يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تحفيز الفيروبتوزيس في الورم الدبقي بواسطة كالسيولاريوسيد A عبر تعديل مسار PI3K/Akt/Nrf2

469 مشاهدات

DOI:

10.3791/69643

ديسمبر 30, 2025

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

تستكشف هذه الدراسة الإمكانات العلاجية للكالسيولاريوسيد A في الورم الدبقي (glioma)، وتظهر قدرته على تثبيط إشارات PI3K/Akt وتعزيز تحلل Nrf2، مما يحفز الفيروبتوزيد ويمنع تقدم الورم في المختبر والحي.

الملخص

يوضح هذا البروتوكول سير العمل التجريبي المستخدم لدراسة تأثيرات كالسيولاريوسيد A (CaA) على تحفيز وتعديل مسار فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K)/بروتين كيناز B (Akt)/عامل نووي مرتبط بإريثرويد 2 (Nrf2) في نماذج الورم الدبقي (Neuro Tumor). تشمل الإجراءات سلسلة من الفحوصات الخلوية في خطوط الورم الدبقي البشري U251 وU87 لتقييم بقاء الخلايا، وتكاثرها، وحساسية الكيميائي بعد علاج CaA. يتم تقييم التغيرات المرتبطة بالفيروبتوزيس من خلال قياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، الجلوتاثيون (GSH)، المالونديالديهايد (MDA)، ومستويات الحديد المتقلب، إلى جانب التعبير عن بروتينات مرتبطة بالفيروبتوسيس مثل الجلوتاثيون بيروكسيداز 4 (GPX4)، وحدة مضاد النقل السيستين/الجلوتامات (xCT)، والفيريتين عبر البلوت الغربي. لتقييم مشاركة المسار، يوضح البروتوكول اختبارات qRT-PCR، ويسترن بلوت، واختبارات التقرب المناعي للتعبير عن Nrf2 واليوبيكوتين. تتضمن تجارب فرط التعبير ل Nrf2 لتأكيد دوره في تنظيم الفيروبتوز. يوضح البروتوكول أيضا استخدام نموذج زراعة الجنس للفأر، حيث تزرع خلايا U87 تحت الجلد، تليها إعطاء CaA داخل الصفاق لتقييم نمو الورم في الجسم الحي وسميته. يتم إجراء تحليل نسيجي للأعضاء الرئيسية لتقييم السلامة الجهازية. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم الالتحام الجزيئي للتنبؤ بالارتباط المباشر بين CaA ووحدة PI3K p110α (PIK3CA). معا، توفر هذه الإجراءات إطارا قابلا للتكرار لفحص آليات الفيروبتوزيس والفعالية العلاجية للمركبات الطبيعية في أبحاث الورم الدبقي النفسي.

المقدمة

الأورام الدبقية، وخاصة الأورام الأرومية الدبقية عالية الدرجة، تمثل واحدة من أكثر أشكال أورام الدماغ فتكا، وتتميز بالتكاثر السريع، ومقاومة العلاج، وسوء التوقعات1. في السنوات الأخيرة، تم استكشاف عدة عوامل مضادة للورم الدبقي الكهربائي، بما في ذلك العلاجات الكيميائية التقليدية مثل تيموزولوميد ومجموعة من المركبات الطبيعية مثل الكركمين2، الريسفيراترول3، والإبيغالوكاتشين جالات4. تؤثر هذه العوامل على تأثيرها من خلال آليات متعددة، منها تحفيز الاستماتة المبرمجة، وتثبيط تكوين الأوعية، وتعديل مسارات الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، تواجه العديد من هذه المركب....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

زراعة الخلايا والعلاج
تم زراعة خلايا المورس العصبية HT22 وسلاسل الخلايا الدبقية البشرية U87 وU251 في وسط النسر المعدل في دولبيكو مع مكمل بنسبة 10٪ مصل أبقار جنيني و4 ملليمولار L-جلوتامين، في ظروف رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. لتبسيط الاتساق التجريبي، تم توحيد جميع علاجات الخلايا ووصفها هنا. يوضح هذا القسم الحالات المحددة المستخدمة في كل مجموعة معالجة والاختبارات اللاحقة المقابلة.

علاج CaA:
تمت معالجة خلايا HT22 بتركيزات متزايدة من CaA (0، 0.1، 0.5، 1، 10، 50، 100، 250، و500 ميكرومول) لمدة 72 ساعة. تمت معالجة خلايا الورم الدبقي U87 وU251 بتركيزات 5 أو 20 أو 50 ميكرومولار....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تثبيط التكاثر وزيادة الحساسية الكيميائية لخلايا U251 وU87 في المختبر بواسطة CaA
يوضح الشكل 1A بنية CaA. قمنا أولا بتقييم التأثيرات السامة للسيتوسام للكاثوليد باستخدام اختبار MTT على خلايا الفرسان العصبية HT22 الطبيعية وخلايا الورم الدبقي البشرية U251 وU87. مقارنة بالخلايا غير المعالجة (0 ميكرومولار CaA)، كان للCaA تأثير طفيف على بقاء خلايا HT22 عند تركيزات أقل من 100 ميكرومولار خلال 72 ساعة (الشكل 1B

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يظهر CaA تأثيرا مضادا قويا للأورام في الورم الأرومي الدبقي من خلال تعديل محورين حيويين للبقاء بشكل فريد: مسار PI3K/Akt/mTOR وآلية الدفاع عن Nrf2-ferroptosis. غالبا ما يتم تنشيط مسار PI3K/Akt بشكل مفرط في الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM، الذي يتغير في ما يصل إلى ~88-90٪ من الحالات) بسبب فقدان PTEN أو تنشيط RTK، مما يدفع التكاثر ومقاومة العلاج26. ومع ذلك، فإن استهداف هذا المسار وحده أدى إلى موت المبرمج المحدود في GBM، حيث غالبا ما تهرب الأورام من تثبيط PI3K .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agilent 2100 Bioanalyzerنظام الكهربائي القائم على الشعيرات الدموية
Annexin V-FITC Apoptosis KitRoche Diagnostics11858777001N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)برنامج تحضير الالتحام الجزيئي (خوارزمية التحام)
Calceolarioside A (CaA)Sigma-AldrichSMB00246N/A
Chem3Dبرنامج النمذجة الجزيئية
cDNA Synthesis KitVazyme BiotechR223N/A
DCFH-DASigma-AldrichD6883N/A
DMEMThermo Fisher Scientific11965092N/A
DMSOMerckD8418N/A
FerroOrange probeDojindoF374N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF2442N/A
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAriaIII Flow Cytometryجهاز لتحليل الخلايا الملطخة بـ Annexin V
Fluorescence microscopeOlympusIX73جهاز لمراقبة فلوريسنس FerroOrange وDCFH-DA
FTH1 antibodyAbcamab75973AB_1310150
GAPDH antibodyAbcamab8245AB_2107448
GLS antibodyAbcamab93434AB_10563527
GPX4 antibodyAbcamab125066AB_10972289
HT22 murine neuronal cell lineAddexBioC0011008CVCL_0321
jetPRIME transfection reagentPolyplus-transfection114-07عامل نقل بوليمر
Keap1 antibodyAbcamab139729AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081N/A
LigPlot+أداة رسم تفاعل ثنائي الأبعاد
Lipofectamine 3000Thermo Fisher Scientificعامل نقل دهني
Liproxstatin-1SelleckS7699N/A
MG132SelleckS2619N/A
Microplate readerThermo Fisher ScientificH1Mجهاز لقياس الامتصاص في اختبار MTT (عند 490 نانومتر)
MTTSigma-AldrichM5655N/A
NanoDropمقاييس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية بحجم دقيق
Nrf2 antibodyAbcamab62352AB_945626
Nude BALB/c miceVital River, ChinaN/AIMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOLبرنامج تصور جزيئي
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master MixVazyme BiotechQ711N/A
TRIzol ReagentThermo Fisher15596026N/A
U251 human glioma cell lineCLS Cell Lines Service300385CVCL_0021
U87 human glioma cell lineATCCHTB-14CVCL_0022
Ubiquitin antibodyAbcamab7780AB_306981
xCT/SLC7A11 antibodyAbcamab175186AB_2715513

المراجع

  1. Bajwa, M. H., Anis, S. B., Yousaf, I., Shah, M. A. A 10-year survival-trend analysis of low-grade glioma and treatment patterns from an LMIC. Asian J Neurosurg. 18 (3), 533-538 (2023).
  2. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Ferroptosis Induction in Glioma by Calceolarioside A via Modulation of the PI3K/Akt/Nrf2 Pathway
Posted by JoVE Editors on 8/06/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69643

الوسوم

PI3K Akt Nrf2 4