياس اللاكتات المذكورة في الخطوة 8.
  6. اغسل الخلايا بلطف شديد بمقدار 1 مل من وسط التحليل المعدل حسب الرقم الهيدروجيني لتجنب الارتفاع عن الخلايا.
  7. تخلص من وسط الفحص وأضف 500 ميكرولتر من وسط الفحص المعدل حسب الرقم الهيدروجيني واحتضن على حرارة 37 درجة مئوية (بدون ثاني أكسيد الكربون2) لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة.
  8. في هذه الأثناء، أضف جميع المثبطات المطلوبة إلى لوحة معايرة محلل التدفق خارج الخلوي في منافذ كل منها - 55 ميكرولتر من الجلوكوز إلى المنفذ A في أعلى اليسار في جميع الآبار، 60 ميكرولتر من الأوليغوميسين في المنفذ B إلى الآبار العلوية اليمنى و65 ميكرولتر من 2DG في المنفذ C إلى الآبار السفلية اليسرى (بما في ذلك الآبار الخلفية) (راجع الشكل 4A).
    ملاحظة: زيادة الحجم في كل خطوة مطلوبة للحفاظ على المولارية، حيث تزداد الأحجام مع إضافة الجلوكوز والأوليغوميسين مسبقا.
  9. بعد إضافة المثبطات، قم بإعداد اختبار إجهاد التحلل السكري باستخدام برنامج Agilent Seahorse Wave (راجع الشكل 3). ثم، شغل لوحة المعايرة بمجرد أن يطلب منك ذلك.
    ملاحظة: قم بإزالة الغطاء العلوي من اللوحة والغطاء الوردي بين الألواح قبل وضع لوحة المعايرة في الجهاز. خلال هذه الخطوة، سيتم اختبار حساسات الرقم الهيدروجيني والأكسجين2 ، وفحص مراقبة الجودة.
  10. بعد انتهاء المعايرة، سيقوم الجهاز بطلب من تفريغ لوحة المعايرة وتحميل لوحة الزراعة.
    1. الخطوة الأولى: اختيار قالب الاختبار (الشكل 3A)
      1. افتح برنامج الموجة ، ومن قسم القوالب ، اختر قالب الاختبار المناسب للتجربة.
      2. في هذه الحالة، اختر "اختبار إجهاد تحلل السكر XF" في محلل التدفق خارج الخلية.
    2. الخطوة الثانية: تعريف المجموعات واستراتيجيات الحقن (الشكل 3B)
      1. اذهب إلى تبويب تعريفات المجموعات وأنشئ مجموعات تجريبية (مثل الخلفية، التحكم، وLPS).
      2. حدد استراتيجية الحقن باختيار المركبات التي سيتم حقنها في كل منفذ (مثل الجلوكوز، الأوليغوميسين، 2DG لاختبار إجهاد التحلل السكري؛ هذه الإعدادات محددة مسبقا من قبل البرنامج كافتراضية، تحقق بناء على ذلك).
    3. الخطوة الثالثة: تعيين المجموعات لخريطة الألواح (الشكل 3C)
      1. افتح عرض خريطة الألواح وخصص الآبار لكل مجموعة عن طريق سحب أسماء المجموعات (مثلا: الخلفية = الأسود، التحكم = الأخضر، LPS = الأحمر) على تخطيط اللوحة.
      2. تأكد من تخصيص آبار فارغة/خلفية لتطبيع دقيق.
    4. الخطوة الرابعة: إعداد البروتوكول (الشكل 3D)
      1. تحت تبويب البروتوكول ، برمج دورات القياس والحقن. يشمل التسلسل النموذجي لاختبار إجهاد التحلل السكري تحمض غير الجليكوليكية، وحقن الجلوكوز (المنفذ A) → قياس تحلل السكر، وحقن الأوليغوميسين (المنفذ B) → قياس السعة القابلة للجليكوليكية، وحقن 2-DG (المنفذ C) → قياس الاحتياطي الجليكوليكي
      2. حدد عدد دورات القياس بعد كل حقنة وعدل التوقيت (مثلا: 3 دورات من خلط 3 دقائق، انتظار دقيقتين، قياس لمدة 3 دقائق).
        ملاحظة: في تجاربنا، نستخدم الإعدادات الافتراضية للبرنامج.
      3. راجع إجمالي وقت الفحص قبل إجراء الاختبار.
    5. الخطوة الخامسة: التطبيع (الشكل 3E)
      1. تطبيع البيانات بقيم تركيز البروتين التي تم الحصول عليها من اختبار حمض البيسينشونيك (BCA) داخل برنامج Wave باستخدام خيار التطبيع المدمج (مثل محتوى البروتين، عدد الخلية، أو طرق أخرى متاحة). تظهر قياسات تركيز البروتين في الجدول 1.
        ملاحظة: بروتوكول عزل البروتين لاختبار BCA بعد قياس ECAR موصوف في الخطوة 7 التالية.

7. جمع الخلايا لقياس البيانات وتطبيعه

  1. بمجرد اكتمال اختبار التدفق خارج الخلية، قم بإزالة لوحة الزراعة وبدء استخراج البروتين فورا أو تخزين الطبق عند -80 درجة مئوية حتى يكون جاهزا لاستخلاص البروتين.
    ملاحظة: تسمح اختبارات البروتين لنا بتطبيع القيم عبر ظروف العلاج المختلفة (وهي إحدى الطرق لتطبيع البيانات، وليست الطريقة الوحيدة).
  2. لعزل البروتين الفوري، قم بإزالة وسط الاختبار من الآبار وغسل مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من زيت RT PBS (مرة واحدة) (ينصح بغسل خفيف بغسيل واحد لتقليل تمزيق طبقة الخلية الأحادية).
  3. لجمع الخلايا التي قد تنفصل خلال هذه العملية، قم بطرد مركزي على اللوحة مرة واحدة على 300 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من PBS، وأعد تعليق الحبيبات الناتجة في مخزن RIPA لضمان قياسات بروتين كلية دقيقة.
  4. أضف حوالي 75–100 ميكرولتر من مخزن RIPA إلى كل بئر ووضع اللوحة على هز (دوران منخفض-متوسط) لمدة 30 دقيقة (RT). ثم انقل المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل.
    ملاحظة: قم بالتثبيث وامزج جيدا داخل الآبار قبل نقل مخزن RIPA إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل.
  5. حضن أنبوب الطرد المركزي الدقيق على جهاز دوار لمدة حوالي 30 دقيقة عند RT لتحلل الخلايا بشكل صحيح. خلال هذا الوقت، قم بتبريد الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  6. قم بعمل طرد مركزي على محلل الخلية عند 16,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من الحبيبة لأنها ستحتوي على حطام خلوي.
  7. اجمع المادة الفائقة لقياس كمية البروتين باستخدام اختبار BCA (أو أي طريقة مفضلة أخرى). إما أن تتابع فورا أو تخزن الليزاتات بعد إزالة جميع وسائط الفحص عند -20 درجة مئوية (للتخزين قصير الأمد)، أو -80 درجة مئوية (للتخزين طويل الأمد).
  8. عند إعادة التشغيل بعد تخزين العينات على -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية، قم بإذابتها على الجليد لمدة 20–30 دقيقة تقريبا، مع دوامة/دوران قصيرة، واستمر في بروتوكول BCA القياسي.
  9. بدلا من ذلك، عد الخلايا في كل بئر باستخدام مقياس الدم أو عبر مقياس تدفق خلوي ودمجها في استراتيجيات التطبيع. في هذه الحالة، أضف حوالي 100–200 ميكرولتر من التريبسين (تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية) فور انتهاء الاختبار وإزالة وسط الاختبار، وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اجمع الخلايا بإضافة 100–200 ميكرولتر من 10٪ FBS لتحييد تأثيرات التربسين.
    1. قم بالطرد المركزي للخلايا بقوة 300 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم أزل السوبرناتان، وأعد تعليق الرصاصة في حوالي 1 مل من 10٪ FBS قبل العد باستخدام جهاز قياس الدم. بدلا من ذلك، يمكن تثبيت الخلايا بنسبة 4٪ من PFA لمدة 15 دقيقة قبل البدء في عد الخلايا المعتمد على قياس تدفق الخلايا (تدفق الخلايا الخلوية).
      ملاحظة: إذا بدأت عد الخلايا فورا، فلا حاجة للتثبيت القائم على PFA.
  10. تطبيع قيم ECAR مع تركيز البروتين من الخطوة 7.8 أو عد الخلايا من الخطوة 7.9.1 في كل بئر باستخدام برنامج Wave كما في الخطوة 6.10.5.1. القيم الناتجة هي القيم المقررة لاختبار إجهاد التحلل الجليكولي.
  11. توليد النتائج والرسم البياني باستخدام خيار "تصدير" يليه خيار "منشور لوحة الرسم البياني" و"ورقة إكسل" لكل قيمة نقطة بيانات للقياس.
    ملاحظة: في لوحة زراعة الخلية، يكون اختيار أربعة آبار فارغة مخصصة مرنا ويمكن للباحث تحديده. الترتيب الافتراضي للفراغات موضح في الشكل 3C.

8. قياسات اللاكتات من الكائنات الزائدة في الزراعة

  1. قم بإذابة الأليكوات الفائقة على الجليد التي جمعت في اليوم الثاني عشر وتم تخزينها عند −80 درجة مئوية من الخطوة 6.5.
  2. تحديد تركيزات L-Lactate باستخدام مجموعة اختبار L-Lactate في الوضع الفلورومتري، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: الوضع الفلورومتري أكثر حساسية بكثير من اختبار الألوان اللوني.
  3. إعداد المعايير عن طريق التخفيف التسلسلي لمعيار اللاكتات المقدم لتوليد منحنى معايرة يتراوح من 0 إلى 0.1 نانومول/بئر.
  4. أضف العينات والمعايير إلى صفيحة دقيقة شفافة مكونة من 96 بئر مكررة، ثم أضف خليط التفاعل الذي يحتوي على خليط إنزيمات اللاكتات ومسبار فلوري إلى كل بئر.
  5. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة محميا من الضوء. قس شدة التألق باستخدام قارئ ميكرولوح فلوري مع أطوال موجية للإثارة/الانبعاث مضبوطة على 535/587 نانومتر.
  6. احسب تركيزات اللاكتات في العينات من المنحنى القياسي وعبر عنها كpM. مستويات اللاكتات من الكائنات الفائقة للدبقية الدبقية الأولية غير المعالجة (الضابطة) والمعالجة ب LPS معروضة في الجدول 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يقيس اختبار الإجهاد القائم على تدفق الجليكولوس خارج الخلية الملف الجليكوليزي للميكروغليا الأولية بنجاح. يقيس الاختبار التحلل السكري القاعدي، أي التحلل السكري بعد حقن الجلوكوز، القدرة التحليلية بعد حقن الأوليغوميسين، وتثبيط التحلل السكري عند حقن 2DG. في تجربتنا، قارنا بين الدبقية الدبقية الدقيقة الأولية المعالجة ب LPS (غير المعالجة) والمنطقة الدبقية الدبقية الأولية. لاحظنا تغيرات شكلية طفيفة بين الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة بالألياف السطحية الضابطة والصغرى المعالجة ب LPS بعد 24 ساعة (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يرافق استجابة الخلايا الدبقية الدقيقة أثناء الالتهاب العصبي إعادة توصيل أيضية عميقة تمكن هذه الخلايا من تلبية متطلبات الطاقة والتخليق الحيوي لحالتها الوظيفية. اختبار الإجهاد القائم على التدفق خارج الخلوي للجليكوليز يقدم طريقة حساسة وفي الوقت الحقيقي لقياس التدفق الجليكوليتيكي، مما يمكننا من تحليل كيفية تكيف الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية مع الأيض تحت الظروف الالتهابية. في هذه الدراسة، استخدمنا الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في الفأر وقمنا بتقييم نشاطها الجليكوليزي بعد التعرض للمحفزات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يعلنون عن تضارب مصالح.

شكر وتقدير

يتم تمويل العمل من خلال منحة مشروع CIHR ل DKK. المرجع المرجعي للدكتور كريغ مور لتحليل اختبار Seahorse XFe24 محل تقدير كبير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حل HEPES بسعة 1Mسيغما ألدريتشH0887
1X HBSSGibco   14175-079
2.5٪ تريبسينGibco   15090-046
2DGميليبور سيغما  D6134
مضاد حيوي/مضاد للفطريات جيبكو15240-062
D & ndash; (+)الجلوكوز، اللامائي&nb;علم الحرارة   A16828.36
DMEMجيبكو  11965-092
DNase Iميليبور سيغما  11284932001- روش
FBSفيشربراندFB12999102
غلوتامكسGibco   35050-061
مجموعة L-LactateأبكامAB65330
LPS سيغما ألدريتش  L4391
ميم NEAA Gibco   11140-050
أوليغوميسين أميليبور سيغما  495455
البنسلين/الستربتوميسينGibco   15240-062
شرائط مؤشر الحموضةفيشربراند13-640-516
سيهورس XFe24تقنيات أجيلينتلا يوجدالاسم العام: محلل التدفق خارج الخلوي
صفائح الخلايا الصغيرة Seahorse 24 V7 PSأجيلينت سيهورس100777-004الاسم العام: صفائح الخلايا الدقيقة لزراعة خلايا التدفق خارج الخلية
اختبار فرس البحر XF العازف (pH 7.4)أجيلينت سيهورس    100840-000الاسم العام: مخزن معايرة التدفق خارج الخلوي
اختبار حصان البحر XF DMEM media (pH 7.4)أجيلينت سيهورس      103575-100الاسم العام: وسائط اختبار التدفق خارج الخلوي
مجموعة اختبار التدفق خارج الخلوي من فرس البحرأجيلينت سيهورس  102342-100الاسم العام: لوحة معايرة التدفق خارج الخلية 
بيروفات الصوديوم Gibco   11360-070

المراجع

  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179, 292-311 (2019).
  2. Tay, T. L., et al. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathol. Commun. 6, 87(2018).
  3. Wang, Z., et al. Glycolysis and oxidative phosphorylation play critical roles in natural killer cell receptor-mediated natural killer cell functions. Front. Immunol. 11, 202(2020).
  4. Soto-Heredero, G., Gómezde Las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis-a key player in the inflammatory response. FEBS J. 287, 3350-3369 (2020).
  5. O'Neill, L. A., Kishton, R. J., Rathmell, J. A guide to immunometabolism for immunologists. Nat. Rev. Immunol. 16, 553-565 (2016).
  6. Bernier, L. P., et al. Microglial metabolic flexibility supports immune surveillance of the brain parenchyma. Nat. Commun. 11, 1559(2020).
  7. Bernier, L. P., York, E. M., MacVicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43, 854-869 (2020).
  8. Geric, I., et al. Metabolic reprogramming during microglia activation. Immunometabolism. 1, e190002(2019).
  9. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol. Cells. 47, 100095(2024).
  10. Zhang, Z., et al. Glutamine metabolism modulates microglial NLRP3 inflammasome activity through mitophagy in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation. 21, 261(2024).
  11. Wang, L., et al. Glucose transporter 1 critically controls microglial activation through facilitating glycolysis. Mol. Neurodegener. 14, 2(2019).
  12. Lu, J., Zhou, W., Dou, F., Wang, C., Yu, Z. TRPV1 sustains microglial metabolic reprogramming in Alzheimer's disease. EMBO Rep. 22, e52013(2021).
  13. Orihuela, R., McPherson, C. A., Harry, G. J. Microglial M1/M2 polarization and metabolic states. Br. J. Pharmacol. 173, 649-665 (2016).
  14. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J. Neuroinflammation. 18, 129(2021).
  15. Kaushik, D. K., et al. Enhanced glycolytic metabolism supports transmigration of brain-infiltrating macrophages in multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 129, 3277-3292 (2019).
  16. Hu, Y., et al. mTOR-mediated metabolic reprogramming shapes distinct microglia functions in response to lipopolysaccharide and. Glia. 68, 1031-1045 (2020).
  17. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Front. Cell. Neurosci. 14, 22(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

دراسة التحلل السكري في الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية باستخدام اختبار التدفق خارج الخلوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.