يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تحفيز الفيروبتوزيس في الورم الدبقي بواسطة كالسيولاريوسيد A عبر تعديل مسار PI3K/Akt/Nrf2

469 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69643

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Pediatric Surgery, Weifang Peoples Hospital, 3Department of Burn, Weifang Peoples Hospital

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

تستكشف هذه الدراسة الإمكانات العلاجية للكالسيولاريوسيد A في الورم الدبقي (glioma)، وتظهر قدرته على تثبيط إشارات PI3K/Akt وتعزيز تحلل Nrf2، مما يحفز الفيروبتوزيد ويمنع تقدم الورم في المختبر والحي.

الملخص

يوضح هذا البروتوكول سير العمل التجريبي المستخدم لدراسة تأثيرات كالسيولاريوسيد A (CaA) على تحفيز وتعديل مسار فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K)/بروتين كيناز B (Akt)/عامل نووي مرتبط بإريثرويد 2 (Nrf2) في نماذج الورم الدبقي (Neuro Tumor). تشمل الإجراءات سلسلة من الفحوصات الخلوية في خطوط الورم الدبقي البشري U251 وU87 لتقييم بقاء الخلايا، وتكاثرها، وحساسية الكيميائي بعد علاج CaA. يتم تقييم التغيرات المرتبطة بالفيروبتوزيس من خلال قياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، الجلوتاثيون (GSH)، المالونديالديهايد (MDA)، ومستويات الحديد المتقلب، إلى جانب التعبير عن بروتينات مرتبطة بالفيروبتوسيس مثل الجلوتاثيون بيروكسيداز 4 (GPX4)، وحدة مضاد النقل السيستين/الجلوتامات (xCT)، والفيريتين عبر البلوت الغربي. لتقييم مشاركة المسار، يوضح البروتوكول اختبارات qRT-PCR، ويسترن بلوت، واختبارات التقرب المناعي للتعبير عن Nrf2 واليوبيكوتين. تتضمن تجارب فرط التعبير ل Nrf2 لتأكيد دوره في تنظيم الفيروبتوز. يوضح البروتوكول أيضا استخدام نموذج زراعة الجنس للفأر، حيث تزرع خلايا U87 تحت الجلد، تليها إعطاء CaA داخل الصفاق لتقييم نمو الورم في الجسم الحي وسميته. يتم إجراء تحليل نسيجي للأعضاء الرئيسية لتقييم السلامة الجهازية. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم الالتحام الجزيئي للتنبؤ بالارتباط المباشر بين CaA ووحدة PI3K p110α (PIK3CA). معا، توفر هذه الإجراءات إطارا قابلا للتكرار لفحص آليات الفيروبتوزيس والفعالية العلاجية للمركبات الطبيعية في أبحاث الورم الدبقي النفسي.

المقدمة

الأورام الدبقية، وخاصة الأورام الأرومية الدبقية عالية الدرجة، تمثل واحدة من أكثر أشكال أورام الدماغ فتكا، وتتميز بالتكاثر السريع، ومقاومة العلاج، وسوء التوقعات1. في السنوات الأخيرة، تم استكشاف عدة عوامل مضادة للورم الدبقي الكهربائي، بما في ذلك العلاجات الكيميائية التقليدية مثل تيموزولوميد ومجموعة من المركبات الطبيعية مثل الكركمين2، الريسفيراترول3، والإبيغالوكاتشين جالات4. تؤثر هذه العوامل على تأثيرها من خلال آليات متعددة، منها تحفيز الاستماتة المبرمجة، وتثبيط تكوين الأوعية، وتعديل مسارات الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، تواجه العديد من هذه المركبات قيودا مثل ضعف التوافر البيولوجي أو عدم اكتمال التوصيف الميكانيكي. هذا يبرز الحاجة الملحة إلى منهجيات شاملة لا تؤكد فقط النشاط المضاد للأورم، بل تقوم أيضا بتحليل الآليات الدوائية الأساسية بشكل منهجي. يعد إنشاء مثل هذه السير الآلية أمرا مهما بشكل خاص لتسريع تطوير مركبات مضادة للورم الدبقي من الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري.

لدعم هذا الهدف، أصبح عدد متزايد من الدراسات الآن يدمج أدوات حسابية وتجريبية متقدمة لتعزيز الدقة الميكانيكية 5,6. تسهل نماذج تصميم الأدوية القائمة على البنية والذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) — مثل AlphaFold3 والالتحام الجزيئي — تحديد التفاعلات الواعدة مع الأهداف الدوائية بسرعة ودقة غير مسبوقة 7,8. تكمل هذه الأدوات الطرق التجريبية من خلال التنبؤ بمواجهات الارتباط وتحديد الأهداف الجزيئية المحتملة قبل التحقق من المخبر. وفي الوقت نفسه، تتيح ظهور الفحوصات الوظيفية القائمة على المسارات، وتصوير الخلايا الحية، والتقنيات عالية الدقة للبروتيوميات للباحثين تقييم تأثير الخلايا للمركبات الجديدة عبر محاور تنظيمية متعددة، بما في ذلك استجابات الإجهاد التأكسدي، وسلاسل نقل الإشارة، وأنماط موت الخلايا مثل الفيروبتوزيس 9,10,11.

من بين مسارات الإشارات المشاركة في بيولوجيا الورم الدبقي، فإن مسارات فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K)/بروتين كيناز B (Akt) وعامل الفيروس النووي المرتبط بالإريثرويد 2 (Nrf2) ذات أهمية خاصة بسبب أدوارها في نمو الورم، وتوازن الأكسدة والاختزال، ومقاومة العلاج12,13. تعزز إشارات PI3K/Akt البقاء والتكاثر والتكيف الأيضي في خلايا الورم الدبقية، بينما يعمل Nrf2 كمنظم رئيسي للاستجابة المضادة للأكسدة، حيث يثبط موت الخلايا الفيروبتوتيكية14. التنشيط المستمر لهذه المسارات يساهم في التهرب من العلاج، مما يجعلها أهدافا جذابة للتدخل الدوائي15. تشمل الطرق التقليدية لفحص المسارات الغربي للبروتينات الكلية والبروتينات المفسفرة، بالإضافة إلى qRT-PCR لتحليل التعبير الجيني. ومع ذلك، يتطلب التحليل المتعمق لإشارات Nrf2 اختبارات إضافية لتقييم استقرار البروتينات، ونقل النواة، والتعديلات بعد الترجمة مثل التوبيكوتين. تعد هذه الاستراتيجيات متعددة الجوانب ضرورية لفهم كيفية تعطيل أو تعزيز المركبات المحددة لتنظيم الأكسدة والاختزاز والسيطرة على الفيروبتوتيك.

كالسيولاريوسيد A (CaA)، مشتق حمض الهيدروكسي سيناميك، يقدم آلية مزدوجة من خلال تثبيط إشارات PI3K/Akt وتعزيز تحلل Nrf2 البروتيازومي، مما يعزز الحساسية الفيروبتوزية. قد تحسن هذه الاستراتيجية ذات الاستهداف المزدوج قابلية التكرار والعمق الميكانيكي مقارنة بالعوامل الموجودة مثل إيراستين أو RSL3، التي تعمل بعد الدفاعات المضادة للأكسدة. يقدم هذا البروتوكول نهجا تجريبيا متكاملا للتحقيق في الآلية الدوائية ل CaA، والذي يشمل الالتحام الجزيئي لتحديد مواقع ارتباط PI3K، والتطهير المناعي والتقرب المناعي للكشف عن تعبير Nrf2 وتوبيعه في كل مكان (ubiquitin)، وعلامات الفيروبتوزيس مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، الجلوتاثيون (GSH)، والمالونديالديهايد (MDA). علاوة على ذلك، يستخدم نموذج فأر الزينوغرافت لتقييم فعالية CaA العلاجية والسلامة الجهازية. يوفر هذا السير الشامل منصة قابلة للتكرار ومعلوماتية لدراسة آلية عمل العوامل المضادة للسرطان، مع التركيز على دمج تعديل مسار الإشارة وتنظيم موت الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

زراعة الخلايا والعلاج
تم زراعة خلايا المورس العصبية HT22 وسلاسل الخلايا الدبقية البشرية U87 وU251 في وسط النسر المعدل في دولبيكو مع مكمل بنسبة 10٪ مصل أبقار جنيني و4 ملليمولار L-جلوتامين، في ظروف رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. لتبسيط الاتساق التجريبي، تم توحيد جميع علاجات الخلايا ووصفها هنا. يوضح هذا القسم الحالات المحددة المستخدمة في كل مجموعة معالجة والاختبارات اللاحقة المقابلة.

علاج CaA:
تمت معالجة خلايا HT22 بتركيزات متزايدة من CaA (0، 0.1، 0.5، 1، 10، 50، 100، 250، و500 ميكرومول) لمدة 72 ساعة. تمت معالجة خلايا الورم الدبقي U87 وU251 بتركيزات 5 أو 20 أو 50 ميكرومولار لمدة 24 ساعة في معظم التجارب، أو ب 50 ميكرومولار لمدة 0 أو 6 أو 12 أو 18 ساعة للدراسات الزمنية. تم استخدام هذه العلاجات في التحليلات التالية: البلوتينغ الغربي لوحدة مضاد الحمل للسيستين/الجلوتامات (xCT)، غلوتاثيون بيروكسيداز 4 (GPX4)، الفيريتين (FTH1)، الجلوتاميناز، وPI3K/Akt/الثدييات المستهدفة للراباميسين (mTOR)/ عامل البدء الحقيقي النوى 4B (EIF4B) (المستويات الكلية والفوسفورية); تفاعل البوليميراز الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) لبروتين Nrf2 والبروتين المرتبط ب ECH الشبيه بكيلش 1 (Keap1)؛ قياس ROS باستخدام ثنائي كلورودي هيدروفلوريسين ثنائي أسيتات 2′,7′ (DCFH-DA); قياس GSH وMDA؛ كشف Fe2+ المعتمد على FerroOrange؛ اختبار انتشار 5-إيثينيل-2′-ديوكسيوريدين (EdU)؛ اختبار تكوين المستعمرة؛ اختبار بقاء خلايا 3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-إيل)-2,5-ديفينيل تيترازوليوم بروميد (MTT).

العلاج المشترك بليبروكسستاتين-1 (Lip1):
تمت معالجة الخلايا مسبقا ب 50 نانوميل Lip1 لمدة ساعتين قبل إضافة 50 ميكرومولار CaA. تم استخدام هذه الشروط في اختبار MTT (0، 24، 48، 72 ساعة)؛ اختبار تكوين المستعمرة؛ اختبار EdU؛ اختبار المبرمج بنظام Annexin V/PI (مع/بدون 20 نانوماليتر سيسبلاتين).

العلاج المشترك مع MG132:
تمت معالجة الخلايا بجرعة MG132 بمقدار 10 ميكرومولار أو دمجه مع 50 ميكرومولار CaA لمدة 24 ساعة. تم تطبيق ذلك على البلوط الغربي لتثبيت بروتين Nrf2 (الكلي والنووي)؛ اختبارات التقرب المناعي (IP) لجرعة Nrf2 وKeap1 المجمعة في كل كوتين.

العلاج المشترك مع السيسبلاتين:
تمت معالجة الخلايا ب 20 نانومالي سيسبلاتين وحده أو مع 20 ميكرومولار CaA لمدة 24 ساعة. تم استخدام هذه العلاجات في اختبار الاستماتة المبرمج من Annexin V/بروبيديوم يوديد (PI).

تعبير Nrf2 المفرط:
تم نقل الخلايا باستخدام بلازميد 2.5 ميكروغرام Nrf2 زائد التعبير أو متجه فارغ باستخدام عامل النقل لمدة 18 ساعة، ثم عولجت ب 50 ميكرومولار CaA لمدة 24 ساعة. تم استخدام هذه الحالة في البلتينغ الغربي لعلاج xCT، GPX4، FTH1، والجلوتاميناز؛ اختبارات ROS، MDA، GSH؛ صبغة فيرو أورانج للحديد داخل الخلية.

يلخص مخطط سير العمل (الشكل التكميلي S1) الشروط التجريبية أعلاه والتحليلات المقابلة. يربط هذا الشكل بصريا كل بروتوكول علاج باختباراته الخاصة في المراحل النهائية لتحسين الوضوح وقابلية التكرار.

تقييم صلاحية الخلية
تم تقييم بقاء الخلايا باستخدام الطريقة التقليدية لقياس الألوان MTT كما هو موضحسابقا 16. تم طلاء خلايا HT22 وU251 وU87 في ألواح زراعة بسعة 96 بئرا وحضنتها طوال الليل للسماح بالالتصاقها. بعد إكمال فترة المعالجة، تم إدخال 15 ميكرولتر من محلول MTT في كل بئر وتم حضن الألواح لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ثم تم التخلص من الوسط، وأضيف 150 ميكرولتر من ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO) لإذابة بلورات الفورمازان المتشكلة. تم تسجيل الامتصاص لاحقا عند 490 نانومتر باستخدام قارئ الميكرولوتين. تشير قيم الامتصاص الأعلى إلى قدرة أكبر على الاستمرار الخلوي، بينما يشير انخفاض الامتصاص إلى تأثيرات سامة للخلايا.

اختبار دمج EdU
لتقييم تخليق الحمض النووي وتكاثر الخلايا، أجريت اختبارات دمج EdU باستخدام مجموعة تصوير EdU كما هو موضح سابقا17. لفترة وجيزة، تم زرع خلايا الورم الدبقي U251 وU87 في صفائح مكونة من 24 بئرا. بعد العلاج، تم حضن الخلايا ب EdU (تركيز نهائي 10 ميكرومول) وزراعتها لمدة 24 ساعة إضافية. بعد خطوة الحضانة، تم تثبيت الخلايا باستخدام بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ ثم نفرت ب 0.5٪ ترايتون X-100، وصبغت وفقا لتعليمات المجموعة. تم قياس نسبة الخلايا الإيجابية ل EdU (الخلايا المتكاثرة) بواسطة المجهر الفلوري وتم تطبيعه إلى إجمالي أنوية مصبوغة ب 4′,6 دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI).

اختبار تكوين المستعمرة
لاختبار تكوين المستعمرة، تم طلاء خلايا الدبقية U251 وU87 في أطباق بحجم 3.5 سم بكثافة منخفضة (500 خلية في كل طبق). بعد العلاج، تم استبدال وسط الزراعة بوسط طازج خال من الأدوية، وتم الحفاظ على الخلايا لمدة 14 يوما أخرى للسماح بتكوين المستعمرة، مع إجراء تغييرات في الوسط كل ثلاثة أيام. تم تثبيت المستعمرات الناتجة لاحقا باستخدام 4٪ بارافورمالديهايد، وصبغها بلون بنفسجي بلوري 0.1٪، وتم عدها يدويا تحت المجهر. تم تسجيل العناقيد التي يزيد قطرها عن 75 ميكرومتر كمستعمرات. تم إجراء كل تجربة على ثلاث نسخ وأعيد تكرارها ثلاث مرات. اتبعت هذه الاختبارات البروتوكولات المقبولة عادة لتقييم القدرة التكاثرية طويلة الأمد18. يجب أن تظهر المستعمرات كمجموعات دائرية كثيفة؛ تشير المستعمرات الأقل والصغرى إلى انخفاض القدرة على التكاثر.

تقييم الاستماتة الخلوية
تم تقييم موت الخلايا الاستماتة باستخدام مجموعة كشف الاستماتة FITC-Annexin V كما هو موصوف سابقا16. تمت معالجة خلايا الورم الدبقي U87 وU251 بسيسبلاتين 20 نانوميل في وجود أو غياب 20 ميكرومولار CaA لمدة 24 ساعة قبل الصبغ. في التجارب التي تتعلق بتثبيط الفيروبتوزيس، تم معالجة الخلايا مسبقا ب 50 نانوماليت Lip1 لمدة ساعتين، تلتها معالجة مشتركة ب 20 ميكرومولار CaA و20 نانوماليتر سيسبلاتين لمدة 24 ساعة إضافية. بعد المعالجات الموجهة، تم جمع الخلايا (300 × جم، 5 دقائق) وصبغها ب Annexin V-FITC وPI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد وضع العلامات، تم فحص العينات باستخدام جهاز قياس تدفق خلوي. تم إجراء جمع البيانات باستخدام قنوات FL1 (FITC) وFL2 (PI)، مع تطبيق إعدادات تعويض لتقليل التداخل الطيفي. تم حساب نسبة خلايا Annexin V-إيجابية لاحقا لتحديد درجة الاستماتة المبرمجة.

تحليل البقع الغربية
تم إجراء التغطية الغربية وفقا للإجراءات المعتمدة 19,20. لفترة وجيزة، بعد العلاجات المشار إليها، تم تحلل الخلايا في محلول RIPA يحتوي على مثبطات بروتياز وفوسفاتاز، وتم تحديد مستويات البروتين باستخدام اختبار برادفورد. في التجارب التي قيمت توزيع Nrf2 تحت الخلوي، تم استخراج البروتينات النووية والسيتوبلازمية باستخدام مجموعة استخراج نووية تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

تم حل ما مجموعه 40 ميكروغرام من البروتين من كل عينة على هلام SDS-PAGE بنسبة 10٪ ثم نقله لاحقا إلى أغشية PVDF. تم حجب الأغشية بحليب 5٪ خالي من الدسم معد في PBST (PBS بنسبة 0.1٪ Tween-20) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، تلاها حضانة ليلية مع أجسام مضادة أولية عند 4 درجات مئوية. بعد الغسيل، تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع HRP (1:5,000) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، وتم اكتشاف الإشارات باستخدام نظام التوهج الكيميائي المعزز (ECL).

تم قياس مستويات تعبير xCT، الجلوتاميناز، GPX4، وFTH1، باستخدام إزيز الجلسراالديهيد-3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH) كضابط للحمل. تم قياس البروتينات المفسفرة (p-PI3K، p-Akt، p-mTOR، و p-EIF4B) بالنسبة لمستويات البروتين الكلية الخاصة بها، بينما تم تطبيع البروتينات الكلية مقابل GAPDH. تم تطبيع Nrf2 النووي إلى لامين B. تشمل النتائج المتوقعة انخفاضا يعتمد على الجرعة والوقت في Nrf2 وp-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B، وتقليل تنظيم مؤشرات الفيروبتوسيس في الخلايا المعالجة ب CaA.

في اختبارات اليوبيكوتينات، عولجت الخلايا ب MG132 (10 ميكرومولار) مع أو بدون CaA (50 ميكرومولار) لمدة 24 ساعة. بعد التحلل، تم تصحيح مركبات البروتينات المناعية باستخدام أجسام مضادة مضادة ل Nrf2 أو مضادة لكيب1؛ تم استخدام IgG للأرنب العادي كتحكم سلبي. ثم تم فحص الأجسام المضادة المضادة لليوبيكويتين على الأجسام المضادة لليوبيكويتين للكشف عن الأشكال المجمعة، كما تم فحص الليزات الكلية لمستويات Nrf2 ومستويات بروتين ECH 1 (Keap1) الشبيهة ب Kelch لتأكيد المدخلات.

استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل المباير الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي وqRT-PCR وفقا للبروتوكولاتالقياسية 21. باختصار، تم علاج خلايا الورم الدبقي U87 وU251 مع أو بدون 50 ميكرومولار CaA لفترات مختلفة (6 و18 ساعة). تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي وتحويله إلى cDNA من خلال النسخ العكسي. تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) باستخدام مزيج رئيسي من SYBR Green qPCR على منصة PCR في الوقت الحقيقي. تم تحديد التعبير الجيني النسبي باستخدام حساب 2-ΔΔCt. كانت تسلسلات البادئية المستخدمة في Nrf2 وKeap1 وجين التدبير المنزلي GAPDH كما يلي:

Nrf2 للأمام، 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′؛
عكس Nrf2 ، 5′-GGAATGTCTGCGCCAAAAGCTG-3′

Keap1 للأمام، 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATGGC-3′;
كيب1 للخلف، 5′-TGATGAGGGTCACCAGGTTGGCA-3′

GAPDH للأمام، 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′؛
عكس GAPDH، 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′

تحويل Nrf2
تم نقل خلايا الورم الدبقي U251 وU87 بشكل مؤقت إما بلازميد تعبير زائد Nrf2 أو ناقل تحكم فارغ باستخدام كاشف النقل القائم على الدهون؛ استند الإجراء إلى طرق النقل العابر التقليدية22. لفترة وجيزة، تم زرع الخلايا في صفائح ذات 6 آبار بكثافة 3 × 10⁵ خلايا لكل بئر وزرعت طوال الليل لتحقيق التقاء حوالي 70-80٪ عند النقل. لكل بئر، تم تخفيف 2.5 ميكروغرام من حمض البلازميد النووي في 125 ميكرولتر من وسط المصل المختزل وخلطه مع 5 ميكرولتر من مادة التحويل الكهربائي. بشكل منفصل، تم تخفيف 3.75 ميكرولتر من كاشف النقل في 125 ميكرولتر أخرى من وسط المصل المختزل. ثم تم دمج خلطات الحمض النووي المخفف وكاشف النقل الخلفي، وخلطها برفق، وحضانها لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين المعقد. تمت إضافة مركبات النقل الناتجة (الحجم الكلي 250 ميكرولتر) بشكل إسقاطي إلى كل بئر يحتوي على خلايا في وسط جديد كامل.

بعد 18 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂، تم استبدال وسط النقل بوسط زراعة طازج. ثم تم إجراء اختبارات لاحقة على الخلايا، بما في ذلك التحليل الغربي للبتل، وتحليل ROS، وقياس MDA/GSH، ودراسات تراكم الحديد. يتبع هذا البروتوكول إجراءات تعبير جينات عابرة مقبولة على نطاق واسع ويسمح بتعبير قوي ل Nrf2 خلال 24-48 ساعة بعد النقل.

قياس الحديد داخل الخلية
تم قياس مستويات Fe2+ داخل الخلايا باستخدام مؤشر الفلورسنت FerroOrange. باختصار، تم زرع خلايا الورم الدبقي U251 وU87 في صفائح ب 24 بئر وعولجت بتركيزات متفاوتة من CaA (5، 20، و50 ميكرومو). لتقييم تأثير فرط تعبير Nrf2 على الفيروبتوزيس، تم نقل خلايا U87 وU251 إلى بلازميد تعبير Nrf2 أو ناقل فارغ. بعد 18 ساعة، تم استبدال الوسط، وعالجت الخلايا ب 50 ميكرومولار CaA لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تعرضت الخلايا ل 1 ميكرومولار فيروورانج في وسط خال من المصل وحضنتها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل التحليل. بعد الحضانة، تم شطف الخلايا وملاحظتها تحت مجهر فلوري، باستخدام مجموعة مرشح TRITC (الإثارة ~543 نانومتر، الانبعاث 560-600 نانومتر)، حيث تشير شدة الفلورة البرتقالية المتزايدة إلى مستويات أعلى من Fe2+ المتقلب، والتي تكون عادة متمركزة في السيتوبلازم. تم تكييف هذه الطريقة من اختبارات الحديد المعتمدة على المجسات الفلوريةالمعروفة 23.

قياس GSH و MDA
تم تحديد مستويات GSH وMDA داخل الخلايا وفقا لبروتوكولات التقييم الموحدة لتقييم الإجهاد التأكسدي24. باختصار، تم زرع خلايا الورم الدبقي U251 وU87 في صفائح ب 24 بئر وعولجت بتركيزات متفاوتة من CaA (5، 20، و50 ميكرومو). لتقييم تأثير فرط تعبير Nrf2 على الفيروبتوزيس، تم نقل خلايا U87 وU251 إلى بلازميد تعبير Nrf2 أو ناقل فارغ. بعد 18 ساعة، تم استبدال الوسط وعالجت الخلايا ب 50 ميكرومولار CaA لمدة 24 ساعة. لاحقا، تم تحليل الخلايا في مخزن RIPA، وتم قياس تركيزات البروتين الكلية باستخدام مجموعة قياس كمية بروتين BCA. تم تحليل محتويات GSH وMDA لاحقا باستخدام مجموعات كشف تجارية وفقا لبروتوكولات الشركات المصنعة.

اختبار ROS
تم تقييم توليد ROS داخل الخلايا باستخدام مسبار الفلورسنت DCFH-DA وفقا للبروتوكولات المعتمدة25. باختصار، تم زرع خلايا الورم الدبقي U251 وU87 في صفائح ب 24 بئر وعولجت بتركيزات متفاوتة من CaA (5، 20، و50 ميكرومو). لتقييم تأثير فرط تعبير Nrf2 على الفيروبتوزيس، تم نقل خلايا U87 وU251 إلى بلازميد تعبير Nrf2 أو ناقل فارغ. بعد 18 ساعة، تم استبدال الوسط وعالجت الخلايا ب 50 ميكرومولار CaA لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، عولجت الخلايا ب 5 ميكرومتر DCFH-DA عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، تلاها غسولات PBS لإزالة الصبغة الزائدة. تم تصور إشارات الفلورة باستخدام مجهر فلوري مقلوب، مزود بمرشح FITC (الإثارة 488 نانومتر، الانبعاث 525 نانومتر)، وتم التقاط صور للتحليل. زيادة شدة الفلورة الخضراء تتوافق مع ارتفاع مستويات ROS داخل الخلية.

تجارب حيوانية
تم إجراء جميع التجارب على وفقا لتوصيات دليل العناية واستخدام المخبرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في مستشفى ويفانغ بيبولز بموجب رقم الموافقة [2025SDL579]. لتوليد نموذج الزينوغرافت للورم الدبقي، تم إعادة تعليق 2 × 106 خلايا U87 في 0.2 مل من PBS وتلقيح تحت الجلد في الجانب الأيسر لذكور الفئران العارية BALB/c التي تبلغ من العمر 4 أسابيع. بعد السماح بنمو الأورام لمدة 7 أيام، تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى ثلاث مجموعات (n = 8 لكل مجموعة): مجموعة تحكم غير معالجة، معالجة ب CaA (2.5 ملغ/كغ)، وCaA (2.5 ملغ/كغ) مع Lip1 (10 ملغ/كغ). تم إعطاء العلاجات عن طريق الحقن اليومي داخل الصفاق لمدة 14 يوما متتاليا. تم قياس أبعاد الورم كل 3 أيام باستخدام الكاليبر، وتم حساب الأحجام باستخدام الصيغة: الحجم = (الطول × العرض²) / 2. في اليوم الحادي والعشرين، تم قتل جميع الفئران، وتم استئصال الأورام وتصويرها لمزيد من التحليل.

تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل مسارات KEGG
تم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد التغيرات في النسخ بعد التعرض ل CaA. تم تأكيد سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف UV-VIS ميكروحجمي ونظام الرحلان الكهربائي القائم على الشعيرات الدموية قبل التسلسل على منصة Illumina. تم تعيين القراءات النظيفة إلى الجينوم المرجعي البشري (GRCh38) باستخدام HISAT2، وتم قياس تعبير الجين ك FPKM. تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي باستخدام DESeq2 (FDR < 0.05، |log₂FC| ≥ 1)، وتم تقييم الإثراء الوظيفي بواسطة تحليل مسار KEGG (معدل P < 0.05).

تحليل الالتحام الجزيئي
تم استخدام الالتحام الجزيئي للتنبؤ بالتفاعل بين CaA ومسار PI3K/Akt. تم الحصول على البنية البلورية للوحدة الحفازة البشرية PI3K p110α (PIK3CA) من بنك بيانات البروتين (معرف PDB: 8BFU). تم استرجاع بنية CaA من PubChem وتم تقليل الطاقة باستخدام برامج النمذجة الجزيئية. باستخدام برنامج تحضير الالتحام الجزيئي، تمت إزالة جميع جزيئات الماء والروابط غير الأساسية من بنية PIK3CA، وأضيفت ذرات الهيدروجين. تم تحديد شبكة الالتحام حول الموقع النشط ل PIK3CA (استنادا إلى إحداثيات موقع الربط المعروفة)، وتم استخدام خوارزمية الالتحام لإجراء عملية الالتحام. تم اختيار أوضاع الارتباط الأعلى تقييما في CaA وفقا لألفة الارتباط (kcal/mol) وفحصها للتفاعلات الرئيسية. تم تصور تفاعلات البروتين والرابط، مثل الروابط الهيدروجينية والتلامسات الكارهة للماء، باستخدام برنامج التصور الجزيئي وأداة رسم خرائط التفاعل ثنائي الأبعاد.

السلامة والتخلص من النفايات
أجريت جميع التجارب التي شملت كواشف كيميائية مثل DMSO، والأصباغ الفلورية (DCFH-DA، فيرو أورانج)، والمثبتات داخل غطاء بخاري مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة. تم التعامل مع مجسات DMSO والفلورية بحذر بسبب قدرتها على اختراق الجلد وإمكانية سمية الخلايا المحتملة. تم التخلص من المواد الملوثة، بما في ذلك رؤوس الماصات، وألواح الزراعة، والقفازات، في حاويات نفايات خطرة مخصصة. تم التعامل مع أنسجة والجثث كنفايات بيولوجية خطرة وتم حرقها أو تعقيم وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية والإرشادات البيئية المحلية.

التحليل الإحصائي
تعرض جميع النتائج كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). تم تقييم الفروق بين مجموعتين باستخدام اختبار t للطالب ذو الذيلين. في التحليلات التي تشمل عدة مجموعات، تم تطبيق تحليل أول جديد أحادي الاتجاه تليها مقارنات مناسبة بعد الحدث (مثل اختبار توكي). اعتبرت قيمة p أقل من 0.05 دلالة على الدلالة الإحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تثبيط التكاثر وزيادة الحساسية الكيميائية لخلايا U251 وU87 في المختبر بواسطة CaA
يوضح الشكل 1A بنية CaA. قمنا أولا بتقييم التأثيرات السامة للسيتوسام للكاثوليد باستخدام اختبار MTT على خلايا الفرسان العصبية HT22 الطبيعية وخلايا الورم الدبقي البشرية U251 وU87. مقارنة بالخلايا غير المعالجة (0 ميكرومولار CaA)، كان للCaA تأثير طفيف على بقاء خلايا HT22 عند تركيزات أقل من 100 ميكرومولار خلال 72 ساعة (الشكل 1B

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يظهر CaA تأثيرا مضادا قويا للأورام في الورم الأرومي الدبقي من خلال تعديل محورين حيويين للبقاء بشكل فريد: مسار PI3K/Akt/mTOR وآلية الدفاع عن Nrf2-ferroptosis. غالبا ما يتم تنشيط مسار PI3K/Akt بشكل مفرط في الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM، الذي يتغير في ما يصل إلى ~88-90٪ من الحالات) بسبب فقدان PTEN أو تنشيط RTK، مما يدفع التكاثر ومقاومة العلاج26. ومع ذلك، فإن استهداف هذا المسار وحده أدى إلى موت المبرمج المحدود في GBM، حيث غالبا ما تهرب الأورام من تثبيط PI3K ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agilent 2100 Bioanalyzerنظام الكهربائي القائم على الشعيرات الدموية
Annexin V-FITC Apoptosis KitRoche Diagnostics11858777001N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)برنامج تحضير الالتحام الجزيئي (خوارزمية التحام)
Calceolarioside A (CaA)Sigma-AldrichSMB00246N/A
Chem3Dبرنامج النمذجة الجزيئية
cDNA Synthesis KitVazyme BiotechR223N/A
DCFH-DASigma-AldrichD6883N/A
DMEMThermo Fisher Scientific11965092N/A
DMSOMerckD8418N/A
FerroOrange probeDojindoF374N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF2442N/A
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAriaIII Flow Cytometryجهاز لتحليل الخلايا الملطخة بـ Annexin V
Fluorescence microscopeOlympusIX73جهاز لمراقبة فلوريسنس FerroOrange وDCFH-DA
FTH1 antibodyAbcamab75973AB_1310150
GAPDH antibodyAbcamab8245AB_2107448
GLS antibodyAbcamab93434AB_10563527
GPX4 antibodyAbcamab125066AB_10972289
HT22 murine neuronal cell lineAddexBioC0011008CVCL_0321
jetPRIME transfection reagentPolyplus-transfection114-07عامل نقل بوليمر
Keap1 antibodyAbcamab139729AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081N/A
LigPlot+أداة رسم تفاعل ثنائي الأبعاد
Lipofectamine 3000Thermo Fisher Scientificعامل نقل دهني
Liproxstatin-1SelleckS7699N/A
MG132SelleckS2619N/A
Microplate readerThermo Fisher ScientificH1Mجهاز لقياس الامتصاص في اختبار MTT (عند 490 نانومتر)
MTTSigma-AldrichM5655N/A
NanoDropمقاييس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية بحجم دقيق
Nrf2 antibodyAbcamab62352AB_945626
Nude BALB/c miceVital River, ChinaN/AIMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOLبرنامج تصور جزيئي
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master MixVazyme BiotechQ711N/A
TRIzol ReagentThermo Fisher15596026N/A
U251 human glioma cell lineCLS Cell Lines Service300385CVCL_0021
U87 human glioma cell lineATCCHTB-14CVCL_0022
Ubiquitin antibodyAbcamab7780AB_306981
xCT/SLC7A11 antibodyAbcamab175186AB_2715513

المراجع

  1. Bajwa, M. H., Anis, S. B., Yousaf, I., Shah, M. A. A 10-year survival-trend analysis of low-grade glioma and treatment patterns from an LMIC. Asian J Neurosurg. 18 (3), 533-538 (2023).
  2. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15 (1), 2769-2781 (2021).
  3. Karkon-Shayan, S., et al. Resveratrol as an antitumor agent for glioblastoma multiforme: targeting resistance and promoting apoptotic cell deaths. Acta Histochem. 125 (6), 152058(2023).
  4. Kuduvalli, S. S., et al. A combination of metformin and epigallocatechin gallate potentiates glioma chemotherapy in vivo. Front Pharmacol. 14 (1), 1096614(2023).
  5. Abdul Raheem, A. K., Dhannoon, B. N. Automating drug discovery using machine learning. Curr Drug Discov Technol. 20 (6), 79-86 (2023).
  6. Yang, J., et al. Automating biomedical literature review for rapid drug discovery: leveraging GPT-4 to expedite pandemic response. Int J Med Inform. 189 (1), 105500(2024).
  7. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  8. Desai, D., et al. Review of AlphaFold 3: transformative advances in drug design and therapeutics. Cureus. 16 (7), e63646(2024).
  9. Reinis, J., Reicher, A. Monitoring subcellular protein localization at scale in live cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (9), 673(2024).
  10. Kwon, Y. W., et al. Application of proteomics in cancer: recent trends and approaches for biomarkers discovery. Front Med (Lausanne). 8 (1), 747333(2021).
  11. Wang, X., Liu, Z., Ma, L., Yu, H. Ferroptosis and its emerging role in tumor. Biophys Rep. 7 (4), 280-294 (2021).
  12. Glaviano, A., et al. PI3K/AKT/mTOR signaling transduction pathway and targeted therapies in cancer. Mol Cancer. 22 (1), 138(2023).
  13. Hoxhaj, G., Manning, B. D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 20 (2), 74-88 (2020).
  14. Liu, Y., et al. Protein kinase B (PKB/AKT) protects IDH-mutated glioma from ferroptosis via Nrf2. Clin Cancer Res. 29 (7), 1305-1316 (2023).
  15. Su, H., Peng, C., Liu, Y. Regulation of ferroptosis by PI3K/Akt signaling pathway: a promising therapeutic axis in cancer. Front Cell Dev Biol. 12 (1), 1372330(2024).
  16. Song, L., Li, D., Gu, Y., Li, X., Peng, L. Let-7a modulates particulate matter (≤2.5 µm)-induced oxidative stress and injury in human airway epithelial cells by targeting arginase 2. J Appl Toxicol. 36 (10), 1302-1310 (2016).
  17. Liu, H., et al. Activation of PI3K/Akt pathway by G protein-coupled receptor 37 promotes resistance to cisplatin-induced apoptosis in non-small cell lung cancer. Cancer Med. 12 (19), 19777-19793 (2023).
  18. Song, L., et al. miR-144-5p enhances the radiosensitivity of non-small-cell lung cancer cells via targeting ATF2. Biomed Res Int. 2018 (1), 5109497(2018).
  19. Song, L., et al. The Legionella effector SdjA is a bifunctional enzyme that distinctly regulates phosphoribosyl ubiquitination. mBio. 12 (5), e0231621(2021).
  20. Luo, J., et al. Acinetobacter baumannii kills fungi via a type VI DNase effector. mBio. 14 (1), e0342022(2023).
  21. Liu, K., et al. Trim27 aggravates airway inflammation and oxidative stress in asthmatic mice via potentiating the NLRP3 inflammasome. Int Immunopharmacol. 134 (1), 112199(2024).
  22. Song, L., et al. Legionella pneumophila regulates host cell motility by targeting Phldb2 with a 14-3-3ζ-dependent protease effector. Elife. 11 (1), e73220(2022).
  23. Gao, Z., Jiang, J., Hou, L., Ji, F. Lysionotin induces ferroptosis to suppress development of colorectal cancer via promoting Nrf2 degradation. Oxid Med Cell Longev. 2022 (1), 1366957(2022).
  24. Bai, X., et al. Maackiain protects against sepsis via activating AMPK/Nrf2/HO-1 pathway. Int Immunopharmacol. 108 (1), 108710(2022).
  25. Zhu, Y., et al. The protective role of zingerone in a murine asthma model via activation of the AMPK/Nrf2/HO-1 pathway. Food Funct. 12 (7), 3120-3131 (2021).
  26. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  27. Dodson, M., Castro-Portuguez, R., Zhang, D. D. NRF2 plays a critical role in mitigating lipid peroxidation and ferroptosis. Redox Biol. 23 (1), 101107(2019).
  28. Cahuzac, K. M., et al. AKT activation because of PTEN loss upregulates xCT via GSK3β/NRF2, leading to inhibition of ferroptosis in PTEN-mutant tumor cells. Cell Rep. 42 (5), 112536(2023).
  29. Cai, J., et al. Fatostatin induces ferroptosis through inhibition of the AKT/mTORC1/GPX4 signaling pathway in glioblastoma. Cell Death Dis. 14 (3), 211(2023).
  30. Li, F. J., et al. System X(c)-/GSH/GPX4 axis: an important antioxidant system for the ferroptosis in drug-resistant solid tumor therapy. Front Pharmacol. 13 (1), 910292(2022).
  31. Guo, F., et al. Juglone induces ferroptosis in glioblastoma cells by inhibiting the Nrf2-GPX4 axis through the phosphorylation of p38MAPK. Chin Med. 19 (1), 52(2024).
  32. Tuncer, C., Hacioglu, C. Borax induces ferroptosis of glioblastoma by targeting HSPA5/NRF2/GPx4/GSH pathways. J Cell Mol Med. 28 (7), e18206(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Ferroptosis Induction in Glioma by Calceolarioside A via Modulation of the PI3K/Akt/Nrf2 Pathway
Posted by JoVE Editors on 8/06/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69643

الوسوم

PI3K Akt Nrf2 4
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.