مقالة منهجية

رسم خرائط على مستوى الجينوم لتعديلات الهيستون ومواقع ارتباط عوامل النسخ في خطوط خلايا سرطان الرئة الصغيرة للغدد الصماء العصبية باستخدام تقنية CUT&RUN

DOI:

10.3791/69656

⸱

أبريل 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, Cancer Center, Medical College of Wisconsin, 2Linda T. and John A. Mellows Center for Genomic Sciences and Precision Medicine Center Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Data Science Institute, Medical College of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف بروتوكول التقسيم تحت الأهداف والإطلاق باستخدام النيوكلياز يتبعه بروتوكول التسلسل من الجيل التالي (CUT&RUN-seq) لخطوط خلايا سرطان الرئة الصغيرة في الخلايا العصبية الصماء. يتيح ذلك رسم خرائط جينومية شاملة لمختلف تعديلات الهيستون وعوامل الارتباط (مثل E2F7) لدراسة التنظيم فوق الجيني والنسخ في علم الأمراض في SCLC.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب البروتينات التي تعيد تشكيل الكروماتين وعوامل النسخ (TFs) دورا حاسمة في بيولوجيا الأورام لسرطان الرئة صغير الخلايا (SCLC). يعد التوصيف على مستوى الجينوم لتعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) ومواقع ارتباط TF ضروريا لتحديد العناصر التنظيمية للحمض النووي ومسارات الجينات التي ستؤدي إلى فهم ميكانيكي أعمق ل SCLC وتحديد أهداف للتدخل العلاجي. الانقسام تحت الأهداف والإفراج باستخدام النيوكلياز يليه تسلسل الجيل التالي (CUT&RUN-seq) هو طريقة قوية لرسم خرائط تعديلات الهيستون المحددة وتحديد ملفات ارتباط الحمض النووي لمجموعة واسعة من البروتينات في الجينوم الخلوي. في CUT&RUN، يتم تجنيد النيوكلياز الدقيق (MNase) المرتبط بالبروتين A/G عبر الأجسام المضادة إلى المواقع الجينومية للبروتينات المرتبطة بالكروماتين، حيث يتم إطلاق شظايا الحمض النووي الأساسية من الكروماتين الكتلة عند تنشيط وانقسام MNase. ينتج هذا الهضم الموضعي شظايا DNA صغيرة خاصة بالموقع مناسبة للتتابع.

هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحليل تعديلات الهيستون H3K4me3 (المرتبطة بالمحفزات النشطة أو المفتوحة) وH3K4me1 (المرتبطة بالمعززات النشطة)، بالإضافة إلى عامل النسخ E2F7 في SCLC. تم تحسين هذا البروتوكول لنماذج خطوط الخلايا SCLC للغدد الصماء العصبية (NE)، والتي تتميز عادة بنوى كبيرة، وضعف السيتوبلازم، والنمو كمجموعات غير ملتصقة في حالة تعليق.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد التعديلات بعد الترجمة (PTMs) وعوامل النسخ (TFs) من المنظمين المركزيين لتعبير الجينات. تؤثر PTMs الهستونية، مثل الأسيتلة، والمثيلة، والفسفرة، واليوبيكوتين، بشكل رئيسي على ذروله الطرفية N، على بنية الكروماتين 1,2. في السرطان، غالبا ما تكون PTMs الهيستونية غير منظمة، مما يؤدي إلى تنشيط غير طبيعي للجينات المسرطمة أو إسكات جينات مثبط الأورام3. ترتبط TFs بتسلسلات DNA محددة عند محفزات أو معززات لتنشيط أو كبت الجينات المستهدفة، وغالبا ما تستعين بإنزيمات معدلة للهيستون تنسق إعادة تشكيل الكروماتين4. الإنزيمات التي تكتب أو تمسح أو تقرأ علامات الهستون، مثل أسيتيل ترانسفيراز الهيستون (HATs)، وديأسيتيازات الهيستون (HDACs)، والميثيل ترانسفيراز (HMTs)، غالبا ما تكون متحورة أو غير منظمة في السرطان، مما يجعلها أهدافا علاجية جذابة5.

في SCLC، تعد التغيرات فوق الجينية وعوامل النسخ المحددة للنسب (LDTFs) من المحركات الرئيسية لبيولوجيا الورم6. على عكس الطفرات الجينية، تنظم التغيرات اللاجينية، بما في ذلك مثيلة الحمض النووي وتعديلات الهستون، التعبير الجيني دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي. يمكن لهذه التعديلات إسكات جينات مثبطات الأورام أو تنشيط الجينات المسرطة، مما يغذي سلوك SCLC العدواني. على سبيل المثال، غالبا ما يتعرض إزيم الهيستون ميثيل ترانسفيراز KMT2D إلى طفرات بمعدل تغير يبلغ 12.9٪ في مجموعة مرضى SCLC الكبيرةفي العالم الحقيقي السابعة ، وهو مسؤول عن أحادي الميثلة لهيستون H3 ليسين 4 (H3K4me1)، وهي علامة مرتبطة بمناطق التعزيز النشطة في الجينوم. SCLC هو مرض غير متجانس جزيئيا. تصنف SCLC إلى أنواع جزيئية فرعية بناء على التعبير التفاضلي لأربعة LDTFs: نظير الأشييت-سكوت 1 (ASCL1)، عامل التمايز العصبي 1 (NEUROD1)، بروتين المرتبط بنعم 1 (YAP1) وصندوق هوميوبوكس 3 من الفئة 2 POU (POU2F3). تمثل الأنواع الفرعية للغدد الصماء العصبية (NE)، بما في ذلك ASCL1 و NEUROD1، حوالي 70-80٪ من حالات SCLC8. لذلك، قد يوضح التحقيق في توزيع وملفات PTMs الهيستونية المختلفة ومواقع ارتباط TF في الأنواع الفرعية المختلفة ل SCLC برامج جينية محددة بنفس النوع معرضة للتدخل العلاجي.

الطريقة التقليدية لتحديد PTMs الهيستونية ومواقع ارتباط البروتينات التنظيمية الخاصة بالتسلسل على مستوى الجينوم بأكمله هي تسلسل الكروماتين المناعي (ChIP-seq)9. ومع ذلك، يتطلب ChIP-seq عددا كبيرا من الخلايا المدخلة وغالبا ما يعطي خلفية عالية عبر الجينوم. نتيجة لذلك، يتطلب ChIP-seq مستوى عاليا من إثراء البروتين المستهدف لتمييز الإشارة الحقيقية عن الضوضاء، ويحتاج إلى تسلسل عميق لتحليل البيانات بشكل فعال. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للربط المتقاطع للفورمالديهايد المستخدم في ChIP-seq أن يخفي الحواتم ويولد مواقع ارتباط إيجابية كاذبة10. الانقسام تحت الأهداف والإفراج باستخدام النيوكلياز يليه تسلسل الجيل التالي (CUT&RUN-seq) هو بديل عالي الدقة لرسم خرائط PTMs الهيستونية ومواقع ارتباط TF في الموقع داخل الخلايا السليمة. في هذه الطريقة، تحتضن الخلايا المنفاذة بجسم مضاد يستهدف البروتين المرتبط بالكروماتين المعني، يليه ارتباط بروتين اندماج بروتين A(G) ونوكلياز ميكروكوكي (MNase). يتم بعد ذلك تحفيز هضم الحمض النووي المستهدف على جانبي البروتين المعني في ظروف عالية الكالسيوم/منخفضة الملح، مما يطلق شظايا DNA محددة للتنقية. تستخدم شظايا الحمض النووي المنقاة لبناء مكتبات تسلسل باركود، يمكن جمعها لتسلسل عالي الإنتاجية 11,12,13,14. مقارنة ب ChIP-seq، يتطلب CUT&RUN عددا أقل بكثير من الخلايا كمدخل، وينتج ضوضاء خلفية أقل، ويتجنب تشوهات الربط المتقاطع، ويتطلب قراءات تسلسل أقل - مما يجعله مناسبا بشكل خاص لدراسة حالات الكروماتين الديناميكية في السرطان بطريقة فعالة من حيث التكلفة.

تم تطوير تقنية CUT &RUN للتحقيق في المواقع الجينومية للبروتينات المتفاعلة مع الكروماتين، بما في ذلك تعديلات الهستون، ومواقع ارتباط الألياف الوراثية، والمركبات المرتبطة بالكروماتين، مما يكشف عن المناظر التنظيمية فوق الجينية11,12. مكنت هذه التقنية من تحليلات مفصلة لبنية المعزز-المحفز، وتنظيم الشبكات النسخية، وديناميكيات حالة الكروماتين أثناء التطور وتقدم المرض15. في أبحاث السرطان، يسمح CUT&RUN برسم خرائط دقيقة لعلامات الهيستون16,17 وعامل النسخ المسرحي، مما يساعد في تحديد البرامج التنظيمية الخاصة بالسلالة والأهداف العلاجية المحتملة15,16. علاوة على ذلك، يمكن إجراء CUT&RUN في الموقع في الخلايا، بما في ذلك CD8+ خلية T17، وكذلك على عينات الأنسجة18,19.

لاكتشاف الموقع الجينومي لنماذج PTM ومواقع ارتباط عامل النسخ E2F7 في الأنواع الفرعية ل SCLC، طبقنا CUT&RUN-seq على أربعة نماذج خطوط خلايا NE من SCLC: H146 وDMS79 (النوع الفرعي ASCL1)، بالإضافة إلى H446 و H82 (النوع الفرعي NEUROD1)، مع أو بدون طفرات KMT2D. قمنا بتحليل علامة الهيستون H3K4me1، وهي تعديل مرتبط بالمعزز تم تحفيزها أساسا بواسطة KMT2D، وE2F7، الذي ثبت أنه عامل مساعد ل ASCL120. كانت علامة الهستون H3K4me3، المرتبطة بالمحفزات النشطة، بمثابة تحكم إيجابي، بينما عمل IgG كتحكم سلبي.

هنا، نقدم بروتوكول CUT&RUN-seq مفصل لخطوط خلايا SCLC NE، استنادا إلى ما يلي: مجموعة CUT&RUN متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد)، والعمل الأصلي لسكين وهينيكوف 11,12,13، وتحسيناتنا المختبرية الخاصة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يوفر هذا البروتوكول (الشكل 1) تعليمات خطوة بخطوة لتنفيذ CUT&RUN-seq في خطوط خلايا SCLC NE، والتي تنمو عادة كمجموعات غير ملتصقة أو مجموعات عائمة.

1. زراعة الخلايا

  1. الحفاظ على خطوط الخلايا DMS79 (النوع الفرعي ASCL1)، H146 (النوع الفرعي ASCL1)، H82 (النوع الفرعي NEUROD1)، وH446 (النوع الفرعي NEUROD1) في 13 مل من وسط RPMI-1640 مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) و1٪ بنسلين/ستربتوميسين (انظر جدول المواد) في قوارير بحجم 75 مل. زراعة الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: تم شراء جميع الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة من ATCC وتم التحقق منها باستخدام تكرار قصير متتالي.

2. نفاذية الخلايا

ملاحظة: النفاذية الصحيحة للخلايا ضرورية لتمكين الأجسام المضادة، وpAG-MNase، وشظايا البروتين-DNA المهضومة من الانتشار بحرية داخل وخارج الخلايا. قبل بدء بروتوكول CUT&RUN على خط خلوي جديد، يجب إجراء تحسينات لتحديد التركيز المثالي للديجيتونين للنفاذية الفعالة. يجب استخدام أقل تركيز لتحقيق نفاذية تزيد عن 95٪ (حيث أن 95٪ من الخلايا "ميتة") لبروتوكول CUT&RUN.

  1. ضع مخزون 5٪ من الأديجتونين، ومثبط البروتياز، والسبيرميدين على الثلج ودعها تذوب تماما.
  2. جهز مخزن الغسيل حسب الجدول 1 واحتفظ به على الثلج.
  3. جهز محلول عمل ديجيتونين بنسبة 0.05٪ عن طريق خلط 10 ميكرولتر من مخزون 5٪ مع 990 ميكرولتر من مخزن الغسيل. اخلط جيدا عن طريق الدوامة وابق على الثلج.
  4. توليد سلسلة تخفيف من الديجيتونين (0.05٪، 0.01٪، 0.001٪، و0.0001٪)"عن طريق تخفيف المحلول السابق بشكل تسلسلي إلى حجم نهائي 1 مل من كل أنبوب. قم بدوامة كل تخفيف قبل الانتقال إلى التالية. وفي الوقت نفسه، جهز تحكم كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO) بنسبة 0.05٪ في مخزن الغسيل (إجمالي 100 ميكرولتر؛ انظر الجدول 2).
    ملاحظة: ديجيتونين وDMSO هما مواد كيميائية خطيرة. تعامل بحذر وتخلص من جميع النفايات في حاوية نفايات خطرة تحمل علامات صحيحة وأغطية آمنة.
  5. احتفظ بجميع محاليل تخفيف الديجيتونين وتحكم DMSO في حالة تجميد حتى يتم استخدامها.
  6. تحديد عدد الخلايا المطلوبة عن طريق ضرب عدد حالات النفاذية في عدد الخلايا المطلوبة لكل اختبار. أضف 20٪ إضافية لتعويض تباين الماصات (مثلا، في خمس حالات عند 5×105 خلايا لكل منها، جهز حوالي 1.2 × 5 × 5 × 105 خلايا).
  7. اجمع العدد المطلوب من الخلايا المزروعة عن طريق الطرد المركزي عند 600 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). أعد تعليق الحبيبة في 600 ميكرولتر من 1× PBS (100 ميكرولتر لكل حالة بالإضافة إلى 20٪ إضافية).
  8. أليكوت 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة ب PBS في خمسة أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل - أنبوب لكل تركيز ديجيتونين وأنبوب واحد لتحكم DMSO.
  9. قم بعمل الطرد المركزي للأنابيب عند 600 × جرام لمدة 3 دقائق عند RT.
  10. إزالة المادة الفائقة بعناية وإعادة تعليق كل حبيبة في 50 ميكرولتر من الديجيتونين أو مخزن التحكم DMSO المقابل.
  11. حضن العينات في RT لمدة 10 دقائق.
  12. اخلط 10 ميكرولتر من الخلايا المعالجة مع 10 ميكرولتر من تريبان بلو وحمل 10 ميكرولتر من الخليط على شريحة عد الخلايا.
  13. استخدم عداد الخلايا لقياس الخلايا الحية (غير المصبوغة) والخلايا الموجبة غير القابلة للعيش (المصبوغة باللون الأزرق).
  14. حدد أدنى تركيز من ديجتونين ينتج أعلى نسبة من خلايا التريبان الزرقاء الموجبة (Tripan). استخدم هذا التركيز في تجربة CUT&RUN في المرحلة اللاحقة. تأكد من أن جهاز التحكم في DMSO يحافظ على قابلية البقاء النموذجية لزراعة الخلايا الصحية الطبيعية.

3. تسلسل القطع والهروب

ملاحظة: يتم تعديل المواد الكيميائية في هذا البروتوكول لخمس تفاعلات، مع إضافة إضافية لتعويض فقدان التوصيل. للحصول على قائمة المواد والمعدات، انظر جدول المواد. يوصى باستخدام نسختين بيولوجيتين مستقلتين على الأقل لكل تجربة CUT & RUN.

  1. اليوم الأول
    1. تحضير مخزن القطع والتشغيل
      1. جهز محلول الغسيل بدمج محلول ما قبل الغسيل، مثبط بروتياز 25x، و1 متر من سبيرميدين كما هو موضح في الجدول 3.
      2. جهز مخزن نفاذية الخلايا بإضافة 5٪ ديجيتونين إلى مخزن الغسيل وفقا للجدول 3.
      3. جهز مخزن الأجسام المضادة بإضافة 0.4 ميكرولتر من EDTA إلى 100 ميكرولتر من مخزن نفاذية الخلايا بتركيز مناسب من الأجسام المضادة، كما هو موضح في الجدول 3. ضع المخزن المعد على الثلج.
      4. تخزين مخزن نفاذية الخلايا المتبقي عند 4 درجات مئوية للاستخدام في اليوم الثاني.
    2. تنشيط خرز كونكانافالين A (ConA)
      1. أعد تعليق تعليق خرز ConA بلطف لضمان توزيعه بشكل متساو.
      2. انقل 55 ميكرولتر من تعليق الخرزات (11 ميكرولتر لكل عينة) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
      3. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي بسعة 1.5 مل حتى تنفصل الخرزات تماما، ثم استخدم الماصة لإزالة السوبرناتانت.
      4. اغسل الخرزات فورا مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من محلول تفعيل الخرز البارد (100 ميكرولتر لكل عينة). أعد تعليق الخرزات عن طريق الطباعة بلطف في كل غسلة، واستخدم الرف المغناطيسي لتخلص المادة الفائقة بين الغسلات.
      5. بعد الغسل النهائي، أزل المادة الفائقة وأعد تعليق الخرزات المنشطة بلطف في 55 ميكرولتر (11 ميكرولتر لكل عينة) من مخزن تفعيل الخرز البارد جدا.
      6. عليكوت 10 ميكرولتر من الخرزات تعلق في كل أنبوب من مجموعة أنابيب مكونة من 8 شرائط وتحافظ على الأنابيب على الثلج.
    3. اجمع الخلايا وربط الخلايا بالخرز المنشط
      ملاحظة: قابلية البقاء للخلية مهمة لنسبة الإشارة إلى الخلفية. ومع ذلك، يمكن أن تكون جدوى خطوط خلايا SCLC NE متغيرة (70٪-90٪) بسبب معدل دوران الخلايا المرتفع بطبيعتها وتفضيلها للنمو كمجموعات متوسطة إلى كبيرة في حالة تعليق.
      1. قم بإزالة الخلايا من الحاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وفحصها تحت المجهر لضمان الجودة.
      2. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 1000-1200 × جرام لمدة 5 دقائق عند المراقبة.
      3. استنشق الوسط من الأنبوب المخروطي وشطف حبيبات الخلية ب 20 مل من 1× PBS.
      4. استخدم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى، واستنشق PBS، وهضم الرصاصة باستخدام أكوتاز لمدة 3-5 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، حسب حجم الحبيبة.
      5. أنهي الهضم بإضافة 5 مل من PBS + 10٪ FBS. احصل على تعليق الخلية الواحدة عن طريق التوصيل بلطف للأعلى والأسفل باستخدام ماصة مصلية.
      6. قم بطرد المركزي بالخلايا عند 1000-1200 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من الفائق، وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في 5 مل من PBS.
      7. عد الخلايا البدائية، وتأكد من صلاحية الخلية وسلامتها.
      8. احسب إجمالي عدد الخلايا المطلوبة عن طريق ضرب عدد التفاعلات في عدد الخلايا في كل تفاعل (5×10،5). أضف 20٪ فائض لأخذ أخطاء التوصيل في الماكرة (مثلا، 1.2 × 6 × 5 × 105 ل6 تفاعلات). انقل معلقات الخلايا المحسوبة إلى أنابيب بحجم 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 600 × جاذبية، و3 دقائق عند RT.
        ملاحظة: جهز على الأقل رد فعل إضافي واحد كخطة احتياطية.
      9. أعد تعليق الخلايا في مخزن الغسيل RT بكثافة 5×105 خلايا لكل تفاعل (ست تفاعلات إجمالا)، باستخدام 100 ميكرولتر لكل تفاعل، مع التوصيل بلطف ولكن بشكل شامل لضمان تعليق متجانس. الطرد المركزي بقوة 600 × g لمدة 3 دقائق عند RT. استخدم بيبيتا لإزالة الفائق.
      10. كرر خطوة الغسل (الخطوة 9) مرة أخرى.
      11. أليكوت 100 ميكرولتر من الخلايا المغسولة لكل أنبوب في مجموعة 8 شرائط تحتوي على 10 ميكرولتر من خرز CoA المنشط. استخدم الماصة بلطف لخلطها وقم بتدوير سريع في جهاز طرد مركزي صغير لجمع العجينة (يجب ألا تستقر الخرزات بسرعة).
      12. حضن خلط الخلية الحبيبية لمدة 10 دقائق عند RT للسماح للخلايا بالارتباط بالخرز.
      13. ضع الأنابيب على رف مغناطيس أنابيب بسعة 0.2 مل، ودع العجينة تتصفى، ثم تستخدم الماصة لإزالة السوبرناتانت. احتفظ ب 10 ميكرولتر من المادة الفائقة للتأكد من أن الخلايا مرتبطة بالخرز. تخلص من الفائق المتبقي وانتقل بسرعة إلى الخطوة التالية.
      14. أزل الأنابيب من المغناطيس. أضف فورا 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة البارد إلى كل تفاعل واستخدم الماصة بلطف لإعادة تعليق الخرزات.
      15. اخلط 10 ميكرولتر من كل من المادة الفائقة و10 ميكرولتر من تعليق الخلية/الخرزة (معاد تعليقها في مخزن الأجسام المضادة) مع 10 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان وحمل الخليط على شريحة عداد الخلية.
      16. حللها باستخدام عداد الهواتف. تأكد أن المادة الفائقة تحتوي على القليل جدا من الخرزات أو الخلايا، وأن خليط الخرز/الخلية يحتوي على خلايا منفاذة محاطة بالخرز.
        ملاحظة: من المهم التحقق من توافق خرز CoA في الخلايا.
    4. النفاذية وارتباط الأجسام المضادة
      ملاحظة: نجاح CUT & RUN يعتمد بشكل حاسم على مدى ترابط الجسم المضاد مع هدفه وخصوصيته في ظروف تجريبية محددة. نوصي بما يلي: 1. استخدام الأجسام المضادة التجارية التي تم التحقق منها ل CUT & RUN عندما تكون متوفرة. 2. بالنسبة للأهداف التي لا تحتوي على أجسام مضادة معتمدة من CUT&RUN، اعتبر تلك التي تم التحقق منها من أجل التألق المناعي (IF)، حيث تتعرف الأجسام المضادة على الحواتم في سياقها الخلوي الأصلي، مشابهة للارتباط الميداني للأجسام المضادة للاستهداف داخل الخلايا المنفذة في CUT&RUN. 3. اختبر 3-5 أجسام مضادة بالتوازي لتحديد الأكثر فعالية لتطبيقك المحدد.
      1. قم بتدوير لوحة K-MetStat بسرعة والبيبت لإعادة تعليقها. أضف 2 ميكرولتر من لوحة K-MetStat إلى التفاعلات المخصصة للأجسام المضادة لفيروس H3K4me3 الإيجابية وIgG السلبية للتحكم في التفاعلات. مائية للخلط وأنابيب الغزل السريع (اختياري).
      2. أضف 0.5 ميكروغرام لكل من الأجسام المضادة H3K4me3 و H3K4me1 و IgG، و0.6 ميكروغرام من الأجسام المضادة متعددة النسيلات E2F7 من مصادر مختلفة إلى كل تفاعل (الجدول 4). ضع علامة على أنابيب 8 شرائط.
      3. استخدم الماصة بلطف لخلط كل أنبوب تفاعل بشكل صحيح. حضن الحوض طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية على جهاز نوتاتور مع رفع أغطية الأنابيب. لا تدير أو تقلب الأنابيب.
  2. اليوم الثاني
    1. ارتباط pAG-MNase بالأجسام المضادة
      ملاحظة: استقرار الخرزات طوال الليل أمر طبيعي ولا يؤثر على النتائج. إذا أصبحت الخرزات متكتلة أو لزجة بعد الحضانة طوال الليل، أعد تعليقها عن طريق العزف اللطيف على الماصات. لتحسين الاتساق والإنتاجية، ينصح باستخدام الماصات متعددة القنوات. عند استخدام أنابيب 8 شرائط، قم بإزالة واستبدال المخازن شريطا تلو الآخر لمنع جفاف خرزات ConA.
      1. ضع حامل المغناطيس على الثلج.
      2. أزل أنابيب الشريط 8 من حضانة 4 درجات مئوية وادار بسرعة لجمع السائل.
      3. ضع الأنابيب على حامل المغناطيس حتى يزول الخليط السائل. قم بعمل الماصة بعناية وإزالة السوبرناتانت.
      4. حافظ على الأنابيب على حامل المغناطيس. غسل الأنابيب مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من محلول نفاذية الخلايا البارد. بيبت لإزالة السوبرناتانت.
      5. قم بإزالة الأنابيب من حامل المغناطيس وإضافة فورا 50 ميكرولتر من مخزن نفاذية الخلايا البارد إلى كل تفاعل. التوصيل بلطف لإعادة تعليق الخلايا أو الخرز.
      6. أضف 2.5 ميكرولتر من pAG-MNase إلى كل تفاعل وامزج جيدا عن طريق التوصيل اللطيف بالماصات.
      7. حضن التفاعلات لمدة 10 دقائق عند RT.
      8. قم بتدوير الأنابيب بسرعة، ثم أعيدها إلى حامل المغناطيس، حتى يزول الخليط السائل. بيبت لإزالة السوبرناتانت.
      9. مع إبقاء الأنابيب على حامل مغناطيس، اغسل الأنابيب مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن نفاذية الخلايا البارد. بيبت لإزالة السوبرناتانت.
      10. قم بإزالة الأنابيب من حامل المغناطيس، وأعد تعليقها بلطف في 50 ميكرولتر من مخزن نفاذية الخلايا البارد. ضع الأنابيب على الثلج.
    2. الهضم المستهدف للكروماتين وإطلاقه
      ملاحظة: قم بإجراء عملية هضم معتمدة على Ca2+ عند 0 درجة مئوية لتقليل الانقسام غير المقصود MNase للحمض النووي12 المتاح. أضف الحمض النووي الشوكي إلى الداخل مثل الإشريكية القولونية (E. coli)، بحيث يمثل حوالي 0.5-5٪ (ويفضل ~1٪) من إجمالي التسلسل13. يستخدم حمض نووي سبايك إن لتطبيع عمق التسلسل، وهو مهم بشكل خاص عند مقارنة العينات عبر سلسلة، على سبيل المثال، عند تقييم التغيرات العالمية في تعديل الهيستون بعد التثبيط أو الحذف الجيني لإنزيمات تعديل الهستون.
      1. أضف 1 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 100 ملليمولار إلى كل تفاعل في شريط الأنابيب المكون من 8 أنابيب (من الخطوة 3.2.1.10) أثناء وضع الثلج. استخدم الماصة بلطف لإعادة تعليق الخرز بالكامل وضمان هضم فعال.
      2. حضن الأنابيب على جهاز نوتاتور عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين، مع رفع الأطراف المغطاة.
      3. في أنبوب جديد بسعة 1.5 مل، جهز خليط الإيقاف المؤقت (Stop Buffer Mix). لكل تفاعل، اجمع 33 ميكرولتر من مخزن الإيقاف مع 1 ميكرولتر من حمض نووي سبايك في الإشريكية القولونية (0.5 نانوغرام). دوامة لطيفة للخلط.
      4. أضف 33 ميكرولتر من حاجز التوقف إلى كل تفاعل في نهاية الحضانة التي تستغرق ساعتين. امزج عن طريق العزف اللطيف على النبرة.
      5. حضن التفاعلات في جهاز التدوير الحراري عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      6. أنابيب الدوران السريع لجمع المحتويات في الأسفل، ثم وضعها على رف مغناطيس حتى يصبح المحلول شفافا.
      7. انقل بعناية حوالي 84 ميكرولتر من المادة الفائقة التي تحتوي على الحمض النووي المفرج بواسطة CUT&RUN إلى أنابيب جديدة بحجم 1.5 مل.
    3. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي (انظر جدول المواد)
      ملاحظة: قبل الاستخدام الأول، أضف 6.9 مل من الأيزوبروبانول إلى مخزن ربط الحمض النووي وأضف 20 مل ≥ 95٪ إيثانول إلى مخزن غسل الحمض النووي.
      1. أضف 420 ميكرولتر من محلول ربط الحمض النووي إلى كل فائض يتم جمعه. دوامة للحظة لخلطها جيدا.
      2. ضع عمود تنظيف الحمض النووي في أنابيب الجمع الخاصة به.
      3. قم بتحميل كل عينة على العمود المقابل.
      4. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة 30 ثانية عند RT. تخلص من التدفق السريع وأعد العمود إلى أنبوب التجمع.
      5. أضف 200 ميكرولتر من مخزن غسل الحمض النووي إلى كل عمود وجهاز طرد مركزي عند 16,000 × جرام لمدة 30 ثانية عند RT. تخلص من التدفق واستبدل العمود في أنبوب التجميع.
      6. كرر خطوة الغسيل مرة واحدة.
      7. استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 16,000 x g لمدة 30 ثانية عند RT لإزالة بقايا الغسيل بالكامل.
      8. نقل الأعمدة إلى أنابيب 1.5 مل معنونة.
      9. ضع 12 ميكرولتر من محلول التبسيط مباشرة على الغشاء في مركز العمود.
      10. حضن لمدة 5 دقائق عند RT ثم استخدم الطرد المركزي بحرارة 16,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند RT لاستخراج الحمض النووي.
        ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة. تخزين الحمض النووي المائل عند -20 درجة مئوية للمعالجة المستقبلية.
    4. تحليل كمية الحمض النووي CUT&RUN وتوزيع حجم الشظايا
      ملاحظة: قم بقياس الحمض النووي باستخدام جهاز قياس فلورومتر باستخدام مجموعة اختبار الحساسية عالية dsDNA، والتي توفر قياسات أكثر دقة للحمض النووي مزدوج السلسلة مقارنة بالطرق المعتمدة على الامتصاص.
      1. استخدم 1 ميكرولتر من كل عينة لتحديد تركيز الحمض النووي CUT &RUN باستخدام مجموعة اختبار الحساسية عالية dsDNA (انظر جدول المواد).
      2. استخدم 1 ميكرولتر إضافي من الحمض النووي لتقييم وجود وتوزيع حجم الشظايا المشقوقة. قم بتحليل الشظايا باستخدام مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية (انظر جدول المواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (اختياري).
        ملاحظة: يمكن اكتشاف بروتينات الارتباط الوفيرة جدا، مثل تعديلات ما بعد الترجمة الهيستونية (PTMs)، بسهولة في هذه الخطوة. ومع ذلك، قد يكون من الصعب اكتشاف عوامل النسخ منخفضة الوفرة.
    5. بناء المكتبات، تحليل الشظايا، والتسلسل
      ملاحظة: تم استخدام ≤5 نانوغرام DNA إجمالي CUT &RUN، كما تم تحديده بواسطة قياس مجموعة اختبار الحساسية عالية dsDNA، في بناء مكتبات التسلسل من الجيل التالي (NGS). لتقليل الديمرات المحول، قم بتقليل المحول من Illumina إلى 1 ميكرولتر لربط المحول. يمكن تعديل عدد دورات PCR أثناء بناء المكتبة بناء على كمية الإدخال، وعائد المكتبة، ومعدل التكرار. قد تستخدم استراتيجيات اختيار حجم مختلفة لتنقية الحمض النووي (انظر جدول المواد) حسب PTMs أو عوامل النسخ المستهدفة.
      1. تم بناء المكتبة باستخدام مجموعة تحضير المكتبة CUT&RUN (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة، مع تعديلات بسيطة. باختصار، تم استخدام 5 نانوغرام من حمض نووي CUT &RUN كمدخل موصى به لتحضير المكتبة. بالنسبة للحمض النووي الذي يقل عن 5 نانوغرام، استخدم أكبر كمية ممكنة لتحضير المكتبة. تم استخدام بادئات مزدوجة من مؤشر i5 و i7 لكل عينة لضمان نجاح تسلسل الإرسال المتعدد.
        ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة. يمكن تخزين الحمض النووي عند -20°C لمزيد من المعالجة.
      2. قس تركيز مكتبة CUT&RUN باستخدام جهاز قياس الفلورومتر ومجموعة اختبار الحساسية عالية dsDNA. تم تحديد توزيع حجم مكتبات CUT&RUN NGS باستخدام مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية (انظر جدول المواد) بناء على دليل مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية أو جهاز الرحلان الكهربائي الشعري المماثل TapeStation (انظر جدول المواد).
        ملاحظة: قم بتخفيف مكتبة CUT&RUN لجعل التركيز ضمن نطاق الكشف لمجموعة اختبار الحساسية عالية الحساسية dsDNA ومجموعة الحمض النووي عالية الحساسية.
      3. مكتبات المجموعة (40-46) تعتمد على فهارس جزيئية وفريدة متساوية. بعد اختيار حجم الخرزات المغناطيسية لتنقية الحمض النووي، تم إجراء تسلسل النهاية المزدوجة (طول قراءة 100 بيت) للمكتبات المجمعة على نظام Illumina NovaSeq 6000 لنصف S-Prime (SP) بعمق قراءة يقدر ب 10 ملايين قراءة لكل مكتبة.
    6. تحليل بيانات القطع والهرب
      1. تحليل بيانات CUT&RUN باستخدام خط أنابيب مخصص (الشكل 5A). قيم جودة القراءة باستخدام FastQC. قم بإزالة تسلسلات المحولات من بداية القراءات باستخدام Cutadapt. محاذاة الطرف المزدوج يقرأ إلى الجينوم البشري (hg38) والجينوم المرجعي للإشريكية القولونية مع Bowtie2. استخدم Samtools لإزالة القراءات غير المحددة. قم بإزالة القراءات المكررة باستخدام Picard، وإنشاء ملفات bedGraph باستخدام Bedtools. أنشئ ملفات bigWig (بالأبيض والأسود) باستخدام DeepTools. تصور البيانات باستخدام IGV وDeepTools. تطبيع إجمالي عدد القراءة إلى عدد قراءات الإشريكية القولونية المرتفعة. قم بإجراء استدعاء ذروة باستخدام تحليل الإثراء المتناثر (SEACR ل CUT&RUN)19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز خطوط خلايا SCLC NE النموذجية أو "الكلاسيكية" بنوى كبيرة، وقلة السيتوبلازم، ونمو كمجموعات غير ملتصقة أو كرويدات مضغوطة معلقة. تظهر خطوط الخلايا ذات الارتفاع العالي ASCL1، مثل NCI-H146 وDMS79، وخطوط الخلايا ذات ارتفاع NEUROD1 مثل NCI-H82 وH446، هذا النمط الكلاسيكي ل SCLC: خلايا صغيرة إلى متوسطة الحجم ذات سيتوبلازم قليل، كروماتين حبيبي دقيق، وميل للنمو بشكل رئيسي كمجموعات غير ملتصقة أو كرويدات مدمجة. على الرغم من أن النماذج ذات المستوى العالي NEUROD1 تحتفظ بتعبير علامات NE، إلا أنها غ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختلال تنظيم الوراثة وLDTFs هما المحركات الرئيسية لبيولوجيا الأورام في SCLC6. تحديد التوزيع الجيني لتعديلات الهيستون المحددة وبروتينات الارتباط بالحمض النووي في SCLC يمكن أن يكشف عن آليات محتملة للمقاومة العلاجية المكتسبة والمرونة الظاهرية. CUT &RUN-seq هي طريقة قوية لرسم خرائط تفاعلات البروتين والحمض النووي بين الهيستون وغير الهيستون بدقة عالية14 من الخلايا والأنسجة. يقدم هذا البروتوكول بديلا فعالا ومنخفض التكلفة لأساليب ChIP-seq التقليدية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا البحث من قبل NCI K08CA241309 (الباحث الرئيسي: هوي-زي تشين)، وجائزة ACS IRG (الباحث الرئيسي: هوي-زي تشين)، وجائزة اكتشاف سرطان الرئة من الجمعية الأمريكية للرئة (الباحث: هوي-زي تشين). تم إجراء التسلسل في مركز ليندا تي. وجون أ. ميلوز لعلوم الجينوم والطب الدقيق. ونشكر أيضا جميع أعضاء المختبر على رؤاهم ودعمهم لهذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>كاشف
RPMI-1640 media جيبكو ثيرموفيشر ساينتيفيك11875093وسط زراعة الخلايا
مصل الأبقار الجنيني (FBS)علم الأعصابFBS002-HIمكون وسط زراعة الخلايا
1٪ بنسلين-سستربتوميسين جيبكو ثيرموفيشر ساينتيفيك15140122المضادات الحيوية لمنع التلوث البكتيري لزراعة الخلايا
محلول تريبان الأزرق، 0.4٪جيبكو ثيرموفيشر ساينتيفيك15250061تم استخدام صبغة Trypan Blue Staining لتقييم النفاذية باستخدام عداد الخلايا الآلي.
روش كومبليت، كوكتيل Proease Inhibitor الخالي من EDTAروش11873580001مثبط البروتين. مكونات مخزن الغسيل
5٪ ديجيتونين إب سايفر21-1004مكونات المخزن المؤقت   ويمكن العثور على وصفة المخزن في ورقة المخزن
مخزن تفعيل الخرزإب سايفر21-1001مكونات المخزن المؤقت   ويمكن العثور على وصفة المخزن في ورقة المخزن
خرز كونكانافالين A (ConA)إب سايفر21-1401الكرات الميكرومغناطيسية المترافقة ب ConA هي خرز مغناطيسي مغطاة بالليكتين تسمح بارتباط الغشاء الدهني
CUT & مجموعة RUN & nbsp;كوتانا تشيك إبيسايفر14-1048المواد الكيميائية ل CUT & توليد الحمض النووي RUN
مجموعة تنقية الحمض النوويكوتانا  إب سايفر14-0050استخراج الحمض النووي من شظايا الحمض النووي المستهدفة المنبعثة في السوبرنانتانت في الأيون
CUT & مجموعة تحضير مكتبة RUNكوتانا إبيسايفر14-001توليد ال CUT& تشغيل مكتبات التسلسل من الجيل التالي (NGS)
  تنقية الحمض النووي خرز مغناطيسيأجنكورت AMPure XP بيكمان كولترA63880تنظيف منتج PCR وتحديد الحجم (أي إزالة المحول وإزالة البرايمر)
حمض نووي سبايك-إن الإشريكية القولونيةإب سايفر18-1401يستخدم كمؤشر خارجي لمعايرة قراءات التسلسل عبر سلسلة من العينات— على سبيل المثال، الحالات المعالجة مقابل غير المعالجة
pAG-MNaseإب سايفر  15-1016عند الارتباط بالجسم المضاد الأساسي، يشق الإنزيم شظية الحمض النووي المستهدفة على جانبي البروتين المرتبط عند تنشيطه بواسطة الكالسيوم
PBS PH7.4 1xجيبكو (ثيرمو فيشر ساينتيفيك)10010-049الخلايا الغسالة
مخزن ما قبل الغسيلإب سايفر21-1002مكونات المخزن المؤقت   ويمكن العثور على وصفة المخزن في ورقة المخزن
dsDNA حساسية عالية  مجموعة الفحصكيوبتTM ثيرمو فيشر ساينتيفيكس32854CUT & قياس الحمض النووي RUN
مخزن الإيقافإب سايفر21-1003مكونات المخزن المؤقت   ويمكن العثور على وصفة المخزن في ورقة المخزن
مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية  تقنيات أجيلينت5067-4626CUT & تحليل التكبيع وتوزيع حجم الشظايا في RUN وكتبيات NGS
<قوي>مادي
أنابيب PCR بسعة 0.2 ميل ب8 شرائطإب سايفر10-0009kأنابيب ل CUT & تفاعلات RUN، متوافقة مع أنابيب 0.2 مل رف الفصل المغناطيسي
شرائح LUNA ذات 8 قنواتلوغوس بيوسيستمز إنك سيL72001شرائح لعد الخلايا،   فحص صلاحية الخلايا وسلامة الخلايا
خزان الكواشف متعدد القنواتفيشر ساينتيفك14-387-072حاوية العزل الغسلية
DynaMagTM-2 (رف الفصل المغناطيسي)، أنابيب بسعة 1.5 ملثيرمو فيشر العلمي12321Dتم عزل خرز ConA من مخزن التخزين الخاص بها بواسطة رف فصل مغناطيسي، ثم تم تفعيلها بإعادة تعليق في مخزن التفعيل داخل أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
رف فصل مغناطيسي، أنابيب بسعة 0.2 ملإب سايفر10-0008قف للانفصال  الخلايا المرتبطة بالخرز، الأجسام المضادة، pAG/MNase الناتج عن التفاعل وغسيل العينات
أبحاث إبندور بالإضافة إلى ماصة 8 قنوات، 0.5-10 uL إبندورف3125000010عينات أنابيب الشفط ذات 8 الشرائط   لتسريع سير العمل، استخدم ماصة متعددة القنوات مماثلة
منظار إبندورف 2 مضربة 8 قنوات، 30-300 ميكرولترإبندورف4926000050خطوات الشفط والغسل لتسريع سير العمل، ماصة متعددة القنوات مماثلة
<قوي>معدات
خلاط Scientific Industries Vortex-Genie 2، سرعة متغيرة، 120 فولتفيشر ساينتيفك50-728-002الطرد المركزي الدقيق والدوران
عداد الخلايا الأوتوماتيكي LUNA FX7لوغوس بيوسيستمز إنك سيL70001عداد الخلايا
خلاط النوتاتينجVWR82007-202خطوات حضانة الخرزات (حضانة الأجسام المضادة طوال الليل، تفاعل هضم pAG-MNase).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Thermal Cyclerإبندورف6331CUT & بناء مكتبة الجيل القادم من RUN
فلوروميتر الكيوبت 4ثيرمو فيشر العلميQ33226قياس الحمض النووي.
المحلل الحيوي Agilent 2100تقنيات أجيلينتG2939Aحجم الجزء، تحليل التركيز ل CUT&. أجر DNA وCUT & مكتبات RUN,  جهاز الرحلان الكهربائي الشعيري المماثل (مثل Agilent TapeStation)
أجيلينت تيبيستيشنتقنيات أجيلينتG2992AAحجم الجزء، تحليل التركيز ل CUT&. أجر DNA وCUT & مكتبات RUN
نظام إلومينا نوفاسيك 6000  إلومينا، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةتسلسل CUT&S المجمعين مكتبات RUN 

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. J Hum Genet. 58 (7), 439-445 (2013).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications-cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  4. Wang, Y., et al. STAT3 facilitates super enhancer formation to promote fibroblast-to-myofibroblast differentiation by the analysis of ATAC-seq, RNA-seq and ChIP-seq. J Cell Mol Med. 29 (11), e70639(2025).
  5. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biol. 20 (1), 245(2019).
  6. Takumida, H., et al. Integrative epigenome and transcriptome analyses reveal transcriptional programs differentially regulated by ASCL1 and NEUROD1 in small cell lung cancer. Oncogene. 44 (34), 3113-3125 (2025).
  7. Sivakumar, S., et al. Integrative analysis of a large real-world cohort of small cell lung cancer identifies distinct genetic subtypes and insights into histologic transformation. Cancer Discov. 13 (7), 1572-1591 (2023).
  8. Rudin, C. M., et al. Author correction: Molecular subtypes of small cell lung cancer: A synthesis of human and mouse model data. Nat Rev Cancer. 19 (7), 415(2019).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  10. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  11. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 6, e21856(2017).
  12. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  13. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. Elife. 8, e46314(2019).
  14. Custers, S., et al. Cleavage under targets & release using nuclease (CUT&RUN) protocols for the study of genetic and epigenetic regulation in cancer. Methods Mol Biol. 2944, 207-225 (2025).
  15. Hainer, S. J., Boskovic, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329.e11 (2019).
  16. Marroquin-Rivera, A., et al. Immune-related transcriptomic and epigenetic reconfiguration in BV2 cells after lipopolysaccharide exposure: An in vitro omics integrative study. Inflamm Res. 73 (2), 211-225 (2024).
  17. Huang, H., et al. Deciphering the role of histone modifications in memory and exhausted CD8 T cells. Sci Rep. 15 (1), 17359(2025).
  18. De Sarkar, N., et al. Nucleosome patterns in circulating tumor DNA reveal transcriptional regulation of advanced prostate cancer phenotypes. Cancer Discov. 13 (3), 632-653 (2023).
  19. Roberti, A., Fraga, M. F. Epigenomic profiling of histone posttranslational modifications in frozen cancer tissue using CUT&RUN. Methods Mol Biol. 2930, 229-243 (2025).
  20. Black, J. B., et al. Master regulators and cofactors of human neuronal cell fate specification identified by CRISPR gene activation screens. Cell Rep. 33 (9), 108460(2020).
  21. Augert, A., et al. Small cell lung cancer exhibits frequent inactivating mutations in the histone methyltransferase KMT2D/MLL2: CALGB 151111 (Alliance). J Thorac Oncol. 12 (4), 704-713 (2017).
  22. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  23. Yang, Y., et al. H3K9me3 involved in FOXL2 regulation of SerpinE2 expression to affect steroid hormone synthesis in follicular granulosa cells. FASEB J. 39 (12), e70730(2025).
  24. Panday, A., Elango, R., Willis, N. A., Scully, R. A modified CUT&RUN-seq technique for qPCR analysis of chromatin-protein interactions. STAR Protoc. 3 (3), 101529(2022).
  25. Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease. J Vis Exp. (180), e63536(2022).
  26. Hsieh, T. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Mol Cell. 78 (3), 539-553.e8 (2020).
  27. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nat Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CUT And RUN H3K4me3 H3K4me1 E2F7

مقالات ذات صلة