تحفيز الفيروبتوزيس في الورم الدبقي بواسطة كالسيولاريوسيد A عبر تعديل مسار PI3K/Akt/Nrf2

ملخص

تستكشف هذه الدراسة الإمكانات العلاجية للكالسيولاريوسيد A في الورم الدبقي (glioma)، وتظهر قدرته على تثبيط إشارات PI3K/Akt وتعزيز تحلل Nrf2، مما يحفز الفيروبتوزيد ويمنع تقدم الورم في المختبر والحي.

الملخص

يوضح هذا البروتوكول سير العمل التجريبي المستخدم لدراسة تأثيرات كالسيولاريوسيد A (CaA) على تحفيز وتعديل مسار فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K)/بروتين كيناز B (Akt)/عامل نووي مرتبط بإريثرويد 2 (Nrf2) في نماذج الورم الدبقي (Neuro Tumor). تشمل الإجراءات سلسلة من الفحوصات الخلوية في خطوط الورم الدبقي البشري U251 وU87 لتقييم بقاء الخلايا، وتكاثرها، وحساسية الكيميائي بعد علاج CaA. يتم تقييم التغيرات المرتبطة بالفيروبتوزيس من خلال قياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، الجلوتاثيون (GSH)، المالونديالديهايد (MDA)، ومستويات الحديد المتقلب، إلى جانب التعبير عن بروتينات مرتبطة بالفيروبتوسيس مثل الجلوتاثيون بيروكسيداز 4 (GPX4)، وحدة مضاد النقل السيستين/الجلوتامات (xCT)، والفيريتين عبر البلوت الغربي. لتقييم مشاركة المسار، يوضح البروتوكول اختبارات qRT-PCR، ويسترن بلوت، واختبارات التقرب المناعي للتعبير عن Nrf2 واليوبيكوتين. تتضمن تجارب فرط التعبير ل Nrf2 لتأكيد دوره في تنظيم الفيروبتوز. يوضح البروتوكول أيضا استخدام نموذج زراعة الجنس للفأر، حيث تزرع خلايا U87 تحت الجلد، تليها إعطاء CaA داخل الصفاق لتقييم نمو الورم في الجسم الحي وسميته. يتم إجراء تحليل نسيجي للأعضاء الرئيسية لتقييم السلامة الجهازية. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم الالتحام الجزيئي للتنبؤ بالارتباط المباشر بين CaA ووحدة PI3K p110α (PIK3CA). معا، توفر هذه الإجراءات إطارا قابلا للتكرار لفحص آليات الفيروبتوزيس والفعالية العلاجية للمركبات الطبيعية في أبحاث الورم الدبقي النفسي.

المقدمة

الأورام الدبقية، وخاصة الأورام الأرومية الدبقية عالية الدرجة، تمثل واحدة من أكثر أشكال أورام الدماغ فتكا، وتتميز بالتكاثر السريع، ومقاومة العلاج، وسوء التوقعات¹. في السنوات الأخيرة، تم استكشاف عدة عوامل مضادة للورم الدبقي الكهربائي، بما في ذلك العلاجات الكيميائية التقليدية مثل تيموزولوميد ومجموعة من المركبات الطبيعية مثل الكركمين²، الريسفيراترول³، والإبيغالوكاتشين جالات⁴. تؤثر هذه العوامل على تأثيرها من خلال آليات متعددة، منها تحفيز الاستماتة المبرمجة، وتثبيط تكوين الأوعية، وتعديل مسارات الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، تواجه العديد من هذه المركب....

البروتوكول

زراعة الخلايا والعلاج
تم زراعة خلايا المورس العصبية HT22 وسلاسل الخلايا الدبقية البشرية U87 وU251 في وسط النسر المعدل في دولبيكو مع مكمل بنسبة 10٪ مصل أبقار جنيني و4 ملليمولار L-جلوتامين، في ظروف رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. لتبسيط الاتساق التجريبي، تم توحيد جميع علاجات الخلايا ووصفها هنا. يوضح هذا القسم الحالات المحددة المستخدمة في كل مجموعة معالجة والاختبارات اللاحقة المقابلة.

علاج CaA:
تمت معالجة خلايا HT22 بتركيزات متزايدة من CaA (0، 0.1، 0.5، 1، 10، 50، 100، 250، و500 ميكرومول) لمدة 72 ساعة. تمت معالجة خلايا الورم الدبقي U87 وU251 بتركيزات 5 أو 20 أو 50 ميكرومولار....

النتائج

تثبيط التكاثر وزيادة الحساسية الكيميائية لخلايا U251 وU87 في المختبر بواسطة CaA
يوضح الشكل 1A بنية CaA. قمنا أولا بتقييم التأثيرات السامة للسيتوسام للكاثوليد باستخدام اختبار MTT على خلايا الفرسان العصبية HT22 الطبيعية وخلايا الورم الدبقي البشرية U251 وU87. مقارنة بالخلايا غير المعالجة (0 ميكرومولار CaA)، كان للCaA تأثير طفيف على بقاء خلايا HT22 عند تركيزات أقل من 100 ميكرومولار خلال 72 ساعة (الشكل 1B

المناقشة

يظهر CaA تأثيرا مضادا قويا للأورام في الورم الأرومي الدبقي من خلال تعديل محورين حيويين للبقاء بشكل فريد: مسار PI3K/Akt/mTOR وآلية الدفاع عن Nrf2-ferroptosis. غالبا ما يتم تنشيط مسار PI3K/Akt بشكل مفرط في الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM، الذي يتغير في ما يصل إلى ~88-90٪ من الحالات) بسبب فقدان PTEN أو تنشيط RTK، مما يدفع التكاثر ومقاومة العلاج²⁶. ومع ذلك، فإن استهداف هذا المسار وحده أدى إلى موت المبرمج المحدود في GBM، حيث غالبا ما تهرب الأورام من تثبيط PI3K .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agilent 2100 Bioanalyzer			نظام الكهربائي القائم على الشعيرات الدموية
Annexin V-FITC Apoptosis Kit	Roche Diagnostics	11858777001	N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)			برنامج تحضير الالتحام الجزيئي (خوارزمية التحام)
Calceolarioside A (CaA)	Sigma-Aldrich	SMB00246	N/A
Chem3D			برنامج النمذجة الجزيئية
cDNA Synthesis Kit	Vazyme Biotech	R223	N/A
DCFH-DA	Sigma-Aldrich	D6883	N/A
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	N/A
DMSO	Merck	D8418	N/A
FerroOrange probe	Dojindo	F374	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	N/A
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAriaIII Flow Cytometry	جهاز لتحليل الخلايا الملطخة بـ Annexin V
Fluorescence microscope	Olympus	IX73	جهاز لمراقبة فلوريسنس FerroOrange وDCFH-DA
FTH1 antibody	Abcam	ab75973	AB_1310150
GAPDH antibody	Abcam	ab8245	AB_2107448
GLS antibody	Abcam	ab93434	AB_10563527
GPX4 antibody	Abcam	ab125066	AB_10972289
HT22 murine neuronal cell line	AddexBio	C0011008	CVCL_0321
jetPRIME transfection reagent	Polyplus-transfection	114-07	عامل نقل بوليمر
Keap1 antibody	Abcam	ab139729	AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	N/A
LigPlot+			أداة رسم تفاعل ثنائي الأبعاد
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific		عامل نقل دهني
Liproxstatin-1	Selleck	S7699	N/A
MG132	Selleck	S2619	N/A
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	H1M	جهاز لقياس الامتصاص في اختبار MTT (عند 490 نانومتر)
MTT	Sigma-Aldrich	M5655	N/A
NanoDrop			مقاييس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية بحجم دقيق
Nrf2 antibody	Abcam	ab62352	AB_945626
Nude BALB/c mice	Vital River, China	N/A	IMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOL			برنامج تصور جزيئي
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master Mix	Vazyme Biotech	Q711	N/A
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	N/A
U251 human glioma cell line	CLS Cell Lines Service	300385	CVCL_0021
U87 human glioma cell line	ATCC	HTB-14	CVCL_0022
Ubiquitin antibody	Abcam	ab7780	AB_306981
xCT/SLC7A11 antibody	Abcam	ab175186	AB_2715513